CN114438220B - 一种红鳍原鲌放流评价方法 - Google Patents

一种红鳍原鲌放流评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红鳍原鲌放流评价方法，属于动物分子遗传学领域，采集被放流红鳍原鲌亲鱼的鳍条，保存于酒精内；回捕各放流洄游点的红鳍原鲌个体，并取每个个体的鳍条；提取所有鳍条样本的DNA；利用本方法提供的5组双重PCR引物检测被捕个体和被放流红鳍原鲌亲鱼的亲子关系。本方法利用亲子鉴定技术准确鉴定被捕个体和被放流红鳍原鲌亲鱼的亲子关系，进而判断被捕红鳍原鲌个体中放流个体的数量，实现对红鳍原鲌放流效果的准确评价。

Description

一种红鳍原鲌放流评价方法
技术领域
本发明涉及动物分子遗传学领域，尤其涉及一种红鳍原鲌放流评价方法。
背景技术
红鳍原鲌为红鳍原鲌喜欢栖息在水草繁茂的湖泊中，也可生活在江河的缓流里。幼鱼常群集在沿岸一带觅食；成鱼则常成群游动于水面，冬季在深水处越冬。2冬龄鱼一般能达到第一次性成熟，最小个体仅11厘米，重约17.6克。产卵期在5-7月，产卵场一般在水草丛生的地方，卵产出后粘附于水草上。红鳍原鲌为凶猛性肉食性鱼类，幼鱼主要摄取枝角类、桡足类和水生昆虫，成鱼一般以小鱼为食，亦食少数的虾、昆虫和浮游动物。
随着人类活动的增加，野生红鳍原鲌资源受到严重破坏。野生红鳍原鲌数量急剧减少，引来越来越多关注。人工放流是解决红鳍原鲌数量减少的有效手段。但是到目前为止，红鳍原鲌的人工放流的效果未得到正确有效的评价，主要原因是缺乏一种有效的红鳍原鲌放流评价方法。
发明内容
本发明为解决现有红鳍原鲌的人工放流的效果未得到正确有效的评价，而提出的一种红鳍原鲌放流评价方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种红鳍原鲌放流评价方法，所述全生物降解吹膜材料的原料按重量份计为：
S1、采集被放流红鳍原鲌亲鱼的鳍条，保存于酒精内；
S2、回捕各放流洄游点的红鳍原鲌个体，并取每个个体的鳍条；
S3、提取所有鳍条样本的红鳍原鲌DNA；
S4、采用5组双重PCR微卫星引物检测回捕的红鳍原鲌个体和被放流红鳍原鲌亲鱼的亲子关系。
优选地，所述S3中红鳍原鲌DNA的提取包括以下步骤：
A1、消化准备：清洗工具，取固定于无水乙醇中的样品50～100mg，用去离子水浸泡20min，出去酒精，重复三次，新鲜组织样品可省略此步骤；
A2、消化：剪碎样品，置于1.5ml离心管中，加入200μLDNA裂解液，5μL蛋白酶K(10mg/mL)，略离心，颠倒混匀，放入50℃～55℃水浴锅消化3～5h，直至裂解液澄清；
A3、抽提：按照体积比为25：24：1的比例加入酚：氯仿：异戊醇200μL，颠倒晃动15～20min，8000rpm离心5min，吸出上清液，置于新的1.5mL离心管中，重复三次；
A4、沉淀：加入-20℃预冷的无水乙醇800μL，若产生絮状沉淀，则为纯度较高的DNA样品，可挑出待用，12000rpm离心15min，倒掉上清液，加入75％的酒精400～800μL清洗沉淀，12000rpm离心5min，倒掉上清液，用滤纸略吸水，室温放置约2～5h晾干；
A5、溶解：加入ddWater100～200μL，涡旋振荡仪震荡10s，使其溶解，略离心，4℃静置1d以上，使其充分混匀；
A6、检测：1％琼脂糖凝胶电泳检验DNA的完整性，并用NanoDrop2000紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度；
A7、保存：DNA样品至于-20℃保存，使用时稀释，终浓度为20～50ng/μL。
优选地，所述S5中的红鳍原鲌微卫星标记的5组双重PCR微卫星引物，具体引物信息如下：
优选地，所述S5中检测回捕的红鳍原鲌个体和被放流红鳍原鲌亲鱼的亲子关系包括以下步骤：将PCR扩增产物在10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型；所述的PCR反应体系是25ul：10×PCRBuffer3ul，2.5mmol/LdNTP2ul，MgCl23ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水12.5ul。
优选地，所述的PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
优选地，所述的红鳍原鲌个体之间亲缘关系远近的测量方法为根据PCR产物的条带大小，使用mega5.0软件和population软件做聚类发育树，根据聚类分析图鉴定个体之间的亲缘关系。
优选地，所述采样枪内管段和采样枪外管段上端通过高温轴承活动连接。
与现有技术相比，本发明提供了一种红鳍原鲌放流评价方法，具备以下有益效果：
1.本发明的有益效果是：该方法可以有效培育出稳定遗传的具有优良性状的红鳍原鲌群体，可以快速恢复红鳍原鲌的遗传多样性，提高红鳍原鲌养殖户的收入。本方法较传统的优良性状培育方法具有快速稳定的特定，具有巨大的推广价值。
附图说明
图1为本发明提出的一种红鳍原鲌放流评价方法的一具体实施例的最终筛选出扩增效果较好的引物图；
图2为本发明提出的一种红鳍原鲌放流评价方法的一具体实施例的8尾红鳍原鲌个体亲缘关系结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例1：
红鳍原鲌DNA的提取：
消化准备。清洗工具，取固定于无水乙醇中的样品50～100mg，用去离子水浸泡20min，出去酒精。重复三次。新鲜组织样品可省略此步骤。
消化。剪碎样品，置于1.5ml离心管中，加入200μLDNA裂解液，5μL蛋白酶K(10mg/mL)，略离心，颠倒混匀，放入50℃～55℃水浴锅消化3～5h，直至裂解液澄清。
抽提。加入酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)200μL，颠倒晃动15～20min，8000rpm离心5min，吸出上清液，置于新的1.5mL离心管中。重复三次。
沉淀。加入-20℃预冷的无水乙醇800μL(若产生絮状沉淀，则为纯度较高的DNA样品，可挑出待用。)，12000rpm离心15min，倒掉上清液，加入75％的酒精400～800μL清洗沉淀，12000rpm离心5min，倒掉上清液，用滤纸略吸水，室温放置约2～5h晾干。
溶解。加入ddWater100～200μL，涡旋振荡仪震荡10s，使其溶解，略离心，4℃静置1d以上，使其充分混匀。
检测。1％琼脂糖凝胶电泳检验DNA的完整性，并用NanoDrop2000紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度。
保存。DNA样品至于-20℃保存，使用时稀释，终浓度为20～50ng/μL。
实施例2：
微卫星引物的选择和筛选
把红鳍原鲌基因组DNA送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行基因组高通量测序，针对其中含有微卫星的片段设计出200对微卫星引物，送至上海生工生物工程有限公司合成。选用24个不同个体DNA模板对所有微卫星引物进行筛选，选出能稳定扩增的微卫星标记。所述的PCR反应体系是25ul：10×PCRBuffer3ul，2.5mmol/LdNTP2ul，MgCl23ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水12.5ul。最终筛选出扩增效果较好的引物，如图一所示。
实施例3：
利用微卫星位点对红鳍原鲌样品进行PCR扩增：
取所有待测量红鳍原鲌鳍条样品；提取红鳍原鲌样品DNA；利用本专利筛选出来的微卫星位点对红鳍原鲌样品进行PCR扩增；把PCR扩增产物在10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型。所述的PCR反应体系是25ul：10×PCRBuffer3ul，2.5mmol/LdNTP2ul，MgCl23ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水12.5ul。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。本专利所述的微卫星位点具体信息如下：
实施例4：
利用本专利引物检测红鳍原鲌个体间的亲缘关系
在珠江区域收集性成熟红鳍原鲌个体8尾，测量这8尾红鳍原鲌个体亲缘关系的远近。
利用实施例1方法对这8尾红鳍原鲌个体进行取鳍条样本，提取DNA。利用实施例3提供的PCR方法扩增这8尾红鳍原鲌DNA，根据扩增结果使用mega5.0软件和population软件做聚类发育树，根据聚类分析图鉴定个体之间的亲缘关系，测量这8尾红鳍原鲌个体亲缘关系的远近。这8尾红鳍原鲌个体亲缘关系结果如图二所示，个体1、2和6亲缘关系较近，个体3、4和5较近，个体7和8较近，并且个体1、2和6组成的分支和个体3、4和5组成的分支距离较远，说明这两个分支的个体亲缘关系较远。经过这种方式可获得红鳍原鲌个体间的亲缘关系。
SEQUENCELISTING
<110>——
<120>——一种红鳍原鲌放流评价方法
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AGCTGCTTCCCATCGATTTA——20。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所
<120> 一种红鳍原鲌放流评价方法
<130> 20
<140> 202210004939.X
<141> 2022-01-05
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 20
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Claims (2)

1.一种红鳍原鲌放流评价方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、采集被放流红鳍原鲌亲鱼的鳍条，保存于酒精内；
S2、回捕各放流洄游点的红鳍原鲌个体，并取每个个体的鳍条；
S3、提取所有鳍条样本的红鳍原鲌DNA；
S4、采用5组双重PCR微卫星引物检测回捕的红鳍原鲌个体和被放流红鳍原鲌亲鱼的亲子关系；
5组双重PCR微卫星引物，具体引物信息如下：
利用所述5组双重PCR微卫星引物对红鳍原鲌样品进行PCR扩增，将PCR扩增产物在10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型；
所述PCR的反应体系是25μL：10×PCRBuffer3μL，2.5mmol/LdNTP2μL，MgCl23μL，上下游引物各1μL，Taq酶0.5μL，DNA模板2μL，超纯水12.5μL；
所述PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
红鳍原鲌个体之间亲缘关系远近的测量方法为根据PCR产物的条带大小，使用mega5.0软件和population软件做聚类发育树，根据聚类分析图鉴定个体之间的亲缘关系。
2.根据权利要求1所述的一种红鳍原鲌放流评价方法，其特征在于：所述S3中红鳍原鲌DNA的提取包括以下步骤：
A1、消化准备：清洗工具，取固定于无水乙醇中的样品50～100mg，用去离子水浸泡20min，除去酒精，重复三次；
当样品为新鲜组织样品时，省略A1步骤；
A2、消化：剪碎样品，置于1.5ml离心管中，加入200μLDNA裂解液，5μL蛋白酶K，蛋白酶K浓度为10mg/mL，略离心，颠倒混匀，放入50℃～55℃水浴锅消化3～5h，直至裂解液澄清；
A3、抽提：按照体积比为25：24：1的比例加入酚：氯仿：异戊醇200μL，颠倒晃动15～20min，8000rpm离心5min，吸出上清液，置于新的1.5mL离心管中，重复三次；
A4、沉淀：加入-20℃预冷的无水乙醇800μL，若产生絮状沉淀，则为纯度较高的DNA样品，将纯度较高的DNA样品12000rpm离心15min，倒掉上清液，加入75％的酒精400～800μL清洗沉淀，12000rpm离心5min，倒掉上清液，用滤纸吸水，室温放置约2～5h晾干；
A5、溶解：加入ddWater100～200μL，涡旋振荡仪震荡10s，使其溶解，略离心，4℃静置1d以上，使其充分混匀；
A6、检测：1％琼脂糖凝胶电泳检验DNA的完整性，并用NanoDrop2000紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度；
A7、保存：DNA样品至于-20℃保存，使用时稀释，终浓度为20～50ng/μL。
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