CN108373997B - 一种pMKRN1基因敲除的猪体细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种pMKRN1基因敲除的猪体细胞及其制备方法和应用，采用基因敲除技术，获得突变的PK‑15细胞，利用此突变的PK‑15细胞可快速复制并获得高滴度的PCV2病毒，进而为PCV2致病机制研究和PCV2灭活疫苗和减毒疫苗制备提供高效的病毒扩增细胞。

Description

一种pMKRN1基因敲除的猪体细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及猪圆环病毒2型(PCV2)毒株快速扩增细胞株的建立，具体涉及敲除pMKRN1的猪体细胞的构建。

背景技术

猪圆环病毒相关性疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)是由猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)引起的，主要包括猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、仔猪传染性先天性震颤(congenital tremors,CT)和断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemicwasting syndrome,PMWS)等多种疾病。虽然PCV2能在PK-15细胞中复制，但是复制效率相对较低，这不仅给PCV2致病机制研究带来了较大的困难，而且给PCV2疫苗株的生产带来了极大的困难，造成了PCV2疫苗的高生产成本。因此，获得一株能够显著提高PCV2复制能力的细胞株是目前研究PCV2致病机制和疫苗生产亟待解决的关键问题。

研究表明，人的MKRN1对包括病毒蛋白在内的多种底物蛋白具有E3泛素连接酶的作用。但对于PCV2而言，目前仅报道了PCV2在PK-15细胞中与porcine MKRN1(pMKRN1)结合。pMKRN1结合后对于PCV2的主要结构蛋白成分，即其衣壳蛋白(Cap)有怎样的作用，带来怎样的影响，并未得到研究。PCV2的Cap是由234个氨基酸(aa)组成的单肽链蛋白，其具体氨基酸序列可以参考“Ultrasensitive Detection of RNA and DNA Viruses SimultaneouslyUsing Duplex UNDP-PCR Assay”，其包含11个赖氨酸。目前发现的PCV2毒株主要包括2a亚型、2b亚型等，比对分析2a亚型与2b亚型发现164位和179位的赖氨酸高度保守，191位氨基酸不同。

发明内容

本发明的目的在于提供一种pMKRN1基因敲除的猪体细胞及其制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种基因敲除细胞，该细胞为pMKRN1基因敲除的猪体细胞。

优选的，所述猪体细胞选自pMKRN1基因敲除的PK-15细胞。

优选的，PCV2病毒在所述猪体细胞内不被泛素化蛋白酶体途径所降解。

优选的，所述猪体细胞是利用CRISPR-Cas9系统完成基因敲除的。

优选的，所述CRISPR-Cas9系统用于靶向pMKRN1基因组的gRNA的序列如下所示：

gRNA64-oligo1：5'-CAGTCACCTCCCCGTCCCCG-3'(SEQ.ID.NO.5)；

gRNA64-oligo 2：5'-CGGGGACGGGGAGGTGACTG-3'(SEQ.ID.NO.6)。

优选的，所述CRISPR-Cas9系统用于靶向pMKRN1基因组的gRNA的序列如下所示：

gRNA266-oligo1：5'-CACCGTATGGACTGTCAGAG-3'(SEQ.ID.NO.7)；

gRNA266-oligo2：5'-CTCTGACAGTCCATACGGTG-3'(SEQ.ID.NO.8)。

上述基因敲除细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)制备CRISPR/Cas9系统靶向pMKRN1的gRNA(优选序列如上所示)；

2)利用gRNA构建重组慢病毒载体，然后包装为重组慢病毒；

3)将重组慢病毒感染猪体细胞(例如，PK-15细胞)，然后筛选感染的阳性细胞克隆；

4)通过对所述细胞克隆进行鉴定，得到pMKRN1敲除的猪体细胞，可称之为“突变细胞”。

上述基因敲除细胞在制备PCV2病毒中的应用。

本发明的有益效果体现在：

本发明基于对pMKRN1(Porcine MKRN1)蛋白能够对猪圆环病毒2型(PCV2)毒株Cap的三个氨基酸位点(即164K,179K,191K)发挥其泛素连接酶作用的发现。通过对猪体细胞MKRN1(pMKRN1)的基因敲除，在此突变细胞感染PCV2，即可实现PCV2快速复制，获得高滴度的PCV2病毒，本发明为PCV2致病机制研究和PCV2灭活疫苗和减毒疫苗制备提供高效的病毒扩增细胞，有助于更好的研究PCV2的致病机制和更高效地扩增PCV2疫苗毒株。

附图说明

图1为pMKRN1和PCV2Cap的PCR和双酶切鉴定结果；其中：A为pMKRN1的PCR产物鉴定；B为Cap的PCR产物鉴定；C为不带Flag标签的pMKRN1的真核表达载体的双酶切鉴定；D为不带Flag标签的Cap的真核表达载体的双酶切鉴定；数字1～4为泳道编号，M为DNA MarkerDL5000/2000。

图2为pMKRN1稳定表达细胞系的鉴定结果；其中：泳道1为PK-15细胞，泳道2为转染pCI-neo的细胞，泳道3为转染Flag-pMKRN1-pCI的细胞；β-actin为内参，Flag-pMKRN1为带Flag标签的pMKRN1。

图3为pMKRN1稳定表达细胞系中Cap蛋白表达的检测结果；其中：泳道1为PK-15细胞，泳道2为转染pCI-neo的细胞，泳道3为转染Flag-pMKRN1-pCI的细胞。

图4为重组慢病毒载体的鉴定结果；其中：M为DNA Marker DL15000，泳道1为Re-LentiCRISPR-sgRNA1(64)，泳道2为Re-LentiCRISPR-sgRNA2(266)，泳道3为Re-LentiCRISPR-sgRNA3(2211)。

图5为基因敲除细胞western blotting鉴定结果；其中：泳道1为野生型PK-15细胞，泳道2为pMKRN1(64)细胞，泳道3为pMKRN1(266)细胞，泳道4为pMKRN1(2211)细胞；β-actin为内参。

图6为基因敲除细胞的基因组测序结果；其中：A为pMKRN1(64)细胞，B为pMKRN1(266)细胞，C为pMKRN1(2211)细胞。

图7为pMKRN1敲除细胞中Cap蛋白表达的检测结果；其中：2211PK^mkrn1+/+为pMKRN1未敲除的细胞，64PK^mkrn1+/+为pMKRN1敲除细胞，β-actin为内参。

图8为pMKRN1介导Cap蛋白的泛素化结果；其中：Input表示裂解产物对照，IP表示免疫沉淀；HA-(Ub)n表示Cap蛋白结合n个带HA标签的ub分子；β-actin为内参。

图9为pMKRN1敲除细胞中PCV2Cap蛋白表达的western blotting检测结果。

图10为pMKRN1敲除细胞中PCV2复制水平的荧光定量PCR检测结果；其中：64PK15^mkrn1+/+为pMKRN1敲除细胞。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。所述实施例是对本发明的解释，而不是限定。

本发明通过将porcine MKRN1(pMKRN1)与PCV2Cap共表达检测pMKRN1对Cap降解的作用；同时构建pMKRN1过表达细胞及敲除细胞系验证pMKRN1对PCV2Cap降解的作用，利用敲除细胞实现PCV2病毒在宿主(例如PK-15细胞)中高速复制。

(一)pMKRN1和PCV2Cap真核表达载体的构建

设计pMKRN1和PCV2Cap的扩增引物：

pMKRN1上游引物P1：5'-CCGCTCGAGATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGCATGGGGTTTGTAAGGAAG-3'(下划线位置表示Xhol限制性内切酶识别序列，斜体位置表示Flag标签)；

pMKRN1下游引物P2：5'-GCTCTAGACTATAGATCCAAGTCATAAAAGTCT-3'(下划线位置表示Xbal限制性内切酶识别序列)；

Cap上游引物P3：5'-CCGCTCGAGATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGACGTATCCAAGGAGGCGTTA-3'(下划线位置表示Xhol限制性内切酶识别序列，斜体位置表示Flag标签)；

Cap下游引物P4：5'-CCCAAGCTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3'(下划线位置表示HindIII限制性内切酶识别序列)；

以PK-15细胞(ATCC)的cDNA(提取细胞总RNA反转录获得)和PCV2病毒DNA(2b亚型，GenBank No.EU366323)为模板(病毒是从采集的2010-2012年的组织样品中分离得到，采集地点：陕西省宝鸡、延安及咸阳；PK-15细胞购买于2009年7月)，分别PCR扩增带有或不带Flag的pMKRN1读码框和带有或不带Flag的Cap读码框，PCR产物经电泳后分别用胶回收试剂盒回收，用限制性内切酶双酶切目的基因和对应真核表达载体，然后将目的基因pMKRN1(带Flag标签或者不带Flag标签)连接到pCI-neo载体(Promega)上，将Cap(带Flag标签或者不带Flag标签)连接到pcDNA3.1载体(Biovector)或者pEGFP-N1载体(Biovector)上，转化大肠杆菌感受态DH5a(TAKARA)，37℃过夜培养后，挑取单克隆，37℃摇床摇菌12h，质粒提取试剂盒提取质粒，提取的质粒用PCR鉴定和双酶切鉴定，鉴定正确后送上海生工生物科技有限公司进行测序，测序正确后命名为Flag-pMKRN1-pCI(由pCI-neo载体和带Flag标签的pMKRN1连接而成)、pMKRN1-pCI(由pCI-neo载体和不带Flag标签的pMKRN1连接而成)、GFP-Cap(由pEGFP-N1载体和不带Flag标签的Cap连接而成)、Flag-Cap(由pcDNA3.1载体和带Flag标签的Cap连接而成)、pcDNA-Cap(由pcDNA3.1载体和不带Flag标签的Cap连接而成)，结果如图1所示。

由图2看出，利用western blotting方法可检测到pMKRN1于PK-15细胞中过表达，即利用上述构建的真核表达载体可以得到稳定表达细胞系。由图3看出，在pMKRN1稳定表达细胞系中共转染pcDNA-Cap和pEGFP-N1表达载体后，pMKRN1的表达可降低Cap蛋白的表达，而绿色荧光蛋白(GFP)的表达量没有变化。

进一步的研究发现，PCV2病毒的Cap可以与pMKRN1介导的ub分子结合，发生泛素化蛋白酶体途径的降解，具体结合并介导降解的位置位于164K、179K、191K。

(二)pMKRN1敲除细胞系的构建

1、重组慢病毒载体的构建

设计CRISPR/Cas系统靶向pMKRN1的三对gRNA，gRNA引物序列分别为(设计完成时间：2014年10月)：

gRNA64-oligo1：5'-CAGTCACCTCCCCGTCCCCG-3'；

gRNA64-oligo 2：5'-CGGGGACGGGGAGGTGACTG-3'；

gRNA266-oligo1：5'-CACCGTATGGACTGTCAGAG-3'；

gRNA266-oligo2：5'-CTCTGACAGTCCATACGGTG-3'

gRNA2211-oligo1：5'-AACACTGCAACCAGGCAGGG-3'；

gRNA2211-oligo 2：5'-CCCTGCCTGGTTGCAGTGTT-3'。

分别将三对引物用T4PNK磷酸化，37℃反应30min，然后将以上磷酸化的引物100℃水浴10min，待自然冷却后用ddH₂O按照1:200的比例稀释。用BsmbⅠ酶切慢病毒载体(addgene：#52961)，胶回收约11000bp条带，将三对引物分别与线性化的慢病毒载体于16℃连接过夜，转化至stbl3感受态细胞(TAKARA)中，37℃过夜培养后，挑取单克隆，37℃摇床摇菌12h，质粒提取试剂盒提取质粒，提取的质粒用双酶切鉴定(ECORI和NotI)，结果如图4所示，鉴定正确后送上海生工生物科技有限公司进行测序，测序正确后命名为重组慢病毒载体Re-LentiCRISPR-sgRNA1(64)、Re-LentiCRISPR-sgRNA2(266)、Re-LentiCRISPR-sgRNA3(2211)。

2、重组慢病毒的包装

将293T细胞(ATCC)正常传代培养。计数板计数后铺在6孔板中，使每个孔中细胞数达到5×10⁵个。按照Lipofectamine^TM 2000试剂盒操作说明，采用脂质体法分别将2.5μg重组慢病毒载体Re-LentiCRISPR-sgRNA1(64)、Re-LentiCRISPR-sgRNA2(266)、Re-LentiCRISPR-sgRNA3(2211)与包装混合质粒即2μg的psPAX2(Addgene)和1.5μg的pMD2.G(Addgene)转染293T细胞，转染6h后弃掉上层清液，加入2mL含10％FBS的DMEM。72h后收获上清液，在常温下以3000g速度离心20min，再用0.45μm的滤膜过滤，取上层清液并弃掉细胞沉淀。将病毒上清分装，并于﹣80℃贮存，获得3组重组慢病毒，分别命名为Re-LentiCRISPR-Sg1(64)、Re-LentiCRISPR-Sg2(266)、Re-LentiCRISPR-Sg3(2211)。

3、基因敲除细胞的筛选

将PK-15细胞正常传代铺在24孔板上，每孔5×10⁴个细胞，待贴壁后弃掉培养基，用PBS洗涤2次后加入重组慢病毒感染，8-12h后更换培养基。48h后加入含有5μg/mL嘌呤霉素的含血清培养基培养感染后的PK-15细胞。每2天换一次新鲜的含有5μg/mL的嘌呤霉素的含血清培养基，直到感染的细胞克隆(Clone)长出，得到抗嘌呤霉素细胞。将细胞消化后转至96孔板内，使每孔1个细胞，待抗嘌呤霉素细胞长满后扩大培养并冻存备用。共获得3株细胞，分别命名为pMKRN1(64)、pMKRN1(266)、pMKRN1(2211)。

4、基因敲除细胞的western blotting鉴定

分别将3株细胞正常传代，收集细胞，1000rpm离心5min，用RIPA细胞裂解液冰上裂解细胞30min，用BCA试剂盒检测蛋白浓度后进行SDS-PAGE，并转至PVDF膜，用MKRN1特异性抗体(Bethyl Laboratories)检测表达，其中pMKRN1(64)和pMKRN1(266)细胞的pMKRN1敲除成功，pMKRN1(2211)细胞的pMKRN1仍正常表达，检测结果如图5所示。

5、基因敲除细胞的基因组测序鉴定

分别将3株细胞，按照细胞DNA提取试剂盒(离心柱型)提取细胞总DNA，以提取的DNA为模板，利用基因组DNA检测引物进行PCR扩增。

引物序列分别为：

pMKRN1-64-F：5'-TACTTGCACACTACACCGTA-3'；

pMKRN1-64-R：5'-GCTCTAGAAGCCGCGGCGAGAGC-3'；

pMKRN1-266-F：5'-CGGAATTCCAGAGGTAAGTGGGGCCTTG-3'；

pMKRN1-266-R：5'-GCTCTAGACCCACGACGGAAGTCAGAAA-3'；

pMKRN1-2211-F：5'-CGGAATTCATTGCACACAAGTAATA-3'；

pMKRN1-2211-R：5'-GCTCTAGACTGGAAAGGCCGAGGGG-3'。

将PCR产物电泳后回收，连接至PGEM-T-easy载体(Promega)，送上海生工生物科技有限公司测序鉴定。其中pMKRN1(64)细胞基因组插入一段未知序列(图6A中框内)，pMKRN1表达提前终止；pMKRN1(266)细胞基因组缺失2个碱基(图6B中框内)，导致pMKRN1表达提前终止；而pMKRN1(2211)细胞基因组序列与野生型(WT)细胞完全一致(图6C)。

(三)pMKRN1介导Cap蛋白的降解及泛素化

1.pMKRN1敲除增加Cap蛋白的表达

在pMKRN1敲除的细胞中共转染pcDNA-Cap和pEGFP-N1表达载体，分别在24h和48h收集细胞，用western blotting检测蛋白表达，结果显示(图7)，与野生型细胞(PK-15)和pMKRN1未敲除的细胞(例如，pMKRN1(2211)细胞)相比，pMKRN1敲除细胞(例如，pMKRN1(64)细胞)中Cap的表达量在24h和48h明显增加，而GFP的表达量没有明显差异。

2.pMKRN1介导Cap蛋白的泛素化

在pMKRN1敲除细胞中共同转染pMKRN1-pCI、HA-Ub(Addgene)、Flag-Cap质粒，并用10μM的MG132(Sigma-Aldrich)处理细胞6h，收集细胞，用NP-40裂解液(碧云天)冰上裂解细胞30min，取上清与proteinG琼脂悬液(Santa Cruz)共孵育进行杂蛋白的预清除，4℃、6000rpm离心15min，取上清移至新的离心管，加入Flag单抗(Sigm a-Aldrich)作为捕获抗体，置于4℃轻摇混匀过夜使之充分形成混合物，将此混合物加入100μL含50％proteinG琼脂悬液中室温孵育1h，用微量离心机瞬离弃上清，然后用预冷PBS洗3遍，加入2×SDS上样缓冲液(索莱宝)煮10min，最后4℃、12000rpm离心10min，取上清进行SDS-PAGE，用泛素ub单抗(Cell Signalling Technology)做western blotting(简称WB)，检测泛素化的Cap。结果如图8所示，可以看出，Cap蛋白能与多个ub分子结合。

(四)感染实验

将野生型PK-15细胞和pMKRN1敲除的PK-15细胞(例如，pMKRN1(64)细胞)铺到6孔板中，每孔5×10⁵个细胞，待细胞贴壁后分别接种1MOI PCV2，24、48、72hpi用westernblotting检测病毒Cap蛋白的表达量的变化，同时用定量PCR检测病毒拷贝数的变化。

从图9看出，在敲除细胞(例如，pMKRN1(64)细胞)中Cap蛋白的表达量在PCV2感染后24、48和72h高于在野生型细胞(PK-15)中的表达量；从图10看出，PCV2在敲除细胞(例如，pMKRN1(64)细胞)中的拷贝数在感染后24、48和72h显著高于在野生型PK-15细胞中的拷贝数。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种pMKRN1基因敲除的猪体细胞及其制备方法和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> pMKRN1上游引物P1()

<400> 1

ccgctcgaga tggattacaa ggatgacgac gataagcatg gggtttgtaa ggaag 55

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> pMKRN1下游引物P2()

<400> 2

gctctagact atagatccaa gtcataaaag tct 33

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> Cap上游引物P3()

<400> 3

ccgctcgaga tggattacaa ggatgacgac gataagacgt atccaaggag gcgtta 56

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Cap下游引物P4()

<400> 4

cccaagctta gggttaagtg gggggtc 27

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> gRNA64- oligo1

<400> 5

cagtcacctc cccgtccccg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> gRNA64- oligo 2

<400> 6

cggggacggg gaggtgactg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> gRNA266- oligo1

<400> 7

caccgtatgg actgtcagag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> gRNA266- oligo2

<400> 8

ctctgacagt ccatacggtg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> gRNA2211- oligo1

<400> 9

aacactgcaa ccaggcaggg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> gRNA2211- oligo 2

<400> 10

ccctgcctgg ttgcagtgtt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> pMKRN1-64-F

<400> 11

tacttgcaca ctacaccgta 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> pMKRN1-64-R

<400> 12

gctctagaag ccgcggcgag agc 23

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> pMKRN1-266-F

<400> 13

cggaattcca gaggtaagtg gggccttg 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> pMKRN1-266-R

<400> 14

gctctagacc cacgacggaa gtcagaaa 28

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> pMKRN1-2211-F

<400> 15

cggaattcat tgcacacaag taata 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> pMKRN1-2211-R

<400> 16

gctctagact ggaaaggccg agggg 25

Claims (5)

1.一种基因敲除细胞，其特征在于：该细胞为pMKRN1基因敲除的猪体细胞，所述猪体细胞是利用CRISPR/Cas9系统完成基因敲除的，所述CRISPR/Cas9系统用于靶向pMKRN1基因的gRNA的序列如SEQ.ID.NO.5及SEQ.ID.NO.6所示。

2.根据权利要求1所述一种基因敲除细胞，其特征在于：所述猪体细胞选自pMKRN1基因敲除的PK-15细胞。

3.根据权利要求1所述一种基因敲除细胞，其特征在于：PCV2病毒在所述猪体细胞内不被泛素化蛋白酶体途径所降解。

4.一种如权利要求1所述的基因敲除细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)制备CRISPR/Cas9系统靶向pMKRN1基因的gRNA，所述CRISPR/Cas9系统用于靶向pMKRN1基因的gRNA的序列如SEQ.ID.NO.5及SEQ.ID.NO.6所示；

2)利用gRNA构建重组慢病毒载体，然后包装为重组慢病毒；

3)将重组慢病毒感染猪体细胞，然后筛选感染的阳性细胞克隆；

4)通过对所述细胞克隆进行鉴定，得到pMKRN1敲除的猪体细胞。

5.一种如权利要求1所述的基因敲除细胞在制备PCV2病毒中的应用。

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