WO2023234407A1 - 経口ワクチン組成物 - Google Patents

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WO2023234407A1
WO2023234407A1 PCT/JP2023/020590 JP2023020590W WO2023234407A1 WO 2023234407 A1 WO2023234407 A1 WO 2023234407A1 JP 2023020590 W JP2023020590 W JP 2023020590W WO 2023234407 A1 WO2023234407 A1 WO 2023234407A1
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porcine circovirus
oral
pupa
cells
protein
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建太 大和
雅浩 谷口
洋和 中武
啓一 江崎
宜宏 日下部
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Kaico株式会社
国立大学法人九州大学
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Definitions

  • the present invention relates to an oral vaccine composition for porcine circovirus-related diseases and a method for producing the same.
  • Porcine circovirus-related diseases are diseases caused by porcine circovirus type 2 (PCV2).
  • PCV2 porcine circovirus type 2
  • the most common period of onset is between 7 and 16 weeks of age, and symptoms include loss of energy, poor growth, thinning, difficulty breathing, swollen lymph nodes on the body surface, jaundice, and miscarriage. Therefore, it is necessary for pig farmers and veterinarians to develop effective prevention or treatment methods for porcine circovirus-related diseases.
  • baculovirus is a nuclear polyhedrovirus (NPV) that infects insects as its main host, and during the growth process it produces a crystalline protein called polyhedrin in the nucleus of infected cells.
  • NDV nuclear polyhedrovirus
  • one method for producing a target protein using the baculovirus-silkworm system is to introduce a gene encoding the target protein into baculovirus and inoculate silkworm larvae or pupae with the recombinant baculovirus.
  • There is a method of causing silkworms to produce a target protein Non-Patent Document 1). Producing proteins using the baculovirus-silkworm system in this way is useful in that the target protein can be produced in large quantities.
  • the present inventors have surprisingly found that immunogenicity can be maintained by infecting silkworm pupae with a recombinant baculovirus into which DNA encoding the PCV2 protein has been introduced, followed by freeze-drying. , we have completed the present invention.
  • the present invention is as follows, for example.
  • Vaccine composition [2] The oral vaccine composition according to [1], wherein the DNA encoding the porcine circovirus type 2 protein is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the porcine circovirus-related disease is at least one selected from the group consisting of post-weaning multisystem failure syndrome, porcine dermatitis nephropathy syndrome, porcine respiratory complex infection, and reproductive disorders [1] Oral vaccine compositions as described. [6] Infecting the larva or pupa of a baculovirus-infective insect with a recombinant baculovirus into which DNA encoding the porcine circovirus type 2 protein has been introduced, and the pupa that pupates from the infected larva or the infected pupa.
  • a method for producing an oral vaccine against a porcine circovirus-related disease comprising the step of freeze-drying the subsequent pupa.
  • Porcine circovirus-related including the step of infecting baculovirus-infectious cells with a recombinant baculovirus into which DNA encoding porcine circovirus type 2 protein has been introduced, and lyophilizing the infected cells.
  • a method for producing an oral vaccine against a disease [8] The oral vaccine composition according to [6] or [7], wherein the DNA encoding the porcine circovirus type 2 protein is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the method according to [6], wherein the insect is a silkworm.
  • the present invention provides an oral vaccine composition for porcine circovirus-related diseases and a method for producing the same.
  • the manufactured vaccine composition for oral administration can be used for administration as it is, and therefore can be included in, for example, pig feed.
  • FIG. 3 shows an attack test design.
  • FIG. 2 is a diagram showing changes in PCV2 virus genome copy number in serum.
  • FIG. 2 is a diagram showing the PCV2 virus genome copy number in organs. It is a figure showing the transition of weight change. It is a figure showing the antibody titers of IgG and IgA in the colostrum of a sow at the time of parturition. It is a figure showing the antibody titers of IgG and IgA in the serum of piglets at 1 day of age.
  • FIG. 4 is a diagram showing a comparison of body weight gain from virus challenge to 4 weeks (at the end of the test).
  • FIG. 3 is a diagram showing the time course of the PCV2 gene amount after virus attack.
  • FIG. 2 is a diagram showing the change in the amount of antigen-specific IgG antibodies from the start of immunization to before virus challenge.
  • FIG. 3 is a diagram showing the time course of antigen-specific IgG antibody responses.
  • DNA encoding the porcine circovirus type 2 (PCV2) protein is introduced into the pupa or cells of a baculovirus-infected insect, and the pupa or cells of a recombinant baculovirus-infected insect into which the DNA has been introduced are
  • PCV2 porcine circovirus type 2
  • the present invention provides an oral vaccine against porcine circovirus-related diseases, which comprises pupae or cells of baculovirus-infected insects that have been infected and/or freeze-dried with a recombinant baculovirus into which DNA encoding the PCV2 protein has been introduced.
  • a composition is provided.
  • Recombinant baculoviruses include infection treatments, freeze-drying, and combinations of both.
  • the present invention infects the larva or pupa of a baculovirus-infectious insect with a recombinant baculovirus into which DNA encoding the PCV2 protein has been introduced, and the pupa that pupates from the larva after the infection, or the pupa after the infection
  • a method for producing an oral vaccine against a porcine circovirus-related disease comprising the step of freeze-drying a pupa.
  • the present invention provides a method for treating porcine circovirus-related diseases, which comprises a step of infecting baculovirus-infectious cells with a recombinant baculovirus into which DNA encoding the PCV2 protein has been introduced, and lyophilizing the infected cells.
  • a method for producing an oral vaccine is provided.
  • examples of the antigen include circovirus antigens such as porcine circovirus antigen (PCV). More specific examples of antigenic proteins include ORF2 (1-233) of porcine circovirus type 2 (PCV2) isolate PCV2a (GenBank accession #AF055392), or PCV2 KU08-1 strain (PC V2a :GenBank accession number, LC381288, etc.
  • PCV2a porcine circovirus type 2
  • PCV2a GenBank accession #AF055392
  • PCV2 KU08-1 strain PC V2a :GenBank accession number, LC381288, etc.
  • the base sequence of the DNA described in the above accession number can be optimized to silkworm codon. The base sequence optimized from the base sequence of accession number LC381288 The sequence is shown in SEQ ID NO:1.
  • the size of the antigen is not particularly limited, and may be, for example, 5 to 1000 kDa, 10 to 500 kDa, or 30 to 200 kDa.
  • Immunogenicity refers to the property of an antigen to induce antibody production or cell-mediated immunity. The presence or absence of immunogenicity can be evaluated, for example, by the presence or absence of antibody production after antibody administration. Expression of antibodies can be confirmed by methods known to those skilled in the art, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blotting, immunoprecipitation, flow cytometry, and immunohistochemistry.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the DNA encoding the PCV2 protein can be introduced into baculovirus by methods known to those skilled in the art, such as those described by Maeda et al., Nature 315, 592-594 (1985), Y. Matsuura et al. ., Virology, (1989) 173, 674-682, etc.
  • the above DNA (including cDNA) is cloned and incorporated into a baculovirus transfer vector to obtain a recombinant baculovirus transfer vector.
  • recombinant baculovirus DNA is obtained by homologous recombination or transposon transfer.
  • This recombinant baculovirus DNA is introduced into cultured insect cells by a known method such as lipofection to obtain a recombinant baculovirus.
  • a baculovirus transfer vector is obtained by subcloning a DNA fragment containing the polyhedrin gene of baculovirus genomic DNA into a plasmid, and can be created by a known method, or a commercially available vector can be used.
  • Commercially available vectors include, for example, pAcYM1, pAcG2T, pAcGP67, and VL1392 (all manufactured by Pharmingen), and pDEST8 (invitrogen).
  • the types of baculoviruses used to produce recombinant baculoviruses include Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcNPV), Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), and Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV). ), Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus (OpNPV), Lymantria disper multiple nucleopolyhedrovirus (LdNPV), etc., and it is a Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV). is preferred.
  • AcNPV Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus
  • BmNPV Bombyx mori nucleopolyhedrovirus
  • BmNPV Bombyx mori nucleopolyhedrovirus
  • BmNPV Bombyx mori nuclear poly
  • recombinant baculoviruses are used to infect larvae or pupae of baculovirus-infected insects or baculovirus-infective cells (these are also collectively referred to as "hosts").
  • Host insects include Lepidoptera insects, and are not particularly limited as long as they are suitable for protein expression and have baculovirus infectivity, such as Spilosoma imparilis, Antheraea pernyi, Examples include silkworm (Bombyx mori) and armyworm moth (Spodoptera frugiperda). Insects may be in either pupal or larval form.
  • the host cell is not particularly limited as long as it is a baculovirus-infectious cell line suitable for protein expression.
  • baculovirus infectivity means that baculovirus can infect, and one of the characteristics of baculovirus infectivity is that a glycoprotein called GP64 is expressed on the cell surface. can be mentioned. Therefore, the type of cell is not limited as long as it has such properties, and examples include cultured cells such as insect cells.
  • Insect cells include the following: Cells derived from Spilosoma imparilis: SpIm Cells derived from Antheraea pernyi: Anpe Silkworm (Bombyx mori) derived cells: BmN, BmN4, Oyanagi-2, Bme21 Spodoptera frugiperda-derived cells: Sf9, Sf21
  • a method for infecting a host insect or cell with a recombinant baculovirus can be performed by a method known to those skilled in the art.
  • the recombinant baculovirus obtained in the above step is injected into pupae or larvae.
  • a solution containing the recombinant baculovirus may be added to the cell culture medium.
  • the antigen protein is expressed in the host insect or host cell.
  • the target protein In the case of production of a target protein using the conventional baculovirus-silkworm system, after the target protein is expressed in the body of a silkworm pupa or larva infected with a recombinant baculovirus, the pupae are crushed and suspended. Alternatively, the target protein is purified by collecting body fluid from the larva and performing various purifications. On the other hand, in the method of the present invention, there is no need to perform such extraction and purification of the target protein, and pupae or cells in which the PCV2 protein is expressed can be freeze-dried and then used as they are.
  • the timing for freeze-drying the pupa or cells of a host infected with a recombinant baculovirus is to ensure that a sufficient amount of PCV2 protein is present within the host (for example, inside the pupa of a silkworm). Preferably, after the is expressed. Furthermore, when larvae are infected with baculovirus, they are allowed to grow until they become pupae. Therefore, the timing of freeze-drying is after pupation if the infected silkworm is a larva, and if the infected silkworm is a pupa, freeze-drying can be performed at any time after infection.
  • Freeze-drying may be carried out without cutting or crushing the pupa infected with the recombinant baculovirus, while the pupa remains in its form, or after cutting or crushing the pupa.
  • the expressions "as is” and "using the pupa shape” mean using or containing the pupa substantially in the pupa shape, for example, without intending to , Even if a part of the pupa is missing during the manufacturing process, as long as 90% or more, 80% or more, 70% or more, 60% or more, or 50% or more of the pupa shape is maintained, the shape of the pupa can be maintained. It can be concluded that it remains the same.
  • Freeze-drying is a method of drying in a frozen state under reduced pressure (for example, maintained in a vacuum state). Freeze-drying can be performed by a method known to those skilled in the art, for example, using a commercially available freeze dryer.
  • the freezing treatment temperature can be appropriately set by those skilled in the art, and is, for example, -90°C to -5°C, -80°C to -10°C, or -50°C to -10°C.
  • the reduced pressure conditions can be adjusted appropriately by those skilled in the art, and are, for example, 2 Pa to 20 Pa, 3 Pa to 20 Pa, or 10 Pa to 20 Pa.
  • Freeze-drying time is, for example, 1 hour to 168 hours, preferably 8 hours to 96 hours. Further, in one embodiment of the present invention, the freeze-drying time is, for example, 8 hours to 36 hours.
  • Freeze-drying removes most of the water in pupae and cells, leaving them in a dry state.
  • the water contained in the pupa after freeze-drying is, for example, 1% by weight or less, 0.5% by weight or less, 0.1% by weight or less, 0.01% by weight or less, or 0.5% by weight or less, based on the total weight of the pupa or cells. 001% by weight or less. From the viewpoint of easily maintaining immunogenicity, it is preferable that the water content in the pupa is close to 0% by weight.
  • pupae or cells can be optionally subjected to liquid treatment, immersion treatment, light treatment, gas treatment, plasma treatment, heat treatment, or pressurized heat treatment.
  • the timing of liquid treatment, immersion treatment, light treatment, gas treatment, plasma treatment, heating or pressurized heating may be before or after freeze-drying, for example, after pupae and cells have been sufficiently dried by freeze-drying. preferable.
  • the step of freeze-drying the host infected with the recombinant baculovirus and the step of liquid treatment, immersion treatment, light treatment, gas treatment, plasma treatment, heat treatment or pressurized heat treatment are performed in succession, that is, freezing.
  • liquid treatment, immersion treatment, light treatment, gas treatment, plasma treatment, heat treatment, or pressurized heat treatment can also be performed without passing through other treatment steps.
  • the timing after freeze-drying is adjusted appropriately depending on the condition of the dried silkworm pupae, etc., but for example, within 1 to 24 hours after freeze-drying, such as within 24 hours, within 12 hours, within 3 hours, or within 1 hour. can be done. It is preferable that the freeze-dried pupa is subjected to liquid agent treatment, immersion treatment, light treatment, gas treatment, plasma treatment, heat treatment, or pressurized heat treatment without cutting or crushing the pupa.
  • the pupae and cells produced by this production method have immunogenicity. Therefore, in the present invention, there is no need to extract the PCV2 protein, and it can be used for oral administration as it is.
  • the freeze-dried pupa is dry and spongy, so by immersing it in liquid, the liquid can easily penetrate inside. Therefore, the manufacturing method according to the present embodiment may further include the step of immersing the freeze-dried pupa, or the pupa that has been subjected to pressure and heat treatment if necessary, in a liquid.
  • the liquid for permeation is preferably a solution containing an adjuvant, since this can easily improve the effectiveness of the vaccine. By immersing the freeze-dried pupa in a solution containing an adjuvant, the solution containing the adjuvant can easily penetrate into the inside of the pupa.
  • the freeze-dried cells When cultured cells are freeze-dried, a powder composition is obtained, so when cells are used, the freeze-dried cells may be immersed in a solution containing an adjuvant.
  • the pupae of the present production method may be mixed with other solids or liquids. For example, it is preferably a solid containing an adjuvant.
  • the pupae or cells produced according to the present invention may be used as they are, or may be used after being cut, crushed, or liquefied, or the crude extract may be collected from the pupae and then re-impregnated into the pupae. It may be used by being impregnated with it, or it may be used by mixing it with other solids. Examples of forms in which the pupae are used as they are include forms in which the pupae are orally administered as a vaccine, and forms in which the pupae are ingested as food.
  • Examples of forms in which pupae are cut or crushed and administered include those in which cut or crushed pupae are administered as is, crushed pupae mixed with other orally administrable materials, and crushed ones mixed in feed. Examples include forms in which it is ingested as food. For example, it may be cut into 1/2, 1/3, 1/4, etc. in order to adjust the dosage taking pupal immunogenicity into consideration.
  • the degree of crushing is not particularly limited as long as it exhibits immunogenicity; for example, it may be in powder form.
  • Cutting can be performed using, for example, food scissors or laboratory animal scissors, and crushing can be performed using, for example, a mixer, a hand mill, or a grinding device. When using cells, they can be treated in the same manner as when pupae were crushed.
  • Oral administration includes, for example, oral administration and sublingual administration. As used herein, administration also includes cases in which the pig ingests the drug itself. When administering the pupa as it is, intraoral administration is preferable, and it may be included in the feed so that the pigs can eat it themselves.
  • orally administrable additives include food materials, beverage materials, excipients, thickeners, stabilizers, preservatives, pH adjusters, sweeteners, colorants, emulsifiers, fragrances, and pharmaceutical additives described below. Examples include things. It can also be mixed with food or beverage materials and administered as a functional food or beverage.
  • the liquid containing the orally administrable material is not particularly limited as long as the pupa for oral administration has immunogenicity and is suitable for oral administration, and may be water or an aqueous solution, for example.
  • Oral Vaccine Composition The pupae or cells obtained as described above contain PCV2 protein and have immunogenicity, and are therefore used as an oral vaccine composition.
  • the diseases to which the oral vaccine of the present invention is applicable are porcine circovirus-related diseases, including postweaning multisystemic stunting syndrome (PMWS), porcine dermatitis nephropathy syndrome (PDNS), and porcine respiratory complex infection (PRDC). ), reproductive disorders, weight loss, increased mortality, gastrointestinal diseases such as diarrhea, etc., and one or more of these can be targeted.
  • PMWS postweaning multisystemic stunting syndrome
  • PDNS porcine dermatitis nephropathy syndrome
  • PRDC porcine respiratory complex infection
  • the oral vaccine composition can be used in other forms, such as liquid preparations (syrups, jelly preparations, etc.), powder preparations, granules, tablets, powders, capsules, mash feed, pellet feed, crumble feed, and expander feed. , and flake feed.
  • liquid preparations spinups, jelly preparations, etc.
  • powder preparations granules, tablets, powders, capsules, mash feed, pellet feed, crumble feed, and expander feed.
  • flake feed flake feed.
  • cells can be in any dosage form such as powder, granules, tablets, powders, capsules, mash feed, pellet feed, crumble feed, expander feed, and flake feed.
  • compositions can be formulated together with pharmaceutical excipients by methods commonly practiced in the art.
  • Pharmaceutical additives include, for example, adjuvants, carriers for oral administration, diluents, excipients, disintegrants, binders, lubricants, fluidizing agents, coating agents, solubilizers, solubilizing agents, thickeners, Examples include dispersants, stabilizers, preservatives, pH regulators, tonicity regulators, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, and the like. From the viewpoint of improving effectiveness as a vaccine, it is preferable that the pharmaceutical additive contains an adjuvant.
  • adjuvants examples include complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, Bordetella pertussis adjuvant, Ribi adjuvant, lipid A, liposomes, aluminum hydroxide, silica, enterotoxin (choleratoxin, cholera toxin ⁇ subunit, cholera toxin ⁇ subunit). units), Toll-like receptor (TLR) ligands (Poly(I:C), lipopolysaccharide, flagellin, CpG), mucoadhesives (chitosan, lectin), cytokines, artificially synthesized adjuvants, oil adjuvants, polymeric polysaccharides, etc. can be mentioned.
  • TLR Toll-like receptor
  • the present invention can further include the step of mixing pupae or cells having immunogenicity with a pharmaceutical additive or a liquid containing them.
  • the pupa or cells contain the expressed PCV2 protein. Therefore, components of pupae or cells having immunogenicity (for example, pupal powder after freeze-drying) are added to the total weight of the vaccine composition, for example, at least 0.001% by weight, at least 0.01% by weight, and at least 0.
  • the liquid used as a pharmaceutical additive is not particularly limited as long as the oral vaccine composition has immunogenicity and is pharmaceutically suitable for oral administration, such as water, physiological saline, or phosphoric acid.
  • examples include aqueous solutions such as buffer solutions (PBS).
  • the immunogenic pupae may be used as they are, cut into pieces, crushed, or liquefied, or a crude extract may be collected from the pupae and then impregnated into the pupae. When using cells, they can also be crushed.
  • the step of mixing it with a liquid containing a pharmaceutical additive may include the step of immersing the freeze-dried pupa in the liquid. For example, by immersing the pupa in a solution containing an adjuvant, the solution containing the adjuvant can easily penetrate into the pupa.
  • An oral vaccine composition may be prepared by further cutting or crushing the pupa into which the liquid has penetrated. Cultured cells can also be used in the same manner as crushed pupa.
  • the step of mixing with a liquid containing a pharmaceutical additive may include a step of dispersing the cut or crushed pupae in the liquid.
  • the subject to which the vaccine composition of the present invention is administered is a pig, and the breed is not particularly limited. Breeds include, for example, Middle Yorkshire, Large Yorkshire, Berkshire, Landrace, Duroc, and Hampshire.
  • the orally administered vaccine of the present invention exhibits immunogenicity even when administered orally in the form of a pupa, but it may also be administered after being cut or crushed. Good too.
  • forms in which the pupa is administered in its pupal form include forms in which the pupa for oral administration are orally administered as it is as a vaccine, and forms in which the pupa for oral administration are ingested as is as food.
  • Examples of forms that can be administered after cutting or crushing include forms in which cut or crushed pupae or cells are orally administered as they are, and forms in which cut or crushed pupae or cells are administered orally as is, or other orally administrable materials such as cut or crushed pupae or cells.
  • Examples include a form in which the product is administered by mixing it with the food, and a form in which the crushed product is mixed with feed and ingested as food. For example, it may be cut into 1/2, 1/3, 1/4, etc. in order to adjust the dosage taking pupal immunogenicity into consideration.
  • the degree of crushing is not particularly limited as long as it exhibits immunogenicity; for example, it may be in powder form.
  • the dosage can be determined as appropriate, taking into consideration the subject to be administered and the amount of antigen protein expressed in the pupa or cells. For example, the amount equivalent to 0.01 to 100 pupae (0.001 g to 30 g) may be administered per dose, or the amount equivalent to 0.1 to 10 pupae (0.01 g to 3 g) may be administered per dose. good.
  • the amount of PCV2 protein expressed is 0.2 mg to 10 mg per pupa weight of approximately 800 mg, and is 0.025% to 1.25% by weight per pupa. According to this, one pupa for oral administration contains more than 10 times the amount of PCV2 protein than one dose of a typical injectable vaccine.
  • the number and period of administration can also be set as appropriate, taking into consideration the subject of administration, the amount of PCV2 protein expressed in pupae or cells, etc. For example, it may be administered 1 to 5 times per day, 1 to 3 times per day, or once per day. Further, for example, the drug may be administered 1 to 7 days per week, 1 to 5 days per week, or 1 to 4 days per week. Furthermore, these administrations may be repeated for 2 to 24 weeks, 1 to 7 weeks, 2 to 5 weeks, or 2 to 4 weeks. You can go there.
  • the age of the pig at the time of administering the vaccine is not particularly limited, and the pig may be of any age from piglets to adult pigs. Note that adult pigs also include pregnant sows. In addition, when administering the vaccine, the subject may be fasted for about 1 to 3 hours before administration (before feeding).
  • the composition of the present invention can be administered to pigs as follows. Dose: 0.1 to 5 pupae (0.01g to 1.5g) administered once per day (feeding) Period: Repeated administration 1 to 5 times per week for 3 to 4 weeks Further, booster immunization may be performed by administering in the same manner, for example, every 1 to 4 weeks, preferably every 1 to 2 weeks.
  • booster immunization may be performed by administering in the same manner, for example, every 1 to 4 weeks, preferably every 1 to 2 weeks.
  • the vaccine composition of the present invention can also be used in combination with other vaccines.
  • Other vaccines may be immunogenic against the PCV2 protein or may be immunogenic against different antigenic proteins. If it has immunogenicity against the same antigenic protein as the pupa or cells, the pupa of the present invention may be administered, for example, for boosting the other vaccines mentioned above.
  • IgG and IgA responses are observed in the colostrum of pregnant sows that have ingested the vaccine composition of the present invention. This indicates that the vaccine effect can also be obtained in breast milk. Furthermore, when piglets received colostrum from the mother pig, IgG and IgA responses were unexpectedly observed in the serum of 1-day-old piglets. This indicates that the vaccine effect is passed on to piglets via mother's milk.
  • Example 1 Effect confirmation test-1 of a new vaccine against PCV2 by oral administration to piglets ⁇ Materials and methods>
  • Silkworm cultured cells and strains Silkworm cultured cells were prepared according to the method described in the prior literature. (Masuda et al., 2018). The silkworm pupa strain used was Showa Kinshu (Atsumaru HD, Kumamoto, Japan).
  • BmNPV-T3 strain has been deleted from 6 types of genes (chitinase A, cathepsin, egt, p26, p10 and p74) to improve protein expression and extend the survival period after silkworm infection.
  • T3 ⁇ PE3P was used.
  • PCV2 capsid protein expression in cultured insect cells and silkworm pupae PCV2 capsid protein expression was performed according to the method described in the previous literature (Masuda et al., 2018). Pupae were infected with the recombinant baculovirus at 1 ⁇ 10 5 plaque-forming units (pfu) per pupa, and the infection period was 4 days.
  • PCV2 virus Serum of individual pigs (several samples) at 10 to 12 weeks of age in which persistent PCV2 viremia and virus excretion in feces were confirmed (number of PCV2 genes: 5 ⁇ 10 5 copies)
  • PCV2 strain was prepared as a challenge strain by 3-4 subcultures.
  • Body weight measurement was measured once a week at the time of introduction, at the beginning of the first administration (4 weeks of age), and at the time of the first challenge (7 weeks of age). 6) Quantification of PCV2 virus genome copy number Quantification was performed by real-time PCR. 7) Necropsy and lesion observation Necropsy was performed 21 days after the first challenge. 8) Statistical analysis Regarding PCR quantification, differences between groups were evaluated using Student's t-test. The significance level was set at 5%.
  • Vaccination test for pregnant pigs ⁇ Materials and methods> 1. Test animal Twelve pregnant pigs (less than 2 months after insemination) with low PCV2 antibody titers were used.
  • Test Category The test categories were as listed in Table 2 below.
  • test substance is mixed with feed and administered orally (feed additive administration).
  • feed additive administration The administration will be 5 times/7 days.
  • the new vaccine dose will be 1.0g/head of silkworm pupa powder once a day.
  • Test schedule The test schedule was as shown in Table 3 below.
  • Test method 1 Test substance administration Approximately 8 weeks (approximately ⁇ 1 week) before scheduled delivery after introduction to the oral immunization group (T02 group), and approximately 4 weeks (approximately ⁇ 1 week) prior to scheduled delivery. Oral administration (1 g per animal per time) was administered to the oral immunization groups (T01 group and T02 group) via feed addition in 5 cycles/7 days. In addition, a non-administration control group (T03 group) was set up. A total of 12 animals, 4 in each group, were tested. 2) Breeding of test pigs During the test period, regular feed for the gestation period and lactation period [manufactured by Chubu Feed Co., Ltd. or Feed One Co., Ltd.] was fed. 3) Observation period was from the first administration to the time of weaning.
  • Weight measurement The weight of all animals was measured at the time of parturition and weaning.
  • Blood collection and antibody titer measurement (piglets) Blood was collected from five animals per litter twice, at 1 day of age and at weaning, and the antibody titer was measured by ELISA.
  • FIG. 5 is a diagram showing the antibody titers of IgG and IgA in colostrum of sows at parturition.
  • Panel A is the results of PCV2 antigen-specific IgG response (ELISA) in colostrum (4000-fold dilution).
  • the bars in each graph of T1, T2, and T03 are, from the left, the absorbance of whey in the oral immunization group (T01 group), the absorbance of whey in the oral immunization group (Group T02), and the absorbance of whey in the non-administered control group (Group T03). shows.
  • Panel B is the results (ELISA) of PCV2 antigen-specific IgA responses in colostrum (250-fold dilution).
  • the bars in each graph of T1, T2, and T03 are, from the left, the absorbance of whey in the oral immunization group (T01 group), the absorbance of whey in the oral immunization group (Group T02), and the absorbance of whey in the non-administered control group (Group T03). shows. From FIG. 5, IgG and IgA responses were observed in the colostrum of sows, indicating that the vaccine effect was also obtained in breast milk.
  • FIG. 6 is a diagram showing the antibody titers of IgG and IgA in the serum of piglets at one day of age.
  • Panel A is the result of PCV2 antigen-specific IgG response (ELISA) in 1-day-old piglet serum (4000-fold dilution).
  • the bars in the T1, T2, and T03 graphs are the absorbance of piglet serum delivered from the oral immunization group (T01 group), the absorbance of piglet serum delivered from the oral immunization group (T02 group), and no administration, respectively.
  • the absorbance of piglet serum delivered from the control group (T03 group) is shown.
  • Panel B is the results of PCV2 antigen-specific IgA response (ELISA) in 1-day-old piglet serum (1:1000 dilution).
  • the bars in the T1, T2, and T03 graphs are the absorbance of piglet serum delivered from the oral immunization group (T01 group), the absorbance of piglet serum delivered from the oral immunization group (T02 group), and no administration, respectively.
  • the absorbance of piglet serum delivered from the control group (T03 group) is shown. From Figure 6, IgG and IgA responses were observed in the serum at 1 day of age even in piglets that received colostrum from mothers inoculated with oral vaccines, and piglets were also vaccinated through breast milk. The effect was shown to be transferable.
  • Example 3 Effect confirmation test-2 of new vaccine against PCV2 by oral administration to piglets (dosage and dosage study) ⁇ Test method> 1.
  • Test substance New vaccine New porcine PCV2 oral vaccine (PCV2 rCap/VLP expressing silkworm pupa powder) 1 type Positive control: Circoflex (manufactured by Boehringer Ingelheim Vetmedica Co., Ltd.)
  • Test schedule The test schedule was as shown in Table 5.
  • Test method 1 Test substance administration Test substance administration was carried out according to the test category. In this example, each group was reared in groups, and administration was by forced oral administration. For forced oral administration, 0.5 g of the test substance was weighed in advance and placed in a 50 mL PP tube, and the pig was restrained and administered orally. After oral administration, approximately 20 mL of tap water was additionally forcibly ingested. Seven test groups were set up, with a total of 28 animals, 4 animals in each group.
  • Saliva collection/sending Saliva was collected at blood sampling a total of 9 times at 1-week intervals from the start of the first administration until the time of autopsy. 4) During the clinical observation test period (56 days), general clinical symptoms were observed. Although we tried to investigate and record the causes of deaths and culling cases as much as possible, no such cases occurred in this example.
  • PCV2 quantification (real-time PCR) Porcine PCV2 was quantified by real-time PCR from serum after challenge and organs examined at autopsy.
  • Test classification The test classification is shown in Table 7.
  • Test schedule The test schedule is shown in Table 8.
  • Body Weight The average body weights of each group were 16.5, 33.8 and 54.2 kg for T01, 10.3, 26.1 and 46.2 kg for T02, and 15.4, 33.7 and 54.1 kg for T03 in order of 0, 28 and 56 days after the start of the test.
  • the average period weight gain was 17.3, 20.4, and 37.7 kg for T01, 15.9, 20.1, and 36.0 kg for T02, and 18.3, 20.4, and 38.7 kg for T03 in order of 0 to 28 days, 28 to 56 days, and the entire period after the start of the test. there were.
  • Serum IgG antibody titer At the start of the test (piglets 4-5 weeks old) and 4 weeks after the start of the test (piglets 8-9 weeks old), the absorbance of the T02 group was significantly higher than the other two groups. It showed a high value. Eight weeks after the start of the test (piglets 12 to 13 weeks old), the T02 group showed a tendency for higher absorbance (Figure 10).
  • Sequence number 1 Synthetic DNA SEQ ID NO: 2: Synthetic construct

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Abstract

ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルスの感染処理及び凍結乾燥処理された、バキュロウイルス感染性昆虫の蛹又は細胞を含む、ブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチン組成物。

Description

経口ワクチン組成物
　本発明は、ブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチン組成物、及びその製造方法に関する。
　ブタサーコウイルス関連疾患は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）が原因の疾病である。好発時期は７～１６週齢であり、元気消失、発育不良、削痩、呼吸困難、体表リンパ節の腫脹、黄疸、流死産などの症状が認められる。このため、養豚業者や獣医師にとっては、ブタサーコウイルス関連疾患に対する有効な予防又は治療法を開発することが必要である。
　ところで、バキュロウイルスは、昆虫を主な宿主として感染する核多角体病ウイルス（Nucleopolyhedrovirus：NPV）であり、増殖過程で感染細胞の核内にポリヘドリン（Polyhedrin、多角体）と呼ばれる結晶構造のタンパク質を形成する。そこで、バキュロウイルス－カイコ系を用いて目的タンパク質を生産する方法の一つとして、目的タンパク質をコードする遺伝子をバキュロウイルスに導入し、その組換えバキュロウイルスをカイコ幼虫又は蛹に接種することにより、カイコに目的タンパク質を生産させる方法がある（非特許文献１）。このようにバキュロウイルス－カイコ系を用いてタンパク質を製造した場合、目的タンパク質を大量に生産させることができる点で有用である。
　上記背景のもと、バキュロウイルス－カイコ系を用いてより簡易かつ大量にブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチンを生産する方法の開発が望まれている。
　本発明者らは、ＰＣＶ２タンパク質をコードするＤＮＡを導入した組換えバキュロウイルスをカイコの蛹に感染させ、その後凍結乾燥することで、驚くべきことに、免疫原性を維持させることができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、例えば以下の通りである。
  [１]　ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルスの感染処理及び凍結乾燥処理された、バキュロウイルス感染性昆虫の蛹又は細胞を含む、ブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチン組成物。
  [２]　ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号１に示されるものである[１]に記載の経口ワクチン組成物。
  [３]　アジュバントを含む溶液をさらに含む、[１]に記載の経口ワクチン組成物。
  [４]　蛹が、組成物の全重量に対して少なくとも０．００１重量％含まれる、[１]に記載の経口ワクチン組成物。
  [５]　ブタサーコウイルス関連疾患が、離乳後多臓器性発育不良症候群、豚皮膚炎腎症症候群、豚呼吸器複合感染症及び繁殖障害からなる群から選ばれる少なくとも１種である[１]に記載の経口ワクチン組成物。
  [６]　ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルスを、バキュロウイルス感染性昆虫の幼虫又は蛹に感染させ、当該感染後の幼虫から蛹化した蛹、又は当該感染後の蛹を凍結乾燥する工程を含む、ブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチンの製造方法。
  [７]　ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルスを、バキュロウイルス感染性の細胞に感染させ、当該感染後の細胞を凍結乾燥する工程を含む、ブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチンの製造方法。
  [８]　ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号１に示されるものである[６]又は[７]に記載の経口ワクチン組成物。
  [９]  昆虫がカイコである[６]に記載の方法。
  [１０]　細胞が、クワゴマダラヒトリ、サクサン、カイコ、ヨトウガ又はイラクサギンウワバに由来するものである[７]に記載の方法。
  [１１]　前記[１]～[５]のいずれか１項に記載の組成物を、ブタに投与する工程を含む、ブタサーコウイルス関連疾患に対するブタの免疫方法。
　本発明により、ブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチン組成物及びその製造方法が提供される。製造した経口投与用ワクチン組成物は、そのまま投与に用いることができるため、例えば、ブタの飼料等に含めることができる。
攻撃試験デザインを示す図である。 血清中のPCV2ウイルスゲノムコピー数の推移を示す図である。 臓器中のPCV2ウイルスゲノムコピー数を示す図である。 体重変化の推移を示す図である。 母豚の分娩時における初乳中のIgG及びIgAの抗体価を示す図である。 子豚の１日齢における血清中のIgG及びIgAの抗体価を示す図である。 ウイルス攻撃後から4週間後（試験終了時）までの増体量の比較を示す図である。 ウイルス攻撃後のPCV2遺伝子量の経時的推移を示す図である。 免疫開始からのウイルス攻撃前までの抗原特異的IgG抗体量の推移を示す図である。 抗原特異的IgG抗体応答の経時的推移を示す図である。
１．概要
　カイコ異種タンパク質発現系を用いて感染症に対するワクチン抗原を生産する場合、対象となる病原微生物（ウイルス等）由来のワクチン抗原遺伝子を挿入した組換えバキュロウイルスを作製し、これをカイコ幼虫又は蛹に接種することにより、カイコ個体内でウイルスが増殖し、ワクチン抗原を産生する。通常の注射により投与するワクチンでは、何らかのワクチン抗原タンパク質の精製を行う必要がある。そして、精製するにはアフィニティー精製、イオン交換精製、硫安沈殿など、複数のクロマトグラムを組み合わせることが必要とされる。しかし、ワクチン抗原を発現させたカイコ蛹そのものをワクチン抗原として投与することができれば、精製のコストを下げることが可能となり、注射投与に関わる労力の削減も期待できる。
　本発明においては、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）タンパク質をコードするＤＮＡをバキュロウイルス感染性昆虫の蛹又は細胞に導入し、当該ＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルス感染性昆虫の蛹又は細胞を凍結乾燥処理することにより、抗原性を高く担保した蛹及び細胞を獲得することに成功した。そして、これらの蛹又は細胞を豚に摂食させて、実際に抗体産生応答が増強されるかを検証した。その結果、ＰＣＶ２抗原に対して、顕著な抗体産生応答の増強が認められた。
　本発明は、上記知見に基づくものである。
　本発明は、ＰＣＶ２タンパク質をコードするＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルスの感染処理及び/又は凍結乾燥処理された、バキュロウイルス感染性昆虫の蛹又は細胞を含む、ブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチン組成物を提供する。組換えバキュロウイルスは、感染処理、凍結乾燥のほか、両者の組み合わせを含む。
　また本発明は、ＰＣＶ２タンパク質をコードするＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルスを、バキュロウイルス感染性昆虫の幼虫又は蛹に感染させ、当該感染後の幼虫から蛹化した蛹、又は当該感染後の蛹を凍結乾燥する工程を含む、ブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチンの製造方法を提供する。
　さらに本発明は、ＰＣＶ２タンパク質をコードするＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルスを、バキュロウイルス感染性の細胞に感染させ、当該感染後の細胞を凍結乾燥する工程を含む、ブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチンの製造方法を提供する。
２．ＰＣＶ２タンパク質をコードするＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルス
　本明細書において、抗原としては、例えば豚サーコウイルス抗原（ＰＣＶ）等のサーコウイルス抗原が挙げられる。抗原タンパク質のより具体的な例としては、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２；ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２）の分離株ＰＣＶ２ａ（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　＃ＡＦ０５５３９２）のＯＲＦ２（１－２３３）、あるいはＰＣＶ２　ＫＵ０８－１　ｓｔｒａｉｎ　（ＰＣＶ２ａ：ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ，　ＬＣ３８１２８８等が挙げられる。本発明においては、上記アクセッション番号に記載のDNAの塩基配列を、カイココドンに最適化することができる。アクセッション番号LC381288の塩基配列を最適化した塩基配列を配列番号１に示す。
　抗原のサイズは特に制限されるものではなく、例えば、５～１０００ｋＤａ、１０～５００ｋＤａ、又は３０～２００ｋＤａであってよい。
　免疫原性は、抗原が抗体の産生や細胞性免疫を誘導する性質を意味する。免疫原性の有無は、例えば、抗体投与後の抗体の産生の有無により評価することができる。抗体の発現は、当業者に公知の方法、例えば、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、フローサイトメトリー及び免疫組織染色により確認することができる。
　ＰＣＶ２タンパク質をコードするＤＮＡをバキュロウイルスに導入する方法は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、Maeda et al.,Nature 315, 592-594 (1985)や、Y.Matsuura et al.,Virology,(1989)173,674-682等に記載された方法により行うことができる。例えば、上記ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）をクローニングし、バキュロウイルストランスファーベクターへ組込み、組換えバキュロウイルストランスファーベクターを得る。次に、この組換えバキュロウイルストランスファーベクターを用いて、相同組換え法により、あるいはトランスポゾン転移法により、組換えバキュロウイルスＤＮＡを得る。この組換えバキュロウイルスＤＮＡをリポフェクション法などの公知の方法により昆虫培養細胞に導入し、組換えバキュロウイルスを得る。
　バキュロウイルストランスファーベクターは、バキュロウイルスゲノムＤＮＡのポリヘドリン遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミドにサブクローン化して得られるものであり、公知の方法により作成することもでき、市販のものを用いることもできる。市販のベクターとしては、例えば、ｐＡｃＹＭ１、ｐＡｃＧ２Ｔ、ｐＡｃＧＰ６７、及びＶＬ１３９２（いずれもファーミンジェン社）、ｐＤＥＳＴ８（インビトロジェン社）が挙げられる。
　本発明において、組換えバキュロウイルスの作製に使用するバキュロウイルスの種類としては、オートグラファカリフォニカ核多角体病ウイルス(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus:AcNPV)、カイコ核多角体病ウイルス(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus:BmNPV)、オルギア・シュードツガタ核多角体病ウイルス（Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus:OpNPV）、マイマイガ核多角体病ウイルス(Lymantria disper multiple nucleopolyhedrovirus:LdNPV)などが挙げられ、カイコ核多角体病ウイルス（BmNPV）であることが好ましい。
３．バキュロウイルス感染性昆虫の幼虫又は蛹への感染
　本発明においては、組換えバキュロウイルスを、宿主となるバキュロウイルス感染性昆虫の幼虫若しくは蛹又はバキュロウイルス感染性細胞（これらをまとめて「宿主」ともいう）に感染させる。
  宿主となる昆虫としては、鱗翅目昆虫が挙げられ、タンパク質の発現に適しバキュロウイルス感染性を有する限り特に限定されるものではなく、例えば、クワゴマダラヒトリ（Spilosoma imparilis）、サクサン（Antheraea pernyi）、カイコ(Bombyx mori)、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）などが挙げられる。昆虫は、蛹及び幼虫のいずれの形態でもよい。
　また、宿主となる細胞としては、タンパク質の発現に適しバキュロウイルス感染性細胞株であれば特に限定されるものではない。ここで、「バキュロウイルス感染性」とは、バキュロウイルスが感染可能であることを意味し、バキュロウイルス感染性を有する特徴の一つとして、細胞表面にGP64と呼ばれる糖タンパク質が発現していることが挙げられる。従って、このような性質を有する限り、細胞の種類は限定されず、昆虫細胞などの培養細胞が挙げられる。
　昆虫細胞としては、以下のものが挙げられる。
　クワゴマダラヒトリ（Spilosoma imparilis）由来細胞：SpIm
　サクサン（Antheraea pernyi）由来細胞：Anpe
　カイコ（Bombyx mori）由来細胞：BmN、BmN4、Oyanagi-2、Bme21
　ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）由来細胞：Sf9、Sf21
　組換えバキュロウイルスを宿主となる昆虫又は細胞に感染させる方法は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、上記工程で得られた組換えバキュロウイルスを、蛹又は幼虫に注射する。宿主細胞に感染させる場合は、組換えバキュロウイルスを含む液を細胞培養培地に添加すればよい。
　宿主昆虫又は宿主細胞に組換えバキュロウイルスを感染させてから１～９日間飼育又は培養すると、宿主昆虫又は宿主細胞において、抗原タンパク質が発現する。
　ここで、従来のバキュロウイルス－カイコ系を用いた目的タンパク質の生産の場合、組換えバキュロウイルスに感染させたカイコの蛹又は幼虫の体内において目的タンパク質が発現された後、蛹の破砕及び懸濁若しくは幼虫からの体液回収を行い、各種精製を行うことにより目的タンパク質を精製する。これに対し、本願発明の方法では、このような目的タンパク質の抽出・精製処理を行う必要がなく、ＰＣＶ２タンパク質が発現した蛹又は細胞を凍結乾燥処理した後、そのまま使用することができる。
４．組換えバキュロウイルスを感染させた宿主の凍結乾燥
　組換えバキュロウイルスに感染させた宿主の蛹又は細胞を凍結乾燥するタイミングとしては、宿主内（例えばカイコの蛹の体内）において十分な量のＰＣＶ２タンパク質が発現された後であることが好ましい。また、幼虫にバキュロウイルスを感染させた場合には、蛹になるまで生育させる。したがって、凍結乾燥するタイミングは、感染させたカイコが幼虫の場合は蛹化した後であり、感染させたカイコが蛹であれば感染後任意の時期に凍結乾燥することができる。凍結乾燥は、組換えバキュロウイルスが感染した蛹を切断又は破砕せずに、蛹の形状のまま行ってもよく、蛹を切断又は破砕した後に行ってもよい。
　本明細書において、蛹を「そのまま」及び「蛹の形状のまま」で用いるとの表現は、実質的に蛹の形状のままで用いる又は含む等することを意味し、例えば、意図せずに、製造過程で一部が欠けてしまった場合にも、蛹の形状の９０％以上、８０％以上、７０％以上、６０％以上、又は５０％以上を維持していれば、蛹の形状のままであると判断してよい。
　凍結乾燥は、凍結状態で減圧下（例えば真空状態で維持）により乾燥させる方法である。凍結乾燥は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、市販の凍結乾燥機を用いて行うことができる。凍結処理温度は、当業者が適宜設定できるが、例えば、－９０℃～－５℃、－８０℃～－１０℃、又は－５０℃～－１０℃である。また、減圧条件も、当業者が適宜調整できるが、例えば、２Ｐａ～２０Ｐａ、３Ｐａ～２０Ｐａ又は１０Ｐａ～２０Ｐａである。凍結乾燥時間は、例えば１時間～１６８時間、好ましくは８時間～９６時間である。また本発明の一態様において、凍結乾燥時間は例えば８時間～３６時間である。
　凍結乾燥により、蛹や細胞の水分の大部分が除去され、乾燥状態となる。凍結乾燥後の蛹に含まれる水分は、例えば、蛹又は細胞の全重量に対して１重量％以下、０．５重量％以下、０．１重量％以下、０．０１重量％以下又は０．００１重量％以下であってよい。免疫原性を維持しやすくする観点から、蛹に含まれる水分は０重量％に近い程好ましい。
　ここで、本発明において任意に蛹又は細胞を液剤処理、浸漬処理、光処理、ガス処理、プラズマ処理、加熱処理、又は加圧加熱処理することができる。液剤処理、浸漬処理、光処理、ガス処理、プラズマ処理、加熱又は加圧加熱するタイミングとしては、凍結乾燥の前でも後でもよく、例えば凍結乾燥により蛹や細胞が十分乾燥した後であることが好ましい。組換えバキュロウイルスを感染させた宿主を凍結乾燥する工程と液剤処理、浸漬処理、光処理、ガス処理、プラズマ処理、加熱処理又は加圧加熱処理する工程が連続して行われること、すなわち、凍結乾燥後に他の処理工程を介さず、液剤処理、浸漬処理、光処理、ガス処理、プラズマ処理、加熱処理又は加圧加熱処理することもできる。凍結乾燥後のタイミングは、乾燥させたカイコの蛹の状況等により適宜調整されるが、例えば、凍結乾燥後１～２４時間以内、例えば２４時間以内、１２時間以内、３時間以内又は１時間以内に行うことができる。凍結乾燥した蛹は切断又は破砕せずに、蛹の形状のまま液剤処理、浸漬処理、光処理、ガス処理、プラズマ処理、加熱処理又は加圧加熱処理することが好ましい。
　本製法で作製した蛹及び細胞は免疫原性を有する。したがって、本発明においては、ＰＣＶ２タンパク質を抽出する必要がなく、そのまま経口投与用とすることができる。
　さらに、本発明の一態様において、凍結乾燥処理をした蛹は乾燥し、スポンジ状であるため、液体に浸漬することで、液体を容易に内部に浸透させることができる。したがって、本実施形態に係る製造方法は、凍結乾燥処理した蛹、又は必要により加圧加熱処理をした蛹を液体に浸漬する工程をさらに含んでもよい。浸透させる液体としては、容易にワクチンとしての効果を向上することができるため、アジュバントを含む溶液であることが好ましい。凍結乾燥処理をした蛹を、アジュバントを含む溶液に浸漬することで、アジュバントを含む溶液を容易に蛹の内部に浸透させることができる。培養細胞を凍結乾燥すると粉末状組成物になるため、細胞を用いる場合は、凍結乾燥後の細胞を、アジュバントを含む溶液に浸漬すればよい。また、本製法の蛹は、他の固体または液体と混合してもよい。例えば、アジュバントを含む固体であることが好ましい。
　本発明により製造した蛹又は細胞は、そのまま用いてもよく、切断、破砕、液状化して用いても、蛹から粗抽出液を回収したのち蛹に含浸しなおしてよく、上述したように、液体を浸透させて用いてもよく、他の固体と混ぜて用いてもよい。
　そのまま用いる形態としては、例えば、蛹をそのままワクチンとして経口投与する形態、及び蛹をそのまま食用として摂取する形態が挙げられる。
　切断又は破砕して用いる形態としては、例えば、切断又は破砕した蛹をそのまま投与する形態、破砕した蛹を他の経口投与可能な素材と混合して投与する形態、及び破砕したものを飼料に混合して食用として摂取させる形態が挙げられる。例えば、蛹の免疫原性を考慮して投与量を調整するために、例えば、１／２、１／３、１／４等に切断してもよい。破砕の程度は、免疫原性を示す限り特に限定されず、例えば、粉状としてもよい。切断は、例えば、食用ハサミ及び実験動物用ハサミにより行うことができ、破砕は、例えば、ミキサー、ハンドミル及び粉砕装置により行うことができる。細胞を用いる場合は、蛹を破砕したときと同様に処理することができる。
　経口投与としては、例えば、口腔内投与及び舌下投与が挙げられる。本明細書において、投与には、ブタが自ら摂取する場合も含まれる。蛹をそのままの形態で投与する場合には、口腔内投与が好ましく、飼料に含めてブタが自ら食するようにしてもよい。
　経口投与可能な添加剤としては、例えば、食品素材、飲料素材、賦形剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤、ｐＨ調節剤、甘味剤、着色剤、乳化剤、香料、後述する医薬品添加物等、が挙げられる。食品素材又は飲料素材と混合して、機能性食品又は飲料として投与することもできる。経口投与可能な素材が含まれる液体としては、経口投与用蛹が免疫原性を有し、経口投与に適した液体である限り特に制限されず、例えば、水又は水溶液であってよい。
５．経口ワクチン組成物
　上記のようにして得られた蛹又は細胞は、ＰＣＶ２タンパク質を含み、免疫原性を有するため、経口ワクチン組成物として使用される。
　本発明の経口ワクチンの適用対象となる疾患はブタサーコウイルス関連疾患であり、離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）、豚皮膚炎腎症症候群（ＰＤＮＳ）、豚呼吸器複合感染症（ＰＲＤＣ）、繁殖障害、体重減少、死亡率の上昇、下痢などの消化管疾患などが含まれ、これらの１種又は複数種を対象とすることができる。
　経口ワクチン組成物は、蛹のままの形状の他、例えば、液状剤（シロップ剤、ゼリー剤等）、粉末剤、顆粒剤、錠剤、散剤、カプセル、マッシュ飼料、ペレット飼料、クランブル飼料、エキスパンダー飼料、及びフレーク飼料等の任意の剤形とすることができる。細胞を経口ワクチン組成物として使用する場合も、粉末剤、顆粒剤、錠剤、散剤、カプセル、マッシュ飼料、ペレット飼料、クランブル飼料、エキスパンダー飼料、及びフレーク飼料等の任意の剤形とすることができる。
　以上の剤形は通常当分野で行われている手法により、医薬品添加物とともに製剤化され得る。医薬品添加物としては、例えば、アジュバント、経口投与用担体、希釈剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、流動化剤、コーティング剤、溶解剤、溶解補助剤、増粘剤、分散剤、安定化剤、防腐剤、ｐＨ調節剤、張度調節剤、浸潤剤、甘味剤、及び香料等が挙げられる。ワクチンとしての効果を向上する観点から、医薬品添加物がアジュバントを含むことが好ましい。
　アジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、リビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント、リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ、エンテロトキシン（コレラトキシン、コレラトキシンαサブユニット、コレラトキシンβサブユニット）、Toll様レセプター（TLR）リガンド（Poly(I:C)、リポポリサッカリド、フラジェリン、CpG）、粘膜付着剤（キトサン、レクチン）、サイトカイン、人工合成アジュバント、オイルアジュバント、高分子多糖類等が挙げられる。
　本発明においては、免疫原性を有する蛹又は細胞と、医薬添加物又はそれらを含む液体とを混合する工程をさらに含めることができる。本発明の経口ワクチン組成物において、蛹又は細胞中には、発現したＰＣＶ２タンパク質が含まれる。そこで、免疫原性を有する蛹又は細胞の成分（例えば凍結乾燥後の蛹の粉末）を、ワクチン組成物の全重量に対して、例えば０.００１重量％以上、０.０１重量％以上、０.１重量％以上、１重量％以上、２重量％以上、５重量％以上、１０重量％以上、２０重量％以上、３０重量％以上、４０重量％以上、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、又は９０重量％以上含むものとすることができる。
　医薬添加物として使用される液体としては、経口ワクチン組成物が免疫原性を有し、薬学的に経口投与に適した液体である限り特に制限されず、例えば、水、生理食塩水又はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）等の水溶液などが挙げられる。
　免疫原性を有する蛹はそのまま用いても、切断して用いても、破砕して用いても、液状化しても、蛹から粗抽出液を回収したのち蛹に含浸させてもよい。細胞を用いる場合も、破砕することができる。
　本発明において、蛹を蛹の形状のまま用いる場合、医薬添加物を含む液体と混合する工程は、凍結乾燥後の蛹を液体に浸漬する工程を含んでもよい。例えば、蛹を、アジュバントを含む溶液に浸漬することで、アジュバントを含む溶液を容易に内部に浸透させることができる。液体が内部に浸透した蛹をさらに切断又は破砕して経口ワクチン組成物としてもよい。培養細胞の場合も、蛹の破砕物に準じて用いることができる。
　切断又は破砕した蛹を用いる場合、医薬添加物を含む液体と混合する工程は、切断又は破砕した蛹を液体に分散させる工程を含んでもよい。
　本発明のワクチン組成物を投与する対象はブタであり、品種は特に限定されない。品種としては、例えば、中ヨークシャー、大ヨークシャー、バークシャー、ランドレース、デュロック、ハンプシャーなどが含まれる。
　本発明の経口投与用ワクチンは、蛹の形状のまま経口投与しても免疫原性を発揮するが、切断又は破砕して投与してもよく、上述したように、液体を浸透させて用いてもよい。
　蛹の形状のまま投与する形態としては、例えば、経口投与用蛹をそのままワクチンとして経口投与する形態、及び経口投与用蛹をそのまま食用として摂取する形態が挙げられる。
　切断又は破砕して投与する形態（細胞の破砕物を含む）としては、例えば、切断又は破砕した蛹又は細胞をそのまま経口投与する形態、切断又は破砕した蛹又は細胞を他の経口投与可能な素材と混合して投与する形態、及び破砕したものを飼料に混合して食用として摂取させる形態が挙げられる。例えば、蛹の免疫原性を考慮して投与量を調整するために、例えば、１／２、１／３、１／４等に切断してもよい。破砕の程度は、免疫原性を示す限り特に限定されず、例えば、粉状としてもよい。
　投与量は、投与対象、及び蛹又は細胞において発現する抗原タンパク質量等を考慮し、適宜設定することができる。例えば、１回当たり蛹０．０１～１００頭分（０．００１ｇ～３０ｇ）を投与してもよく、１回当たり蛹０．１～１０頭分（０．０１ｇ～３ｇ）を投与してもよい。発現するＰＣＶ２タンパク質量は、蛹の重量約８００ｍｇに対して０．２ｍｇ～１０ｍｇであり、蛹１頭分当たり０．０２５重量％～１．２５重量％となる。これによれば、通常の注射型ワクチンの１回分の投与量の１０倍以上のＰＣＶ２タンパク質が経口投与用蛹１頭分に含まれることになる。
　投与の回数及び期間も、投与対象、及び蛹又は細胞において発現するＰＣＶ２タンパク質量等を考慮し、適宜設定することができる。例えば、１日当たり１回～５回投与してもよく、１日当たり１回～３回投与してもよく、１日当たり１回投与してもよい。また、例えば、１週間当たり１日～７日投与してもよく、１週間当たり１日～５日投与してもよく、１週間当たり１日～４日投与してもよい。また、これらの投与を、例えば、２～２４週間反復して行ってもよく、１～７週間反復して行ってもよく、２～５週間反復して行ってもよく、２～４週間反復して行ってもよい。
　ワクチンを投与するときのブタの週齢は特に限定されるものではなく、子豚から成豚までいずれの週齢であってもよい。なお、成豚には妊娠母豚も含まれる。
　なお、ワクチンを投与するに際しては、投与前（摂食前）に１～３時間程度絶食させてもよい。
　具体的には、例えば、ブタに対し以下のように投与することができる。
投与量：蛹０．１～５頭分（０．０１ｇ～１．５ｇ）を１日当たり１回投与（摂食）
期間：１週間当たり１～５回投与を３～４週間反復
　また、以後、例えば、１～４週間毎、好ましくは１～２週間毎に同様に投与することで追加免疫を行ってもよい。
本発明の組成物をブタに投与することにより、ブタサーコウイルス関連疾患に対するブタの免疫を引き起こすことができる。
　本発明のワクチン組成物は、他のワクチンと併用又は組み合わせて用いることもできる。他のワクチンは、ＰＣＶ２タンパク質に対する免疫原性を有するものであってもよく、異なる抗原タンパク質に対する免疫原性を有するものであってもよい。蛹又は細胞と同じ抗原タンパク質に対する免疫原性を有するものである場合には、例えば、上記他のワクチンの追加免疫等のために本発明の蛹を投与してもよい。
　さらに、本発明においては、本発明のワクチン組成物を摂取した妊娠母豚の初乳中において、IgG及びIgA応答反応が観察される。これは、母乳中にもワクチン効果が得られることを示すものである。また、子豚が母豚の初乳を受けると、意外にも子豚１日齢の血清中においてIgG及びIgA応答反応が観察された。このことは、母乳を介して子豚にもワクチン効果が引き継がれることを示すものである。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実施例１］　PCV2に対する新規ワクチンの子豚への経口投与による効果確認試験-1
＜材料と方法＞
（１）カイコ培養細胞および株
　カイコ培養細胞の調製は先行文献に記載の方法に準じた。(Masuda et al., 2018)。カイコ蛹の系統は錦秋鍾和（あつまるHD、熊本、日本）を用いた。
（２）組換えバキュロウイルスの作製
　組換えバキュロウイルスの作製は先行文献に記載の方法に準じた(Masuda et al., 2018)。具体的には、PCV2の遺伝子型はPCV2 KU08-1 strain (PCV2a; Kagoshima University)(GenBank accession number, LC381288)を使用した。PCV2 ORF2全長(アミノ酸1番目から233番目)に相当する領域をカイココドン最適化した上で当該最適化塩基配列（配列番号１）を有するDNA合成を行なった。合成されたDNAを増幅させたのち、pENTR11ベクターにサブクローニングしてpDEST8-PCV2 ORF2(1-233)を作製した。カイココドン最適化した塩基配列を配列番号１（下記）に、当該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
ATGGGCACTTATCCGAGGAGGCGTTACCGCAGAAGAAGACACAGACCCCGTAGTCACCTGGGACAAATACTCAGAAGGAGACCGTGGCTGGTCCACCCGCGTCATAGGTATAGATGGAGACGCAAAAACGGAATCTTCAATACGAGGCTGAGCAGAACTTTTGGCTACACCGTCAAGGCAACAACTGTACGCACTCCGTCCTGGGCGGTCGACATGATGCGTTTCAACATTGACGATTTTGTACCTCCAGGTGGAGGCACCAACAAAATCTCGATTCCCTTCGAATACTATCGCATTCGTAAAGTGAAGGTTGAGTTTTGGCCTTGCTCGCCAATAACGCAAGGTGACCGTGGTGTGGGAAGTACAGCTGTTATCCTGGACGATAACTTCGTGACCAAGGCTACGGCCTTGACATACGATCCTTATGTTAATTACTCATCTAGGCACACAATTCCTCAACCATTCAGCTATCATTCCCGCTACTTTACGCCGAAACCCGTACTCGACTCTACAATCGATTACTTCCAGCCAAACAATAAGAGAACTCAACTGTGGTTGCGCCTCCAGACCTCACGTAACGTCGACCACGTAGGCCTGGGTACTGCCTTTGAAAACTCTATCTACGACCAAGATTACAACATCAGGGTGACCATGTACGTTCAGTTCAGAGAGTTCAACCTCAAGGATCCGCCCCTTAAGCCTTAA
　組換えバキュロウイルスについては、BmNPV-T3株からタンパク質発現向上及びカイコ感染後の生存期間を伸ばすための6種類の遺伝子(chitinase A, cathepsin, egt, p26, p10 and p74)を欠損させたBmNPV- T3ΔPE3Pを用いた。
（３）昆虫培養細胞およびカイコ蛹でのPCV2カプシドタンパク質発現
　PCV2カプシドタンパク質発現は、先行文献に記載の方法に準じた(Masuda et al., 2018)。蛹への組換えバキュロウイルスの感染は蛹1頭あたり1×105 plaque-forming unit (p.f.u.) で行い、感染期間は4日間とした。
（４）PCV2カプシドタンパク質発現したカイコ蛹経口ワクチン抗原の作製
　感染したカイコ蛹を-80℃で凍結保存を行なった。粉末の作製にあたっては、-80℃より蛹を取り出し、ミルミキサー（岩谷産業、大阪）により粉末化を行った。
（５）PCV2ウイルスの調製
　持続的なPCV2ウイルス血症並びに糞便中へのウイルス排泄が確認された10～12週齢時の豚個体（数検体）の血清（PCV2遺伝子数：5×105コピー数/μL前後）より、分離・同定を行ない、3-4継代培養によりPCV2株の攻撃株としての調製を行なった。
（６）豚試験の免疫スケジュール及びサンプル回収
　PCV2陰性をPCR及びELISAキットによりあらかじめ確認した家畜ブタ(4週齢)9頭（予備動物1頭含む）を株式会社京都動物検査センター三和農場に導入し試験に供試した。
　家畜ブタはランダムに2種類の群に分けられた：経口ワクチン投与群、コントロール（無投与）群
　試験日程は図１の通り。
　1)供試物質投与
　導入3日後4週齢から，経口ワクチン投与群において，5回/7日間サイクルを3回飼料添加による経口投与を実施した。新規ワクチン投与量については1回あたりカイコ蛹粉末1gとした。また無投与対照群を設定した。なお各群4頭，合計8頭を供試した。
　2)攻撃方法
　免疫開始後21日（7週齢）の時点で，ブタPCV2（KDK野外分離株：PCV2）培養液5 mLを供試豚の鼻腔内に1日1回2日間噴霧投与することにより攻撃した。なお攻撃菌数はリアルタイムPCR(qPCR)にて測定した。
　3)供試豚の飼育
　試験期間中，抗菌性物質を含有していない子豚試験用標準飼料SDSNo.2［フィードワン（株）製］を給与した。
　4)観察期間
　第1回投与から6週間とした。
　5)体重測定
  導入時，第1回投与開始時(4週齢)，第1回攻撃時(7週齢)以降で毎週1回体重を測定した。
  6)PCV2ウイルスゲノムコピー数の定量
 リアルタイムPCRにて定量した。
  7)剖検及び病変観察
  第1回攻撃後21日で剖検を実施した。
  8)統計解析
 PCR定量についてStudent t検定により群間差を評価した。なお有意水準は5%とした。
＜結果＞
　1)血清中のPCV2ウイルスゲノムコピー数の評価（ウイルス血症の評価）
  経口ワクチン投与群ではPCV2ウイルス感染後も検出限界未満を推移していたのに対して、無投与群（コントロール群）では感染後7日目以降でPCV2ウイルスのゲノムが検出され、経口ワクチン投与群でPCV2ウイルスの増殖が有意に抑制された（p<0.01）（図2）。
   2)各臓器中のPCV2ウイルスゲノムコピー数の評価
  肺、肺門リンパ節、腸管膜リンパ節、鼠径部リンパ節でのPCV2ウイルスゲノムコピー数を評価した結果、経口ワクチン投与は無投与群に比較して、ウイルス検出割合とウイルス量が低い傾向がみられた（図3）。
  3)体重変化
  PCV2ウイルスの臨床症状として増体重の抑制が挙げられる。経口ワクチン投与群は無投与群に比較して、PCV2ウイルス感染後の体重増加が良好な傾向がみられた（図4）。
  4)臓器剖検後の観察
  剖検したリンパ節、肺、腸管について病変の重症度を評価した結果、病変発症割合と重症度は経口ワクチン投与群と無投与群で大きな差は見られなかったものの、結腸・盲腸における病変発現割合は経口ワクチン投与群で少なかった（表1）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
参考文献
Masuda, A., Lee, J. M., Miyata, T., Sato, T., Hayashi, S., Hino, M., Kusakabe, T. (2018). Purification and characterization of immunogenic recombinant virus-like particles of porcine circovirus type 2 expressed in silkworm pupae. J Gen Virol, 99(7), 917-926. https://doi.org/10.1099/jgv.0.001087 
［実施例２］妊娠豚に対するワクチン接種試験　
＜材料と方法＞
１．供試動物
PCV2抗体価の低い妊娠豚12頭（種付後2か月未満）を用いた。
２．試験区分
　試験区分は、下記表２に記載の通りとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　被検物質は飼料に混ぜて経口投与（飼料添加投与）する。
　　投与は5回/7日間の割合とする。
  新規ワクチン投与量については1日１回、カイコ蛹粉末1.0g/頭とする。
３．試験日程
　試験スケジュールは、下記表３の通りとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
４．試験方法
　1)供試物質投与
　　導入後分娩予定の概ね8週間前(±1週間程度)に、経口免疫群(T02群)に、さらに分娩予定の概ね4週間前(±1週間程度)に、経口免疫群(T01群及びT02群)に、5回/7日間サイクルの割合で飼料添加による経口投与（1頭1回あたり1g）を実施した。また、無投与対照群(T03群)を設定した。各群4頭、合計12頭を供試した。
　2)供試豚の飼育
試験期間中、通常の妊娠期間及び授乳期間用の一般飼料［中部飼料（株）またはフィードワン（株）製］を給与した。
　3)観察期間
第1回投与から離乳時までとした。
５．観察項目
　1) 体重測定（母豚）
導入時及び離乳時に体重を測定した。
　2) 採血及び抗体価測定（母豚）
第1回投与時、第2回投与時、分娩時及び離乳時まで合計4回、採血し、ELISAによる抗体価の測定を行った。
　3)　唾液採取・送付（母豚）
　採血時に合計4回唾液を採取した。
 4)　初乳採取（母豚）
　分娩時に初乳を採取した。
　5) 臨床観察（母豚・子豚）
試験期間中（分娩予定8週間前から離乳時まで）、一般臨床症状について観察を行った。
　6) 体重測定（子豚）
分娩時及び離乳時に全頭の体重を測定した。
　7) 採血及び抗体価測定（子豚）
1日齢及び離乳時の合計2回、各腹について1腹当たり5頭について採血を実施し、ELISAによる抗体価の測定を行った。
６．統計学的解析
　統計学的解析は、正規性の判定をShapiro-Wilk検定で確認したのち、Kruskal-Wallis検定及びBonferroni補正したWilcoxon順位和検定により行った。
７．有効性評価
　1)　血清中のPCV2抗原特異的IgG及びIgA抗体価
　2)　唾液中のPCV2抗原特異的IgG及びIgA抗体価
　3)　初乳中のPCV2抗原特異的IgG及びIgA抗体価
＜結果＞
　結果を図５及び図６に示す。
　図５は、母豚の分娩時における初乳中のIgG及びIgAの抗体価を示す図である。
　パネルＡは、初乳（4000倍希釈）中のPCV2抗原特異的IgG応答の結果（ELISA）である。T1、T2及びT03の各グラフのバーは、左から経口免疫群（T01群）乳清の吸光度、経口免疫群（T02群）乳清の吸光度、無投与対照群(T03群) 乳清の吸光度を示す。
　パネルＢは、初乳（250倍希釈）中のPCV2抗原特異的IgＡ応答の結果（ELISA）である。T1、T2及びT03の各グラフのバーは、左から経口免疫群（T01群）乳清の吸光度、経口免疫群（T02群）乳清の吸光度、無投与対照群(T03群) 乳清の吸光度を示す。
　図５より、母豚の初乳中においてIgG及びIgA応答反応が観察され、母乳中にもワクチン効果を得ることが示された。
　図６は、子豚の１日齢における血清中のIgG及びIgAの抗体価を示す図である。
　パネルＡは、子豚１日齢の血清（4000倍希釈）中のPCV2抗原特異的IgG応答の結果（ELISA）である。T1、T2及びT03の各グラフのバーは、それぞれ、経口免疫群（T01群）から分娩された子豚血清の吸光度、経口免疫群（T02群）から分娩された子豚血清の吸光度、無投与対照群(T03群)から分娩された子豚血清の吸光度を示す。
　パネルＢは、子豚１日齢の血清（1000倍希釈）中のPCV2抗原特異的IgＡ応答の結果（ELISA）である。T1、T2及びT03の各グラフのバーは、それぞれ、経口免疫群（T01群）から分娩された子豚血清の吸光度、経口免疫群（T02群）から分娩された子豚血清の吸光度、無投与対照群(T03群)から分娩された子豚血清の吸光度を示す。
　図６より、経口ワクチンを接種された母豚の初乳を受けた子豚であっても、１日齢において血清中においてIgG及びIgA応答反応が観察され、母乳を介して子豚にもワクチン効果が移行されることが示された。
［実施例３］PCV2に対する新規ワクチンの子豚への経口投与による効果確認試験-2（用法用量検討）
＜試験方法＞
1．供試物質
新規ワクチン：ブタPCV2新規経口ワクチン(PCV2 rCap/VLP発現カイコ蛹粉末) 1種類
陽性対照：サーコフレックス（ベーリンガーインゲルハイムベトメディカ株式会社製）
2．供試動物
繁殖豚新規サーコウイルスワクチン試験での陰性対照群からの娩出産子、及び一部ワクチン接種母豚からの娩出産子を供試して、ブタPCV2感染症新規ワクチンの子豚に対する有効性をブタPCV2ウイルスによる実験的攻撃試験で確認した。試験は試験区分に示した合計28頭を試験に供試した（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
4．試験日程
　試験日程は表５に記載の通り行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
5．試験方法
1)供試物質投与
供試物質投与は、試験区分に従って実施した。本実施例では、各群での群飼育とし、投与は強制経口投与とした。強制経口投与は供試物質をあらかじめ0.5g秤量して50mLPPチューブに入れ、ブタを保定して経口投与した。経口投与後約20mLの水道水を追加で強制的に経口摂取させた。
試験群は7群を設定し、各群4頭の合計28頭を供試した。
2)攻撃方法
免疫開始後28日（9週齢から10週令）の時点で、ブタPCV2（KDK野外分離株：PCV2）培養液5 mLを供試豚の鼻腔内に1日1回2日間噴霧投与することにより攻撃した。なお、攻撃菌数はリアルタイムPCR(qPCR)にて測定した。
3)供試豚の飼育
試験期間中、抗菌性物質を含有していない子豚試験用標準飼料SDS No. 2［フィードワン（株）製］を給与した。
4)観察期間
第1回投与から8週間とした。
6．観察項目
1) 体重測定
第1回投与開始時から剖検時まで毎週1回、体重を測定した。
2) 採血，血中PCV2定量及び抗体価測定
第1回投与開始時から剖検時まで、1週間間隔で合計9回の採血を実施して血中のPCV2定量(qPCR)を測定（PCR測定は攻撃後のみ）した。
3)　唾液採取・送付
第1回投与開始時から剖検時まで、1週間間隔で合計9回、採血時に唾液を採取した。
4) 臨床観察
試験期間中（56日間）、一般臨床症状について観察した。死亡及び淘汰例については可能な限り原因を究明し記録することとしたが、本実施例では発生しなかった。
5) 剖検及び肺病変観察
第1回攻撃後28日で剖検を実施した。肺、肺門リンパ節、腸管膜リンパ節及び鼠径部リンパ節を採材した。
6) PCV2定量（リアルタイムPCR）
攻撃以降の血清及び剖検時検査対象臓器からブタPCV2をリアルタイムPCRにて定量した。
7．統計学的解析
1)　増体量：Dunnetの検定（ｐ<0.05, P<0.01）。
2)　PCR定量：Steel-Dwassの方法により試験群間の比較検定を行った。
8．有効性評価
1)　増体量及び血中PCV2ウイルス量(q-PCR)
　2)　血清中のIgG抗体価 
　3)　唾液中のIgA抗体価
＜試験結果＞
試験設定から4週間の免疫付加試験とその後4週間の攻撃試験に分けて記載することとした。
１．免疫付加試験
1) 体重及び増体量
群毎の体重及び増体量の結果、試験期間4週間の各群の平均総増体量は18.2kg～20.4kgであり、Tukey-Kramerの検定の結果、群間に有意差は確認されなかった。
2)　臨床症状
群毎の臨床症状について、試験期間中、活力・食欲、糞便性状等臨床症状の異常は一切確認できなかった。
２．攻撃試験
1) 体重及び増体量
試験期間4週間の平均総増体量は 攻撃無投与対照群(以下T07)で7.3kgであったのに対し、Cap発現カイコ蛹0.5g×10日間投与群(以下T01)で16.9kg、Cap発現カイコ蛹0.5g×6日間投与群(以下T02)で17.8kg、Cap発現カイコ蛹0.5g×3日間投与群(以下T03)で19.3kg、母豚投与(1サイクル)産出子豚攻撃群(以下T04)で9.0kg、母豚投与(2サイクル)産出子豚攻撃群(以下T05)で13.8kgであり、サーコフレックス投与(1回筋肉内投与)群(以下T06)で17.0kgであり、投与群は高い増体量を示した（図７）。
投与群の中ではT01、T02、T03、T05、T06は高い増体量が確認された。Dunnetの検定（ｐ<0.05）の結果、試験期間4週間の総増体量(4-8W)でT01、T02、T03及びT06群について陰性対照群のT07群より有意に高い数値を示した（図７）。
2) 血中PCV2ウイルス遺伝子定量
血中 PCV2遺伝子平均定量数値及びT07（攻撃対照群）に対する割合を表６に、経時的遺伝子量推移を図８に示した。
遺伝子定量では攻撃後4週において、T07で972125 copies/μLと高値を検出したのに対し、投与各群のT07に対する割合はT01で0.4%、T02で0.1%、T03で0.3%、T04で58.7%、T05で39.0%、T06で0.0%であり、特にT01、T02、T03及びT06で顕著に低い数値であった。
血中のPCV2遺伝子量測定ではサーコフレックス投与群最も低い検出量であり、これに続いて、Cap発現カイコ蛹0.5g投与群も投与量に関係なく顕著に低い検出量であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
3) 血清中PCV2抗原特異的抗体価
血清中の抗体量を評価するため、ELISA法を用いた抗原特異的IgG検出を行った結果、T06では免疫後2週目より吸光度が上昇して免疫後4週目（攻撃開始前）での吸光度は1.969を示し、経口免疫群では免疫後3週目から吸光度が上昇して免疫後4週目（攻撃開始前）での吸光度は0.3から0.757を示した（図９）。
＜まとめ＞
ウイルス攻撃試験の結果、子豚への経口免疫群では蛹粉末0.5g×3日間と投与量・投与日数を減らした用法用量においても、増体効果、ウイルス増殖の抑制および抗原特異的IgG抗体の誘導がみられ、PCV2に対する優れたワクチン効果が示された。
また、移行免疫のみでは上記経口免疫群ほどのウイルス増殖の抑制効果はみられなかったものの、ウイルス攻撃後の一定の増体効果がみられたことから、移行免疫のみで有効な免疫手段となる可能性が示唆された。
［実施例４］PCV2に対する新規ワクチンの妊娠豚への経口投与後における子豚での移行抗体消長確認試験
＜方法＞
１．供試動物
各群母豚4頭から娩出された子豚のうち、採血した各腹5頭の計60頭を試験に供した。
２．試験区分
　試験区分を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
３．試験日程
試験日程を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
4．観察項目
1) 体重測定
試験開始後0日（4～5週齢）、28日（8～9週齢）及び56日（12～13週齢）に個体ごと体重を測定した。
2) 採血及び唾液採取
体重測定日に、全頭の採血及び唾液を採取した。
3) 臨床観察
  試験期間中の一般状態（元気、食欲、糞便性状等）について観察した。
4) 血中抗体価測定
血清中に含まれるPCV2に対するIｇGをELISA法により測定した。
＜試験結果＞
1．体重
各群の平均体重は試験開始後0、28及び56日の順に、T01は16.5、33.8及び54.2 kg、T02は10.3、26.1及び46.2 kg、T03は15.4、33.7及び54.1 kgであった。
平均期間増体量は試験開始後0～28日、28～56日及び全期間の順にT01は17.3、20.4及び37.7 kg、T02は15.9、20.1及び36.0 kg、T03は18.3、20.4及び38.7 kgであった。
２．血清中IgG抗体価
試験開始時（子豚4～5週齢）及び試験開始後4週間後（子豚8～9週齢）において、T02群の吸光度は他の２群と比較して有意に高い値を示した。試験開始後8週間後（子豚12～13週齢）では、T02群で吸光度が高い傾向を示した（図１０）。
＜まとめ＞
移行抗体の抗体消長をELISA法により評価した結果、子豚8～9週齢のタイミングにおいても無投与群と比較して有意に抗体を保持していることが示された。市販の注射ワクチンでは子豚に移行抗体を5週齢まで維持できることを効果として謳う製品もあるため、、本実施例の母豚免疫試験にて、母豚へのカイコ由来抗原の経口投与は子豚に対し移行抗体による優れた免疫効果を賦与するものと考えられた。
配列番号１：合成DNA
配列番号２：合成コンストラクト

Claims (11)

  1. 　ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルスの感染処理及び凍結乾燥処理された、バキュロウイルス感染性昆虫の蛹又は細胞を含む、ブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチン組成物。
  2. 　ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号１に示されるものである請求項１に記載の経口ワクチン組成物。
  3. 　アジュバントを含む溶液をさらに含む、請求項１に記載の経口ワクチン組成物。
  4. 　蛹が、組成物の全重量に対して少なくとも２０重量％含まれる、請求項１に記載の経口ワクチン組成物。
  5. 　ブタサーコウイルス関連疾患が、離乳後多臓器性発育不良症候群、豚皮膚炎腎症症候群、豚呼吸器複合感染症及び繁殖障害からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の経口ワクチン組成物。
  6. 　ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルスを、バキュロウイルス感染性昆虫の幼虫又は蛹に感染させ、当該感染後の幼虫から蛹化した蛹、又は当該感染後の蛹を凍結乾燥する工程を含む、ブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチンの製造方法。
  7. 　ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするＤＮＡが導入された組換えバキュロウイルスを、バキュロウイルス感染性の細胞に感染させ、当該感染後の細胞を凍結乾燥する工程を含む、ブタサーコウイルス関連疾患に対する経口ワクチンの製造方法。
  8. 　ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号１に示されるものである請求項６又は７に記載の経口ワクチン組成物。
  9. 　昆虫がカイコである請求項６に記載の方法。
  10. 　細胞が、クワゴマダラヒトリ、サクサン、カイコ、ヨトウガ又はイラクサギンウワバに由来するものである請求項７に記載の方法。
  11. 請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物を、ブタに投与する工程を含む、ブタサーコウイルスに対するブタの免疫方法。　
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