CN102676674A

CN102676674A - 一种转基因玉米检测用质粒标准分子及其制备方法

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Publication number: CN102676674A
Application number: CN2012101442433A
Authority: CN
Inventors: 于常海; 刘乐庭; 杨滨
Original assignee: HAI KANG LIFE (BEIJING) Corp Ltd; Peking University
Current assignee: HAI KANG LIFE (BEIJING) Corp Ltd; Peking University
Priority date: 2012-05-10
Filing date: 2012-05-10
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明公开了一种转基因玉米检测用质粒标准分子及其制备方法，所述质粒标准分子包含玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米BT176的构建特异性序列。通过设计特异性PCR引物，扩增zSSIIb基因和BT176玉米的构建特异性序列；通过重叠PCR的方法将上述两个特异性扩增片段构建到pEASY-T3载体上获得人工重组质粒标准分子。本发明质粒标准分子适用于转基因玉米BT176的构建特异性检测，灵敏度较高，均一性较好，低温下具有较好的稳定性。

Description

一种转基因玉米检测用质粒标准分子及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种转基因玉米检测用质粒标准分子及其制备方法，具体涉及转基因玉米BT176检测用质粒标准分子及其制备方法。背景技术

随着转基因市场的不断扩大，转基因生物和产品的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内的争论和关注，那么转基因产品的检测技术尤其重要，世界各国也纷纷出台了很多的政策法规，2002年，我国农业部颁布了《农业转基因生物标识管理办法》，要求对转基因成分进行检测，并要求检测结果为阳性者需要标识。而世界上的其他国家，例如欧盟、日本、澳洲、韩国也纷纷出台相关政策，要求对超过一定含量的转基因植物产品进行标识。

基于核酸的PCR检测技术是目前应用最广泛的转基因植物检测技术。根据不同的外源DNA片段，PCR检测策略可以分为四种，即通用元件筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测、品系特异性PCR检测。构建特异性是通过检测外源插入载体中两个元件的连接区的DNA序列实现的。这种方法具有相对较高的特异性，在转基因检测中使用较多。

为了使得检测结果的准确性得到保障，在检测过程中需要使用标准物质。目前大量使用的标准参考物质是由未加工的原材料制备而成的——基体标准物质，然而，由于基质效应和加工过程中完整DNA分子的缺失等原因使得其作为定量标准品应用时具有很大局限性。同时，其制备复杂，价格昂贵，且不利于长期储存。质粒标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有转基因检测目的外源基因和内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子。经验证质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供无限稳定量的标准物质，并且纯度较高；且操作容易，稳定性高。

转基因玉米品系BT176，商品名称为NaturGard KnockOut玉米，是经过特异性基因修饰而具有抗欧洲玉米螟(ECB；Ostrinia nubilalis）抗性的玉米品系。欧洲玉米螟是一种对玉米危害严重的农业害虫，能杀死鳞翅目昆虫，对家畜和人类不敏感。BT176玉米品系可以生产一种剪切杀虫蛋白，来自苏云金芽孢杆菌亚种kurstaki菌株HD-1的Cry1Ab；也能表达土壤吸水链霉菌的bar基因，编码草铵膦乙酰转移酶(PAT）酶。目前，ISO21570、欧盟参考物质及测量研究所对于转基因玉米BT176的检测均为构建特异性检测，因此，开发一种转基因玉米BT176构建特异性检测用质粒标准分子具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种转基因玉米BT176检测用质粒标准分子及其制备方法，本发明质粒标准分子可用作转基因玉米BT176构建特异性检测时的阳性标准品。

为实现上述目的，本发明提供一种转基因玉米BT176检测用质粒标准分子，该质粒标准分子是将玉米内标准基因zSSIIb特异性序列、转基因玉米BT176的构建特异性序列依次构建到质粒载体中而得；所述玉米内标准基因zSSIIb特异性序列如SEQ ID No.1所示，所述转基因玉米BT176的构建特异性序列如SEQ ID No.2所示。

本发明质粒标准分子中，所述质粒载体为pEASY-T3载体。

本发明的另一个目的在于提供一种上述转基因玉米BT176检测用质粒标准分子的制备方法，该制备方法为：将SEQ ID No.1所示核苷酸序列和SEQ ID No.2所示核苷酸序列经重叠PCR法连接起来，并将连接产物构建到质粒载体上，以获得上述质粒标准分子。

上述制备方法中，所述SEQ ID No.1所示核苷酸序列由SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示序列组成的引物对，扩增转基因玉米BT176阳性标准品而得。

上述制备方法中，所述SEQ ID No.2所示核苷酸序列由SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示序列组成的引物对，扩增转基因玉米BT176阳性标准品而得。

上述制备方法中，所述质粒载体为pEASY-T3载体。

上述质粒标准分子的制备方法，具体步骤如下：

（1）由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列组成的引物对，扩增转基因玉米BT176阳性标准品，得SEQ ID No.1所示核苷酸序列的扩增产物；

（2）由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列组成的引物对，扩增转基因玉米BT176阳性标准品，得SEQ ID No.2所示核苷酸序列的扩增产物；

（3）以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列为模板进行重叠PCR扩增，得到SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的连接产物；

（4）将上述连接产物构建到质粒载体上得到权利要求1所述转基因玉米BT176检测用质粒标准分子。

上述步骤（3）中，所述重叠PCR的引物对序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.6所示。

上述步骤（1）和步骤(2）还包括对所得扩增产物进行鉴定的步骤，其具体步骤如下：

将所得扩增产物构建到质粒载体上，获得含有该扩增产物的中间质粒分子；将上述中间质粒分子转化感受态菌株、测序鉴定；对测序正确的中间质粒分子进行PCR扩增，以获得SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2所示核苷酸序列的扩增产物。

本发明依据ISO21570(Foodstuffs-Detection of genetically modifiedorganisms and derived products-Quantitative nucleic acid based methods)中的转基因玉米BT176定量检测方法来设计检测片段组合，内源基因检测片段选择zSSIIb基因，外源基因检测片段选择转基因玉米BT176构建特异性序列，利用重叠PCR的方法将二者连接起来，再将连接产物构建到质粒载体中而获得质粒标准分子。该质粒标准分子可以代替转基因玉米BT176的阳性标准物质用于构建特异性的PCR检测，很好的解决了该品系检测过程中阳性标准物质缺乏的问题。

本发明质粒标准分子不仅具有转基因品系的特异性，还具有检测方法的特异性，即仅对其适用的检测方法即构建特异性检测适用，用其它的检测方法对本发明质粒进行扩增不会产生非特异性条带。

本发明质粒标准分子用于转基因玉米检测时灵敏度较高，其检测下限的绝对值可以达到12.5拷贝。

本发明质粒标准分子具有一定的均一性。

本发明质粒标准分子低温下稳定性较好，质粒分子在-20℃下储存28天后仍具有较好的稳定性。

附图说明

图1为BT176质粒标准分子的琼脂糖电泳图。泳道1:5μl质粒样品；泳道2：3μl质粒样品；泳道3：1μl质粒样品；泳道M：DNA2000ladder。

图2为BT176质粒标准分子的适用性验证。1和2为BT176构建特异性序列的Realtime PCR结果，其中1为以本发明质粒标准分子为模板的扩增结果，模板浓度为0.01ng/μl；2为BT176基因组为模板的扩增结果，模板终浓度为10ng/μl。3和4为内源zSSIIb基因的RealtimePCR结果，其中3为以本发明质粒标准分子为模板的扩增结果，模板浓度为0.01ng/μl；4为以BT176基因组为模板的扩增结果，模板终浓度为10ng/μl。

图3为BT176质粒标准分子相对于转基因玉米GA21的特异性验证。使用转基因玉米GA21的引物探针进行验证：①为以BT176标准分子为模板扩增为结果，模板浓度为0.01ng/μl；②以GA21基因组为模板扩增结果，模板终浓度为10ng/μl。

图4为BT176质粒标准分子相对于转基因玉米MON810的特异性验证。使用转基因玉米MON810的引物探针进行验证，①为以BT176标准分子为模板扩增为结果，模板浓度为0.01ng/ul；②以MON810基因组为模板扩增结果，模板终浓度为10ng/μl。

图5为BT176质粒标准分子相对于转基因玉米BT11的特异性验证。使用转基因玉米BT11的引物探针进行验证：①以BT176标准质粒分子为模板，模板浓度为0.01ng/μl；②以BT11基因组为模板，模板终浓度为10ng/μl。

图6为以BT176质粒标准分子为标准品建立的BT176构建特异性定量PCR标准曲线。

图7为BT176质粒标准分子短期稳定性试验结果。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

以下实施例所用转基因玉米BT176、GA21、MON810、BT11基因组模板，均为购自欧盟IRMM的标准品5％level基因组（即含有5%阳性种子的转基因粉末）。

实施例1本发明质粒标准分子的制备

一、实验试剂

转基因植物及深加工产品提取试剂盒，由海康生命科技有限公司提供；pEASY-T3克隆试剂盒，购自全式金生物技术有限公司；iTaqDNA聚合酶，购自伯乐生命医学产品（上海)有限公司；DNA ladder、胶回收试剂盒，购自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；Taqman基因表达预混液，购自ABI公司；高纯度质粒小提中量试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；高纯度质粒大提试剂盒，购自美国omega生物技术公司；Picogreen DNA定量试剂盒，购自Life technology。

二、主要仪器设备

Bio-Rad my cycler梯度PCR仪、Gel型凝胶成像系统（Bio-Rad）、紫外分光光度计，其他仪器包括：恒温水浴锅、离心机、恒温培养箱、电子天平、微量移液器等。

三、实验方法和过程

1、引物设计

在NCBI GenBank数据库中搜索玉米内标准基因zSSIIb；依据ISO21570中关于转基因玉米BT176的构建特异性检测方法选择构建特异性检测片段，NCBI上查找相关序列信息，DNAMAN查找检测片段位置。

根据获得的zSSIIb基因以及BT176构建特异性序列信息，利用OLIGO6.0设计引物，一对引物用于扩增玉米内标准基因zSSIIb，其序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；另一对引物用于扩增转基因玉米BT176构建特异性序列片段，其序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

2、玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米BT176构建特异性序列的扩增

根据上述引物对，以转基因玉米BT176基因组DNA为模板，对玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米BT176构建特异性序列进行PCR扩增（反应体系和扩增条件分别见表1、表2），所得玉米内标准基因zSSIIb片段大小约400bp，BT176构建特异性序列片段100bp。

表1.内标准基因zSSIIb和BT176构建特异性序列的PCR反应体系

表2.内标准基因zSSIIb和BT176构建特异性序列的PCR扩增条件

3、构建中间质粒分子

使用PCR胶回收试剂盒回收上述PCR得到的内标准基因zSSIIb和BT176构建特异性序列的扩增产物，并将上述两种PCR扩增产物分别构建到pEASY-T3载体上，以获得含有zSSIIb基因或BT176构建特异性序列的中间质粒分子；将上述中间质粒分子转化DH5α感受态菌株，利用菌落PCR对重组菌株进行鉴定，然后将阳性克隆的菌液送去测序，对比与目的扩增片段序列一致，保存菌种，提取质粒。对测序鉴定正确的质粒进行PCR扩增，得内标准基因zSSIIb和BT176构建特异性序列的扩增产物。

4、内标准基因zSSIIb和BT176构建特异性序列的连接

以上述PCR得到的内标准基因zSSIIb和BT176构建特异性序列为模板，以zSSIIb基因的上游引物(SEQ ID No.3）和构建特异性序列的下游引物（SEQ ID No.6)作为重叠PCR的引物对，进行重叠PCR扩增，实现两个片段的重组拼接。重叠PCR扩增的反应体系见表3。

表3、重叠PCR的反应体系

重叠PCR扩增条件如下：

先将表3中除了重叠PCR引物的其它组分混合，反应条件如下：

95℃5min；

95℃30s,45℃30s,72℃30s,5个循环；

后加入上述重叠引物，反应条件如下：

95℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环；

72℃10min;

4℃1min。

5、构建质粒标准分子

利用PCR胶回收试剂盒回收上述重叠PCR扩增产物，并将其构建到pEASY-T3载体上，所得质粒载体转化DH5α感受态菌株，利用菌落PCR对重组菌株进行鉴定，阳性克隆菌液送去测序，测序序列与目的片段序列一致者即为包含本发明质粒标准分子的克隆菌液，常规方法提取质粒，即为本发明质粒标准分子。

所构建质粒标准分子的特性：使用紫外分光光度计检测质粒DNA的纯度，OD260/OD280>1.7；质粒浓度平均达到112.25μg/ml，符合后续实验标准。对所提质粒DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，结果表明：所得质粒不含有菌体基因组以及降解的质粒DNA和RNA。

实施例2本发明质粒标准分子的适用性验证

质粒标准分子的适用性实验：构建的质粒分子适合何种转基因检测方法作为阳性对照样品适用。实验时，选取构建此质粒时所对应的转基因检测方法，对质粒模板进行扩增。可以获得较好的扩增曲线表明此质粒可以作为此检测方法的阳性对照样品。

本发明质粒标准分子的适用性实验分别采用构建质粒以及待检转基因品系的基体标准物质为模板，采用构建质粒时所采用的转基因检测方法（即构建特异性检测）对质粒模板进行扩增。其具体的扩增反应体系见表4。

表4、Realtime PCR反应体系

成分	单管加样体积(μl）	终浓度（μM）
			Taqman qPCR master mix	12.5	1×
上游引物	1.25	0.5
			下游引物	1.25	0.5
探针	0.5	0.2
			模板	2.5	-
ddH2O	7
			总体积	25

Realtime PCR扩增条件如下：

50℃,2min;

95℃,10min;

95℃,30s，59℃,1min，40个循环。

所用引物如下：

针对内标准基因zSSIIb的引物对如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，其探针如SEQ ID No.9所示；针对BT176构建特异性序列的引物对如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，其探针如SEQ ID No.10所示。Realtime PCR扩增曲线如图2所示，结果显示：以本发明质粒DNA或转基因玉米BT176基因组为模板，进行内标准基因zSSIIb和构建特异性序列的PCR扩增，均可以获得较好的扩增曲线，表明本发明质粒可以用于转基因玉米BT176构建特异性检测的阳性标准品。

实施例3本发明质粒标准分子的特异性验证

实验时，选取品系相关的其他转基因品系的检测方法对所构建的阳性质粒进行扩增，无扩增信号，说明此质粒的特异性较好；本发明选用转基因玉米GA21,MON810，BT11作为转基因玉米BT176品系相关的其它转基因品系，以验证本发明质粒标准分子的特异性。

以本发明质粒标准分子为模板，分别使用转基因玉米品系GA21、MON810或BT11相应的检测引物或探针对其进行Realtime PCR扩增，扩增体系和条件采用实施例2所述扩增体系和条件，其结果如图3、图4、图5所示；相应的转基因玉米基因组DNA为模板的Realtime PCR扩增，作为阳性扩增对照。

所述转基因玉米GA21的PCR扩增引物如SEQ ID No.11和SEQID No.12所示，其探针如SEQ ID No.13所示；

所述转基因玉米MON810的PCR扩增引物如SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示，其探针如SEQ ID No.16所示；

所述转基因玉米BT11的PCR扩增引物如SEQ ID No.17和SEQID No.18所示，其探针如SEQ ID No.19所示；

结果表明，以转基因玉米GA21、MON810、BT11的引物、探针对本发明质粒标准分子进行扩增，未见扩增信号；提示我们：本发明质粒标准分子不能作为转基因玉米GA21、MON810、BT11检测时的阳性对照质粒，具有较高的特异性。

实施例4本发明质粒标准分子的灵敏度验证

将构建好的质粒标准分子从1×10⁵copies/μl梯度稀释为2×10⁴copies/μl、1×10⁴copies/μl、2×10³copies/μl、1×10³copies/μl、200copies/μl、20copies/μl、5copies/μl，以上述浓度梯度的质粒DNA为模板分别进行内标准基因zSSIIb、BT176构建特异性序列的定量PCR扩增，扩增体系和条件采用实施例2所述扩增体系和条件，每个反应重复三次；以标准质粒浓度的对数值(logC0)为横坐标，扩增zSSIIb基因或BT176构建特异性序列的Ct值为纵坐标绘制标准曲线；标准曲线如图6所示，其回归方程分别为：

zSSIIb：Ct=-3.45logC0+39.29，R2=0.99；

BT176：Ct=-3.38logC0+37.79，R2=0.99。

结论：使用本发明质粒标准分子建立的标准曲线，体现了良好的线性，R²值均达到0.98以上，扩增效率在90%-110％之间。并且，质粒在1×10⁵copies/μl到5copies/μl的浓度范围内具有很好的线性关系。质粒的检测下限的绝对值可以达到12.5拷贝，在12.5拷贝时候的Ct值为35.77±0.61。

实施例5本发明质粒标准分子的均一性验证

在质粒的制备过程中，我们使用OMEGA质粒大提试剂盒。提取后的质粒使用紫外分光光度计检测纯度和浓度，之后出于对DNA定量的准确性考虑，我们采用荧光染料Picogreen的方法对质粒DNA进行定量。然后按照实际使用浓度对质粒进行分装，约为10⁶copy/管（根据实际定量结果计算精确的拷贝数)。构建成的质粒由于分装浓度过低，容易降解以及吸附到容器壁中等原因，我们在制备的质粒中添加了背景DNA（环化的pEASY-T3载体），终浓度为1ng/μL，并且使用AxygenHigh recovery试管分装质粒DNA。制备的质粒一共分装300管，每管500μL，存放于-70℃。从这300管中随机抽取10管，使用双重荧光定量PCR对抽检样品分别进行外源基因（BT 176构建特异性序列）片段和内源基因（zSSIIb基因)片段的检测，最小取样量5μL，外源基因对应CT值除以内源基因对应CT值来比较两个基因的均一性。

使用One-way ANOVA分析检测结果，F值为1.876，P=0.141>0.05,无显著差异，说明BT176质粒分子具有一定的均一性。

实施例6本发明质粒标准分子的稳定性验证

将制备好的质粒以100μl/管分装入艾本德公司0.2ml的PCR管，分别储存于4℃、25℃、37℃、-20℃、-70℃，于第0、3、7、14、21、28天进行短期稳定性检测。每个温度储存5管，使用Realtime PCR验证质粒的稳定性，每管重复3次。扩增反应体系和条件采用实施例2所述扩增体系和条件。结果如图7所示。结果显示，质粒分子在-20℃下储存28天后具有较好的稳定性。而在37℃，因为温度较高，水分挥发，会对质粒分子的含量存在一定的影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种转基因玉米BT176检测用质粒标准分子，其特征在于，将玉米内标准基因zSSIIb特异性序列、转基因玉米BT176的构建特异性序列依次构建到质粒载体中而得；所述玉米内标准基因zSSIIb特异性序列如SEQ ID No.1所示，所述转基因玉米BT176的构建特异性序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的质粒标准分子，其特征在于，所述质粒载体为pEASY-T3载体。

3.如权利要求1所述质粒标准分子的制备方法，其特征在于，将SEQ ID No.1所示核苷酸序列和SEQ ID No.2所示核苷酸序列经重叠PCR法连接起来，并将连接产物构建到质粒载体上，获得权利要求1所述质粒标准分子。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述SEQ ID No.1所示核苷酸序列由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列组成的引物对，扩增转基因玉米BT176阳性标准品而得。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述SEQ ID No.2所示核苷酸序列由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列组成的引物对，扩增转基因玉米BT176阳性标准品而得。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述质粒载体为pEASY-T3载体。

7.如权利要求3所述的制备方法，其具体步骤如下：

（1）由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列组成的引物对，扩增转基因玉米BT176阳性标准品，得SEQ ID No.1所示核苷酸序列的扩蹭产物；

（2）由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列组成的引物对，扩增转基因玉米BT176阳性标准品，得SEQ ID No.2所示核苷酸序列的扩蹭产物；

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述重叠PCR的引物对序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.6所示。

9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）和步骤(2）还包括对所得扩增产物进行鉴定的步骤，其具体步骤如下：将所得扩增产物构建到质粒载体上，获得含有该扩增产物的中间质粒分子；将上述中间质粒分子转化感受态菌株、测序鉴定；对测序正确的中间质粒分子进行PCR扩增，以获得SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示核苷酸序列的扩增产物。