JP5726395B2 - Ｐｃｖ２免疫原性組成物及びそのような組成物を製造する方法 - Google Patents

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Description

関連する出願
本出願は２００４年１２月３０日出願の仮出願番号６０／６４０，５１０及び２００５年１月３１日に出願の出願番号１１／０３４，７３７の優先権を主張し、それらの教示と内容はここに参照により取り込まれる。
配列表
この出願は紙面及びコンピューターで読めるフォーマットの配列表を含み、その教示と内容はここに参照により取り込まれる。
発明の背景
発明の分野
本発明の一態様は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）によって発現されるタンパク質の回収に関する。
より詳細には、タンパク質はブタサーコウイルス２型の組換えコード配列、オープンリーディングフレーム２を含むトランスフェクトされたウイルスにより発現される組換えタンパク質である。
よりさらに詳細には、トランスフェクトされたウイルスは培地中の細胞に感染させられ、オープンリーディングフレーム２によって発現されるタンパク質が、細胞の内部よりもむしろ、上清中で回収される。
よりいっそう詳細には、この方法はブタサーコウイルス２型由来オープンリーディングフレーム２遺伝子を増幅し、この増幅された部分を最初のベクターにクローニングし、オープンリーディングフレーム２部分を最初のベクターから切り出してそれを運搬ベクターにクローニングし、運搬ベクターをウイルスベクターとともに倍地中の細胞にコトランスフェクトし、細胞にウイルスベクターによる感染を引き起こしてそれによってオープンリーディングフレーム２を発現させ、そして、発現されたオープンリーディングフレーム２にコードされる組換えタンパク質を上清中で回収するステップを含む。
別の態様では、本発明はＰＣＶ２に対する免疫応答を誘導するのに有効な免疫原性組成物、及びそれらの免疫原性組成物を製造する方法に関する。
より詳細には、本発明はその組成物を与えられる動物を防御し、ＰＣＶ２感染に関連する臨床症状の重篤さを減らす又軽くする免疫応答をもたらすために有効な免疫原性組成物に関する。よりさらに詳細には、本発明はＰＣＶ２による感染に対する有効な防御を与えるタンパク質ベースの免疫原性組成物に関する。
よりいっそう詳細には、本発明は、ＰＣＶ２−ＯＲＦ２の投与がＰＣＶ２による感染に対する防御をもたらす、ＰＣＶ２のＯＲＦ２を含んでなる免疫原性組成物に関する。
最も詳細には、本発明は免疫原性組成物を与えられるブタに効果的な免疫を与えるために有効な免疫原性組成物に関し、ここで、その組成物はＰＣＶ２のＯＲＦ２によって発現されるタンパク質を含んでなる。
先行技術の記載
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）は小さな（直径１７―２２μｍ）、正二十面体（イコサヘドラル）の、エンベロープがないＤＮＡウイルスであり、一本鎖の環状ゲノムをもつ。ＰＣＶ２は、ブタサーコウイルス１型とおよそ８０％の配列同一性をもつ。
しかしながら、概して非病原性のＰＣＶ１とは対照的に、ＰＣＶ２に感染したブタは、離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）と通常いわれる症候群を呈する。ＰＭＷＳは臨床的に、削痩、皮膚の蒼白、増体重の減少、呼吸困難、下痢、及び黄疸によって特徴付けられる。
感染ブタでは、全ての症状の組合せが現れるものもあるが、１または２の症状しかないものもある。解剖中に、微視的及び巨視的な病変もまた複数の組織や器官に現れ、リンパ器官が最も普通の病変の部位である。
ＰＣＶ２の核酸の量又は抗原と微視的なリンパ病変の間に、強い相関が観察される。ＰＣＶ２に感染したブタの死亡率は８０％に達しうる。
ＰＭＷＳに加え、ＰＣＶ２は、オーエスキー病、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）、グレーサー病、連鎖球菌性髄膜炎、サルモネラ症、大腸菌症、肝臓症及び化膿性気管支肺炎を含む、他のいくつかの感染症に関係している。
ＰＣＶ２のオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動したときに分子量約３０ｋＤａをもち、以前から、ＰＣＶ２に対するワクチンの抗原成分として扱われてきた。そのようなワクチンで使用するためのＯＲＦ２を得る代表的な方法は、一般に、ＯＲＦ２をコードするＰＣＶ２のＤＮＡを増幅し、ウイルスベクターにＯＲＦ２ ＤＮＡをトランスフェクトし、ＯＲＦ２ ＤＮＡを含むウイルスベクターを細胞に感染し、細胞中でウイルスにＯＲＦ２タンパク質を発現させ、そして、細胞溶解によってＯＲＦ２タンパク質を細胞から抽出することからなる。
これらの手順は概してウイルスベクターによる細胞の感染後、約４日間までを必要とする。しかしながら、これらの手順は抽出手順が費用と時間の両方がかかるという点において、欠点を有している。その上、細胞から回収されるＯＲＦ２の量がそれほど多くない；従って、十分な量の組換え発現タンパク質をワクチンその他に使用するために得るために、多数の細胞が多数のウイルスベクターによって感染される必要がある。
ＰＣＶ２の免疫化に対する現在のアプローチは、米国特許第６，７０３，０２３号のような、ＤＮＡベースのワクチンを含む。しかしながら、そのようなワクチンはＰＣＶ２感染及びそれに伴う臨床症状に対する防御免疫を与える際に有効ではなかった。
従って、当該技術分野において必要なものは、ＯＲＦ２タンパク質を感染細胞内からＯＲＦ２タンパク質を抽出することを要しない、ＯＲＦ２タンパク質を得る方法である。さらに必要なものは、組換えＯＲＦ２タンパク質をワクチン組成物を効果的に調製するのに十分な量得る方法である。
よりさらに必要なものは、現在のＯＲＦ２タンパク質抽出プロトコールには不可欠な、複雑で人手がかかる方法を要しないＯＲＦ２タンパク質を得る方法である。最後に、組成物に関しては、当該技術分野において必要なものは、ＰＣＶ２感染に対する防御免疫を与え、それに関する臨床症状の重さを軽くする、又は防ぐ、免疫原性組成物である。
発明の要約
本発明は先行技術に内在する課題を克服し、技術水準に明確な進歩を提供する。詳細に述べると、本発明の一態様は組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を生産及び／又は回収するための改良された方法を、ｉ）ＯＲＦ２タンパク質が組換えウイルスベクターによって発現される、培養中の感受性細胞にＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡをコードする配列を含む組換えウイルスベクターを感染させること、及びｉｉ）その後、ＯＲＦ２を上清中で回収すること、によって提供する。
細胞内からＰＣＶ２ ＯＲＦ２を抽出する典型的な以前のＰＣＶ２ ＯＲＦ２回収プロセスを越えて、感染とそれに続く感染細胞のインキュベーションが行われれば、ＯＲＦ２が大量に上清中に放出されることが、予期せず知見された。さらに、驚くべきことに、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質は生産細胞外での通常の分解に対して強いということが知見された。
２つの知見によって、大量のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質をＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含み、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発現する組換えウイルスベクターに感染した細胞培養の上清から回収することができる。大量のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質とは、約２０μｇ／ｍＬ上清を超えること、好ましくは約２５μｇ／ｍＬ超、よりいっそう好ましくは約３０μｇ／ｍＬ超、よりいっそう好ましくは約５０μｇ／ｍＬ超、よりいっそう好ましくは約６０μｇ／ｍＬ超、よりいっそう好ましくは約８０μｇ／ｍＬ超、よりっそう好ましくは約１００μｇ／ｍＬ超、よりいっそう好ましくは約１５０μｇ／ｍＬ超、最も好ましくは約１９０μｇ／ｍＬ超を意味する。これらの発現率はまた、例えば、実施例１から３に記載される方法によって達成することもできる。
好ましい細胞培養は約０．３−２．０×１０６細胞／ｍＬの間の、より好ましくは０．３５−１．９×１０６細胞／ｍＬの、よりさらに好ましくは約０．４−１．８×１０６細胞／ｍＬの、よりいっそう好ましくは約０．５−１．５×１０６細胞／ｍＬの細胞数カウントをもつ。
好ましい細胞は当業者によって決定可能である。好ましい細胞は、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含み、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発言する、適切な組換えウイルスベクターの感染に感受性のものである。好ましくは、細胞は昆虫細胞であり、より好ましくは、それらは、Ｓｆ＋昆虫細胞（プロテインサイエンスコーポレーション、メリデン、ＣＴ）の商標の下に販売される昆虫細胞を含む。
適切な培地もまた、いわゆる当業者によって、好ましい培地はエクセル４２０（ＪＲＨバイオサイエンス、レネクサ、ＫＳ）その他のような無血清昆虫細胞培地であると、決定されるだろう。
好ましいウイルスベクターは、特に生産細胞が昆虫細胞ならば、バキュロゴールド（ＢＤバイオサイエンス、ファーミンゲン、サンディエゴ、ＣＡ）のようなバキュロウイルスを含む。バキュロウイルス発現系が好ましいが、当業者によって他の発現系も本発明の目的、つまり、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２の細胞培養上清中への発現、のために利用できると理解される。そのような他の発現系では、ＯＲＦ２の培地中への発現を引き起こすために、シグナル配列が必要かもしれない。
驚くべきことに、ＯＲＦ２がバキュロウイルス発現系で生産されるとき、培地中へのＯＲＦ２の発現を引き起こすために、いかなるシグナル配列又はさらなる改変が必要とされないということが知見された。このタンパク質は独立にウイルス様粒子を形成でき（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． ８１， ｐｐ． ２２８１−２２８７ （２０００））、培養上清に分泌されると信じられている。
ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡ配列を含む組換えウイルスベクターは、感受性細胞の感染に使用されるとき、約０．０３−１．５の好ましい多重感染度（ＭＯＩ）を、より好ましくは約０．０５−１．３の、よりさらに好ましくは約０．０９−１．１の、そして、最も好ましくは約０．１−１．０のものをもつ。好ましくは、上記のＭＯＩは１ｍＬの細胞培養液に関する。
好ましくは、ここに記載の方法は、０．３５−１．９×１０６細胞／ｍＬの、よりさらに好ましくは約０．４−１．８×１０６細胞／ｍＬの、よりいっそう好ましくは約０．４５−１．７×１０６細胞／ｍＬの、そして最も好ましくは約０．５−１．５×１０６細胞／ｍＬの細胞に、約０．０３−１．５の間の、より好ましくは約０．０５−１．３の、よりさらに好ましくは約０．０９−１．１の、そして最も好ましくは約０．１−１．０のＭＯＩ（多重感染度）をもつ、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含みＰＣＶ２ ＯＲＦ タンパク質を発現する組換えウイルスベクターが感染することを含んでなる。
感染した細胞はそれから、１０日間まで、より好ましくは約２日間から約１０日間、よりさらに好ましくは約４日間から約９日間、よりさらに好ましくは約５日間から約８日間の期間にわたってインキュベートされる。好ましいインキュベーション条件は、約２２−３２℃の間の、より好ましくは約２４℃から３０℃の、よりさらに好ましくは約２５−２９℃の、よりいっそう好ましくは約２６−２８℃の、そして最も好ましくは約２７℃の温度を含む。
好ましくは、Ｓｆ＋細胞は接種に続き、バキュロウイルスによって誘導される特徴が観察される。そのような観察は細胞密度の変化及び感染後期間中の生存率減少のモニタリングを含んでもよい。ウイルスタイターのピークが感染後３−５日後に観察され、ＯＲＦ２の細胞から上清中へのリリースのピークが５日目と８日目の間、及び／又は細胞生存率が１０％未満に減少したときに得られることが知見された。
そして、本発明の一態様は、組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の生産及び／又は回収の、好ましくは上述の量における、改良された方法を、ｉ）多数の感受性細胞（上記を見よ）に上で定義されるＭＯＩをもつ組換えウイルスベクターを培養中で感染させること、ｉｉ）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を組換えウイルスベクターによって発現させること、及びｉｉｉ）その後、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質、を感染後５日目と８日目の間、及び／又は細胞生存率が１０％未満に減少するときに得られる細胞の上清から回収すること、によって提供する。
好ましくは、組換えウイルスベクターは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡをコードする配列を含む組換えバキュロウイルスであり、細胞はＳｆ＋細胞である。さらに、培養はコンタミネーションの巨視的及び微視的な兆候、又は細胞形態の非定型的な変化を、感染後期間中定期的に検査をされることが好ましい。何らかのコンタミネーションを示す培養は廃棄されるべきである。好ましくは、発現されるＯＲＦ２組換えタンパク質は、細胞によって、細胞の生存を維持する周囲の培地に分泌される。ＯＲＦ２は、その後、細胞そのものからよりもむしろ、細胞を取り囲む上清中から回収される。
回収プロセスは好ましくは、分離ステップによる培地中に発現されたＯＲＦ２からの細胞片の分離から始まる。好ましい分離ステップは、ろ過、約２０，０００×ｇまでのスピードでの遠心分離、連続フロー遠心分離、イオン交換又はゲルろ過を用いるクロマトグラフィーによる分離、及びコンベンショナルなイムノアフィニティ法を含む。
これらの方法は、例えば、（ハリスとエンジェル（編集）、タンパク質精製法―実践的アプローチ、ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９９５）によって、いわゆる当業者には公知である。最も好ましい分離法は、約２０，０００×ｇまでの回転数での遠心分離及びろ過を含む。
好ましいろ過法は、中空糸ろ過閉端精密ろ過を含む閉端精密ろ過及びタンジェンシャルフロー（又はクロスフロー）ろ過である。もちろん、閉端精密ろ過が好ましい。閉端精密ろ過のための好ましいポアサイズは、約０．３０−１．３５μｍ、より好ましくは約０．３５−１．２５μｍ、よりさらに好ましくは約０．４０−１．１０μｍ、及び最も好ましくは約０．４５−１．０μｍである。いかなるコンベンショナルなろ過膜でも本発明の目的のために使うことができ、ポリエーテルスルホン膜が好ましいと信じられる。どんな低分子量の核酸種であってもろ過ステップの間に除去される。
そして、本発明のさらに別の態様は、組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の製造及び／又は回収の、好ましくは上述の量における、改良された方法を、ｉ）多数の感受性細胞（上記を見よ）を上で定義されるＭＯＩをもつ組換えウイルスベクターに培養中で感染させること、ｉｉ）ＰＣＶ ＯＲＦ２タンパク質を組換えウイルスベクターによって発現すること、ｉｉｉ）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を、感染後５日目と８日目の間及び／又は細胞生存率が１０％未満に減少するときに得られる細胞の上清中で回収すること、及びｉｖ）細胞片を発現されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２から分離ステップで分離すること、によって提供する。
好ましくは、組換えウイルスベクターが、ＯＲＦ２ ＤＮＡをコードする配列を含むバキュロウイルスであり、細胞がＳＦ＋細胞である。好ましい分離ステップは上に記載のものである。約０．３０−１．３５μｍの、より好ましくは約０．３５−１．２５μｍの間の、よりさらに好ましくは約０．４０−１．１０μｍの間の、そして最も好ましくは約０．４５−１．０μｍの間のポアサイズを有する膜を使用する閉端精密ろ過が最も好ましい。
ワクチンのような免疫原性又は免疫学的組成物に使用されるであろうＰＣＶ２ ＯＲＦ２を回収するためには、ウイルスベクターを不活化するために不活化ステップを含むことが好ましい。
“免疫原性又は免疫学的組成物”とは、ホストの体内で対象の組成物又はワクチンに対する細胞性及び／又は抗体による免疫応答の免疫学的応答を誘導する少なくとも１つの抗原を含んでなる物質の混合物をいう。
通常、“免疫学的反応”は、１又は２以上の次の効果を含むが、これらに限定されない：対象の組成物又はワクチン中に含まれる抗原に特異的に誘導された、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はｙｄ Ｔ細胞の生産又は活性化。
好ましくは、ホストは新しい感染に対する抵抗性が増大される及び／又は病気の臨床的重篤さが軽減されるというような治療的あるいは防御的な免疫学的応答を示す。そのような防御は感染ホストによって普通示されるに症状が軽減あるいは無いこと、より迅速な回復時間及び／又は感染ホスト内のより低レベルのウイルスタイターよって示されるだろう。
そして、本発明はまた、組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２たんぱく質の、好ましくは上述の量における、生産及び／又は回収の、ｉ）多数の感受性細胞（上記を見よ）に先に定義されたＭＯＩをもつ組換えウイルスベクターを培養中で感染させること、ｉｉ）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を組換えウイルスベクターによって発現すること、ｉｉｉ）感染後５日目と８日目の間及び／又は細胞生存率が１０％未満に減少するときに得られる細胞の上清中でＰＣＶ２ ＯＲＦ２を回収すること、ｉｖ）分離ステップにより細胞片を発現されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２から分離すること、及びｖ）組換えウイルスベクターを不活化すること、による方法に関する。
好ましくは、この不活化はろ過ステップの直前あるいは、ろ過ステップの後に不活化のために好ましい時間があれば、直後に行われる。いかなるコンベンショナルな不活化法が本発明の目的のために使用できる。そして、不活化は化学的及び／または物理学的処理によって行われうる。
好ましい形態では、回収液の容量が決定され、温度が約３２−４２℃の間、より好ましくは約３４−４０℃の間、及び最も好ましくは３５−３９℃の間に引き上げられる。
好ましい不活化ステップは環化されたバイナリエチレンイミン（ＢＥＩ）を、好ましくは、約１から約２０ｍＭの、好ましくは約２から約１０ｍＭの、よりさらに好ましくは約２から約８ｍＭの、よりさらに好ましくは約３から７ｍＭの、最も好ましくは約５ｍＭの濃度で加えることを含む。
例えば、不活化は２−ブロモエチレンアミン臭化水素酸塩の溶液を、好ましくは約０．４Ｍの、環化して０．２Ｍバイナリエチレンイミン（ＢＥＩ）の０．３Ｎ ＮａＯＨ溶液となる、溶液を、約５ｍＭのＢＥＩ終濃度を与えるように液に加えることを含む。好ましくは、液はそれから７２−９６時間連続的に撹拌され、不活化された回収液は凍結して−４０℃以下、又は１−７℃の間で保存できる。
不活化が完了の後、チオ硫酸ナトリウムが、好ましくは１．０Ｍのものが、残りのＢＥＩを中和するために加えられる。好ましくは、チオ硫酸ナトリウムは不活化のために先に加えられたＢＥＩに対して当量加えられる。例えば、ＢＥＩが終濃度５ｍＭに加えられているとき、１．０Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液は残りのＢＥＩを中和するために最終的な最小濃度５ｍＭを与えるために加えられる。
そして、本発明のさらに別の態様は組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を、好ましくは上述の量において、ｉ）多数の感受性細胞（上記を見よ）上に記載されるＭＯＩをもつ組換えウイルスベクターに培養中で感染させること、ｉｉ）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を組換えウイルスベクターによって発現すること、ｉｉｉ）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２を感染後５日目から８日目の間及び／又は細胞生存率が１０％以下に減少するときに得られる細胞の上清中で回収すること、ｉｖ）分離ステップで細胞片を発現されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２から分離すること、及びｖ）組換えウイルスベクターを不活化すること、によって生産する方法に関する。
好ましくは、組換えウイルスベクターがＯＲＦ２ ＤＮＡをコードする配列を含むバキュロウイルスであり、細胞がＳＦ＋細胞である。好ましい分離ステップは上述のものであり、最も好ましいものはろ過ステップである。好ましい不活化ステップは上述のものである。好ましくは、不活化は３５−３９℃の間で２から８ｍＭのＢＥＩ存在下で、よりさらに好ましくは約５ｍＭのＢＥＩの存在下で行われる。驚くべきことに、より高い濃度のＢＥＩがＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質に負の影響を及ぼすことがわかった。
本発明のさらに別の態様では、上に記載の方法はまた、ステップｖ）の後に中和ステップを含む。このステップｖｉ）は、溶液中の不活化薬剤を中和する当量の薬剤を加えることを含んでなる。好ましくは、不活化薬剤がＢＥＩならば、チオ硫酸ナトリウムを当量加えることが好ましい。
そして、さらなる態様では、ステップｖｉ）は、不活化薬剤がＢＥＩのとき、チオ硫酸ナトリウム溶液を終濃度約１から約２０ｍＭ、好ましくは約２から１０ｍＭ、よりさらに好ましくは約２から約８ｍＭ、よりさらに好ましくは約３から約７ｍＭ、最も好ましくは７ｍＭとするように加えることを含む。
好ましい形態及び特に組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２をワクチンのような免疫原性組成物中で使う形態では、回収されたＯＲＦ２の各ロットは不活化の検査が、足場依存性、バキュロウイルス感受性Ｓｆ＋細胞での継代によって検査されるだろう。この検査の好ましい形態では、１５０ｃｍ２の好ましい細胞培養モノレイヤーが１．０ｍＬの不活化ＰＣＶ２液で接種され、２５−２９℃で１４日間、少なくとも２回継代して保育される。保育期間の終わりに、細胞モノレイヤーはＰＣＶ２ ＯＲＦ２バキュロウイルスに典型的な細胞変性効果（ＣＰＥ）を検査される。
好ましくは陽性ウイルスコントロールもまた使用される。そのようなコントロールは、非不活化リファレンスＰＣＶ２ ＯＲＦ２を接種したＳｆ＋細胞の１つの培養及び接種しないままのＳｆ＋細胞の１つのフラスコからなってもよい。インキュベーションと継代の後、ＢＥＩ処理されたウイルス液中にウイルスに感染した細胞が無いことが十分な不活化試験となろう。
リファレンスウイルスを接種したコントロール細胞はＰＣＶ２ ＯＲＦ２バキュロウイルスに典型的なＣＰＥを示すべきであり、接種しなかったフラスコはＰＣＶ２ ＯＲＦ２バキュロウイルスのＣＰＥのいかなる徴候も示してはならない。
あるいは、保育期間の終わりに、上清サンプルが採集され、Ｓｆ＋細胞をローディングしたＳｆ＋９６ウェルプレートに接種され、その後、２５−２９℃で５−６日間保育される。プレートはそれから固定され、抗ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗体結合ＦＩＴＣで染色される。
ＩＦＡ顕微鏡によって観察されるＣＰＥとＯＲＦ２発現がＢＥＩ処理ウイルス液で無いことが十分な不活化試験である。リファレンスウイルスを接種したコントロール細胞はＣＰＥ及びＩＦＡ活性を示すべきであり、非接種フラスコはＰＣＶ２ ＯＲＦ２バキュロウイルスのＣＰＥを示したり、ＩＦＡ活性を含んだりしてはならない。
そして、本発明のさらに別の態様は組換えウイルスベクターの不活化の効果を確認するための不活化試験に関し、次のステップを含んでなる：ｉ）組換えウイルスベクターを含む培養液の少なくとも一部を、好ましくは上述のように、不活化薬剤に接触すること、ｉｉ）不活化薬剤を中和するために中和薬剤を、好ましくは上述のように、加えること、及びｉｉｉ）上に記載の測定法によって、残った感染性を測定する。
不活化後、サンプル中の組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の相対量がいくつもの方法によって決定できる。好ましい定量方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥデンシトメトリ、ＥＬＩＳＡ、及びワクチンの既知量と臨床的な結論（血清学等）と相関する、実験動物にワクチンを接種する研究である。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥが定量のために使われるとき、未知量の組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含むサンプル物質が、異なる既知量の組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含むサンプルとともにゲル上を流される。標準曲線が既知のサンプルに基づいてその後作成でき、未知サンプル中の組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２の量が標準曲線との比較によって決定されうる。
ＥＬＩＳＡは抗原定量のための産業標準として一般に認められているので、それらは定量のために好ましい。
そして、さらに別の態様では、本発明はまた組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の定量のためのＥＬＩＳＡに関する。ここで提供されるような好ましいＥＬＩＳＡは、概してキャプチャー抗体をコーティング緩衝液中で１：６０００、又は適切な作業希釈物に希釈することから始まる。
好ましいキャプチャー抗体はブタ抗ＰＣＶ２ ＰＡｂタンパク質Ｇ精製であり、好ましいコーティング緩衝液は、２．９３ｇのＮａＨＣＯ３（シグマ カタログ番号Ｓ−６０１４、又は相当品）及び１．５９ｇのＮａＣＯ３（シグマ カタログ番号Ｓ−６１３９、又は相当品）を混合することによって作ることができる、０．０５Ｍ炭酸緩衝液である。混合物は、１リットル、ｐＨ９．６±０．１とするために、蒸留水、又は相当のものと合わせられる。次に、キャプチャー抗体が１：６０００に希釈されるか、又は他の適切な作業用希釈に、コーティング緩衝液中で希釈される。
例えば、４つのプレートに対して、１つあたり４２ｍＬのコーティング緩衝液及び７μＬのキャプチャー抗体を必要とするだろう。逆ピペッティング法を使い、１００μＬの希釈キャプチャー抗体が全てのウェルに加えられる。均一なコーティングを得るために各プレートの側面が穏やかにタップされるべきである。それからプレートは、プレートを重ねてその上に空の９６ウェルプレートでキャップする前に、プレートシーラーでシールされる。プレートは一晩（１４−２４時間）、３５−３９℃でインキュベートされる。
各プレートはそれから、ウルトラウォッシュプラスマイクロタイタープレートウォッシャーセットを２５０μＬ／ウォッシュで３回及びソークタイムなしの設定で使い、洗浄緩衝液で３回洗われる。最後の洗浄後、プレートはペーパータオルに叩きつけられるべきである。再び、リバースピペッティングの技法を使い、２５０μＬのブロッキング液が全てのウェルに加えられるべきである。試験プレートはシールされ、およそ１時間（±５分間）、３５−３７℃でインキュベートされるべきである。好ましくは、このステップの後はプレートを重ねない方がよい。ブロッキングステップの間に、全ての試験サンプルは取り出され、室温に戻されるべきである。
次に、４つの別個の希釈プレートが、２００μＬの希釈液をＡ行とＨ行の１−３列を除く、残りのウェル全てに加えることによって、準備されるべきである。次に、６本の試験間が次のようにラベルされるべきである。低タイター、中タイター、高タイター、不活化／ろ過（１：２４０）、不活化／ろ過（１：４８０）、及び、内部コントロール。名付けられたチューブに、適切な希釈が次の試験サンプルのために調製されるべきである。解かした試験サンプルは使用前にボルテックスされるべきである。
４つのプレートに対して、次の希釈がされる：Ａ）低タイターはプレ希釈されない：３．０ｍＬの低タイター；Ｂ）１：３０に希釈の陰性コントロール（ＳＦ＋細胞）：３．７７ｍＬの希釈液＋１３０μＬの陰性コントロール；Ｃ）１：３０に希釈の中タイター（８μｇ／ｍＬ）：３．７７ｍＬの希釈液＋１３０μＬの中タイター；Ｄ）１：９０に希釈の高タイター（１６μｇ／ｍＬ）：２．９６７ｍＬの希釈液＋３３μＬの高タイター；Ｅ）１：２４０に希釈の不活化／ろ過：２．３９ｍＬの希釈液＋１０μＬの不活化／ろ過サンプル；Ｆ）１：４８０に希釈の不活化／ろ過：１．０ｍＬの希釈液＋１．０ｍＬの上記Ｅで調製したサンプル不活化／ろ過（１：２４０）；Ｇ）１：３０に希釈の内部コントロール：３．７７ｍＬの希釈液＋１３０μＬの内部コントロール。
次に、３００μＬの調製サンプルをプレート１から４の希釈プレートの対応する空のウェルに加える。マルチチャネルピペッターが１００μＬの設定され、Ａ行の中身が少なくとも５回のピペッティングによって混合され、それから、１００μＬがリバースピペッティング技法を使いＢ行に移される。チップが交換され、同じ手順がＧ行まで行われるべきである。試験プレートがウルトラウォッシュプラスマイクロタイタープレートウォッシャーを使い洗浄バッファーで３回洗われた（２５０μＬ／ウォッシュ、３回洗い、ソークタイムなしに設定）ので、これらの希釈プレートのサンプルは今やいつでも試験プレートに移す準備が整っている。
最後の洗いの後、プレートはパーパータオル上でタッピングされるべきである。次に、希釈プレートの中身が、単純な移送手順を使い、試験プレートに移される。より詳しくは、H行から開始し、１００μL／ウェルが希釈プレートから試験プレートの対応するウェルに、リバースピペッティング技法を使い、移される。移すたびに、ピペットのチップは交換されるべきである。
Ｇ行から、希釈プレートの１００μＬ／ウェルが、リバースピペッティング技法を使い、試験プレートの対応するウェルに移される。同じセットのピペットチップを残りを移すために使用することができる。移しのために均一な溶液を保証するために、溶液は移しの前に少なくとも３回ピペッティング混和されるべきである。
次に試験プレートはシールされ、１．０時間±５分間、３７±２．０℃でインキュベートされる。再度、プレートを重ねないことが好ましい。プレートはその後、ウルトラウォッシュマイクロタイタープレートウォッシャー（２５０μＬ／ウォッシュ、３回洗う、ソークタイムなしに設定）を使い、洗浄バッファーで３回洗われる。最後の洗いの後、プレートはペーパータオルにタップされる。
リバースピペッティング技法を使い、希釈溶液で１：３００、又は適切な作業希釈に希釈された１００μＬの検出抗体が、試験プレートの全ウェルに加えられる。例えば、４つのプレートに対して、４２ｍＬの希釈溶液と１４０μＬのキャプチャー抗体が必要となろう。
試験プレートはその後シールされ、１．０時間±５分間、３７℃±２．０℃でインキュベートされる。再度、プレートはウルトラウォッシュプラスマイクロタイタープレートウォッシャー（２５０μＬ／ウォッシュ、３回洗浄、ソークタイムなしに設定）を使い、洗浄バッファーで３回洗われる。最後の洗いの後、プレートはペーパータオルにタップされる。
次に、コンジュゲート希釈液が１％正常ウサギ血清を希釈液に加えることによって調製される。例えば、４つのプレートのために、４２０μＬの正常ウサギ血清が４２ｍＬの希釈液に加えられる。コンジュゲート抗体は１：１０，０００、又は他の適切な作業希釈に、試験プレートの全てのウェルに新しく調製されたコンジュゲート希釈液で、希釈される。
リバースピペッティング技法を使い、１００μＬのこの希釈コンジュゲート抗体が全ウェルに加えられる。試験プレートはそれからシールされ、４５±５分間、３７℃±２．０℃でインキュベートされる。好ましくは、プレートは重ねられない。プレートはそれからウルトラウォッシュプラスマイクロタイタープレートウォッシャー（２５０μＬ／洗浄、３回洗浄、ソークタイムなしに設定）を使い、３回洗浄バッファーで洗われる。最後の洗いの後、プレートはペーパータオルにタップされる。
次に、等量のＴＭＢペルオキシダーゼ基質（試薬Ａ）がペルオキシダーゼ溶液Ｂ（試薬Ｂ）と使用直前に混合される。混合される量はプレート数によって変化するが、各プレートは１０ｍＬ／プレート＋２ｍＬを必要とする。従って、４つのプレートに対しては、２１ｍＬの試薬Ａ＋２１ｍＬの試薬Ｂである。リバースピペッティング技法を使い、１００μＬの基質が試験プレートの全てのウェルに加えられる。プレートはその後室温で１５分間±１５秒間インキュベートする。反応は１００μＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液を、リバースピペッティング技法を使い、全てのウェルに加えることによって停止させられた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーがそれから電源が入れられ、自己診断と定例のテストフェーズが終わってから次に進むことができる。
本発明のさらなる態様は、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含み、感受性細胞に感染したときに、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を大量に発現する組換えウイルスベクターを構築する方法に関する。驚くべきことに、ここで提供されるような組換えウイルスベクターは、上で説明されるように、感受性細胞に感染後、大量のＰＣＶ２ ＯＲＦ２を発現する。
それゆえ、本発明はまた、好ましくは次のステップを含んでなる、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２たんぱく質を生産及び／又は回収するための改良された方法に関する：ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含み、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発現するウイルスベクターを構築すること。好ましくは、ウイルスベクターは組換えバキュロウイルスである。
ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含み、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発現する組換えウイルスベクターを構築する方法の詳細は、ここで提供されるように、次のとおり記載される：好ましい形態では、細胞に感染するために使用されるＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含み、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発現する組換えウイルスベクターは、ＯＲＦ２をそこにクローニングされた運搬ベクターをウイルスベクターにトランスフェクトすることによって作られる。
好ましくは、運搬ベクターの、ＯＲＦ２ ＤＮＡを含む一部のみがウイルスベクターにトランスフェクトされる。“ウイルスベクターにトランスフェクトされる”という用語は、ヘテロロガスなＤＮＡを、例えば、バキュロウイルスベクターのような、ウイルスベクターに“導入する”又は“クローニングする”ことを意味し、そして、同義語として使用される。
そして、本発明のさらなる態様では、組換えウイルスベクターは、非相同のＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含む運搬ベクターとウイルスベクター、好ましくはバキュロウイルス、よりいっそう好ましくは線状非増殖性バキュロウイルス（バキュロゴールドＤＮＡのような）、との間の組換えによって作られる。
“運搬ベクター”とは、少なくとも１つの複製開始点、非相同遺伝子、この場合はＰＣＶ２ ＯＲＦ２、及び前記非相同遺伝子をウイルスベクターにクローニングさせられるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子をいう。
好ましくは、非相同遺伝子をウイルスベクターにクローニングさせられる配列はその非相同遺伝子の隣に位置する。よりいっそう好ましくは、それらのフランキング配列は少なくとも部分的にウイルスベクターの配列と相同である。配列相同性によって、非相同遺伝子を含む組換えウイルスベクターを作るために、両分子、ウイルスベクターと運搬ベクター、の組換えができる。
一つの好ましい運搬ベクターはｐＶＬ１３９２ベクター（ＢＤバイオサイエンス、ファーミンゲン）であり、それは、バキュロゴールドＤＮＡとともに好ましくはＳｆ＋細胞ラインにコトランスフェクトのために設計されている。
好ましくは、前記ウイルスベクターはＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含んでなる。コトランスフェクトされるコンストラクトは、長さ約１０，３８７塩基対である。
より好ましい形態では、本発明の方法はＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡの単離で始まるであろう。一般に、ＯＲＦ２ ＤＮＡは、分離株間で少なくとも約９５％の配列同一性を有して高度に保存されているようなので、これは既知又は未知の株からできる。公知のどんなＰＣＶ２ ＯＲＦ２遺伝子でも、上清中に発現されるだろうから、本発明の目的のために利用できる。
ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡは、好ましくはＰＣＲ法を使い増幅され、よりいっそう好ましくは５’フランキング・コザックコンセンサス配列（ＣＣＧＣＣＡＵＧ）（配列番号１）及び／又は３’フランキングＥｃｏＲＩ認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）（配列番号２）の導入とともに行われる。
５’コザックコンセンサスのこのような導入は、好ましくはＰＣＶ２ ＯＦ２の本来もっている開始コドンＡＵＧを除去する。３’ＥｃｏＲＩ認識部位は好ましくはＰＣＶ２ ＯＲＦ２の終止コドンの下流に導入される。より好ましくは、それは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２の終止コドンの下流に位置するポリＡ転写終了配列の下流に導入される。
コザックコンセンサス配列の使用は、とりわけ上述のように、続くＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の発現レベルを増大させることが知られている。増幅されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡは、これらの追加の配列とともに、ベクターにクローニングされる。この最初のクローニングステップのために好ましいベクターは、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（プロメガ、マジソン、ＷＩ）である。いくらかのｐＧＥＭベクター配列を含むＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡ（配列番号７）は、好ましくはＮｏｔＩ制限サイトでベクターから切り出される。得られるＤＮＡはそれから運搬ベクターにクローニングされる。
そして、本発明の一態様では、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含む組換えウイルスベクターを構築する方法が提供される。この方法は次のステップを含んでなる：ｉ）組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２を運搬ベクターにクローニングする；及び、ｉｉ）組換えウイルスベクターを作るために組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２を含む運搬ベクターの部分をウイルスベクターにトランスフェクトする。好ましくは、運搬ベクターは上述のものであるか、又は、上に記載されるように、若しくは、図１に例示されるように、構築される。そして、さらなる態様では、運搬ベクターは、ここに記載されるように組換えウイルスベクターを構築するために使用され、配列番号７の配列を含む。
さらに別の態様では、この方法は、ステップｉ）の前に次のステップをさらに含んでなる：インビトロでＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを増幅する。ここで、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡのフランキング配列が上述のように改変される。ＰＣＶ２ＯＲＦ２ ＤＮＡを増幅する方法及びフランキング配列を改変する方法、インビトロで増幅されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを運搬ベクターまたは適切な運搬ベクターにクローニングする方法及び運搬ベクターは、上に記載され、図１に典型的に示され、又はいわゆる当業者には公知である。
かくして、さらに別の態様では、本発明は、ｉ）インビトロでＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを増幅する。ここで、前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＮＤＡのフランキング配列が改変される、ｉｉ）増幅されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを運搬ベクターにクローニングする、及びｉｉｉ）組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含む運搬ベクター又はその一部をウイルスベクターにトランスフェクトして組換えウイルスベクターを作る、のステップを含んでなる、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含み、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ タンパク質を発現する、組換えウイルスベクターを構築する方法に関する。
好ましくは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡのフランキング配列の改変は上述のように行われる。例えば、５’コザック配列及び／又はＥｃｏＲＩ認識部位を導入することによる。好ましくは上述のように行われる。
さらに別の態様では、ＰＣＶ２のオープンリーディングフレーム２によって発現される組換えタンパク質を生産及び／又は回収する方法が提供される。その方法は、ｉ）組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２を運搬ベクターにクローニングする；ｉｉ）組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２を含む運搬ベクターの一部をウイルスにトランスフェクトする； ｉｉｉ）媒地中の細胞をトランスフェクトされたウイルスに感染させる； ｉｖ）トランスフェクトされたウイルスに組換えタンパク質をＰＣＶ２ ＯＲＦ２から発現させる； ｖ）細胞を上清から分離する； そして、ｖｉ）発現されたＰＶ２ ＯＲＦ２ タンパク質を上清から回収する、のステップを一般に含んでなる。
組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを運搬ベクターにクローニングする方法は上に記載されている。好ましくは、運搬ベクターは配列番号３、配列番号４、配列番号７の配列を含む。しかしながら、運搬ベクターは、非改変又は改変を問わず、任意のＰＣＶ２ ＯＲＦ ＤＮＡを、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡが、組換えウイルスベクターにトランスフェクトされたときに、細胞培養中で発現される限り、含むことができる。好ましくは、組換えウイルスベクターは配列番号８の配列を含んでなる。
さらに、細胞に感染する方法は、好ましくは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含みＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発現する確定した数の組換えバキュロウイルスを細胞に感染させる方法は上に詳細に記載されている。さらに、細胞を上清から分離するステップは、発現されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を回収するステップと同様に、やはり、上に詳細に記載されている。ここに記載される、これらの特定のプロセスのステップは、上述のように、ＰＣＶ２のオープンリーディングフレーム２によって発現される組換えタンパク質を製造及び／又は回収する方法の一部である。
好ましくは、細胞はＳＦ＋細胞である。よりさらに好ましくは、細胞培養は約０．３−２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの間の細胞数をもち、より好ましくは、約０．３５−１．９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、よりさらに好ましくは、約０．４−１．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、よりいっそう好ましくは、約０．４５−１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、そして、最も好ましくは、約０．５−１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。
好ましくは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含む組換えウイルスベクターは、感受性細胞への感染に使用されるときに、０．０３−１．５の間の好ましい多重感染度（ＭＯＩ）をもち、より好ましくは約０．０５から１．３であり、よりさらに好ましくは約０．０９−１．１であり、よりさらに好ましくは、約０．１−１．０であり、そして最も好ましくは、約０．５である。
好ましくは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ タンパク質を、感染後第５日と第８日の間、及び／又は細胞生残率が１０％未満にまで減少するときに得られる細胞の上清中で回収すること。好ましくは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を生産するために、細胞が２５℃から２９℃で培養される。好ましくは、分離ステップは遠心またはろ過ステップである。
任意に、この方法はＰＣＶ２からのＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを増幅するステップを、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを運搬ベクターにクローニングする前に、含むことができる。好ましい形態では、５’コザック配列、３’ＥｃｏＲＩ認識部位、及びそれらの組合せもまた、増幅される配列に、好ましくは増幅の前又はその間に、加えることができる。好ましい５’コザック配列は、配列番号１を含んでなる。好ましい３’ＥｃｏＲＩ認識部位は配列番号２を含んでなる。
好ましいＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡはヌクレオチド配列Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８６８３４（配列番号３）及び配列番号４を含んでなる。好ましい組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質は配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるが、それは配列番号３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８６８３４）及び配列番号６によってコードされるタンパク質であり、それは配列番号４によってコードされるタンパク質である。
好ましい培地は無血清昆虫細胞培地を、よりさらに好ましくはエクセル４２０培地を、含んでなる。オプションの増幅ステップが行われるとき、まず増幅されたオープンリーディングフレーム２を１番目のベクターにクローニングし、次にオープンリーディングフレーム２を１番目のベクターから切り出し、そして切り出されたオープンリーディングフレームを運搬ベクターにクローニングするために使用する、ことが好ましい。コトランスフェクションのための好ましい細胞ラインはＳＦ＋細胞ラインである。コトランスフェクションのための好ましいウイルスはバキュロウイルスである。
この方法の好ましい形態では、運搬ベクターのトランスフェクトされた部分は配列番号８を含んでなる。最後に、この方法では、ＰＣＶ２オープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）タンパク質を、細胞にウイルスが感染してから少なくとも５日間過ぎてから細胞培養上清中で回収することが好ましい。
そして、本発明のさらなる態様は、次のステップを含んでなる、ＰＣＶ２オープンリーディングフレーム２を生産及び／又は回収するための方法に関する：ｉ）インビトロでＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを、好ましくは５’コザック配列を加えて、及び／又は、３’ＥｃｏＲＩ認識部位を加えて、増幅する、ｉｉ）増幅されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２を運搬ベクターにクローニングする；ｉｉｉ）組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２を含む運搬ベクターの部分をウイルスにトランスフェクトする；ｉｖ）培地中の細胞をトランスフェクトされたウイルスで感染する；ｖ）トランスフェクトされたウイルスにＰＣＶ２ ＯＲＦ２由来の組換えタンパク質を発現させる；ｖｉ）細胞を上清から分離する；及びｖｉｉ）発現されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を上清から回収する。
本発明のさらなる態様は、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質、及び不活化ウイルスベクターを含んでなる組成物を調製するための方法に関する。この方法は次のステップを含んでなる：ｉ）増幅されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２を運搬ベクターにクローニングする；ｉｉ）組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２を含む運搬ベクターの部分をウイルスにトランスフェクトする；ｉｉｉ）培地中の細胞をトランスフェクトされたウイルスベクターで感染する；ｉｖ）トランスフェクトされたウイルスベクターにＰＣＶ２ ＯＲＦ２由来の組換えタンパク質を発現させる；ｖ）細胞を上清から分離する；ｖｉ）発現されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を上清から回収する；及びｖｉｉ）組換えウイルスベクターを不活化する。
好ましくは、組換えウイルスベクターはＯＲＦ２ ＤＮＡをコードする配列を含むバキュロウイルスであり、細胞はＳＦ＋細胞である。好ましい分離ステップは上に記載されるものであり、最も好ましいものはろ過ステップである。好ましい不活化ステップは上に記載されるものである。好ましくは、不活化は３５−３９℃の間で、２から８ｍＭのＢＥＩの存在下で、よりさらに好ましくは約５ｍＭのＢＥＩの存在下で行われる。
驚くべきことに、より高濃度のＢＥＩはＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質に悪影響を及ぼし、より低濃度では２４から７２時間の不活化の間にウイルスベクターを不活化するのに有効ではないということが見出された。好ましくは、不活化は少なくとも２４時間、よりいっそう好ましくは２４から７２時間の間行われる。
さらなる態様では、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質、及び不活化ウイルスベクターを含んでなる組成物を調製する方法はまた、上に記載されるように、ステップｖｉｉ）の後に中和ステップを含む。このステップｖｉｉｉ）は溶液中の不活化薬剤を中和する当量の薬剤を加えることを含んでなる。好ましくは、不活化薬剤がＢＥＩであれば、チオ硫酸ナトリウムを当量加えることが好ましい。
そして、さらなる態様では、ステップｖｉｉｉ）は、不活化薬剤がＢＥＩであるとき、チオ硫酸ナトリウムを終濃度約１から約２０ｍＭ、好ましくは約２から約１０ｍＭ、よりさらに好ましくは約２から８ｍＭ、よりさらに好ましくは約３から７ｍＭ、最も好ましくは約５ｍＭとなるように加えることを含んでなる。
さらなる態様では、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２、及び不活化ウイルスベクターを含んでなる組成物を調製する方法は、上に記載されるように、ステップｉ）の前に次のステップを含んでなる：ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡをインビトロで増幅する、ここでＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡの前後の配列が上に記載のように改変される。ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを増幅し、前後の配列を改変し、インビトロで増幅されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを運搬ベクターにクローニングするためのインビトロの方法及び好適な運搬ベクターは上に記載され、図１に例示的に示され、又は当業者に知られている。
そして、さらなる態様では、この方法は次のステップを含んでなる：ｉ）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡをインビトロで増幅する、ここで前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡの前後の配列が改変される、ｉｉ）増幅されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを運搬ベクターにクローニングする；及びｉｉｉ）運搬ベクター又は組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含むその一部を、組換えウイルスベクターを作るために、ウイルスベクターにトランスフェクトする、ｉｖ）培地中の細胞をトランスフェクトされたウイルスで感染する；ｖ）トランスフェクトされたウイルスにＰＣＶ２ ＯＲＦ２由来の組換えタンパク質を発現させる；ｖｉ）細胞を上清から分離する；ｖｉｉ）発現されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を上清から回収する；ｖｉｉｉ）組換えウイルスベクターを、好ましくは約１から約２０ｍＭのＢＥＩの存在下で、最も好ましくは約５ｍＭのＢＥＩの存在下で、不活化する；及びｉｘ）溶液中の不活化薬剤を中和する薬剤の当量を、不活化薬剤がＢＥＩであるときには、好ましくはチオ硫酸ナトリウム溶液を終濃度約１から約２０ｍＭで、好ましくは約５ｍＭで、加える。
本発明の別の態様では、ＰＣＶ２に対する免疫応答を引き起こすための組成物、好ましくは、例えばワクチンのような、抗原性組成物を調製する方法が提供される。概して、この方法はコンストラクトをウイルスにトランスフェクトするステップを含む。ここで、コンストラクトはｉ）ＰＣＶ２のＯＲＦ２由来組換えＤＮＡ、ｉｉ）培地中の細胞をトランスフェクトされたウイルスで感染する、ｉｉｉ）ウイルスにＰＣＶ２ ＯＲＦ２由来組換えタンパク質を発現させる、ｉｖ）発現されたＯＲＦ２タンパク質を上清中から回収する、ｖ）回収されたタンパク質を好適なアジュバント及び／又は他の薬学的に許容できる担体と混合することによって、組成物を調製する、を含んでなる。
ここで使われるような“アジュバント”は、ここで使われるように、水酸化アルミニウム及びリン酸、例えばクイルＡ、ＱＳ−２１（ケンブリッジ・バイオテック・インク、ケンブリッジ、ＣＡ）、ＧＰＩ−０１００（ガレニカ・ファーマセウティカルズ・インク、バーミンガム、ＡＬ）等のサポニン類、ウォーター・イン・オイル型エマルジョン、オイル・イン・ウォーター型エマルジョン、ウォーター・イン・オイル・イル・ウォーター型エマルジョンを含みうる。
エマルジョンは、特に軽質流動パラフィンオイル（ヨーロピアン・ファーマコピア型）；スクアラン又はスクアレンのようなイソプレノイドオイル；アルケン、特にイソブテン又はデケンのオリゴマー化によって得られるオイル；直鎖アルキル基を含む酸の、又はアルコールのエステル類、より詳しくは、植物油、オレイン酸エチル、ジカプリル酸／ジカプリン酸プロピレングリコール、トリカプリル酸／トリカプリン酸グリセリル、又はジオレイン酸プロピレングリコール；分枝した脂肪酸又はアルコールのエステル類、詳細には、イソステアリン酸エステル類、をベースとすることができる。
エマルジョンを作るために、オイルは乳化剤と組み合わせて使用される。乳剤は好ましくは非イオン性界面活性剤、特に、ソルビタンの、マンニド（例えば、無水オレイン酸マンニトール）の、グリコールの、ポリグリセロールの、プロピレングリコールの、及び、オレイン酸の、イソステアリン酸の、リシノール酸の、又は任意にエトキシル化されたヒドロキシステアリン酸のエステル、及びポリオキシプロピレン‐ポリオキシエチレンブロック共重合体、特にプルロニック製品、なかでもＬ１２１、である。
Ｈｕｎｔｅｒら、Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ（Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ，Ｄ．Ｅ．Ｓ．編集）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ｐｐ．５１−９４（１９９５）及びＴｏｄｄら、Ｖａｃｃｉｎｅ １５：５６４−５７０（１９９７）をみよ。例えば、“Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ”Ｍ．ＰｏｗｅｌｌとＭ．Ｎｅｗｍａｎ編集、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９５の１４７ページに記載されるＳＰＴエマルジョン及びこの同じ本の１８３ページに記載されるエマルジョンＭＦ５９を使うことができる。
アジュバントのさらなる例はアクリル酸又はメタクリル酸及び無水マレイン酸とアルケニル誘導体の共重合体から選ばれる化合物である。好適なアジュバント化合物は、特に糖又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルと、架橋したアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物はカルボマー（Ｐｈａｍｅｕｒｏｐａ 第８巻第２号、１９９６年６月）の用語によって知られている。
当業者はまた、少なくとも３個の、好ましくは８個を超えない、ヒドロキシル基をもち、少なくとも３個のヒドロキシル基の水素原子が少なくとも２個の炭素原子をもつ不飽和アリファトラジカルによって置換された、ポリ水酸化化合物と架橋したアクリル酸ポリマーを記載するＵＳ特許２，９０９，４６２号を参照することもできる。好ましいラジカルは２から４個の炭素原子を含むもの、例えば、ビニル基、アリル基及び他の不飽和エチレン系基である。不飽和ラジカルは、メチル基のような、他の置換基を含んでもよい。
カーボポール（ＢＦグッドリッチ社、オハイオ、ＵＳＡ）の名称で販売される製品が特に適している。それらはアリルスクロースで、又はアリルペンタエリスリトールで、架橋されている。このうち、カーボポール９７４P、９３４P及び９７１Pの名称が挙げられるかもしれない。最も好ましいのはカーボポール９７１Pの使用である。無水マレイン酸とアルケニル誘導体の共重合体、無水マレイン酸とエチレンの共重合体であるＥＭＡ（モンサント）の間。免疫原性、免疫学的又はワクチン組成物そのものが混ぜられるだろうアジュバント溶液を与えるために、これらの共重合体を水に溶解すると、好ましくは生理学的ｐＨに、中和されるだろう酸性水溶液となる。
さらに好適なアジュバントは、ＲＩＢＩアジュバントシステム（リビ社）、共重合体ブロック（ＣｙｔＲｘ社、アトランタ、ＣＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（カイロン社、エメリービル、ＣＡ）、モノリン酸リピドＡ、アブリジンリピド‐アミンアジュバント、熱易失活性Ｅ．ｃｏｌｉ由来エンテロトキシン（組換えその他）、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４又は他の多くのもののムラミルジペプチドを含むが、これらに限定されない。
好ましくは、アジュバントは１用量あたり約１００μｇから約１０ｍｇの量で加えられる。よりいっそう好ましいアジュバントは１用量あたり約１００μｇから約１０ｍｇの量で加えられる。よりいっそう好ましいアジュバントは１用量あたり５００μｇから約５ｍｇの量で加えられる。よりいっそう好ましいアジュバントは１用量あたり約７５０μｇから約２．５ｍｇの量で加えられる。最も好ましいアジュバントは１用量あたり１ｍｇの量で加えられる。
そして、さらなる態様では、例えばワクチンのような、ＰＣＶ２に対する免疫応答を引き起こすための抗原性組成物を調製する方法は、ｉ）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を調製及び回収すること、及びｉｉ）これを好適なアジュバントと混合すること、を含んでなる。好ましくは、アジュバントはカーボポール９７１Ｐである。よりいっそう好ましくは、カーボポール９７１Ｐが１用量あたり約５００μｇから約５ｍｇの量で、よりいっそう好ましくは１用量あたり約７５０μｇから約２．５ｍｇの量で、そして最も好ましくは１用量あたり約１ｍｇの量で加えられる。
好ましくは、プロセスのステップｉ）はＰＣＶ２ ＯＲＦ２の調製と回収について記載されるようなプロセスのステップを含む。例えば、この方法の好ましい形態では、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含んでなるコンストラクトが運搬ベクター内に得られる。好適な運搬ベクターとそれらを調製する方法は上に記載されている。任意に、この方法は、ＯＲＦ２を運搬ベクターにクローニングする前に、ＰＣＲを使ってＰＣＶ２株に由来するＯＲＦ２を増幅するステップを含んでもよい。
好ましいオープンリーディングフレーム配列、コザック配列、３’ＥｃｏＲＩ認識部位配列、組換えタンパク質配列、トランスフェクトされたコンストラクトの配列、培地、細胞、及びウイルスは先の方法に記載されるとおりである。
この方法の別の任意のステップは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを最初のベクターにクローニングし、この最初のベクターからＯＲＦ２ ＤＮＡを切り出し、そしてこの切り出されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを運搬ベクターにクローニングするために使用することを含む。他の方法と同様に、組換えＯＲＦ２タンパク質を上清から回収する前に、トランスフェクトされたバキュロウイルスによる細胞の感染後少なくとも５日間待つこと好ましい。
好ましくは、この方法の回収ステップはまた、培地を細胞と細胞片から分離するステップを含む。これは様々な方法で行うことができるが、容易さと簡便さのためには、細胞、細胞片及び培地を、約０．４５μｍから約１．０μｍのサイズのポアをもつフィルターを通してろ過することが好ましい。
最後に、この方法に対しては、ウイルス不活化ステップを、回収された組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を組成物に混合する前に、入れることが好ましい。これは種々の方法で行うことができるが、本発明の実際においてはＢＥＩを使用することが好ましい。
そして、さらなる態様では、この方法は次のステップを含んでなる：ｉ）インビトロでＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを増幅する、ここで、前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡの前後の配列が改変される、ｉｉ）増幅されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを運搬ベクターにクローニングする；及びｉｉｉ）トランスフェクトされたウイルスを作るために、組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含む運搬ベクター又はその部分をウイルスベクターにトランスフェクトする、ｉｖ）培地中の細胞にトランスフェクトされたウイルスで感染する；ｖ）トランスフェクトされたウイルスにＰＣＶ２ ＯＲＦ２由来の組換えタンパク質を発現させる；ｖｉ）細胞を上清から分離する；ｖｉｉ）発現されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を上清から回収する；ｖｉｉｉ）組換えウイルスベクターを、好ましくは約１から約２０ｍＭのＢＥＩの存在下で、最も好ましくは約５ｍＭのＢＥＩの存在下で、不活化する；ｉｘ）溶液中の不活化薬剤を中和する薬剤を当量加える、不活化薬剤がＢＥＩであるとき、好ましくはチオ硫酸ナトリウムを終濃度約１から約２０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭとなるように加える、及びｘ）適量のアジュバントを加える、好ましくはカーボポールを、より好ましくはカーボポール９７１Ｐを、よりいっそう好ましくは上に記載される量で（例えば、１用量約５ｍｇに対して約５００μｇ、よりいっそう好ましくは１用量約２．５ｍｇに対して約７５０μｇの量で、及び最も好ましくは１用量１ｍｇの量で）、加える。
さらに、組成物は１又は２以上の薬学的に許容できる担体を含むことができる。ここで使われるように、“薬学的に許容できる担体”は、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗細菌及び抗真菌剤、浸透圧調節剤、吸収遅延剤、及びその他を含む。
最も好ましい、ここで提供される組成物は、インビトロで培養された細胞で、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含み、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２を発現する組換えウイルスベクターに前記細胞が感染した細胞で、細胞培養が、ウイルスベクターを不活化するために、約２から約８ｍＭのＢＥＩ、好ましくは約５ｍＭのＢＥＩ、及び当量濃度の中和薬剤、好ましくはチオ硫酸ナトリウムを終濃度約２から約８ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ、で処理された前記細胞培養の上清から回収されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を、カーボポールを、より好ましくはカーボポール９７１Ｐを、好ましくは１用量あたり約５００μｇから約５ｍｇの量で、よりいっそう好ましくは１用量あたり約７５０μｇから約２．５ｍｇの量で、そして最も好ましくは１用量あたり１ｍｇの量で、及び、生理食塩水を、好ましくは約５０から９０％（ｖ／ｖ）の量で、より好ましくは約６０から８０％（ｖ／ｖ）、よりさらに好ましくは約７０％（ｖ／ｖ）で、含む。
そして、さらなる態様は、次のステップを含んでなる、ＰＣＶ２に対する免疫応答を引き起こすための、例えばワクチンのような、抗原性組成物を調製する方法に関する：ｉ）インビトロでＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを増幅する、ここで前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡの前後の配列が改変される、ｉｉ）増幅されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを運搬ベクターにクローニングする；及びｉｉｉ）運搬ベクター又は組み替えＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含むその一部を、組換えウイルスベクターを作るために、ウイルスベクターにトランスフェクトする、ｉｖ）培地中の細胞をトランスフェクトされたウイルスで感染する；ｖ）トランスフェクトされたウイルスにＰＣＶ２ ＯＲＦ２由来の組換えタンパク質の発現を引き起こす、ｖｉ）細胞を上清から分離する；ｖｉｉ）発現されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を上清から回収する；ｖｉｉｉ）組換えウイルスベクターを、好ましくは約２から約２０ｍＬのＢＥＩ存在下で、最も好ましくは約５ｍＭのＢＥＩ存在下で、不活化する；ｉｘ）溶液中の不活化薬剤を中和する薬剤を当量加える、不活化薬剤がＢＥＩのとき、好ましくは、チオ硫酸ナトリウム溶液を終濃度約０．５から約２０ｍＭ、好ましくは５ｍＭとするように加える、ｘ）適量のアジュバントを加える、好ましくはカーボポールを加える、より好ましくはカーボポール９７１Ｐを加える、よりさらに好ましくは上に記載される量で加える（例えば、１用量約５ｍｇに対して約５００μｇを、よりいっそう好ましくは１用量約２．５ｍｇに対して約７５０ｍｇの量で、そして最も好ましくは１用量につき約１ｍｇの量で）；及びｘｉ）生理食塩水を、好ましくは約５０から約９０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約６０から８０％（ｖ／ｖ）、よりさらに好ましくは約７０％（ｖ／ｖ）となるように加える。
任意に、この方法はまた、保護剤を加えることを含むことができる。ここで使われる保護剤とは、例えばゲンタマイシン、マーシオレート、及びその他のような、抗微生物活性をもつ薬剤をいう。特に、保護剤を加えることは、多用量の組成物を調製するために最も好ましい。
これらの抗微生物学的活性をもつ薬剤は、対象の組成物の微生物学的汚染を防ぐため、又は、対象の組成物中での微生物学的増殖を阻止するために有効な濃度で加えられる。
さらに、この方法はまた、産物の有効期間を増やす及び／又は保持するために、例えば、糖類、トレハロース、マンニトール、サッカロース及びその他のような、何らかの安定剤を加えることを含んでなることができる。しかしながら、驚くべきことに、できた製剤は、さらに安定剤を加えなくとも、少なくとも２４ヶ月の期間にわたって免疫学的に有効であることが知見された。
本発明のさらなる態様は、上に記載されるような方法により生じる産物に関する。詳しくは、本発明は組換えにより発現されるＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなる組成物に関する。
さらに、本発明はまた、昆虫細胞培養の上清から回収される、組換えにより発現されるＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなる組成物に関する。
さらに、本発明はまた、昆虫細胞培養の上清から回収される、組換えにより発現されるＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなる組成物に関する。
好ましくは、この組成物はまたウイルスベクターを不活化するために適した薬剤を含んでなる。好ましくは、前記不活化薬剤はＢＥＩである。
さらに、本発明はまた、昆虫細胞培養の上清から回収される、組換えで発現されるＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含み、ウイルスベクターの不活化に適した薬剤、好ましくはＢＥＩ及び不活化薬剤を中和するための中和薬剤を含んでなる。好ましくは、ＢＥＩが不活化薬剤として使用されるときには、その中和薬剤はチオ硫酸ナトリウムである。
本発明のさらに別の態様では、免疫応答を誘導、より好ましくは、ＰＣＶ２感染の臨床的徴候に対する防御免疫を付与する免疫原性組成物が提供される。組成物は一般に、ＰＣＶ２のオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）によって発現されるポリペプチド、又はその断片を組成物の抗原成分として含んでなる。
ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡ及びタンパク質は、組成物の調製のためにここで使われるように、及び、また、ここで規定されるプロセスの中で使われるように、ＰＣＶ２単離物の中に高度に保存されたドメインであり、そして、それにより、ここで使われるように、いかなるＰＣＶ２ ＯＲＦ２もＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡ及び／又はポリペプチドのソースとして有効である。好ましいＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質は、配列番号１１のそれである。好ましいＰＣＶ２ ＯＲＦ２ポリペプチドはここに配列番号５として与えられるが、この配列は配列相同性にして最大で６〜１０％変化でき、そして、免疫原性組成物中で有用性を与える抗原性を変わらず保持することは、当業者によって理解される。免疫原性組成物の抗原性は、例えば、実施例４によって提供されるようなチャレンジ実験によって評価されうる。
その上、改変された抗原が、配列番号３又は配列番号４のポリヌクレオチド配列によってコードされるＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質に比べて少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の防護免疫を与えるとき、改変された抗原の抗原性はなお維持されている。ここで使われるように、“免疫原性組成物”とは宿主の中で細胞性及び／または“免疫応答”を誘導するＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を意味する。
ここで使われるように、“免疫原性組成物”はＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質に対する細胞性及び／又は抗体性免疫応答である“免疫学的応答”をホストに誘発するＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を意味する。好ましくは、この免疫原性組成物はＰＣＶ２感染及びそれに伴う臨床徴候に対する防御免疫を与えることができる。
いくつかの態様では、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の免疫原性部分は、組成物において抗原成分として利用される。ここで使われる“免疫原性部分”という語は、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質及び／又はポリヌクレオチドの欠損し、及び／又は、置換された形態、又は断片を、それぞれいう。好ましくは、そのような欠損し、及び／又は、置換された形態、又は断片は、全長ＯＲＦ２ポリペプチドから少なくとも６個の連続したアミノ酸を含んでなるだろう。より好ましくは、欠損し、又は置換された形態、又は断片は少なくとも１０個の、より好ましくは少なくとも１５個の、そしてよりさらに好ましくは少なくとも１９個の、全長ＯＲＦ２ポリペプチドからの連続したアミノ酸をもつだろう。
この点において、２つの好ましい配列がここで、配列番号９及び１０として規定される。そのような配列はより大きな断片又は欠損した形態の一部であってもよいということがさらに理解される。
ここで規定されるさらに好ましいＰＣＶ２ ＯＲＦ２ポリペプチドは、配列番号３又は配列番号４のヌクレオチド配列によってコードされる。しかし、この配列は配列相同性で６−２０％まで変化し、免疫原性組成物中においてそれを有用にする抗原性をなお保持しうることは、いわゆる当業者により理解される。いくつかの態様では、ＯＲＦ２の欠損又は置換された形態、又は断片が組成物中で抗原成分として利用される。好ましくは、そのような欠損し又は置換された形態、又は断片は、全長ＯＲＦ２ヌクレオチド配列、例えば、配列番号３又は配列番号４の、からの少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含んでなるであろう。
より好ましくは、欠損し又は置換された形態、又は断片は、少なくとも３０個、より好ましくは、少なくとも４５個、そして、よりさらに好ましくは、少なくとも５７個の、全長ＯＲＦ２ヌクレオチド配列、例えば、配列番号３又は配列番号４、からの連続したヌクレオチドを有するであろう。
“配列同一性”とは、通常知られるように、２又は３以上のポリペプチド配列、又は２又は３以上のポリヌクレオチド配列の間の関係、具体的には、参照配列と、参照配列に比較される指定の配列との間の関係をいう。配列同一性は、与えられた配列と参照配列が、配列のストリング間のマッチによって決定される、最も高い配列類似性を示すように最適にアラインされた後、与えられた配列を参照配列と比較することによって決定される。そのようなアラインメント上では、配列同一性は位置ごとに確認される。例えば、特定位置で、ヌクレオチド又は残基が同一であれば、配列はその特定の位置で“同一”である。そのような同一位置の総数が、それから参照配列中のヌクレオチド又は残基の総数で割られて、％配列同一性を与える。
配列同一性は、既知の方法によって容易に計算されうる。その方法は、下記に記載されているが、これらに限定されない：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｎ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．（編集）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ （１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｇｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．（編集）， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１）；及び、Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．とＬｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８： １０７３ （１９８８）。これらの教示は参照によってここに取り込まれる。
配列同一性を決定するための好ましい方法は、分析される配列間の最大のマッチを与えるように設計されている。配列同一性を決定するための方法は、与えられた配列間の配列同一性を決定する、公衆に利用可能なコンピュータープログラムに分類される。そのようなプログラムの例は、次のものを含むが、これらに限定されない。ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １２（１）：３８７ （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．ら， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３−４１０ （１９９０）。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩ及び他のソースから公衆に利用可能である（ＢＬＡＳＴマニュアル，Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら， ＮＣＶＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ２０８９４， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．ら， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３−４１０ （１９９０）。これらの教示は参照によりここに取り込まれる。
これらのプログラムは、与えられた配列と参照配列との間で最も高いレベルの配列同一性を得るために既定のギャップウェイトを使い、最適に配列をアラインする。実例として、少なくとも、例えば、８５％、好ましくは９０％、よりいっそう好ましくは９５％の“配列同一性”を参照配列に対して有するヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドによって、与えられたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、与えられたポリヌクレオチドの配列が、参照配列の各１００ヌクレオチドあたり１５個までの、好ましくは１０個までの、よりいっそう好ましくは５個までの点変異を含んでもよいということを除き、参照配列に一致することが意図される。
別の言葉では、少なくとも８５％、好ましくは９０％、よりいっそう好ましくは９５％の同一性を参照ヌクレオチド配列と比較して有するヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドでは、１５％まで、好ましくは１０％まで、よりいっそう好ましくは５％まで、参照配列中のヌクレオチドが欠失又は別のヌクレオチドで置換されてもよく、又は、参照配列中の全ヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％まで、よりいっそう好ましくは５％までの多数のヌクレオチドが、参照配列に挿入されてもよい。
参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置又は、参照配列中のヌクレオチド間に単独に、あるいは、参照配列中の１又は２以上のグループに、分散される、それら末端位置の間のどこにでも起きてもよい。
同様に、参照アミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば、８５％、好ましくは９０％、よりいっそう好ましくは９５％の配列同一性を有する、与えられたアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、ポリペプチドの指定のアミノ酸配列が、指定のポリペプチド配列が、参照アミノ酸配列の１００アミノ酸あたり１５までの、好ましくは１０までの、よりいっそう好ましくは５までのアミノ酸変化を含んでもよいということを除き、参照配列に一致するということが意図されている。
別の言葉では、参照アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、よりいっそう好ましくは９５％の配列一致をする指定のポリペプチド配列を得るために、１５％までの、好ましくは１０％までの、よりいっそう好ましくは５％までの、参照配列中のアミノ酸残基が欠失又は別のアミノ酸と置換されてもよく、又は、参照配列中のアミノ酸残基の総数のうち、１５％までの、好ましくは１０％までの、よりいっそう好ましくは５％までの、多数のアミノ酸が参照配列に挿入されてもよい。
参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ又はカルボキシル末端位置、又は、参照配列中の残基間に単独に、あるいは、参照配列内の１又は２以上の連続するグループに、分散される、それら末端位置の間のどこでも、起こってよい。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。しかしながら、保存的置換は、配列同一性を決定するときに、マッチするものに含まれない。
ここで使われるように、“配列相同性”とは、２つの配列の相関性を決定する方法をいう。配列相同性を決定するためには、２又は３以上の配列が最適にアラインされ、そして、必要ならばギャップが導入される。しかしながら、“配列同一性”とは対照的に、配列相同性を決定するときに保存的アミノ酸置換はマッチとしてカウントされる。
別の言葉では、参照配列と９５％の配列相同性をもつポリペプチド又はポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中の８５％、好ましくは９０％、よりいっそう好ましくは９５％のアミノ酸残基又はヌクレオチドがマッチ、又は、他のアミノ酸またはヌクレオチドとの保存的置換を含まなければならないか、又は、参照配列中の総アミノ酸残基又はヌクレオチドのうち、保存的置換を含まずに、１５％までの、好ましくは１０％までの、よりいっそう好ましくは５％までの、多数のアミノ酸又はヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。好ましくは、相同な配列は少なくとも５０の、よりいっそう好ましくは１００、よりいっそう好ましくは２５０、よりいっそう好ましくは５００の長さのヌクレオチドを含む。
“保存的置換”とは、全体的な機能が大きく変化しないような、アミノ酸残基又はヌクレオチドの、サイズ、疎水性等を含めて類似の特徴又は性質を有する他のアミノ酸残基又はヌクレオチドとの置換をいう。
“単離された”とは“人の手によって”その自然の状態から変えられたことすなわち、それが自然界に生じるならば、それが変えられている、又はその本来の環境から取り除かれている、又はその両方をいう。例えば、生きている生物にもともと存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは“単離された”ではないが、自然状態の時に共存する物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、その用語がここで使われるように、“単離された”である。
そして、本発明のさらに別の態様は、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなるＰＣＶ２感染による臨床症状の重篤さを軽減するために有効な免疫原性組成物に関する。好ましくは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質は上述のもののうちのいずれかである。
好ましくは、前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質は、
ｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１の配列を含んでなるポリペプチド
ｉｉ） ｉ）のポリペプチドに対して少なくとも８０％の相同性をもつ任意のポリペプチド
ｉｉｉ） ｉ）及び・又はｉｉ）のポリペプチドの任意の免疫原性部分
ｉｖ） ｉｉｉ）の免疫原性部分で、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１の配列に含まれる少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含んでなるもの
ｖ） 配列番号３又は配列番号４の配列を含んでなるＤＮＡによってコードされるポリペプチド
ｖｉ） ｖ）のポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドによってコードされる任意のポリペプチド
ｖｉｉ） ｖ）及び・又はｖｉ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの任意の免疫原性部分
ｖｉｉｉ） ｖｉｉ）の免疫原性部分であって、前記免疫原性部分をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３又は配列番号４の配列に含まれる、少なくとも３０個の連続するヌクレオチドを含むもの
好ましくは、配列番号３又は配列番号４の配列によってコードされるＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の免疫原特性をもつ免疫原性部分のいずれか。
さらに別の態様では、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質は、所望の免疫応答を誘導する、つまり、ＰＣＶ２感染に起因する臨床症状の発生件数を低下させる、又は、重篤さを軽減するために有効な抗原含有レベルで免疫原性組成物中に提供される。好ましくは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質含有レベルは少なくとも、最終的な免疫原性組成物（μｇ／ｍｌ）のうち０．２μｇ抗原／ｍｌであり、より好ましくは約０．２から約４００μｇ／ｍｌ、よりさらに好ましくは、約０．３から約２００μｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは、約０．３５から約１００μｇ／ｍｌ、よりさらに好ましくは、約０．４から約５０μｇ／ｍｌ、よりさらに好ましくは、約０．４５から約３０μｇ／ｍｌ、よりさらに好ましくは約０．６から約１５μｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは、約０．７５から約８μｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは、約１．０から約６μｇ／ｍｌ、よりさらに好ましくは、約１．３から約３．０μｇ／ｍｌ、よりさらに好ましくは、約１．５から約２．０μｇ／ｍｌ、そして最も好ましくは、約１．６μｇ／ｍｌである。
さらに別の態様では、ＯＲＦ２抗原の含有レベルが、最終的な抗原組成物の用量あたり（μｇ／用量）、少なくとも０．２μｇの上述のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質であり、より好ましくは、約０．２から４００μｇ／用量、よりさらに好ましくは約０．３から２００μｇ／用量であり、よりいっそう好ましくは、約０．３５から約１００μｇ／用量であり、よりさらに好ましくは、約０．４から約５０μｇ／用量であり、よりさらに好ましくは、約０．４５から約３０μｇ／用量であり、よりさらに好ましくは、約０．６から約１５μｇ／用量であり、よりいっそう好ましくは、約０．７５から約８μｇ／用量であり、よりいっそう好ましくは、約１．０から約６μｇ／用量であり、よりさらに好ましくは、約１．３から約３．０μｇ／用量であり、よりいっそう好ましく亜ｈ、約１．４から約２．５μｇ／用量であり、よりいっそう好ましくは、約１．５から約２．０μｇ／用量であり、そして、最も好ましくは、役１．６μｇ／用量である。
本発明に係る免疫原性組成物に使用されるＰＣＶ２ ＯＲＦ２ポリペプチドは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２の単離と精製、標準的なタンパク質合成、及び組換え法を含む様々な方法で取得することができる。ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ポリペプチドを得るための好ましい方法は、上に記載され、また、米国特許出願番号１１／０３４，７９７においても提供され、その教示と内容は参照によってここに取り込まれる。手短にいえば、感受性細胞が、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡをコードする配列を含む組換えウイルスベクターに感染され、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ポリペプチドが、組換えウイルスによって発現され、そして、発現されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２ポリペプチドが、ろ過によって上清から回収され、また、何らかのコンベンショナルな方法、好ましくはバイナリエチレンイミンを使用すること、により不活化され、その後、不活化プロセスを停止するために中和される。
そして、さらに別の態様では、免疫原性組成物は、ｉ）上述のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質のいずれかを、好ましくは上述の濃度で、及び、ｉｉ）前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発現するウイルスベクターの、好ましくは組換えバキュロウイルスの、少なくとも一部を、含んでなる。
また、さらに別の態様では、免疫原性組成物は、ｉ）上述のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質のいずれかを、好ましくは上述の濃度で、及び、ｉｉ）前記ＰＣＶ３ ＯＲＦ２タンパク質を発現するウイルスベクターの、好ましくは組換えバキュロウイルスの、少なくとも一部を、及び、ｉｉｉ）細胞培養の上清を、含んでなる。
ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の製造と回収プロセスのひとつの特定の実施形態では、細胞培養の上清が、好ましくは約０．４５から１μｍの間の、ポアサイズをもつメンブレンを通してろ過される。
そして、さらに別の態様は、ｉ）上述のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質のいずれかを、好ましくは上述の濃度で、ｉｉ）前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発現するウイルスベクターの、好ましくは組換えバキュロウイルスの、少なくとも一部を、及び、ｉｉｉ）細胞培養の一部を、含んでなる免疫原性組成物に関する；ここで、成分の約９０％は１μｍよりも小さなサイズである。
さらに別の態様では、本発明は、ｉ）上述のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質のいずれかを、好ましくは上述の濃度で、ｉｉ）前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発現するウイルスベクターの少なくとも一部を、ｉｉｉ）細胞培養の一部を、及び、ｉｖ）組換えウイルスベクターを不活化するための不活化薬剤、好ましくはＢＥＩを、含んでなる免疫原性組成物に関する。
ここで、成分ｉ）からｉｉｉ）の約９０％は１μｍよりも小さなサイズである。好ましくは、ＢＥＩがバキュロウイルスを不活化するために有効な濃度で存在する。有効な濃度は上に記載されている。
さらに別の態様では、本発明は、ｉ）上述のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質で、好ましくは上述の濃度のもの、ｉｉ）前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発現するウイルスベクターの少なくとも一部、ｉｉｉ）細胞培養の一部、ｉｖ）組換えウイルスベクターを不活化するための不活化薬剤で、好ましくはＢＥＩ、及びｖ）不活化薬剤によって行われる不活化を停止するための中和薬剤、を含んでなる免疫原性組成物に関し、
ここで、成分ｉ）からｉｉｉ）の約９０％は１μｍよりも小さなサイズをもつ。好ましくは、不活化薬剤がＢＥＩであれば、前記組成物はＢＥＩに当量のチオ硫酸ナトリウムを含んでなる。
ポリペプチドが、ＰＣＶ２感染に感受性の動物に投与されうる組成物に混合される。好ましい態様では、組成物はまた、いわゆる当業者に既知の追加の成分を含んでもよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． （１９９０）． １８ｔｈ ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．， Ｅａｓｔｏｎも参照）。さらに、組成物は１又は２以上の獣医学的に許容できる担体を含んでもよい。
ここで使われるように、“獣医学的に許容できる担体”はあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈液、保存剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、浸透圧調製剤、吸着遅延剤、及びその他を含む。
好ましい実施態様では、免疫原性組成物は、ここに規定されるようなＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を、好ましくは上述の濃度で、抗原成分として含んでなるが、アジュバント、好ましくはカーボポールと生理食塩水、と混合される。
いわゆる当業者は、この組成物は既知の注入可能な、生理学的に許容できる無菌溶液に混合されてもよいということを理解するだろう。非経口的インジェクション又はインフュージョンのためのレディ・トゥ・ユースの溶液を調製するために、例えば、生理食塩水又は相当する血漿タンパク質溶液のような水性等張溶液が既に利用可能である。
さらに、本発明の免疫原性及びワクチン組成物は、希釈液、浸透圧調整剤、安定化剤、又はアジュバントを含むことができる。希釈液は水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を含むことができる。浸透圧調整剤は塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトース、その他を含むことができる。安定化剤はアルブミン及びエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩等を含む。適切なアジュバントは上述のものである。
最も好ましいのは、カーボポールを使用することであり、特に、カーボポール９７１Ｐを使用することである。好ましくは上に記載の量である（例えば、１用量あたり約５００μｇから約５ｍｇ、よりいっそう好ましくは、１用量あたり約７５０μｇから約２．５ｍｇの量であり、そして最も好ましくは１用量あたり約１ｍｇの量である）。
そして、本発明はまた、ｉ）上述のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質のいずれかで、好ましくは上述の濃度のもの、ｉｉ）前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発現するウイルスベクターをの少なくとも一部、ｉｉｉ）細胞培養の一部、ｉｖ）組換えウイルスベクターを不活化するための不活化薬剤で、好ましくはＢＥＩ、及びｖ）不活化薬剤によって行われる不活化を停止するための中和薬剤で、好ましくはＢＥＩに当量のチオ硫酸ナトリウム；及びｖｉ）適切なアジュバントで、好ましくは上に記載の量のカーボポール９７１、を含んでなる免疫原性組成物に関する；ここで成分ｉ）からｉｉｉ）の約９０％は１μｍよりも小さなサイズをもつ。
さらに別の態様では、この免疫原性組成物は、薬学的に許容できる塩、好ましくはリン酸塩を、生理学的に許容できる濃度で、さらに含んでなる。好ましくは、前記免疫原性組成物のｐＨは、約６．５から７．５の間を意味する、生理学的ｐＨに調整される。
そして、本発明はまた、ｉ）少なくとも１．６μｇの上述のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質、ｉｉ）前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発現するバキュロウイルスの少なくとも一部、ｉｉｉ）細胞培養の一部、ｉｖ）約２から８ｍＭのＢＥＩ、ｖ）ＢＥＩに当量のチオ硫酸ナトリウム；及び、ｖｉ）約１ｍｇのカーボポール９７１、及びｖｉｉ）を生理学的に許容できる濃度のリン酸塩、を１ｍｌ当たりに含んでなる免疫原性組成物に関する；ここで、成分ｉ）からｉｉｉ）の約９０％は１μｍよりも小さいサイズをもち、前記免疫原性組成物のｐＨは約６．５から７．５に調整される。
免疫原性組成物は１又は２以上の、例えば、インターロイキン、インターフェロン、又は他のサイトカインのような免疫変調薬剤を含むことができる。免疫原性組成物はまた、ゲンタマイシン及びメルチオレートを含むことができる。本発明の状況において有用なアジュバントや添加物の量や濃度は、いわゆる当業者によって容易に決定することができるが、本発明は約５０μｇから約２０００μｇのアジュバントを含んでなる組成物を、好ましくは約２５０μｇ／ｍｌ用量のワクチン組成物を意図する。
もうひとつの好ましい実施例では、本発明は約１μｇ／ｍｌから６０μｇ／ｍｌの抗生物質、より好ましくは約３０μｇ／ｍｌ未満の抗生物質を含んでなるワクチン組成物を意図する。
そして、本発明はまた、ｉ）上述のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質で、好ましくは上述の濃度のもの、ｉｉ）前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を発現するウイルスベクターの少なくとも一部、ｉｉｉ）細胞培養の一部、ｉｖ）組換えウイルスベクターを不活化するための不活化薬剤で、好ましくはＢＥＩ、及びｖ）不活化薬剤によって行われる不活化を停止するための中和薬剤で、好ましくはＢＥＩに当量のチオ硫酸ナトリウム；ｖｉ）適切なアジュバントで、好ましくは上に記載された量のカーボポール９７１、ｖｉｉ）薬学的に許容される濃度の食塩水緩衝液で、好ましくはリン酸塩を含むもの、ｖｉｉｉ）抗微生物活性を有する薬剤、を含んでなる免疫原性組成物に関する；ここで、成分ｉ）からｉｉｉ）の約９０％は１μｍよりも小さいサイズをもつ。
驚くべきことに、ここで規定される免疫原性組成物は２４ヶ月以上の期間にわたって非常に安定であることが知られている。ここで規定される組換えバキュロウイルス発現ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなる、ここで規定される免疫原性組成物がＰＣＶ２感染による臨床症状を軽減するにあたって非常に有効であることもまた知られている。
驚くべきことに、ここで規定されるような組換えバキュロウイルス発現ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなる免疫原性組成物は、不活化形態のＰＣＶ２全ウイルス粒子、又は単離されたウイルスのＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原を含んでなる免疫原性組成物よりも有効であることが知られている。
特に、驚くべきことに、組換えバキュロウイルス発現ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質は非常に低い濃度、つまり、０．２５μｇ／用量までの濃度でも有効であることが知られている。ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質のこの予期せぬ高い免疫能力はカーボポールを加えることによってさらに増強することができた。
さらに別の態様は、ここで規定されるように、少なくとも１用量のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の免疫原性組成物を含んでなる容器に関する。ここで、１用量は少なくとも２μｇのＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質、好ましくは２から１６μｇのＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなる。
前記容器は、１から２５０用量の免疫原性組成物、好ましくは１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、又は２５０用量のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含んでなることもできる。好ましくは、２用量以上のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の免疫原性組成物を含んでなる各容器は、さらに抗微生物活性薬剤を含む。これらの薬剤は、例えば、ゲンタマイシン及びメルチオレート等である。
かくて、本発明の一態様は、１から２５０用量のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の免疫原性組成物を含んでなる容器に関する。ここで、１用量は少なくとも２μｇのＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質、及びゲンタマイシン及び・又はメルチオレート、好ましくは約１μｇ／ｍｌから約６０μｇ／ｍｌの抗生物質、そしてより好ましくは約３０μｇ／ｍｌよりも少ない抗生物質を含んでなる。
さらに別の態様は、上に記載される容器及び、Ｐ少なくとも１用量のＰＣＶ２ ＯＲＦ２の免疫原性組成物をＣＶ２感染による臨床症状の重篤さを軽減するために子豚に筋肉内注入するための情報を含む取扱説明書を含んでなるキットに関する。さらに、また別の態様では、前記取扱説明書は、２回目又はそれ以上の回数の少なくとも１用量のＰＣＶ２ ＯＲＦ２の免疫原組成物の投与の情報を含んでなる。ここで、２回目の投与又はそれ以上の回数の投与は最初又は前回の投与から少なくとも１４日目以降である。
好ましくは、前記取扱説明書はまた免疫刺激剤を投与するための情報を含む。好ましくは、前記免疫刺激剤は少なくとも２回投与される。好ましくは、少なくとも３日間、より好ましくは少なくとも５日間、よりいっそう好ましくは少なくとも７日間が免疫刺激剤投与の１回目と２回目又はそれ以上の回数との間隔である。
好ましくは、免疫刺激剤はＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の免疫原性組成物を最初に投与してから少なくとも１０日後、好ましくは１５日後、よりいっそう好ましくは２０日後、よりいっそう好ましくは少なくとも２２日後に与えられる。
好ましい免疫刺激物質は、例えば、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）であり、より好ましくはフロインドの不完全アジュバントのエマルジョンである（ＫＬＨ／ＩＣＦＡ）。
しかしながら、いわゆる当業者に知られる他のいかなる免疫刺激剤もまた使用できることは、ここで理解される。ここで使われる「免疫刺激剤」とは免疫応答を、好ましくは特定の免疫応答、例えば特定の病原体に対する免疫応答を開始または増強することなく、誘導できる薬剤又は組成物をいう。免疫刺激剤を適切な用量投与することがさらに説明される。さらに、キットはまた、少なくとも１用量の免疫刺激剤、好ましくは１用量のＫＬＨ又はＫＬＨ／ＩＣＦＡを含む容器を含んでなってもよい。
さらに、驚くべきことに、組換えバキュロウイルス発現ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質、好ましくはカーボポールとの組合せ、を含んでなる免疫原性組成物の免疫能力が、インゲルバックＰＲＲＳ ＭＬＶワクチンの投与によってさらに増強されることが見出されている（実施例５参照）。ＰＣＶ２の症状の臨床的兆候及び病状発現はＰＲＲＳ感染があるときに大いに強化される。
しかしながら、ここに規定されるような免疫原性組成物及びワクチン接種の戦略によってこの影響が非常に、そして期待されるよりもいっそう低減される。言い換えれば、動物、好ましくはブタが、ここで規定されるように、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２免疫原性組成物及びインゲルバックＰＲＲＳ ＭＬＶワクチン（ベーリンガー・インゲルヘイム）で処理されたときに、予期しないシナジー効果が観察された。
そして、本発明のさらに別の態様は、ここに規定されるようなＰＣＶ２ ＯＲＦ２の免疫原性組成物及び取扱説明書を含んでなる、上に記載されるようなキットに関する。ここで、取扱説明書は、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２免疫原性組成物を、ＰＲＲＳ抗原を含んでなる免疫原性組成物、好ましくはアジュバントが加えられたＰＲＲＳ抗体、と一緒に投与するための情報をさらに含む。好ましくは、ＰＲＲＳ抗原はインゲルバック（ＩｎｇｅｌＶａｃ、登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶ（ベーリンガー・インゲルヘイム）である。
本発明のさらに別の態様はまた、ｉ）ここで規定されるように少なくとも１用量のＰＣＶ２ ＯＲＦ２の免疫原性組成物を含む容器、及びｉｉ）少なくとも１用量のＰＲＲＳ抗原、好ましくはアジュバントが加えられたＰＲＲＳ抗原を含んでなる免疫原性組成物を含む容器、を含んでなるキットに関する。好ましくは、ＰＲＲＳ抗原はインゲルバック（ＩｎｇｅｌＶａｃ、登録商標）ＭＬＶ（ベーリンガー・インゲルヘイム）である。より好ましくは、キットは、両方の薬学的組成物を投与するための情報を含む取扱説明書をさらに含んでなる。好ましくは、それは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２含有組成物がＰＲＲＳ含有組成物よりも時期的に前に投与されるという情報を含む。
さらに別の態様は、医薬として、好ましくは動物用医薬として、さらにいっそう好ましくはワクチンとして、ここに規定される組成物のいずれかの使用に関する。さらに、本発明はまた、ＰＣＶ２感染による臨床症状の重篤さを軽減するための医薬を調製するための、ここに記載される組成物のいずれかの使用に関する。好ましくは、医薬はＰＣＶ２の感染を防ぐためであり、よりいっそう好ましくは子豚においてである。
さらに別の態様は、（ｉ）ＰＣＶ２の感染、又は再感染の阻止のための、又は（ｉｉ）ＰＣＶ２によって対象動物に引き起こされる臨床症状の緩和又は除去のための、ここで提供される免疫原性組成物のいずれかを対象動物に必要な場合に投与することを含む、方法に関する。好ましくは、対象動物はブタである。好ましくは、免疫原性組成物は筋肉内に投与される。好ましくは、１用量又は２用量の免疫原性組成物が投与さる。ここで、１用量は好ましくは少なくとも約２μｇのＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含み、よりいっそう好ましくは、約２から約１６μｇ、及び少なくとも約０．１から約５ｍｇのカーボポールを含み、好ましくは約１ｍｇのカーボポールを含む。
さらに別の態様は、上に述べられた処理方法に関する。ここでは２度目の免疫原性組成物が投与される。好ましくは、２回目の投与は、好ましくは同量のＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含む、同じ免疫原性組成物で行われる。好ましくは、２回目の投与もまた筋肉内に注射される。好ましくは、２回目の投与は最初の投与から少なくとも１４日以上経過後に、よりいっそう好ましくは最初の投与から少なくとも４週間以上経過後に行われる。
さらに別の態様では、処理方法には、免疫刺激物質を投与することも含まれる。好ましくは、前記免疫刺激物質は少なくとも２回投与される。好ましくは少なくとも３日、より好ましくは少なくとも５日、よりいっそう好ましくは少なくとも７日を最初と２回目の免疫刺激物質投与の間に開ける。最初のＰＣＶ２ ＯＲＦ２免疫原性組成物の投与後から、好ましくは少なくとも１０日、好ましくは１５日、よりいっそう好ましくは、２０日、よりいっそう好ましくは２２日経過してから免疫刺激物質が投与される。
好ましい免疫刺激物質は、例えば、スカシ貝（キーホール・リンペット、Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）であり、いっそう好ましくはフロインドの不完全アジュバントで懸濁されたものである（ＫＬＨ／ＩＣＦＡ）。しかしながら、いわゆる当業者が知る他のどんな免疫刺激物質もまた使用することができることが同時に理解される。免疫刺激物質を適切な用量投与することは、いわゆる当業者の通常の知識の範囲内のことである。
さらに別の態様では、上に記述の処理方法はまた、ＰＲＲＳ抗原の投与を含む。好ましくは、ＰＲＲＳ抗原は、インゲルバック（ＩｎｇｅｌＶａｃ，登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶ（ベーリンガー・インゲルヘイム）である。好ましくは、前記ＰＲＲＳ抗原はＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の免疫原性組成物の投与から時間が経過してから投与される。
＜好適な実施例の詳細な記載＞
これから述べられる実施例によって、本発明に従った好ましい材料と手順が示される。しかしながら、これらの実施例は例示のためだけに提供されるものであり、それによって本発明の範囲を制限するものではないと理解されるべきである。
実施例１
この実施例は、本発明の方法を用いたＯＲＦ２の相対的な収率を公知方法を用いた場合と比較する。４本の１０００ｍＬスピナーフラスコそれぞれに、１．０×１０６個／ｍｌのＳｆ＋細胞を含む３００ｍＬの昆虫無血清培地、エクセル４２０（ＪＲＨバイオサイエンス，レネクサ，ＫＳ）が入れられた。マスター細胞培養はＳＦ＋（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）マスター細胞ストック、１９継代、ロット＃ Ｎ１１２−０９５Ｗとして識別される。ＳＦ＋マスター細胞ストックを作るために使用された細胞は、プロテイン・サイエンス・コーポレーション、メリデン、ＣＴから購入された。
この実施例のためのＳＦ＋細胞ラインは１９から５９継代の間に限定された。詳細に調べてはいないが、それ以外の継代数のものも本発明の目的のためには使えるであろうが、大規模製造のためにプロセスをスケールアップするためには、少なくとも１９継代のものがおそらく必要であり、５９継代を超えるものは発現に影響するかもしれない。
より詳細には、液体窒素保存からの最初のＳＦ＋細胞培養は、スピナーフラスコ中のエクセル４２０培地に懸濁して、連続的に撹拌しながら増殖させられた。培養は１００ｍＬから２５０ｍＬのスピナーフラスコに、２５から１５０ｍＬのエクセル４２０無血清培地を入れて増殖させられた。細胞が細胞密度１．０−８．０×１０６細胞／ｍｌまで増えたときに、それらは播種濃度０．５−１．５×１０６細胞／ｍＬで新しい容器に分けられた。引き続き増える培養は容量３６Ｌまでのスピナーフラスコ又は３００Ｌまでのステンレス鋼製バイオリアクターで、２−７日間、２５−２９℃で、増殖させられた。
接種後、フラスコは２７℃で４時間インキュベートされた。続いて、各フラスコにはＰＣＶ２ ＯＲＦ２遺伝子（配列番号４）を含む組換えバキュロウイルスが接種された。ＰＣＶ２ ＯＲＦ２遺伝子を含む組換えバキュロウイルスは次のように作られた：ＰＣＶ２の北米株からのＰＣＶ２ ＯＲＦ２遺伝子がＰＣＲ増幅されて５’コザック配列（配列番号１）及び３’ＥｃｏＲＩ認識部位（配列番号２）を含む、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（プロメガ、マジソン、ＷＩ）にクローニングされた。それから、それは、引き続いて切り出され、運搬ベクターｐＶＬ１３９２（ＢＤバイオサイエンス、ファーミンゲン、サンディエゴ、ＣＡ）にサブクローニングされた。
サブクローニングされた部分はここに配列番号７として示される。
ＰＣＶ２ ＯＲＦ２遺伝子を含むｐＶＬ１３９２プラスミドはＮ４７−０６４Ｙと名付けられ、その後、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを作製するために、バキュロゴールド（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ、登録商標）（ＢＤバイオサイエンス、ファーミンゲン）バキュロウイルスＤＮＡとともにＳｆ＋昆虫細胞（プロテインサイエンス、メリデン、ＣＴ）にコトランスフェクトされた。
新しいコンストラクトはここに配列番号８として与えられる。
ＰＣＶ２ ＯＲＦ２遺伝子を含む組換えバキュロウイルスはプラーク純化され、マスターシードウイルス（ＭＳＶ）がＳＦ＋細胞ラインで増殖させられ、分取され、−７０℃に保存された。ＭＳＶはバキュロウイルス特異的プライマーを用いるＰＣＲ−ＲＦＬＰによってＰＣＶ２ ＯＲＦ２バキュロウイルスとして陽性識別された。
ＭＳＶ又は作業用シードウイルスを作製するためにＰＣＶ２ ＯＲＦ２バキュロウイルスに感染した昆虫細胞は、間接蛍光抗体測定法でポリクローナル血清又はモノクローナル抗体によって検出されるＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原を発現する。さらに、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２バキュロウイルスの同一性はＮ末端のアミノ酸配列によって確認された。ＰＣＶ２ ＯＲＦ２バキュロウイルスＭＳＶもまた、９ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１１３．２７（ｃ）、１１３．２８及び１１３．５５に従って純度がテストされた。
スピナーフラスコに接種されたそれぞれの組換えバキュロウイルスは様々な重複感染度（ＭＯＩ）をもっていた。フラスコ１は７．５２ｍＬの０．８８ＭＯＩシードが接種された；フラスコ２は３．０１ｍＬの０．３６ＭＯＩシードが接種された；フラスコ３は１．５ｍＬの０．１８ＭＯＩシードが接種された；そして、フラスコ４は０．７５ｍＬの０．０９ＭＯＩシードが接種された。
ＰＣＶ２ ＯＲＦ２組変えバキュロウイルスを構築するために使用される基本的ステップを図示する概念的フロー図がここに図１として提供される。
バキュロウイルスを接種した後に、フラスコは２７±２℃で７日間インキュベートされ、さらにその期間中１００ｒｐｍで振とうされた。フラスコは通気できるように通気性キャップを使用した。各フラスコからのサンプルは、７日間にわたり、２４時間毎に採取された。抽出後、各サンプルは遠心され、ペレットと上清の両方が分けられ、それからポアサイズ０．４５−１．０μｍのメンブレンを通して精密ろ過された。
できあがったサンプルは、それから、その中に存在するＯＲＦ２の量をＥＬＩＳＡアッセイで定量された。ＥＬＩＳＡアッセイは１：６０００に０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で希釈したキャプチャー抗体ブタ抗ＰＣＶ２ Ｐａｂ ＩｇＧ ＰｒｏｔＧ（ＰＢＳで１：２５０に希釈）を用いて行われた。１００μＬの抗体がそれからマイクロタイタープレートのウェルに置かれ、シールされ、一晩３７℃でインキュベートされた。
プレートはそれから０．５ｍＬのツイーン２０（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で１００ｍＬの１０×Ｄ−ＰＢＳ（ギブコ・インビトロゲゲン、カールスバッド、ＣＡ）及び８９９．５ｍｌの蒸留水を含む洗浄液で３回洗われた。続いて、２５０μＬのブロッキング溶液（５ｇ カーネーション脱脂粉乳（ネスレ、グレンデール、ＣＡ）を１０ｍＬのＤ−ＰＢＳに溶かし、蒸留水で１００ｍｌに調製）が各ウェルに加えられた。
次のステップはテストプレートを洗い、その後、プレ希釈抗原を加えることである。プレ希釈抗原は２００μＬの希釈溶液（０．５ｍＬツイーン２０を９９９．５ｍＬのＤ−ＰＢＳに溶かす）を希釈プレート上の各ウェルに加えることによって作られた。それからサンプルが１：２４０の比と１：４８０の比に希釈され、そして、１００μＬの各希釈サンプルが希釈プレートの一番上のウェルに加えられた（つまり、一番上のウェルには１００μＬの１：２４０希釈が入り、他は１００μＬの１：４８０希釈が入る）。系列希釈がそれからプレートの残りに対して１００μＬをそれぞれの連続するウェルからとり、プレート上の次のウェルに移動することによって行われた。
各ウェルは次の移動を行う前に混合された。テストプレート洗いにはプレートを洗浄バッファーで３回洗うことが含まれた。プレートはそれからシールされ、洗浄バッファーでさらに３回洗う前に１時間３７℃でインキュベートされた。
使用された検出抗体はＰＣＶ２ ＯＲＦ２に対するモノクローナル抗体であった。それは１：３００に希釈溶液で希釈され、そして、それから１００μＬの希釈検出抗体がウェルに加えられた。プレートはその後シールされ、洗浄バッファーで３回洗われる前に１時間３７℃でインキュベートされた。コンジュゲート希釈剤がそれから正常ウサギ血清（ジャクソンイムノリサーチ，ウェストグルーブ，ＰＡ）を希釈液に１％濃度になるように加えることによって調製された。コンジュゲート抗体ヒツジ抗マウス（Ｈ＋１）‐ＨＲＰ（ジャクソンイムノリサーチ）がコンジュゲート希釈剤中で１：１０，０００に希釈された。１００μＬの希釈コンジュゲート抗体がそれから各ウェルに加えられた。
プレートはそれからシールされ、洗浄バッファーで３回洗われる前に４５分間３７℃でインキュベートされた。１００μＬの基質（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質，カークガード・アンド・ペリー・ラボラトリー（ＫＰＬ），ガイザーズバーグ，ＭＤ）が、等量のペルオキシダーゼ基質Ｂ（ＫＰＬ）と混ぜられ、各ウェルに加えられた。プレートは室温で１５分間インキュベートされた。それから１００μＬの１Ｎ ＨＣＬ溶液が反応を停止するために全ウェルに加えられた。プレートはそれからＥＬＩＳＡリーダーに通された。このアッセイの結果は下の表１に示される：
Figure 0005726395
これらの結果は、インキュベーション時間が延長されるときに、ＯＲＦ２の遠心により分けられた細胞と培地の上清への発現が、遠心により分けられた細胞と培地のペレットでの発現よりも多いということを示している。
従って、ＯＲＦ２の発現を少なくとも５日間続けさせて、それを上清中で回収することが、５日間よりも短い期間発現を続けさせて、細胞からＯＲＦ２を回収することよりもむしろ、ＯＲＦ２の収量の著しい増大、従来の方法を超える著しい進歩を与える。
実施例２
この実施例はここで主張される発明の有効性に関するデータを提供する。１０００ｍｌのスピナーフラスコにおよそ１．０×１０６細胞／ｍｌのＳｆ＋細胞を含む３００ｍｌのエクセル４２０培地が入れられた。フラスコはそれから２７℃でインキュベートされ、１００ｒｐｍで振盪された。
続いて、フラスコに１０ｍｌの０．１のＭＯＩをもつＰＣＶ２ ＯＲＦ２／Ｂａｃ ｐ＋６（ＳＤ昆虫細胞でさらに６代継代した、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２遺伝子を含む組換えバキュロウイルス）ウイルスシードが２４時間のインキュベーション後に接種された。
フラスコはそれから２７℃で合計６日間インキュベートされた。インキュベーションの後、フラスコは遠心され、生じた上清の３つのサンプルが採集され、不活化された。上清はその温度を３７±２℃に引き上げることによって不活化された。
１番目のサンプルに対しては、環化して０．２Ｍのバイナリエチレンイミン（ＢＥＩ）となったブロモエチレンアミン臭化水素酸塩の０．４Ｍ濃度０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液が上清に加えられて、終濃度５ｍＭのＢＥＩを与えた。
２番目のサンプルに対しては、１０ｍＭのＢＥＩが上清に加えられた。
３番目のサンプルに対しては、上清にＢＥＩが加えられなかった。
サンプルはそれから４８時間連続して撹拌された。最終最小濃度５ｍＭを与える１．０Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液が残りのＢＥＩを中和するために加えられた。
各サンプル中のＯＲＦ２の量がそれから実施例１の記載と同じＥＬＩＳＡアッセイ手順を用いて定量された。
この結果は下の表２に見られよう。
Figure 0005726395
この実施例はＢＥＩでの中和は組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質産物の有意な量を除去したり分解したりしないということを説明する。これはＢＥＩ又は温度上昇からの上清中のＯＲＦ２の大きな損失がないという事実によって裏づけられる。
いわゆる当業者は回収されたＯＲＦ２は安定なタンパク質産物であるということを理解するだろう。
実施例３
この実施例は本発明が組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２の小規模生産から、組換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２の大規模製造までスケーラブルであることを示す。７０００ｍＬのエクセル４２０培地中の５．０×１０５細胞／ｍｌのＳＦ＋細胞／ｍｌが、２００００ｍＬのアプリコンバイオリアクターに移植された。培地と細胞はそれから２７℃でインキュベートされ、１００ｒｐｍで続く６８時間の間撹拌された。
６８時間目に、４１．３ｍＬのＰＣＶ２ ＯＲＦ２バキュロウイルスＭＳＶ＋３が７０００ｍＬのエクセル４２０培地に加えられた。できた混合物はそれからバイオリアクターに加えられた。続く７日間、混合物は２７℃でインキュベートされ、１００ｒｐｍで撹拌された。バイオリアクターからのサンプルは、感染後、４日目から開始し、２４時間毎に抽出され、各サンプルは遠心された。サンプルの上清が保存され、ＯＲＦ２の量がその後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥデンシトメトリーを使って定量された。
この結果は下の表３に見ることができる。
Figure 0005726395
実施例４
このこの実施例は７つのＰＣＶ２ワクチン候補の効果をテストし、さらにＰＣＶ２の病原性株への暴露に続く有効性パラメタを定める。
帝王切開により分娩され、初乳を与えられない（ＣＤＣＤ）、９−１４日齢の、１０８匹の子ブタが無作為に同じ個体数の９つのグループに分けられた。
表４はこの実施例の全体的な研究設計を示す。
Figure 0005726395
グループのうち７つ（グループ１−７）には、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ポリペプチドの用量を投与され、グループのうちの１グループはチャレンジコントロールの役を務め、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２の投与がされず、残り１グループは厳密な陰性コントロールの役を務め、やはりＰＣＶ２ ＯＲＦ２の投与がされなかった。
実験０日目に、グループ１からグループ７は割り当てられたワクチンで処理された。
グループ７のブタは実験１４日目にブースター処理を受けた。
ブタはワクチン接種に続き副作用の兆候及び注射部位の反応を観察され、実験１９日目に２番目の研究サイトに移動された。
２番目の研究サイトでは、グループ１−８が一つの建物に一緒に収容されたが、グループ９は別の建物に収容された。
すべてのブタが、スカシ貝（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）／フロインドの不完全アジュバント（ＩＣＦＡ）の投与を実験２１日目と２７日目に受け、実験２４日目に、グループ１−８は病原性ＰＣＶ２のチャレンジを受けた。
チャレンジ前後に、血液サンプルがＰＣＶ２の血清学のために採取された。チャレンジ後に、平均的な日ごとの体重増加を確定するための体重データ、及び臨床症状が、ＰＣＶ２の鼻からの排出を確認するための鼻スワブサンプルとともに、採取された。
実験４９日目に、全ての生き残ったブタが解剖され、肺が病変に従ってスコア化され、選ばれた組織が後日の免疫組織化学（ＩＨＣ）的検査のためにホルマリン中に保存された。
材料と方法
これは、実験０日目に９から１４日齢であった、ＣＤＣＤブタにおいて行われた、一部盲検化されたワクチン接種−チャレンジのフィージビリティ・スタディであった。研究に含まれるため、種雄豚のＰＣＶ２ ＩＦＡタイター≦１：１０００であった。さらに、種雄豚の血清学的状態は既知のＰＲＲＳ陰性の群れに由来した。
２８匹の種雄豚がＰＣＶ２の血清学的状態を検査された。１４匹の種雄豚が１０００以下のＰＣＶ２タイターを示し、１番目の研究サイトに移された。
１１０匹の子ブタが帝王切開手術によって分娩され、実験−４日目にこの研究のために利用可能であった。上の表４に示されるように、実験−３日目に、１番目の研究サイトにいる１０８匹のＣＤＣＤブタが体重を測定され、耳タグで個体識別され、体重によって区分され、そして、無作為に９グループのうちの１つに割り振られた。
算入基準に合致するテスト動物が研究に含められ、後に何らかの理由で除外された場合、調査員とモニターが、最終的な分析でその動物から採集されたデータの使用を判断するために、相談した。子ブタを登録した日は除外され、除外の理由は文書に記録されている。最初に、種雄豚で除外されたものはなかった。
実験−３日目に、利用可能な１１０匹のうち総数１０８匹のブタが無作為に９グループのうちの１つに割り振られた。２匹の最も小さなブタ（番号１７及び１８）はグループに割り振られず、必要ならばエキストラとして利用可能であった。
研究行程中、数匹の動物が除かれた。実験−１日目に８２番のブタ（グループ９）、実験３日目に５６番のブタ（グループ６）、実験４日目に５３番のブタ（グループ９）、実験８日目に２８番のブタ（グループ８）、実験７日目に６９番のブタ（グループ８）、及び実験９日目に９３番のブタ（グループ４）が、それぞれ、チャレンジ前に死亡していることが発見された。
これら６匹のブタは最終的な研究結果に含まれていない。１７番のブタ（エキストラのブタの１匹）がグループ９に割り振られた、残りのエキストラのブタ、１９番は、研究から除かれた。
各グループに与えられた調製物は次の通りである：グループ１は、１６μｇ／ｍｌのＯＲＦ２を含む１ｍｌのウイルスＯＲＦ２（ｖＯＲＦ２）を投与することが計画された。これは、１０．２４ｍｌのウイルスＯＲＦ２（２５６μｇ／２５μｇ／ｍｌ＝１０．２４ｍｌ ｖＯＲＦ２）を３．２ｍｌの０．５％カーボポール及び２．５６ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）と混合することにより行われた。こうして１６ｍｌのグループ１用調製物が作られた。
グループ２は、８μg／ｍｌのｖＯＲＦ２を含む１ｍｌのｖＯＲＦ２を投与することが計画された。これは、５．１２ｍｌのｖＯＲＦ２（１２８μｇ／２５μｇ／ｍｌ＝５．１２ｍｌ ｖＯＲＦ２）を３．２ｍｌの０．５％カーボポール及び７．６８ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）と混合することにより行われた。こうして１６ｍｌのグループ２用調製物が作られた。
グループ３は、４μg／ｍｌのｖＯＲＦ２を含む１ｍｌのｖＯＲＦ２を投与することが計画された。これは、２．５６ｍｌのｖＯＲＦ２（６４μｇ／２５μｇ／ｍｌ＝２．５６ｍｌ ｖＯＲＦ２）を３．２ｍｌの０．５％カーボポール及び１０．２４ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）と混合することにより行われた。こうして１６ｍｌのグループ３用調製物が作られた。
グループ４は、１６μg／ｍｌのｒＯＲＦ２を含む１ｍｌの組換えＯＲＦ２（ｒＯＲＦ２）を投与することが計画された。これは、２．２３ｍｌのｒＯＲＦ２（５１２μｇ／２３０μｇ／ｍｌ＝２．２３ｍｌ ｒＯＲＦ２）を６．４ｍｌの０．５％カーボポール及び２３．３７ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）と混合することにより行われた。こうして３２ｍｌのグループ４用調製物が作られた。
グループ５は、８μg／ｍｌのｒＯＲＦ２を含む１ｍｌの組換えＯＲＦ２（ｒＯＲＦ２）を投与することが計画された。これは、１．１１ｍｌのｒＯＲＦ２（２５６μｇ／２３０μｇ／ｍｌ＝１．１１ｍｌ ｒＯＲＦ２）を６．４ｍｌの０．５％カーボポール及び２４．４９ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）と混合することにより行われた。こうして３２ｍｌのグループ５用調製物が作られた。
グループ６は、４μg／ｍｌのｒＯＲＦ２を含む１ｍｌの組換えＯＲＦ２（ｒＯＲＦ２）を投与することが計画された。これは、０．５６ｍｌのｒＯＲＦ２（１２８μｇ／２３０μｇ／ｍｌ＝０．５６ｍｌ ｒＯＲＦ２）を６．４ｍｌの０．５％カーボポール及び２５．０４ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）と混合することにより行われた。こうして３２ｍｌのグループ６用調製物が作られた。
グループ７は、ＭＡＸ ＰＣＶ２ ＫＶを含む２ｍｌのＰＣＶ２ 不活化ウイルス全粒子（ＰＣＶ２ ＫＶ）を投与することが計画された。これは、５６ｍｌのＰＣＶ２ ＫＶを１４ｍｌの０．５％カーボポールと混合することにより行われた。こうして７０ｍｌのグループ７用調製物が作られた。
最後に、グループ８は、２ｍｌ用量あたり０．５μｇ／ｍｌ又は１．０μｇ／ｍｌのＫＬＨを投与することが計画された。これは、４０．７１ｍｌのＫＬＨ（０．５μｇ／ｍｌで７．０μｇタンパク質／ｍｌ＝５７０ｍｌ（７．０μｇ／ｍｌ）(x)＝（０．５）（５７０ｍｌ））、２４４．２９ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）及び２８５ｍｌのフロインドアジュバントを混合することにより行われた。表５はこの実施例のキーとなる行動に対するタイムフレームを記載している。
Figure 0005726395
研究の生存中フェイズの完了に引き続き、病理学者によって、ホルマリン固定組織が免疫組織化学（ＩＨＣ）によってＰＣＶ２抗原の検査がされ、血液サンプルはＰＣＶ２血清学の評価をされ、鼻スワブサンプルはＰＣＶ２排出の評価をされ、そして平均１日あたり体重増加（ＡＤＷＧ）が実験２４日目から５９日目まで決定された。
動物は１番目の研究サイトで、５つの部屋の個別のケージに、誕生から約１１日齢まで、収容された（ほぼ研究０日目である）。各部屋は同じレイアウトであり、加温され、ろ過された空気が分離単位ごとに供給される個別のステンレス鋼製のケージから構成されていた。各部屋は別々の暖房装置と換気装置をもち、それによって部屋の間の空気のクロスコンタミネーションを防いだ。
動物は２番目の研究サイトで、２つの異なる建物に収容された。グループ９（厳密な陰性コントロール）が改造された仕上棟に分けて収容され、グループ１−８は改造された飼育棟に収容された。
各グループは別々の檻に収容され（檻１つにつきブタ１１−１２匹）、各檻はブタ１匹につき約３．０平方フィートを提供した。各檻はプラスチック製の羽根板の板材でできた、高架デッキ上にあった。檻の下のピットは、排泄物やゴミの汚物槽として供された。各建物は別個の加温及び換気システムをもち、建物間の空気のクロスコンタミネーションをほとんどなくしていた。
１番目の研究サイトでは、子ブタは特別組成のミルク飼料を、誕生からおよそ３週齢まで給餌された。全ての子ブタは固形の特別配合の飼料を実験１９日まで食べていた（およそ４１／２週齢）。
２番目の研究サイトでは、全てのブタは、週齢と体重に適した、特製の、薬が入っていない商用配合飼料を好きなときに給餌された。水も両方のサイトで随意に利用可能であった。
全ての被験ブタは実験−２日目にビタミンＥで、実験−１日目に鉄注射で、実験１６、１７、１８及び１９日目にナクセル（ＮＡＸＣＥＬ、登録商標）で処理された（１．０ｍＬ、筋肉内注射、脚を順に変える）。加えて、５２番のブタ（グループ９）は実験３日目に鉄注射で処理され、４５番のブタ（グループ６）は実験１１日目に鉄注射で処理され、６９番のブタ（グループ８）はナクセル（ＮＡＸＣＥＬ、登録商標）で実験６日目に処理され、７４番のブタ（グループ３）はデキサメタゾンとペニシリンで実験１３日目に、ナクセル（ＮＡＸＣＥＬ、登録商標）で実験１４日目に、様々な健康上の理由から処理された。
両方の研究サイトにいる間、ブタは家畜管理の下に置かれた。動物の健康診断は実験０日目に行われ、健康診断報告フォームに記録された。全ての動物は実験０日目の観察によって確認されたように、ワクチン接種前によい健康状態と栄養状態にあった。全てのテスト動物は、チャレンジの前に、よい健康及び栄養状態にあることが観察された。死骸と組織はレンダリングにより処分された。研究動物の最終処分は動物処分記録に記録された。
実験０日目に、グループ１−６に割り振られたブタが、１．０ｍＬのＰＣＶ２ワクチン１−６を、それぞれ、筋肉内注射（ＩＭ）で、首の左側部分に、滅菌した３．０ｍＬのルアーロックシリンジと滅菌した２０ｇ×１／２”ニードルを使って投与された。グループ７に割り振られたブタは、２．０ｍＬのＰＣＶ２ワクチンＮｏ．７を、筋肉内注射（ＩＭ）で、首の左側部分に、滅菌した３．０ｍＬのルアーロックシリンジと滅菌した２０ｇ×１／２”ニードルを使って投与された。
実験１４日目に、グループ７に割り振られたブタは、２．０ｍＬのＰＣＶ２ワクチンＮｏ．７を、筋肉内注射（ＩＭ）で、首の右側部分に、滅菌した３．０ｍＬのルアーロックシリンジと滅菌した２０ｇ×１／２”ニードルを使って投与された。
実験２１日目に、すべての被験ブタが、２．０ｍＬのＫＬＨ／ＩＣＦＡを、筋肉内注射（ＩＭ）で、右の太もも部分に、滅菌した３．０ｍＬのルアーロックシリンジと滅菌した２０ｇ×１／２”ニードルを使って投与された。実験２７日目に、すべての被験ブタが、２．０ｍＬのＫＬＨ／ＩＣＦＡを、筋肉内注射（ＩＭ）で、左の太もも部分に、滅菌した３．０ｍＬのルアーロックシリンジと滅菌した２０ｇ×１／２”ニードルを使って投与された。
実験２４日目に、グループ８に割り振られたブタが、１．０ｍＬのＰＣＶ２ ＩＳＵＶＤＬチャレンジマテリアル（５．１１ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を筋肉内注射で、首の左側部分に、滅菌した３．０ｍＬのルアーロックシリンジと滅菌した２０ｇ×１／２”ニードルを使って投与された。追加の１．０ｍＬの同じマテリアルが、鼻内（ＩＮ）注入で、滅菌した３．０ｍＬのルアーロックシリンジと鼻カニューレを使って、各ブタに投与された（鼻孔あたり０．５ｍＬ）。
被験ブタは、全体的な健康と副作用について、実験−４日目及び実験０日目から実験１９日目まで、毎日観察された。観察結果は臨床観察記録に記録された。全ての被験ブタは、注射部位の反応について、実験０日目から実験７日目まで観察され、グループ７は実験１４日目から２１日目までさらに観察された。実験−３、２４及び４９日目、又は、チャレンジ後にブタが死んでいることが発見された日に、平均１日あたり体重増加が、キャリブレーションされた体重計の上で、それぞれのブタの体重を測定することによって、決定された。体重は体重フォームに記録された。実験−３日目の体重が、無作為抽出の前に、ブタを分けるために利用された。実験２４日目及び実験４９日目の体重データが、各ブタに対する、この期間内の、平均１日あたり体重増加（ＡＤＷＧ）を決定するために、利用された。チャレンジ後、実験４９日以前に死んだブタに対しては、実験２４日目から死亡の日までのＡＤＷＧを表すように、ＡＤＷＧが調整された。
ＰＣＶ２の血清学を決定するため、各子ブタから、静脈全血が、眼窩静脈洞から、実験−３日目及び１３日目に、採集された。各子ブタに対して、眼窩静脈洞から、滅菌したキャピラリーチューブを片側の目の目頭に挿入し、約３．０ｍＬの全血を、４．０ｍＬの血清分離チューブ（ＳＳＴ）に吸引することによって、血液が採集された。
実験２４、３１及び４９日目に、各ブタからの静脈全血が、上大静脈から、滅菌した１８ｇ×１／２”バキュテイナーニードル（ベクトン・ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー）、バキュテイナーニードルホルダー及び１３ｍＬのＳＳＴを使い、採集された。各時点での血液採集が、サンプル採集記録に記録された。各ＳＳＴ内の血液は、凝固するままにされ、その後、各ＳＳＴがスピンダウンされて血清が集められた。集められた血清は滅菌したスナップチューブに移され、−７０±１０℃で、後日検査されるまで、保存された。血清サンプルは、ＰＣＶ２抗体の存在を、ＢＩＶＩ−Ｒ＆Ｄの職員によって、検査された。
ブタは実験２０日目から実験４９日目まで１日１回、臨床症状を観察され、臨床的観察は臨床観察記録に記録された。
ＰＣＶ２の鼻からの排出を検査するため、実験２４、２５日目に、そして、その後奇数実験日毎に実験４９日目まで、滅菌したダクロンのスワブがそれぞれのブタの左あるいは右の鼻から鼻内部に可能な限り無菌的に挿入され（ブタ１匹に対してスワブ１個）、数秒間動かし、それから取り除いた。それぞれのスワブはそれから１％ＩＦＢＳ、５００ユニット／ｍＬのペニシリン、５００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び２．５μｇ／ｍＬのフンギゾンを含有する１．０ｍＬのＥＭＥＭ培地を入れた１つの滅菌済スナップ式キャップのチューブに入れられた。スワブはチューブ内で分解され、スナップチューブは封をされ、動物の番号、採集の日、実験序数日、及び“鼻スワブ”で適切なラベルをされた。封されたスナップチューブはＢＩＶＩ‐セント・ジョセフに移送されるまで一晩、−４０±１０℃で保管された。鼻スワブの採集品は鼻スワブサンプル採集フォームに記録された。ＢＩＶＩ‐Ｒ＆Ｄが鼻スワブサンプルのＰＣＶ２の定量的なウイルスの単離（ＶＩ）検査を行った。結果はｌｏｇ１０値で表された。１．３ｌｏｇ又はそれよりも小さい値は陰性とみなされ、１．３ｌｏｇよりも大きな値は陽性とみなされた。
最初の研究サイトで死んだブタ（Ｎｏ．２８、５２、５６、６９、８２、及び９３）は診断を行うのに必要なレベルまで解剖された。肉眼的病変が記録され、これらのブタからは組織が保存されなかった。
２番目の研究サイトで、実験４９日目よりも前に死亡したブタ（番号、４５、２３、５８、３５）、実験４９日目に安楽死の前に死んでいることが発見されたブタ（番号、２、４３）及び実験４９日目に安楽死させられたブタは解剖された。あらゆる肉眼的病変が確認され、病変がある肺葉のパーセンテージが解剖報告フォームに記録された。
２番目の研究サイトで解剖された１０３匹のブタのそれぞれから、扁桃腺、肺、心臓、肝臓、腸間膜リンパ節、腎臓及び鼠径部リンパ節の組織サンプルが緩衝１０％ホルマリンが入った１つのコンテナに入れられた；一方、同じ前述の器官からとられた別の組織サンプルは、ワールパック（Ｍ−テック・ダイアグノスティクス社、セルウォール、ＵＫ）にいれられ、それぞれのワールパックは氷上に置かれた。それぞれのコンテナは適切にラベルされた。サンプルを採集したものは解剖報告フォームに記録された。その後、ホルマリン固定組織サンプル及び診断要求フォームがＩＨＣ検査のために提出された。ＩＨＣ検査は、サンプルの受け入れ、サンプルとスライドの調製、及び染色技術について、標準的なＩＳＵラボラトリーの手順に従って実施された。ワールパック内の新鮮な組織アイスパックとともに保存（−７０℃±１０℃）と将来的的に使用するために研究モニターに送られた。
ホルマリン固定サンプルは病理学者によって、ＩＨＣによるＰＣＶ２検出の検査がされ、次のスコア化システムを使いスコア化された：０＝なし；１＝貧弱な陽性染色、ほとんど染色箇所がない；２＝中程度に陽性染色、多数の染色箇所；及び、３＝明らかな陽性染色、組織全体にわたって分布。病理学者が鼠径部リンパ節と腸間膜リンパ節を確信をもって区別できないという事実のために、これらの組織に対する結果は単純にリンパ節及び１動物あたり２つの組織のそれぞれに対して与えられる最も高いスコアがラベルされた。
結果
この実施例にの結果が下記に与えられる。グループ９からの１匹のブタが実験０日目以前に、さらに５匹（グループ４から１匹；グループ６から１匹；グループ８から２匹；及びグループ９から１匹）のブタがワクチン接種後に死亡したことが注記される。死後の検査により、６匹はすべてワクチン接種又はＰＭＷＳに関係しない潜在的感染によって死亡したことが示された。
１日あたり平均体重増加（ＡＤＷＧ）の結果は下に表６に示される。厳密な陰性コントロールであるグループ９が最も高いＡＤＷＧを示し（１．０６±０．１７ ｌｂ／日）、８μｇのｒＯＲＦ２の１用量を投与されたグループ５が（０．９４±０．２２ ｌｂ／日）次に位置し、４μｇのｖＯＲＦ２の１用量を投与されたグループ３が最も低いＡＤＷＧ（０．４９±０．２１ ｌｂ／日）を示し、不活化ワクチンの２用量を投与されたグループ７がそれに続いた（０．５０±０．１５ ｌｂ／日）。
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ＰＣＶ２の血清学の結果は下に表７に示される。９つすべてのグループはＰＣＶ２に対して実験―３日目には血清学的陰性であった。実験１４日目に、ｖＯＲＦ２ワクチンの接種を受けたグループが最も高いタイターを示し、１８７．５から５２９．２の範囲であった。不活化ワクチンを投与されたブタが次に高いタイターを示し、ｒＯＲＦ２ワクチンを投与されたグループがそれに続いた。グループ８及び９はこの時には血清学的陰性のままであった。
実験２４日目及び実験３１日目に、ｖＯＲＦ２を投与されたブタは強い血清学的反応を示し続け、不活化ワクチンの２用量を投与されたグループがすぐ後に続いた。ｒＯＲＦ２ワクチンを投与されたブタは血清学的に応答が遅く、グループ８と９は血清学的陰性のままであった。
実験４９日目に、ｖＯＲＦ２ワクチン、２用量の不活化ウイルスワクチン及び最低用量のｖＯＲＦ２ワクチンをを投与されたブタが最も強い血清学的応答を示した。１６μｇ及び８μｇのｒＯＲＦ２ワクチンを投与されたブタは、チャレンジコントロールよりもやや高いＩＦＡタイターを示した。グループ９は実験４９日目に強い血清学的応答を示した。
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チャレンジ後の臨床的観察の結果が下の表８に示される。この結果のまとめは、異常な行動、異常な呼吸、咳及び下痢を含む。
表９は、グループごとの全臨床症状発生件数のまとめからの結果を含み、表１０はグループごとのチャレンジ後死亡率のまとめからの結果を含む。
この研究において確認された最も普通の臨床症状は、軽度から重度の昏睡としてスコアされた異常行動であった。２種類のより低用量のｖＯＲＦ２を投与されたブタ、１６μｇのｒＯＲＦ２を投与されたブタ及びＫＶワクチンを２用量投与されたブタは、発生率≧２７．３％を示した。８μｇのＯＲＦ２を投与されたブタと厳密な陰性コントロールグループは全く異常行動を示さなかった。
この研究では、ブタは全く異常呼吸を示さなかった。咳は全てのグループで頻繁に（０から２５％）確認されたが、下痢も同様（０−２０％）であった。確認された臨床症状は、全くＰＭＷＳに病患特異的ではなかった。
全体的な臨床症状の発生率はグループ間で異なっていた。いずれかのｖＯＲＦ２ワクチンを投与されたグループ、１６μｇのｒＯＲＦ２を投与されたグループ、ＫＶワクチンの２用量を投与されたグループ及びチャレンジコントロールグループは、最も高い臨床症状発生率（≧３６．４％）を示した。厳密な陰性コントロールグループ、８μｇのｒＯＲＦ２を投与されたグループ及び４μｇのｒＯＲＦ２を投与されたグループは、それぞれ、０％、８．３％及び９．１％の全体的な臨床症状発生率を示した。
グループ間の全体的な死亡率も同様に異なっていた。ＫＶワクチンを２用量投与されたグループは最も高い死亡率（１６．７％）を示した；その一方で、４μｇのｖＯＲＦ２、１６μｇのｒＯＲＦ２又は８μｇのｒＯＲＦ２を投与されたグループ及び厳密な陰性コントロールグループは全て０％の死亡率を示した。
Figure 0005726395
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ＰＣＶ２の鼻からの排出の結果は下記の表１１に示される。
Figure 0005726395
実験２４日目のチャレンジ後、実験２７日目にグループ７の１匹のブタがＰＣＶ２を排出し始めた。実験３３日目まで、他のグループでは排出するものはいなかった。鼻からの排出の大部分は、実験３５日目から４５日目まで確認された。
３種類のｖＯＲＦ２ワクチンのいずれかを投与されたグループ及びｒＯＲＦ２を４又は８μｇ投与されたグループは、最も低いＰＣＶ２の鼻からの排出発生率（≦９．１％）を示した。
チャレンジコントロールグループ（グループ８）は最も高い排出率（８０％）を示し、６３．３％の発生率を示した厳密な陰性コントロールグループがそれに続いた。
グループごとの黄疸発生率、グループごとの胃潰瘍発生率、グループごとの平均肺病変スコア、及びグループごとの肺病変発生率が下の表１２に示される。
Figure 0005726395
６匹のブタが１番目の試験サイトで研究のワクチン接種後フェイズ中に死亡した（グループ４、Ｎ＝１；グループ６、Ｎ＝１；グループ８、Ｎ＝２；グループ９、Ｎ＝２）。
６匹中４匹のブタには、１又は２以上の体腔において、フィブリンの病変があった。１匹のブタ（グループ６）はクロストリジウム症に一致する病変があり、また、１匹のブタ（グループ９）には肉眼的病変が無かった。研究のワクチン接種後フェイズの間に死亡したブタには、ＰＭＷＳに一致する病変が全く無かった。
チャレンジ後に死亡したブタと実験４９日目に安楽死させられたブタが解剖された。解剖では、黄疸及び胃潰瘍が、どのグループにも見られなかった。平均％肺病変に関しては、グループ９が最も低い平均％肺病変（０％）を示し、グループ１が０．４０±０．５０％で、グループ５が０．６８±１．１５％で、それに続いた。
グループ２，３，７及び８が最も高い平均％肺病変（≧７．２７％）を示した。これら４グループのそれぞれは、これら４グループに対する結果を高く歪曲する、％肺病変≧７１．５％なる１匹のブタを含んだ。０％の肺病変が確認されたグループ９を除き、残る８グループは≦３６％の肺病変を示した。ほとんど全ての確認された肺病変が、赤／紫及びかたまっていると記載された。
グループごとのＩＨＣ陽性発生率のまとめが表１３に示される。
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グループ１（ｖＯＲＦ２−１６μｇ）及びグループ５（ｒＯＲＦ２−８μｇ）が最も低率のＩＨＣ陽性の結果（１６．７％）を示した。
グループ８（チャレンジコントロール）及びグループ９（厳密な陰性コントロール）が最も高率のＩＨＣ陽性の結果、それぞれ９０％及び９０．９％を示した。
チャレンジ後、８μｇのｒＯＲＦ２抗原を１用量投与されたグループ５は、他の６種類のワクチングループよりも優れた効果を示した。グループ５は最も高いＡＤＷＧ（０．９４±０．２２ ｌｂ／日）、最も低い異常行動発生率（０％）、２番目に低い咳発生率（８．３％）、最も低い全臨床症状発生率（８．３％）、最も低い死亡率（０％）、最も低い鼻からのＰＣＶ２排出率（８．３％）、２番目に低率の平均％肺病変（０．６８±１．１５％）及び最も低い陽性組織発生率（１６．７％）を示した。
様々なレベルのｒＯＲＦ２抗原を投与されたグループは全体的に様々なレベルのｖＯＲＦ２抗原を投与されたグループよりも優れた結果を示し、不活化全粒子ＰＣＶ２ワクチンを２用量投与されたグループは最も悪い結果を示した。
表１４及び１５はグループごとのチャレンジ後のデータのまとめを含む。
Figure 0005726395
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この研究の結果は、あらゆる今後のワクチン開発の努力がｒＯＲＦ２ワクチンに集中すべきであることを示している。
全般的に、鼻からのＰＣＶ２排出がチャレンジ後に検出され、ＰＣＶ２ワクチンによるワクチン接種が排出の低減をもたらした。
選ばれたリンパ組織の免疫組織化学はまた、ＡＤＷＧ、臨床症状、及び肉眼的病変における大きな違いはグループ間で検出されなかったが、ワクチンの効果に対するよいパラメタとして役立った。
この研究は、鼻からのＰＣＶ２の排出、ＰＣＶ２の血清型変換及び厳密な陰性コントロールグループであるグループ９でのＩＨＣ陽性組織によって証拠づけられる、外部からのＰＣＶ２が研究中のどこかの時点で持ち込まれたという事実のために、分析しにくかった。
考察
７種類のＰＣＶ２ワクチンがこの研究で評価されたが、それは、実験０日目に１回投与される３種類の異なる用量レベルのｖＯＲＦ２抗原、実験０日目に１回投与される３種類の異なる用量レベルのｒＯＲＦ２抗原、及び実験０日目と実験１４日目に投与される１用量レベルの不活化全粒子ＰＣＶ２ワクチンを含んだ。
全般的に、８μｇのｒＯＲＦ２抗原を含むワクチンの１用量を投与されたグループ５が最もよい結果を示した。グループ５は最も高いＡＤＷＧ、最も低い異常行動発生率、最も低い異常呼吸発生率、２番目に低い咳発生率、最も低い全体的臨床症状の出現率、最も低い死亡率、最も低い鼻からのＰＣＶ２排出率、２番目に低率の平均％肺病変及び最も低いＩＨＣ陽性組織の発生率を示した。
興味深いことに、グループ５よりも高用量のｒＯＲＦ２抗原を投与されたグループ４はグループ５と同等又はより優れた結果を示さなかった。グループ４は、グループ５よりも、やや低いＡＤＷＧ、より高い異常行動発生率、より高い全体的な臨床症状の出現率、より高い鼻からのＰＣＶ２排出率、より高率の平均％肺病変、及びより高いＩＨＣ陽性組織の発生率を示した。
これら２つのグループ間の違いが統計学的に意味が無いことを示せたかもしれない統計学的解析は、これらのデータについては行われなかったが、グループ４はグループ５と同等の成果を示していないという観察された傾向がある。
ワクチン接種後、６匹のブタが最初の研究サイトで死亡した。６匹のブタのうち４匹は、ワクチン投与を受けないグループ８又はグループ９からであった。６匹のブタはすべてＰＭＷＳに合致する病変を呈していなかった。
副作用は全く報告されず、全般的に、７種類全てのワクチンは、約１１日齢のブタに投与されたときに安全であることが明らかとなった。
研究のワクチン接種後フェイズの間、ワクチングループの中で、３用量レベルのｖＯＲＦ２ワクチン又は不活化全粒子ワクチンを投与されたブタは、最も高いＩＦＡＴレベルを示したが、一方、グループ５は最も低いＩＦＡＴレベルをチャレンジ直前に示した。
正式には証明されていないが、離乳後まもなくの若いブタへのＰＣＶ２の主要な伝染ルートは、口と鼻の直接接触によるものであると信じられており、生産環境で鼻からのＰＣＶ２排出を減少する効果のあるワクチンは感染の拡大をコントロールすることを助けるだろう。
３種類のｖＯＲＦ２抗原レベルのうち１種類を投与されたグループ及び８μｇのｒＯＲＦ２を投与されたグループは、最も低い鼻からのＰＣＶ２排出率（８．３％）を示した。予想通り、チャレンジコントロールグループは最も高い鼻からの排出率（８０％）を示した。
ＰＣＶ２感染に続き、ＰＭＷＳを発症したブタの肉眼的病変は典型的には、一般的なリンパ節症と次のうちの１又は複数の組合せからなる：（１）小葉間浮腫を伴う間質性肺炎、（２）皮膚の蒼白又は黄疸、（３）斑点のある萎縮性肝臓、（４）胃潰瘍、及び（５）腎炎。
解剖時に、黄疸、肝炎、腎炎、及び胃潰瘍はどのグループでも確認されず、リンパ節炎は特に検査されなかった。平均％肺病変スコアはグループ間で異なっていた。
１６μｇのｖＯＲＦ２抗原を投与されたグループは、最も低い平均％肺病変スコア（０．４０±０．５０％）を示し、８μｇのｒＯＲＦ２を投与されたグループ（０．６８±１．１５％）がそれに続いた。
予想通り、チャレンジコントロールグループが最も高い平均％肺病変スコア（９．８８±２９．２％）を示した。
４グループ全てで、平均％肺病変スコアが、非常に高い肺病変スコアをもつ、各グループの１匹のブタのせいで上昇した。
肺病変のほとんどは、赤／紫及びかたまっているとして記載された。典型的には、ＰＭＷＳに関係する肺病変は、小肺葉浮腫のためにタン色で散らばっているとして記載される。この研究で確認された肺病変は、ＰＣＶ２感染に関係するのではなく、二次的な肺感染生物が存在していたかもしれない。
本研究の状況では、％肺病変スコアは、おそらくＰＣＶ２による肺感染の量の本当の値を反映しない。
他の研究者は、ＩＨＣによるＰＣＶ２抗原の存在と組織病理学の間の直接的な相関を示した。選ばれた組織の組織病理学はこの研究では行われなかった。
グループ１（１６μｇのｖＯＲＦ２）とグループ５（８μｇのｒＯＲＦ２）は最も低いＰＣＶ２抗原に対して陽性のブタの発生率（８．３％）を示したが、一方、グループ９（厳密な陰性コントロールグループ−９０．９％）とグループ８（チャレンジコントロールグループ−９０．９％）は最も高いＰＣＶ２抗原に対して陽性のブタの発生率を示した。このテストの非主観的な性質のため、ＩＨＣの結果は、おそらく、ワクチンの効力を判定するための最もよいパラメタのひとつである。
そして、本発明の一態様では、１ｍｌ／１用量の抽出されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２（ｒＯＲＦ２）抗原による組換え産物の、ＣＤＣＤブタモデルにおける、ＰＣＶ２チャレンジに対する、最小保護用量（ＭＰＤ）が決定された。
様々なレベルのｒＯＲＦ２抗原を投与された３グループのうち、グループ５（８μｇのｒＯＲＦ２抗原）は明瞭に最も高いレベルの保護を示した。グループ５は最もよい結果を示すか、又は、試験されたパラメタのすべてに関して最も好ましい結果と結び付けられた。
グループ５がチャレンジ後に他の６つのワクチングループと比較されたとき、グループ５は最も高いＡＤＷＧ（０．９４±０．２２ ｌｂ／日）、最も低い異常行動発生率（０％）、２番目に低い咳の発生率（８．３％）、最も低い全臨床症状の発生率（８．３％）、最も低い死亡率（０％）、最も低い鼻からのＰＣＶ２排出率（８．３％）、２番目に低率の平均％肺病変（０．６８±１．１５％）、及び最も低いＩＨＣ陽性組織の発生率を示した。
本発明の別の態様では、１ｍｌ／１用量の、部分的に精製されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２ （ｖＯＲＦ２）抗原である、コンベンショナルな産物の、ＣＤＣＤモデルにおける、ＰＣＶ２チャレンジに対するＭＰＤが決定された。
様々なレベルのｖＯＲＦ２抗原を投与された３グループのうち、グループ１（１６μｇのｖＯＲＦ２抗原）は明瞭に最も高いレベルの保護を示した。グループ１はＡＤＷＧ，平均％肺病変、及びＩＨＣに関して、グループ２及び３をよりも優れていた。
グループ１及び２（８μｇのｖＯＲＦ２抗原）は、臨床症状の全発生率に関して同じ性能を発揮し、グループ３（４μｇのｖＯＲＦ２抗原）は最も低い死亡率を示し、３グループ全てが鼻からの排出に関して同じ性能を示した。
全体的に、ｖＯＲＦワクチンはｒＯＲＦ２ワクチンと同程度の性能を示さなかった。
本発明のさらに別の態様では、２ｍｌ／２用量の、コンベンショナルな不活化ＰＣＶ２ワクチンの最大用量の、ＣＤＣＤブタモデルにおける、ＰＣＶ２チャレンジに対する有効性が決定された。
この研究で評価された７種類のワクチンのうち、不活化全粒子ＰＣＶ２ワクチンが、最も悪い性能を示した。
２用量の不活化全粒子ＰＣＶ２ワクチンを投与された子ブタは、最も低いＡＤＷＧ、２番目に高い異常行動率（５８．３％）、２番目に高い臨床症状の全発生率（５８．３％）、最も高い死亡率（１６．７％）、２番目に高い鼻からの排出発生率（４１．７％）、もっとも高い平均％肺病変（９．８８±２９．２％）、高率の確認された肺病変（７５％）、及び中程度の組織でのＩＨＣ発生率（４１．７％）を示した。しかしながら、免疫応答を誘導することについてはかなり有効であった。
本発明のさらに別の態様では、鼻からのＰＣＶ２排出が、有効性パラメタとして検討され、以前の研究からの以前のＰＣＶ２有効性パラメタが再確認された。この研究からの結果は鼻からのＰＣＶ２の排出が鼻内チャレンジに続いて起こること及びチャレンジ後にＰＣＶ２ワクチンがＰＣＶ２の鼻からの排出を低減するということを示す。さらに、この研究からの結果及び文献中の報告は、将来のＰＣＶ２ワクチン試験においても同様にＩＨＣが評価され続けるべきであることを示す。
この研究から生じるいくつかの追加の結論は、リンパ節症はＰＭＷＳのひとつの特徴であるということである。ＰＭＷＳのもうひとつの特徴はリンパ球の減少と多核／巨大食細胞である。
さらに、副作用又は注射部位の反応が７種類のＰＣＶ２ワクチンのいずれに対しても確認されず、７種類のＰＣＶ２ワクチンがすべて若いブタに投与されたときに安全であることが明らかになった。
実施例５
この実施例は８種類のＰＣＶ２ワクチン候補の有効性をテストし、ＰＣＶ２の病原性株への曝露後の以前のチャレンジ研究からのＰＣＶ２チャレンジパラメタを確認する。帝王切開で分娩され、初乳を与えられない（ＣＤＣＤ）、６−１６日齢の１５０匹の子ブタが、体重によって分別され、無作為に同じ個体数の１０グループに割り振られた。
表１６は、この実施例に対する全般的な研究設計を示す。
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各グループに与えられたワクチンの調製物は次の通りであった。ＰＣＶ２ワクチンＮｏ．１は、グループ１に１×２ｍｌ用量で投与される、高用量（１６μｇ／２ｍｌ用量）のＩＭＳ １３１４でアジュバントされた不活化組換えＯＲＦ２抗原（１６μｇ ｒＯＲＦ２−ＩＭＳ １３１４）であった。
ＰＣＶ２ワクチンＮｏ．２は、グループ２に１×２ｍｌ用量で投与される、高用量（１６μｇ／２ｍｌ用量）のカーボポールでアジュバントされた一部精製ＶＩＤＯ Ｒ−１生成ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原（１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポール）であった。
ＰＣＶ２ワクチンＮｏ．３は、グループ３に１×２ｍｌ用量で投与される、高用量（１６μｇ／２ｍｌ用量）のカーボポールでアジュバントされた不活化組換えＯＲＦ２抗原（１６μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール）であった。
ＰＣＶ２ワクチンＮｏ．４は、グループ４に１×１ｍｌ用量で投与される、高用量（１６μｇ／１ｍｌ用量）のカーボポールでアジュバントされた一部精製ＶＩＤＯ Ｒ−１生成ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原（１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポール）であった。
ワクチンＮｏ．５は、グループ５に１×２ｍｌ用量で投与される、４μｇ／２ｍｌ用量のカーボポールでアジュバントされた不活化組換えＯＲＦ２抗原（４μｇ ｒＲＯＲ２−カーボポール）であった。
ＰＣＶ２ワクチンＮｏ．６は、グループ６に１×２ｍｌ用量で投与される、１μｇ／２ｍｌ用量のカーボポールでアジュバントされた不活化組換えＯＲＦ２抗原（１μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール）であった。
ＰＣＶ２ワクチンＮｏ．７は、グループ７に１×２ｍｌ用量で投与される、低用量（０．２５μｇ／２ｍｌ用量）のカーボポールでアジュバントされた不活化組換えＯＲＦ２抗原（０．２５μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール）であった。
ＰＣＶ２ワクチンＮｏ．８は、グループ８に１×２ｍｌ用量で投与される、高用量（不活化前タイター＞８．０ ｌｏｇ／２ｍｌ用量）の、カーボポールでアジュバントされた、不活化された、コンベンショナルな、殺された、ＶＩＤＯ Ｒ−１によって生成したＰＣＶ２ Ｓｔｒｕｖｅ抗原（＞８．０ ｌｏｇ ＫＶ−カーボポール）であった。
実験０日目に、グループ１−８はそれらに割り当てられたワクチンで処理された。グループ１−３及び５−８はそれらに対応するワクチンのブースターを実験１４日目に再び投与された。１６μｇのｖＯＲＦ２−カーボポールの１用量の効果が、実験１４日目にブースターを投与されなかったグループ４についてテストされた。子ブタは、２度のワクチン接種に続く副作用と注射部位の反応を観察された。
実験２１日目に、子ブタは、グループ１−９が１つの建物に収容され、グループ１０が別の建物に収容される２番目の研究サイトに移動された。全ての子ブタはフロイントの不完全アジュバントでアジュバントしたスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ／ＩＣＦＡ）を実験２２及び２８日目に投与された。
実験２５日目に、グループ１−９は約４ｌｏｇの病原性ＰＣＶ２ウイルスでチャレンジされた。実験４６日目までにチャレンジコントロールグループではほとんど死亡が起きなかった。ブタを免疫刺激し、ＰＣＶ２チャレンジマテリアルの病原性を増加させる試みでは、すべてのグループがインゲルバック（ＩＮＧＥＬＶＡＣ、登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶ（豚生殖器呼吸器症候群ワクチン、改変生ウイルス）で実験４６日目に処理された。
チャレンジ前後の血液サンプルがＰＣＶ２血清学のために採集された。チャレンジ後の、平均１日当たり体重増加（ＡＤＷＧ）を決定するための体重データ及び臨床的徴候の観察結果が採集された。
実験５０日目に、全ての生き残っているブタが解剖され、肉眼的病変が記録され、肺が病理学のためにスコア化され、選ばれた組織が後日のＰＣＶ２抗原を検出するための免疫組織化学（ＩＨＣ）による検査のためにホルマリン中に保存された。
材料と方法
これは、実験０日目に６から１６日例のＣＤＣＤブタで実施された、一部盲検化したワクチンチャレンジの実現可能性研究である。この研究に加入されるためには、種雄豚のＰＣＶ２ ＩＦＡ≦１０００であった。さらに、種雄豚の血清学的状態は既知のＰＲＲＳ陰性群れに由来した。
１６匹の種雄豚がＰＣＶ２血清学的状態を検査され、１６匹全てが≧１０００のＰＣＶ２タイターを有し、最初の研究サイトに移送された。
１５０匹の子ブタが帝王切開手術によって分娩され、実験−３日目に、この研究のために利用可能であった。上記の表１６に示されるように、実験−３日目に、最初の研究サイトで、１５０匹のＣＤＣＤブタが体重を測定され、耳タグで個体識別され、体重によって区分され、無作為に１０グループのうちの１つに割り振られた。
血液サンプルが全てのブタから採集された。
加入基準に合致する被験動物がこの研究に加入され、後に何らかの理由によって除外されたならば、調査員とモニターが、最終的な分析で、その動物から採集されたデータの使用を決定するために、相談をした。
ブタを加入した日は除外され、除外の理由は記載されている。加入基準に合致し、研究のために選ばれ、１番目の研究サイトに運ばれた種雄豚で除外されたものはなかった。子ブタは研究から全く除外されず、被験動物は終了前に研究から除かれなかった。
表１７は、この実施例の主要な行動のタイムフレームを記載する。
Figure 0005726395
この研究の生存中フェイズの完了に続き、ホルマリン固定組織が、病理学者によって、免疫組織化学（ＩＨＣ）で、ＰＣＶ２抗原検出のために、検査され、血液サンプルがＰＣＶ２血清学のために評価され、平均１日あたり体重増加（ＡＤＷＧ）が実験２５日目から実験５０日目まで決定された。
動物は１番目の研究サイトで７つの部屋の個別のケージに、誕生から約１１日齢まで収容された（ほぼ実験０日目）。
各部屋は同一レイアウトであり、積み重ねられた個々のステンレス鋼製ケージからなり、加温及びろ過された空気が各分離ユニットに個別に供給された。各部屋には個別の暖房及び換気が装備され、それによって部屋間の空気のクロスコンタミネーションを防止した。
動物は２番目の研究サイトで２つの異なる建物に収容された。グループ１０（厳密な陰性コントロールグループ）は別個に改造された飼育棟に収容され、グループ１−９は改造された分娩棟に収容された。
各グループは別々の檻に収容され（檻あたり１４−１５匹）、各檻はブタ１匹あたり約２．３平方フィートを提供した。グループ２、４及び８は、通路の片側の３つの隣接した檻に入れられ、グループ１、３、５、６、７、及び９は通路の反対側の６つの隣接した檻に入れられた。
グループを分けたのは、グループ２、４、及び８に投与されるワクチンが十分に不活化されていないという、研究モニターによる懸念のためであった。
各檻は、プラスチック製スレートの床を備えた架台の上にあった。檻の下のピットは排泄物貯蔵タンクとして供された。各建物は個別に暖房及び換気システムを装備し、建物間の空気のクロスコンタミネーションの可能性をほとんどなくしていた。
１番目の研究サイトで、子ブタは特別に調合されたミルク飼料を誕生から約３週齢まで給餌された。全ての子ブタは固形の、特別に配合された飼料を実験２１日目（およそ、４１／２週齢）まで食べていた。
２番目の研究サイトでは、全てのブタが、週齢と体重に対して適切な、特製の薬剤添加していない商用配合飼料を、随時、与えられた。両研究サイトでの水は、やはり任意に利用することができた。
全ての被験ブタは、実験１９、２０、及び２１日目に、注射するももを変えながら、筋肉内注射で、１．０ｍＬのナクセル（ＮＡＸＣＥＬ、登録商標）で処理された。さらに、ブタＮｏ．１１（グループ１）が、実験１０日目に、０．５ｍＬのナクセル（ＮＡＸＣＥＬ、登録商標）で、筋肉内注射で処理され、ブタＮｏ．１３（グループ１０）が、実験１０日目に、１ｍＬのペニシリン及び１ｍＬのプレデフ（ＰＲＥＤＥＦ、登録商標）２Ｘで処理され、ブタＮｏ．４（グループ９）が、実験１１日目に、１．０ｍＬのナクセル（ＮＡＸＣＥＬ、登録商標）で、筋肉内注射で処理され、ブタＮｏ．１（グループ１）、４及び１１が、実験１４日目に、様々な健康上の理由により、それぞれ１．０ｍｌのナクセル（ＮＡＸＣＥＬ、登録商標）で、筋肉内注射で処理された。
両研究サイトにいる間、ブタは家畜管理の下に置かれた。動物の健康検査は実験−３日目に行われ、健康検査記録フォームに記録された。全ての動物が、ワクチン接種前に、実験０日目の観察によって確認されたように、よい健康及び栄養状態にあった。
全ての被験動物が、チャレンジの前に、よい健康及び栄養状態にあることが観察された。死骸と組織はレンダリングによって廃棄された。研究に使用した動物の最終処分は動物処分記録に記録された。
実験０及び１４日目に、グループ１−３と５−８に割り振られたブタは、２．０ｍＬの割り当てられたＰＣＶ２ワクチン１−４を、それぞれ、筋肉内注射で、右側及び左側の首部分に、滅菌した３．０ｍＬルアーロックシリンジ及び滅菌した２０ｇ×１／２”ニードルを使って、投与された。
グループ４に割り振られたブタは、１．０ｍＬのＰＣＶ２ワクチンＮｏ．２を、筋肉内注射で、右側の首部分に、滅菌した３．０ｍＬルアーロックシリンジ及び滅菌した２０ｇ×１／２”ニードルを使って、実験０日目にのみ、投与された。
実験２２日目に、全ての被験ブタが、２．０ｍＬのＫＬＨ／ＩＣＦＡを、筋肉内注射で、左側の首部分に、滅菌した３．０ｍＬルアーロックシリンジ及び滅菌した２０ｇ×１”ニードルを使って、投与された。
実験２８日目に、全ての被験ブタが、２．０ｍＬのＫＬＨ／ＩＣＦＡを、筋肉内注射で、右側のもも部分に、滅菌した３．０ｍＬルアーロックシリンジ及び滅菌した２０ｇ×１”ニードルを使って、投与された。
実験２５日目に、グループ１−９に割り振られたブタは、１．０ｍＬのＰＣＶ２ ＩＳＵＶＤＬチャレンジマテリアル（３．９８ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を、筋肉内注射で、右側の首部分に、滅菌した３．０ｍＬルアーロックシリンジ及び滅菌した２０ｇ×１”ニードルを使って、投与された。
追加の１．０ｍＬの同じマテリアルが、鼻内（ＩＮ）注入で、滅菌した３．０ｍＬのルアーロックシリンジと鼻カニューレを使って、各ブタに投与された（鼻孔あたり０．５ｍＬ）。
実験４６日目に、全ての被験ブタが２．０ｍＬのインゲルバック（ＩＮＧＥＬＶＡＣ、登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶを、筋肉内注射で、右側の首部分に、３．０ｍＬルアーロックシリンジ及び滅菌２０ｇ×１”ニードルを使って、投与された。ＰＲＲＳ ＭＬＶは、ＰＣＶ２チャレンジマテリアルの病原性を増大させる意図で投与された。
被験ブタは、全般的な健康状態と副作用を、実験−３日目及び実験０日目から２１日目まで、毎日観察された。各ブタは、正常又は異常な行動、呼吸又は咳についてスコア化された。観察結果は臨床観察記録に記録された。
全ての被験ブタは、実験０日目から実験７日目まで観察され、そして、グループ７は実験１４日目から２１日目まで、注射部位の反応を、さらに観察された。
平均１日あたり体重増加は、実験−３、２５及び５０日目、又はチャレンジ後にブタが死んでいることが発見された日に、校正された秤の上で、各ブタを体重測定することによって決定された。体重は体重フォームに記録された。実験−３日目の体重が、ブタを無作為に割り振る前に、区分するために利用された。
実験２５日目及び実験５０日目の体重データが、各ブタに対する、これらの時点の間の、平均１日あたり体重増加（ＡＤＷＧ）を決定するために利用された。チャレンジ後、実験５０日目よりも前に死亡したブタについては、ＡＤＷＧが、実験２５日目から死亡の日までのＡＤＷＧを表すように、調整された。
ＰＣＶ２血清学を決定するために、実験−３及び１４日に、目静脈全血が、各子ブタから、眼窩静脈洞から、採集された。各子ブタについて、血液が、眼窩静脈洞から、滅菌したキャピラリーチューブを一方の目の目頭に挿入し、約３．０ｍＬの全血を４．０ｍＬの血清分離チューブ（ＳＳＴ）に吸引することによって、採集された。
実験２５、３２、及び５０日目に、各ブタからの静脈全血が、上大静脈から、滅菌した２０ｇ×１／２”バキュテイナーニードル（ベクトン・ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー）、バキュテイナーニードルホルダー及び１３ｍＬのＳＳＴを使い、採集された。各時点での血液採集が、サンプル採集記録に記録された。
各ＳＳＴ内の血液は、凝固するままにされ、その後、各ＳＳＴがスピンダウンされて血清が集められた。集められた血清は滅菌したスナップチューブに移され、−７０±１０℃で、後日検査されるまで、保存された。血清サンプルは、ＰＣＶ２抗体の存在を、ＢＩＶＩ−Ｒ＆Ｄの職員によって、検査された。
ブタは、１日１回、実験２２日目から実験５０日目まで、臨床症状を観察され、正常又は異常な行動、呼吸又は咳についてスコア化された。臨床的な観察は臨床観察記録に記録された。
ブタＮｏ．４６（グループ１）及び９８（グループ９）が１番目の研究サイトで死亡した。これら２つの死は出血死として分類され、これら２匹のブタについては解剖が行われなかった。
２番目の研究サイトで、チャレンジ後で実験５０日目よりも前に死亡したブタ及び実験５０日目に安楽死させられたブタは、解剖された。あらゆる肉眼的病変が確認され、病変のある肺葉のパーセンテージが解剖報告フォームに記録された。
２番目の研究サイトで解剖されたブタのそれぞれから、扁桃腺、肺、心臓、及び腸間膜リンパ節の組織サンプルが、緩衝１０％ホルマリン入りの１つのコンテナに入れられた；一方、同じ前述の器官からの別の組織サンプルはワールパック（Ｗｈｉｒｌ−ｐａｋ、登録商標）（Ｍテックダイアグノスティクス社、セルウォール、ＵＫ）に入れられ、それぞれのワールパック（Ｗｈｉｒｌ−ｐａｋ、登録商標）は氷上に置かれた。各コンテナは適切にラベルされた。サンプル採取が解剖報告フォームに記録された。
その後、ホルマリン固定組織サンプル及び診断リクエストフォームがＩＨＣ検査に提出された。ＩＨＣ検査は、サンプル受け入れ、サンプルとスライドの調製、及び染色技術について、標準的な研究室の手順に従って行われた。
ワールパック（Ｗｈｉｒｌ−ｐａｋ、登録商標）内の新鮮な組織は、氷パックとともに、保存（−７０℃±１０℃）及び将来的な使用のために、研究モニターに送られた。
ホルマリン固定組織が、病理学者によって、ＰＣＶ２を検出するために、ＩＨＣで検査され、次のスコアリングシステムを使ってスコア化された：０＝なし；１＝わずかに陽性の染色、ほとんど染色部位なし；２＝中程度に陽性の染色、複数の染色部位；及び３＝明らかな陽性染色、組織全体に散らばる。分析のために、スコア０は“陰性”とみなされ、０よりも大きいスコアは“陽性”とみなされた。
結果
この実施例の結果は下記に与えられる。ブタＮｏ．４６及び９８が、実験１４日目及び２５日目に、それぞれ死亡したことが認められる。これらの死亡は、出血死に分類される。
ブタＮｏ．１１（グループ１）は、実験１５日目に、早い呼吸で息を切らしていた。その他の点では、この観察期間中、全てのブタが、行動、呼吸及び咳について正常であり、どのグループに関しても、全身的な副作用は認められなかった。
実験０日目のワクチン接種後に、注射部位の反応は認められなかった。
実験１４日目のワクチン接種後、グループ１のブタ１４匹中７匹（５０％）が、実験１５日目にスコア２の腫れを示した。
グループ１の１４匹中４匹（２８．６％）が、実験１６日目に、なお“２”の腫れを示していた。
他のグループでは、それぞれのワクチン接種後に注射部位の反応は見られなかった。
平均１日あたり体重増加（ＡＤＷＧ）の結果が下の表１８に示される。出血のために死亡したブタＮｏ．４６及び９８が、グループの結果から除かれた。
Figure 0005726395
１用量の１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループ４は、最も高いＡＤＷＧ（１．１６±０．２６ ｌｂ／日）を示し、１．０７±０．２１ ｌｂ／日から１．１１±０．２６ ｌｂ／日の範囲のＡＤＷＧを示すグループ１、２、３、５、６及び１０がそれに続いた。
グループ９が最も低いＡＤＷＧ（０．８８±０．２９ ｌｂ／日）を示し、それぞれ、０．９３±０．３３ ｌｂ／日及び０．９９±０．４４ ｌｂ／日を示すグループ８及び７が、それに続いた。
ＰＣＶ２血清学の結果が、下記の表１９に示される。１０グループ全てが、実験−３日目にはＰＣＶ２に対して血清陰性であった。実験１４日目に、ＰＣＶ２タイターは１０グループ全てについて低いままであった（５０−１１３の範囲）。
実験２５日目に、全粒子不活化ワクチンを投与されたグループ８が、最も高いＰＣＶ２タイター（４６１７）を示し、１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループ２、１用量の１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループ４、及び１６μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループ３が、それぞれ、２５０７、１９２０及び１５０３のタイターを示し、それに続いた。
実験３２日目（チャレンジ後１週間）に、グループ１−６及びグループ８のタイターは２３６０から７６１９の範囲であった；一方、グループ７（０．２５μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール）、９（チャレンジコントロール）、及び１０（厳密な陰性コントロール）は、それぞれ、３８２、１２９及び７８のタイターを示した。
実験５０日目（解剖の日）に、１０グループ全てが高いＰＣＶ２タイター（≧１２５７）を示した。
実験２５、３２、及び５０日目に、２用量の１６μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループ３は、２用量の１６μｇ ｒＯＲＦ２−ＩＭＳ １３１４を投与されたグループ１よりも高い抗体タイターを示した。実験２５、３２及び５０日目に、２用量の１６μｇ ｖＯＲＦ２を投与されたグループ２は、１用量のみの同じワクチンを投与されたグループ４よりも高いタイターを示した。実験２５及び３２日目に、それぞれ１、４、１、及び０．２５μｇの、減量レベルのｒＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループ３、５、６、７は、減量に対応した抗体タイターを示した。
Figure 0005726395
チャレンジ後の臨床的観察からの結果が下に示される。表２０は異常行動、異常呼吸、咳及び下痢の観察を含む。表２２はグループごとのチャレンジ後死亡率のまとめからの結果を含む。チャレンジ後の異常な行動、呼吸及び咳の発生率は、１６μｇ ｒＯＲＦ２−ＩＭＳ １３１４（グループ１）、１６μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール（グループ３）、１μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール（グループ６）、０．２５μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール（グループ７）を投与されたブタ、及びチャレンジコントロールグループ（グループ９）のブタでは低かった。
チャレンジ後の異常な行動、呼吸及び咳の発生率は、１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポール（グループ２）、１用量の１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポール（グループ４）、４μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール（グループ５）、＞８ ｌｏｇ ＫＶ−カーボポール（グループ８）を投与されたブタ、及び厳密な陰性コントロールグループ（グループ１０）のブタでは、０であった。
臨床症状の全体的な発生率はグループ間で異なった。１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポール（グループ２）、１用量の１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポール（グループ４）を投与されたブタ、及び厳密な陰性コントロールグループ（グループ１０）のブタは、発生率０％を示した；１６μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール（グループ３）及び１μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール（グループ６）を投与されたブタは発生率６．７％を示した；１６μｇ ｒＯＲＦ２−ＩＭＳ １３１４を投与されたブタ（グループ１）は７．１％の全体的な発生率を示した；４μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール（グループ５）、０．２５μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール（グループ７）、及び＞８ｌｏｇ ＫＶワクチンを投与されたブタは、１３．３の発生率を示した；及び、チャレンジコントロールグループ（グループ９）のブタは、１４．３％の発生率を示した。
グループ間の全般的な死亡率は同様に異なった。２用量のＫＶワクチンを投与されたグループ８が２０．０％の最も高い死亡率を示し、チャレンジコントロールのグループ９及び０．２５μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループ７がそれに続き、それぞれ、１４．３％及び１３．３％の死亡率を示した。１用量の１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループ４は、６．７％の死亡率を示した。他のグループ、１、２、３、５、６、及び１０は０％の死亡率を示した。
Figure 0005726395
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Figure 0005726395
グループ間の平均パーセント肺病変及び暫定的診断結果のまとめが下の表２３にしめされる。チャレンジコントロールグループであるグループ９は、最も高いパーセント肺病変を平均値１０．８１±２３．２７％で示し、０．２５μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポールを投与され、平均値６．５７±２４．７４％を示すグループ７、４μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポールを投与され、平均値２．８８±８．８８を示すグループ５、及びＫＶワクチンを投与され、平均値２．０１±４．９８を示すグループ８がそれに続いた。残りの６グループは、０．１１±０．３８％から０．９０±０．１５％の範囲のより低い平均パーセント肺病変を示した。
肺炎の暫定的な診断は、グループ間で異なった。２用量の１６μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループ３は、最も低い肺炎の暫定診断を、１３．３％でされた。チャレンジコントロールグループであるグループ９は、グループの５０％が暫定的に肺炎と診断され、厳密な陰性コントロールグループであるグループ１０及び２用量の１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループ２が、それぞれ４６，７％又は４０％で、暫定的に肺炎と診断され、それに続いた。
グループ１、２、３、５、９及び１０はグループのうち０％がＰＣＶ２に感染したと暫定的に診断された；一方、グループ８は、２用量のＫＶワクチンを投与されたが、グループのうち最も高い率、２０％で、ＰＣＶ２に感染したと暫定的に診断された。
２用量の０．２５μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループ７は及び１用量の１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループ４は、それぞれ、１３．３％及び６．７％で、ＰＣＶ２感染を暫定的に診断された。
胃潰瘍は、グループ７の１匹のブタで診断されたのみであった（６．７％）；一方、他の９つのグループは胃潰瘍が見られないままであった。
Figure 0005726395
グループＩＨＣ陽性発生率の結果のまとめが、下の表２４に示される。グループ１（１６μｇ ｒＯＲＦ２−ＩＭＳ １３１４）が、０％のブタが陽性という最も低いＩＨＣ陽性グループ率の結果を示し、それにグループ２（１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポール）及びグループ４（１６μｇ ｖＯＲＦ２−カーボポールの単一用量）が、それぞれ６．７％と１３．３％のグループＩＨＣ率で続いた。
チャレンジコントロールグループであるグループ９は、１００％のブタがＰＣＶ２に対して陽性である最も高いＩＨＣ陽性発生率を示し、厳密な陰性コントロールグループであるグループ１０、及びグループ８（ＫＶワクチン）が、それぞれ、９３．３％、８０％のブタがＰＣＶ２に対して陽性で、それに続いた。
Figure 0005726395
考察
７種類のＰＣＶ２ワクチンがこの実施例で評価されたが、それには、２回投与される高用量（１６μｇ）のＩＭＳ １３１４でアジュバントされたｒＯＲＦ２抗原、ブタの１つのグループには１回、もう一つのグループには２回投与される高用量（１６μｇ）のカーボポールでアジュバントされたｖＯＲＦ２抗原、２回投与されるカーボポールでアジュバントされた４μｇ用量のｒＯＲＦ２抗原、２回投与されるカーボポールでアジュバントされた１μｇ用量のｒＯＲＦ２抗原、２回投与される低用量（０．２５μｇ）のカーボポールでアジュバントされたｒＯＲＦ２抗原、及び高用量（＞８ｌｏｇ）のカーボポールでアジュバントされた不活化全粒子ＰＣＶ２ワクチン、を含んだ。
全般に、１６μｇのｒＯＲＦ２−ＩＭＳ １３１４を２用量投与されたグループ１は、カーボポールでアジュバントされた様々なレベルのｖＯＲＦ２又はｒＯＲＦ２抗原を投与されたグループ２から７よりもややよい効果を、そして、不活化全粒子ＰＣＶ２ワクチンを２用量投与されたグループ８よりもはるかによい効果を示した。
グループ１は３番目に高いＡＤＷＧ（１．８０±０．３０ ｌｂ／日）、最も低い異常行動発生率（０％）、最も低い異常呼吸発生率（０％）、低い咳発生率（７．１％）、低い全臨床症状発生率（７．１％）を示し、最も低い死亡率（０％）、２番目に低い平均％肺病変率（０．１５±０．３４％）、２番目に低い肺炎率（２１．４％）及び最も低いＩＨＣ陽性組織の発生率（０％）で、３つの他のグループに結び付けられた。
しかしながら、グループ１は、注射部位の反応が確認された唯一のグループであり、それは、ワクチン接種を受けたブタの５０％を２回目のワクチン接種の１日後に含んだ。グループ２から７に投与された他のワクチンは、不活化ワクチンよりもよい効果及びグループ１に投与されたワクチンとほぼ同等の効果を示した。
グループ８は、カーボポールでアジュバントされた不活化ＰＣＶ２ワクチンの２用量を投与されたが、どのワクチングループに対しても最も悪い組合せを示した。グループ８は最も低いＡＤＷＧ（０．９３±０．３３ ｌｂ／日）、２番目に高い異常行動率（６．７％）、最も高い異常呼吸率（６．７％）を示し、最も高い臨床症状の全体低出現率（１３．３％）で他の３つのグループに結び付けられ、全グループ中で最も高い死亡率（２０％）を示し、そして、全ワクチングループ中で最も高いＩＨＣ陽性率（８０％）を呈した。
不活化全粒子ＰＣＶ２ワクチンがグループ８に投与される前に十分に不活化されていなかったかもしれないという懸念があったが、それによってこのグループの悪い結果が説明されるかもしれない。残念ながらこの懸念を確定するための明確なデータが利用できなかった。全般的に、この実施例の場合では、コンベンショナルな不活化ＰＣＶ２ワクチンはＰＣＶ２に関係する病気を低減することの助けとはならなかった。
先に言及されたように、副作用は、ＩＭＳ １３１４でアジュバントされたワクチンを除き、テストワクチンと全く関係しなかった。注射部位の反応が、ＩＭＳ １３１４で組成されたワクチンによる２回目のワクチン接種から１日後に５０．０％のブタで、そして２回目のワクチン接種から２日後に３８．６％のブタで確認された。カーボポールでアジュバントされたワクチンを投与されたブタでは全く反応が確認されなかった。ＩＭＳ １３１４でアジュバントされたワクチンをワクチン接種されたブタを含むいかなる研究も、ブタの注射部位の反応を念入りにモニターし続けるべきである。
全てのブタは実験−３日目にＰＣＶ２に対して血清陰性であり、グループ２だけが実験１４日目に１００を超えるタイターを示した。実験２５日目（チャレンジの日）に、グループ８は最も高いＰＣＶ２抗体タイター（４６１９）を示し、グループ２がそれに続いた（２５０９）。グループ７、９及び１０を例外として、全てのグループが強い抗体反応を実験３２日目までに呈した。実験５０日目までに、グループ７，９及び１０を含む全てのグループが強い抗体反応を呈した。
ＰＣＶ２感染とそれに続くＰＭＷＳの進行の特徴のひとつは、離乳後ブタにおける成長障害であり、重症の事例では、体重減少が確認される。各グループの平均１日あたり体重増加は、成長障害又は体重減少を示す定量的方法である。この実施例では、グループ間でＡＤＷＧに大きな違いが無かった。グループ８が、０．８８±０．２９ ｌｂ／日の最も低いＡＤＷＧを示し、その一方、グループ４は１．１６±０．２６ ｌｂ／日の最も高いＡＤＷＧを示した。この研究の状況の中では、グループ間に将来のワクチンの効力をＡＤＷＧに基づかせるだけの十分な違いが無かった。
体重削痩に加え−呼吸困難、下肢萎縮、皮膚蒼白及び時折、黄疸がＰＭＷＳに関係する臨床症状である。この実施例では、異常な行動及び異常な呼吸及び咳が低頻度で各グループに確認された。この研究で証明されたように、このチャレンジモデル及びチャレンジ株は手に負えない臨床症状を引き起こさず、これはワクチンの効能が基づく強いパラメタではない。
全般的に、死亡率はこの実施例では高くなく、チャレンジコントロールグループで高い死亡率が見られないことによって、ワクチンの有効性が基づくこのパラメタが制限される。実験４６日目以前に、グループ４及び７はそれぞれ１５匹中１匹のブタが死亡した。グループ９は１４匹のブタ中２匹が死亡し、グループ８では１５匹のブタ中３匹のブタが死亡した。
チャレンジコントロールグループであるグループ９は、ＰＣＶ２の臨床症状を示しておらず、わずか２匹の死亡がこのグループ中では第４６日目までに起きた。豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）ＭＬＶワクチンが全ての豚に実験４６日目に投与された。以前の研究は、インゲルバック（ＩＮＧＥＬＶＡＣ、登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶを、ＰＣＶ２に係わるＰＭＷＳ病状を悪化させる免疫刺激剤として利用され、これらの以前の研究では死亡率がより高かった。２匹の死亡は、実験４６日目のＰＲＲＳワクチン投与のすぐ後に起こった―グループ４は実験４６日目に１匹が死亡し、グループ７は実験４７日目に１匹が死亡した―これらはおそらく、実験５０日目までのＰＲＲＳワクチンの投与には関係しないだろう。
実験５０日目までに、２用量の不活化ワクチンを投与されたグループ８は、最も高い死亡率（２０％）を示し、グループ９（チャレンジコントロール）とグループ７（０．２５μｇ ｒＯＲＦ２−カーボポール）が、それぞれ、死亡率１４．３％と１３．３％でそれに続いた。全般に、ＰＲＲＳワクチンをチャレンジモデルにこの実施例のチャレンジ後観察フェイズの遅い時期に投与することによって、死亡率が有意に上昇することは無かった。
ＰＣＶ２感染に続いてＰＭＷＳを発症したブタにおける肉眼的病変は、典型的には、全身的なリンパ節症と次のものの１または２以上の組合せからなる：（１）小葉間浮腫による間質性肺炎、（２）皮膚の蒼白又は黄疸、（３）まだらの萎縮肝臓、（４）胃潰瘍、及び（５）腎炎。解剖時（実験５０日目）には、黄疸、肝炎、及び腎炎が、どのグループにも認められなかった。胃潰瘍はグループ７の１匹のブタについて確認されたが、リンパ節症は詳細に検査されなかった。ＰＣＶ２感染と密接に関連する病変の存在に基づき、３つのグループが、少なくとも１匹のブタがＰＣＶ２（ＰＭＷＳ）と暫定的に診断された。
グループ８は、不活化ワクチンの２用量を投与されたが、２０％が暫定的にＰＣＶ２と診断され、一方、グループ７及びグループ４は、それぞれ、１３．３％及び６．７％が、暫定的にＰＣＶ２と診断された。平均％肺病変スコアは、解剖時に、グループ間で一致しなかった。
グループ１、２、３、４、６及び１０は、０．１１±０．３８％から０．９０±０．１５％にわたる低い％肺病変スコアを示した。期待通り、グループ９は、チャレンジコントロールグループであり、最も高い平均％肺病変スコア（１０．８１±２３．２７％）を示した。
４つのグループにおいて、平均％肺病変スコアが、非常に高い肺病変スコアを示す、１から３匹のブタのために、これらのグループのそれぞれにおいて、上昇した。肺の病変は赤／紫で固まっていた。典型的には、ＰＭＷＳに関係する肺病変は、タン、小葉間の浮腫で固まっていないとして記載される。この研究で確認される肺病変は、ＰＣＶ２感染に関係しないか、あるいは、２次的な肺感染病原体が存在していたかもしれない。
この研究の状況の中で、％肺病変スコアはおそらく、ＰＣＶ２に起因する肺感染の量の正しい尺度を反映していない。さらに加えて、肺炎という暫定的な診断が、同じように濫用されたかもしれない。肺病変をもつブタは、何匹かは０．１０％と小さいが、肺炎の暫定的診断でリストされた。この実施例では、肉眼的病変と％肺病変に関して、ワクチンの効力が根拠とする十分な違いがグループ間になかった。
ＩＨＣの結果は、グループ間の最も大きな違いを示した。グループ１（１６μｇ ｒＯＲＦ２−ＩＭＳ １３１４）は、ＰＣＶ２抗原に対して、最も低い陽性ＩＨＣの結果を示した（０％）；一方、グループ９及び１０は、それぞれ１００％及び９３．３％の発生率をもち、最も高い陽性ＩＨＣの結果を示した。グループ３、５、６及び７は、それぞれ１６、４、１又は０．２５μｇの、カーボポールでアジュバントされた、ｒＯＲＦ２抗原を投与されたが、それぞれ２０％、２０％、４０％及び４６．７％のＩＨＣ陽性率を示した。
グループ２は、カーボポールでアジュバントされた１６μｇのｖＯＲＦ２の２用量を投与されたが、６．７％のＩＨＣ陽性率を示し、その一方で、わずか１用量の同じワクチンを投与されたグループ４は、１３．３％のＩＨＣ陽性率を示した。この検査の目的の本質及びＩＨＣの結果が期待される結果と相関していたという事実のため、ＩＨＣ検査はおそらく最もよい、ワクチンの有効性が根拠とするパラメタの１つである。
そして、本発明の一態様では、ＣＤＣＤブタモデルにおける、ＰＣＶ２のチャレンジに対する、カーボポールでアジュバントされたＰＣＶ２ ｒＯＲＦ２の最小保護用量（ＭＰＤ）が決定される。グループ３、５，６および７はそれぞれ２用量のカーボポールでアジュバントしたｒＯＲＦ２抗原を投与されたが、各グループでｒＯＲＦ２抗原のレベルは異なっていた。グループ３、５，６及び７は、それぞれ、１６、４、１又は１μｇのｒＯＲＦ２抗原を投与された。
一般に、ｒＯＲＦ２抗原のレベルが減少することによってＰＣＶ２抗原タイターが減少し、死亡率、平均％肺病変及びＩＨＣ陽性組織の出現率が上昇した。異なるレベルのｒＯＲＦ２−カーボポールを投与されたグループのうち、それぞれ、１６又は４μｇのｒＯＲＦ２抗原の２用量を投与されたグループ３及び５は、各々わずか２０％のＩＨＣ陽性率を示し、そして各々類似の抗原タイターを示した。
全般に、ＩＨＣ陽性の結果に基づけば、２回投与されるｒＯＲＦ２抗原の最小保護用量は約４μｇである。
本発明の別の態様では、組換え（ｒＯＲＦ２）及びＶＩＤＯ Ｒ−１（ｖＯＲＦ２）ＰＣＶ２抗原の抗原性が評価された。グループ２は１６μｇのｖＯＲＦ２の２用量を投与され、グループ３は１６μｇのｒＯＲＦ２の２用量を投与された。両方のワクチンはカーボポールでアジュバントされていた。両方のワクチンは安全であることが見出され、両者は０％の死亡率を有していた。
グループ２は２５０７のＰＣＶ２抗原タイターを実験２５日目に示したが、一方、グループ３は１５０３のＰＣＶ２抗原タイターを示した。グループ３はグループ２よりも低い平均％の肺病変スコアを示した（０．１１±０．３８％対０．９０±０．１５％）が、グループ２はグループ３よりも低いＩＨＣ陽性発生率を示した（６．７％対２０％）。
全般に、両ワクチンは類似の抗原性を有していたが、ｖＯＲＦ２はややよいＩＨＣの結果に結びついた。
本発明のさらに別の態様では、２種類の異なるアジュバント（カーボポールとＩＭＳ １３１４）の適合性が決定された。グループ１及び３は、ともに１６μｇのｒORF２抗原を含む２用量のワクチンを投与されたが、グループ１はＩＭＳ １３１４でアジュバントされた抗原を投与された一方で、グループ３はカーボポールでアジュバントされた抗原を投与された。
両グループは本質的に同じＡＤＷＧ、本質的に同じチャレンジ後の臨床的徴候の発生率、同じ死亡率、及び本質的に同じ肺病変の平均％を有していた；しかし、グループ１はＩＨＣ陽性率０％である一方で、グループ３はＩＨＣ陽性率２０％であった。しかしながら、カーボポールでアジュバントされたワクチンを投与されたグループ３は、ＩＭＳ １３１４でアジュバントされたグループ１よりも高いＩＦＡＴ ＰＣＶ２タイターを実験２５、３２及び５０日目に示した。
全般に、ＩＭＳ １３１４でアジュバントされたＰＣＶ２ワクチンはよりよいＩＨＣの結果を提供するものの、ＰＣＶ２の感染から圧倒的によい保護を与えず、注射部位の反応を誘導する。カーボポールでアジュバントされたＰＣＶ２ワクチンはＩＭＳ １３１４でアジュバントされたワクチンとほぼ同様の性能を発揮するが、いかなる副作用にも結びつかなかった。
本発明のさらに別の態様では、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２の１ｍｌ‐１用量製品としての実現可能性が確定された。グループ２及び４は両方ともに１６μｇのカーボポールでアジュバントされたｖＯＲＦ２ワクチンを研究０日目に受けたが、グループ２は実験１４日目に２回目接種を受けた。グループ４はグループ２よりもやや高いＡＤＷＧ及び低い肺病変の平均％を示したが、グループ２は実験２５、３２及び５０日目に、より高いＩＦＡＴ ＰＣＶ２タイター及びより低いＩＨＣ陽性組織の発生率を呈した。この２つのグループに対する他のすべての結果が類似していた。全般に、１用量のカーボポールでアジュバントされたｖＯＲＦ２は、同じワクチンの２用量と同じように作用した。
〔本発明の実施の態様として、以下を追加して記載する。〕
（４７）ＰＣＶ２感染に関係する臨床症状の重篤さを軽減するための免疫原性組成物であって、該組成物は、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含み、かつ、１回投与されるものである。
（４８）前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質が次のいずれかである、（４７）に記載の免疫原性組成物：
ｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１の配列を含むポリペプチド；または、配列相同性において配列番号５から最大６〜１０％変化しているいずれかの蛋白質、
ｉｉ） 配列番号３又は配列番号４の配列を含むＤＮＡによってコードされるポリペプチド。
（４９）前記ＯＲＦ２タンパク質が、配列番号５のポリペプチドである（４７）または（４８）に記載の免疫原性組成物。
（５０）前記組成物が不活化ウイルスベクター及び細胞培養上清をさらに含む、（４７）〜（４９）のいずれかに記載の免疫原性組成物。
（５１）前記不活化ウイルスベクターがＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスである、（５０）に記載の免疫原性組成物。
（５２）前記組成物がＢＥＩを含む（５０）または（５１）に記載の免疫原性組成物。
（５３）前記組成物がチオ硫酸ナトリウムを含む（５２）に記載の免疫原性組成物。
（５４）前記組成物が、担体、アジュバント、培地、ウイルス不活化剤、希釈剤、浸透圧調節剤、免疫改変剤、抗生物質、及びこれらの組合せから選ばれる追加成分を含む（４８）〜（５３）のいずれかに記載の免疫原性組成物。
（５５）前記組成物が、アジュバント、好ましくはカーボポールを含む、（５４）に記載の免疫原性組成物。
（５６）上記（５５）に記載の組成物であって、該組成物が薬学的に許容できる塩、好ましくは食塩を含む免疫原性組成物。
（５７）前記組成物が少なくとも０．２ｍｃｇ／ｍｌのＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含む、（４７）〜（５６）のいずれかに記載の免疫原性組成物。
（５８）前記組成物が少なくとも２μｇのＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含む、（４５）〜（５６）のいずれかに記載の免疫原性組成物。
（５９）上記（４７）〜（５７）のいずれかに記載の免疫原性組成物の少なくとも１用量を含む容器であって、１用量が少なくとも２μｇのＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含む容器。
（６０）上記（４７）〜（５７）のいずれかに記載の免疫原性組成物の１０から２５０用量を含む容器であって、１用量が少なくとも２μｇのＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含む容器。
（６１）上記（５９）または（６０）に記載の容器であって、該容器が抗微生物活性薬剤をさらに含む容器。
（６２）上記（５９）〜（６１）のいずれかに記載の容器および、ＰＣＶ２感染に関係する臨床症状の重篤さを軽減するために、少なくとも１用量の免疫原性組成物をブタに筋肉内投与するための情報を含む取扱い説明書を含むキット。
（６３）前記取扱い説明書が、少なくとも１用量の免疫原性組成物の２回目又は３回目以上の投与に関する、２回目の投与又は３回目以降のどの投与も、前回の投与から少なくとも１４日以降であるという情報を含む、（６２）に記載のキット。
ＰＣＶ２ ＯＲＦ２組変えバキュロウイルスの好ましい構成の概念的フロー図である。 本発明に従った組成物の製造方法の概念的フロー図である。 本発明に従った組成物の製造方法の概念的フロー図である。

Claims (44)

  1. 下記のステップを含む、ＰＣＶ２のオープンリーディングフレーム２によって発現される組換えタンパク質を回収する方法。
    Ａ） ＰＣＶ２由来の該組換えオープンリーディングフレーム２をトランスファーベクターにクローニングする；
    Ｂ） 該トランスファーベクターの該組換えオープンリーディングフレーム２を含む部分をバキュロウイルスにトランスフェクトする；
    Ｃ） 昆虫細胞を培地中で該ウイルスに感染させる；
    Ｄ） 該ウイルスに該オープンリーディングフレーム２に由来するタンパク質の発現を引き起こす；
    Ｅ） 該昆虫細胞を上清から分離する；及び
    Ｆ） 該上清中に発現される該オープンリーディングフレーム２タンパク質を、該ウイルスで細胞を感染してから、少なくとも５日後以降に、該上清中で回収する。
  2. 請求項１に記載の方法であって、前記方法が、ＰＣＶ２の株に由来する前記オープンリーディングフレーム２を前記トランスファーベクターにクローニングする前に、該オープンリーディングフレーム２を増幅するステップをさらに含む方法。
  3. 請求項１または２に記載の方法であって、前記組換えオープンリーディングフレーム２が、５’コザック配列、３’ＥｃｏＲＩ認識部位、及びそれらの組合せ、からなる群から選ばれる配列をさらに含む方法。
  4. 前記５’コザック配列が配列番号１を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記３’ＥｃｏＲＩ認識部位が配列番号２を含む、請求項３に記載の方法。
  6. 前記ＰＣＶ２オープンリーディングフレームが配列番号４を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記組換えタンパク質が配列番号６を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  8. 前記培地が無血清昆虫細胞培地を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  9. 請求項１〜８のいずれかに記載の方法であって、次のステップをさらに含む方法：
    ｉ） ステップＡの前に、該増幅されたオープンリーディングフレーム２を第１のベクターにクローニングする；
    ｉｉ） 該オープンリーディングフレーム２を該第１のベクターから切り出す；
    ｉｉｉ） 該切り出されたオープンリーディングフレーム２を、ステップＡで使用する。
  10. 前記細胞がＳＦ＋細胞を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記トランスフェクトされる部分が配列番号４を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記発現された組換えオープンリーディングフレーム２タンパク質が、該周囲の成長媒体中に前記昆虫細胞によって分泌され、そして該オープンリーディングフレーム２タンパク質は、該細胞の内部からよりむしろ、該上清中で回収される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. ＰＣＶ２に対する免疫応答を引き起こすための組成物を調製する方法であって、該方法が次のステップを含む方法：
    ｉ） ＰＣＶ２のオープンリーディングフレーム２に由来する組換えＤＮＡを含むコンストラクトを、バキュロウイルスにトランスフェクトする；
    ｉｉ） 該トランスフェクトされたウイルスで、培地中の昆虫細胞を感染する；
    ｉｉｉ） 該ウイルスに、該オープンリーディングフレーム２に由来する組換えタンパク質を発現させる；
    ｉｖ） 該発現されたオープンリーディングフレーム２タンパク質を、該ウイルスで該細胞を感染してから少なくとも５日後から上清中で回収する；及び
    ｖ） 該回収されたタンパク質を、適切なアジュバント又は薬学的に許容できる担体又は賦形剤と組み合わせる。
  14. 請求項１３に記載の方法であって、該方法が、トランスファーベクターから該コンストラクトを得るステップをさらに含む方法。
  15. 請求項１３または１４に記載の方法であって、該方法が、ＰＣＶ２の株に由来する該オープンリーディングフレーム２を該トランスファーベクターにクローニングする前に、該オープンリーディングフレーム２を増幅するステップをさらに含む方法。
  16. 請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法であって、前記組換えオープンリーディングフレーム２が、５’コザック配列、３’ＥｃｏＲＩ認識部位、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる配列を含む方法。
  17. 前記５’コザック配列が配列番号１を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記３’ＥｃｏＲＩ認識部位が配列番号２を含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記ＰＣＶ２オープンリーディングフレーム２が配列番号４を含む、請求項１３〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. 前記組換えタンパク質が配列番号６を含む、請求項１３〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. 前記培地が無血清昆虫細胞培地を含む、請求項１３〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. 請求項１５〜２１のいずれかに記載の方法であって、次のステップをさらに含む方法；
    ｉ） 該増幅されたオープンリーディングフレーム２を第１のベクターにクローニングする；
    ｉｉ） 該オープンリーディングフレーム２を該第１のベクターから切り出す；；及び
    ｉｉｉ） 該切り出されたオープンリーディングフレーム２を該運搬ベクターにクローニングするために利用する。
  23. 前記昆虫細胞がＳＦ＋細胞を含む、請求項１３〜２２のいずれかに記載の方法。
  24. 前記トランスフェクトされたコンストラクトが配列番号４を含む、請求項１３〜２３のいずれかに記載の方法。
  25. 請求項１３〜２４のいずれかに記載の方法であって、該回収ステップが、該培地を該細胞と細胞片から分ける分離ステップをさらに含む方法。
  26. 前記分離ステップが、該細胞、細胞片、及び培地を、０．４５μｍから１．０μｍの範囲のサイズのポアをもつフィルターを通してろ過するステップを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 請求項１３〜２６のいずれかに記載の方法であって、該方法が、該組換えタンパク質を適切なアジュバントと混合する前に、前記バキュロウイルスを不活化するステップをさらに含む方法。
  28. 前記発現された組換えオープンリーディングフレーム２タンパク質が、該周囲の成長培地中に細胞によって分泌され、そして該オープンリーディングフレーム２タンパク質は、細胞の内部からよりむしろ、該上清中で回収される請求項１３〜２６のいずれかに記載の方法。
  29. ＰＣＶ２に由来するオープンリーディングフレーム２によって発現される組換えタンパク質を回収する方法であって、次のステップを含む方法：
    ｉ） 培地中の昆虫細胞を、該オープンリーディングフレーム２を含む組換えバキュロウイルスベクターで感染する；
    ｉｉ） 該ベクターに該タンパク質を少なくとも５日間発現させる；及び
    ｉｉｉ） 該発現された上清中のタンパク質を回収する。
  30. 前記回収が、前記バキュロウイルスベクターで細胞を感染してから少なくとも５日後から行われる、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記発現された組換えオープンリーディングフレーム２タンパク質が、該周囲の成長培地中に昆虫細胞によって分泌され、そして該オープンリーディングフレーム２タンパク質は、細胞の内部からよりむしろ、該上清中で回収される請求項２９または３０に記載の方法。
  32. 下記のステップを含む、ＰＣＶ２のオープンリーディングフレーム２によって発現する組換えタンパク質を回収する方法：
    Ａ） 該ＰＣＶ２由来組換えオープンリーディングフレーム２を運搬ベクターにクローニングする；
    Ｂ） 該組換えオープンリーディングフレーム２を含む該運搬ベクターの部分をバキュロウイルスにトランスフェクトする；
    Ｃ） 培地中の昆虫細胞を該ウイルスで感染する；
    Ｄ） 該ウイルスに該オープンリーディングフレーム２からのタンパク質を少なくとも５日間発現させる；
    Ｅ） 該昆虫細胞を該上清から分離する；及び
    Ｆ） 該発現されたオープンリーディングフレーム２タンパク質を該上清中で回収する。
  33. 前記ステップＤ）で、発現された組換えオープンリーディングフレーム２タンパク質が、昆虫細胞により、周囲の成長培地中に分泌される請求項３２に記載の方法。
  34. ＰＣＶ２に対する免疫応答を引き起こすための組成物を調製する方法であって、次のステップを含む方法：
    ｉ） ＰＣＶ２のオープンリーディングフレーム２由来の組換えＤＮＡを含むコンストラクトをバキュロウイルスにトランスフェクトする；
    ｉｉ） 培地中にある昆虫細胞を該トランスフェクトされたバキュロウイルスで感染する
    ｉｉｉ） 該ウイルスに該オープンリーディングフレーム２由来の組換えタンパク質を少なくとも５日間発現させる；
    ｉｖ） 該発現された上清中のオープンリーディングフレーム２タンパク質を回収する；及び
    ｖ） 該回収されたタンパク質を適切なアジュバント又は他の薬学的に許容できる担体又は賦形剤と混合する。
  35. 前記ステップｉｉｉ）で、発現された組換えオープンリーディングフレーム２タンパク質が、昆虫細胞により、周囲の成長培地中に分泌される、および前記ステップｉｖ）で、該発現されたオープンリーディングフレーム２タンパク質は昆虫細胞培養液の上清中で回収される請求項３４に記載の方法。
  36. ＰＣＶ２に由来するオープンリーディングフレーム２により発現された蛋白質を回収する方法で、次のステップを含む方法：
    ｉ） 成長培地中の昆虫細胞を、該オープンリーディングフレーム２を含む組換えバキュロウイルスベクターで感染する；
    ｉｉ） 該ベクターに、少なくとも５日間発現させるようにし、ここで該組換えオープンリーディングフレーム２蛋白質は、周囲の成長培地中に昆虫細胞によって分泌される、および
    ｉｉｉ） 該細胞培養液の上清中に発現された該蛋白質を回収する。
  37. 請求項１〜３６のいずれかに記載の方法によって得られる組成物。
  38. 請求項３７に記載の組成物の医薬品としての使用。
  39. 請求項３７に記載の組成物の、ＰＣＶ２感染を防ぐための医薬品を調製するための使用、またはＰＣＶ２感染に伴う臨床症状の重篤性を軽減するための医薬品を調製するための使用。
  40. 次のステップを含む、ＰＣＶ２感染を診断するためのキットを製造する方法：
    ｉ） 請求項１〜３１、および３２〜３６のいずれかに記載されるように組換えタンパク質を製造する；及び
    ｉｉ） 該組換えタンパク質を適切な容器にパッケージングする。
  41. 請求項４０に記載の方法であって、組換えタンパク質をパッケージングする入れ物に、取扱い説明書を同梱するステップをさらに含む方法。
  42. 請求項３７に記載の組成物の少なくとも１用量を有する少なくとも１つの容器を含むキットであって、前記組成物は、免疫を生じるものであり、かつ２μｇ以上のＰＣＶ２オープンリーディングフレーム２タンパク質を含むキット。
  43. ｉ）請求項３２に記載の組成物の少なくとも１用量を有する容器、および
    ii）ＰＲＲＳ抗原を含む免疫原性組成物を有する容器、を備えるキット。
  44. 前記ＰＲＲＳ抗原が、ＩｎｇｅｌＶａｃ（登録商標） ＰＲＲＳ ＭＬＶである請求項４３に記載のキット。
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