JP2015091264A - Pcv2免疫原性組成物および組成物を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】この方法は概して、オープンリーディングフレーム2をコードする配列を含む組換えウイルスを、培地に含まれる細胞に、トランスフェクトし、ウイルスにオープンリーディングフレーム2を発現させ、発現されるタンパク質を上清中で回収するステップを含む。この回収は、十分量の組換えタンパク質を発現させ、細胞から培地中に分泌させるために、細胞に感染してから約5日後から開始するべきである。そのような方法によって、組換えタンパク質を細胞内から分離して回収するために必要な、費用と時間がかかる回収手順を避けることができる。
【選択図】図1
Description
本出願は2004年12月30日出願の仮出願番号60/640,510及び2005年1月31日に出願の出願番号11/034,737の優先権を主張し、それらの教示と内容はここに参照により取り込まれる。
この出願は紙面及びコンピューターで読めるフォーマットの配列表を含み、その教示と内容はここに参照により取り込まれる。
発明の分野
本発明の一態様は、ブタサーコウイルス2型(PCV2)のオープンリーディングフレーム2(ORF2)によって発現されるタンパク質の回収に関する。
ブタサーコウイルス2型(PCV2)は小さな(直径17〜22μm)、正二十面体(イコサヘドラル)の、エンベロープがないDNAウイルスであり、一本鎖の環状ゲノムをもつ。PCV2は、ブタサーコウイルス1型とおよそ80%の配列同一性をもつ。
本発明は先行技術に内在する課題を克服し、技術水準に明確な進歩を提供する。詳細に述べると、本発明の一態様は組換えPCV2 ORF2タンパク質を生産及び/又は回収するための改良された方法を、i)ORF2タンパク質が組換えウイルスベクターによって発現される、培養中の感受性細胞にPCV2 ORF2 DNAをコードする配列を含む組換えウイルスベクターを感染させること、及びii)その後、ORF2を上清中で回収すること、によって提供する。
i) 配列番号5、配列番号6、配列番号9、配列番号10又は配列番号11の配列を含んでなるポリペプチド
ii) i)のポリペプチドに対して少なくとも80%の相同性をもつ任意のポリペプチド
iii) i)及び・又はii)のポリペプチドの任意の免疫原性部分
iv) iii)の免疫原性部分で、配列番号5、配列番号6、配列番号9、配列番号10又は配列番号11の配列に含まれる少なくとも10個の連続するアミノ酸を含んでなるもの
v) 配列番号3又は配列番号4の配列を含んでなるDNAによってコードされるポリペプチド
vi) v)のポリヌクレオチドに対して少なくとも80%の相同性を有するポリヌクレオチドによってコードされる任意のポリペプチド
vii) v)及び・又はvi)のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの任意の免疫原性部分
viii) vii)の免疫原性部分であって、前記免疫原性部分をコードするポリヌクレオチドが、配列番号3又は配列番号4の配列に含まれる、少なくとも30個の連続するヌクレオチドを含むもの
これから述べられる実施例によって、本発明に従った好ましい材料と手順が示される。しかしながら、これらの実施例は例示のためだけに提供されるものであり、それによって本発明の範囲を制限するものではないと理解されるべきである。
この実施例は、本発明の方法を用いたORF2の相対的な収率を公知方法を用いた場合と比較する。4本の1000mLスピナーフラスコそれぞれに、1.0×106個/mlのSf+細胞を含む300mLの昆虫無血清培地、エクセル420(JRHバイオサイエンス,レネクサ,KS)が入れられた。マスター細胞培養はSF+(Spodoptera frugiperda)マスター細胞ストック、19継代、ロット# N112−095Wとして識別される。SF+マスター細胞ストックを作るために使用された細胞は、プロテイン・サイエンス・コーポレーション、メリデン、CTから購入された。
この実施例はここで主張される発明の有効性に関するデータを提供する。1000mlのスピナーフラスコにおよそ1.0×106細胞/mlのSf+細胞を含む300mlのエクセル420培地が入れられた。フラスコはそれから27℃でインキュベートされ、100rpmで振盪された。
この実施例は本発明が組換えPCV2 ORF2の小規模生産から、組換えPCV2 ORF2の大規模製造までスケーラブルであることを示す。7000mLのエクセル420培地中の5.0×105細胞/mlのSF+細胞/mlが、20000mLのアプリコンバイオリアクターに移植された。培地と細胞はそれから27℃でインキュベートされ、100rpmで続く68時間の間撹拌された。
このこの実施例は7つのPCV2ワクチン候補の効果をテストし、さらにPCV2の病原性株への暴露に続く有効性パラメタを定める。
これは、実験0日目に9から14日齢であった、CDCDブタにおいて行われた、一部盲検化されたワクチン接種−チャレンジのフィージビリティ・スタディであった。研究に含まれるため、種雄豚のPCV2 IFAタイター≦1:1000であった。さらに、種雄豚の血清学的状態は既知のPRRS陰性の群れに由来した。
この実施例にの結果が下記に与えられる。グループ9からの1匹のブタが実験0日目以前に、さらに5匹(グループ4から1匹;グループ6から1匹;グループ8から2匹;及びグループ9から1匹)のブタがワクチン接種後に死亡したことが注記される。死後の検査により、6匹はすべてワクチン接種又はPMWSに関係しない潜在的感染によって死亡したことが示された。
7種類のPCV2ワクチンがこの研究で評価されたが、それは、実験0日目に1回投与される3種類の異なる用量レベルのvORF2抗原、実験0日目に1回投与される3種類の異なる用量レベルのrORF2抗原、及び実験0日目と実験14日目に投与される1用量レベルの不活化全粒子PCV2ワクチンを含んだ。
この実施例は8種類のPCV2ワクチン候補の有効性をテストし、PCV2の病原性株への曝露後の以前のチャレンジ研究からのPCV2チャレンジパラメタを確認する。帝王切開で分娩され、初乳を与えられない(CDCD)、6〜16日齢の150匹の子ブタが、体重によって分別され、無作為に同じ個体数の10グループに割り振られた。
これは、実験0日目に6から16日例のCDCDブタで実施された、一部盲検化したワクチンチャレンジの実現可能性研究である。この研究に加入されるためには、種雄豚のPCV2 IFA≦1000であった。さらに、種雄豚の血清学的状態は既知のPRRS陰性群れに由来した。
この実施例の結果は下記に与えられる。ブタNo.46及び98が、実験14日目及び25日目に、それぞれ死亡したことが認められる。これらの死亡は、出血死に分類される。
7種類のPCV2ワクチンがこの実施例で評価されたが、それには、2回投与される高用量(16μg)のIMS 1314でアジュバントされたrORF2抗原、ブタの1つのグループには1回、もう一つのグループには2回投与される高用量(16μg)のカーボポールでアジュバントされたvORF2抗原、2回投与されるカーボポールでアジュバントされた4μg用量のrORF2抗原、2回投与されるカーボポールでアジュバントされた1μg用量のrORF2抗原、2回投与される低用量(0.25μg)のカーボポールでアジュバントされたrORF2抗原、及び高用量(>8log)のカーボポールでアジュバントされた不活化全粒子PCV2ワクチン、を含んだ。
Claims (53)
- 次のステップを含む、PCV2のオープンリーディングフレーム2によって発現される組換えタンパク質を回収する方法
A) 該PCV2由来組換えオープンリーディングフレーム2をトランスファーベクターにクローニングする;
B) 該組換えオープンリーディングフレーム2を含む該トランスファーベクターの一部分をウイルスにトランスフェクトする;
C) 培地中の細胞を該ウイルスで感染する;
D) 該ウイルスに該オープンリーディングフレーム2由来タンパク質を発現させる;
E) 細胞を上清から分離する;及び
F) 該発現オープンリーディングフレーム2タンパク質を該上清中で回収する。 - 請求項1に記載の方法であって、前記方法が、オープンリーディングフレームを該トランスファーベクターにクローニングする前にPCV2ウイルス株由来の該オープンリーディングフレーム2を増幅するステップをさらに含む方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記組換えオープンリーディングフレーム2が、5’側のコザック配列、3’側のEcoRI認識部位、及びそれら両者の組合せからなる群から選ばれる配列をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記5’側のコザック配列が、配列番号1の配列を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記3’側のEcoRI認識部位が、配列番号2の配列を含む、請求項3または4に記載の方法。
- 前記PCV2オープンリーディングフレームが、配列番号4の配列を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えタンパク質が、配列番号6の配列を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記培地が、無血清昆虫細胞培地を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 請求項1の方法であって、さらに次のステップを含む方法:
i) ステップAの前に、該増幅されたオープンリーディングフレーム2を第1のベクターにクローニングする;
ii) 該オープンリーディングフレーム2を第1のベクターから切り出す;及び
iii) 該切り出されたオープンリーディングフレーム2をステップAで使用する。 - 前記細胞が、SF+細胞を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記ウイルスが、バキュロウイルスを含む、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記トランスフェクトされる部分が、配列番号4の配列を含む、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記オープンリーディングフレーム2タンパク質が、細胞を該ウイルスで感染してから少なくとも5日目に該上清中で回収される請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- PCV2に対する免疫応答を引き起こすための組成物を製造する方法であって、該方法が次のステップを含む方法:
i) PCV2のオープンリーディングフレーム2由来の組換えDNAを含むコンストラクトをウイルスにトランスフェクトする;
ii) 該トランスフェクトされたウイルスを、培地中の細胞に感染させる;
iii) 該ウイルスに該オープンリーディングフレーム由来の組換えタンパク質を発現させる;
iv) 該発現されたオープンリーディングフレーム2タンパク質を上清中で回収する;及び
v) 該回収されたタンパク質と適切なアジュバント又は他の薬学的に許容される担体又は賦形剤と合わせる。 - 請求項14に記載の方法であって、前記方法が、該コンストラクトをトランスファーベクターから得る段階をさらに含む方法。
- 請求項14または15に記載の方法であって、前記方法が、該オープンリーディングフレーム2を該トランスファーベクターにクローニングする前に、PCV2の株から該オープンリーディングフレーム2を増幅する段階をさらに含む方法。
- 請求項14〜16のいずれかに記載の方法であって、前記組換えオープンリーディングフレーム2が、5’コザック配列、3’EcoRI認識部位、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる配列をさらに含む方法。
- 前記5’コザック配列が、配列番号1の配列を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記3’EcoRI認識部位が、配列番号2の配列を含む、請求項17または18に記載の方法。
- 前記PCV2オープンリーディングフレーム2が、配列番号4の配列を含む請求項14〜19のいずれかに記載の方法。
- 前記組換えタンパク質が、配列番号6の配列を含む、請求項14〜20のいずれかに記載の方法。
- 前記培地が、無血清昆虫細胞培地を含む、請求項14〜21のいずれかに記載の方法。
- 請求項16〜22のいずれかに記載の方法であって、次のステップをさらに含む方法:
i) 該増幅されたオープンリーディングフレーム2を第1のベクターにクローニングする;
ii) 該オープンリーディングフレームを該第1のベクターから切り出す;
iii) 該切り出されたオープンリーディングフレーム2を該トランスファーベクターにクローニングするために使用する。 - 前記細胞が、SF+細胞を含む、請求項14〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記ウイルスが、バキュロウイルスを含む、請求項14〜24のいずれかに記載の方法。
- 前記トランスフェクトされるコンストラクトが、配列番号4の配列を含む、請求項14〜25のいずれかに記載の方法。
- 前記オープンリーディングフレーム2タンパク質が、該細胞に該ウイルスが感染してから少なくとも5日目以降に回収される、請求項14〜26のいずれかに記載の方法。
- 請求項14〜27のいずれかに記載の方法であって、該回収段階が、該培地を該細胞及び細胞片から分ける分離ステップをさらに含む方法。
- 前記分離ステップが、該細胞、細胞片、及び培地を、0.45μmから1.0μmの範囲にある孔径をもつフィルターを通してろ過するステップを含む、請求項28に記載の方法。
- 請求項14〜29のいずれかに記載の方法であって、該方法が、該回収されたタンパク質を適切なアジュバントと合わせる前に、該ウイルスを不活化するステップをさらに含む方法。
- PCV2由来のオープンリーディングフレーム2によって発現されるタンパク質を回収する方法であって、次のステップを含む方法:
i) 該オープンリーディングフレーム2を含む組換えウイルスベクターを培地中で細胞に感染させる;
ii) 該ベクターに該タンパク質を発現させる;及び
iii)上清中の該発現されるタンパク質を回収する。 - 前記ウイルスベクターによる細胞の感染から少なくとも5日経過後に、該回収を行う、請求項31に記載の方法。
- 請求項1、請求項14、請求項31、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる方法によって得られるものの組成物。
- 請求項33に記載の組成物の医薬品としての使用。
- PCV2の感染を防ぐための医薬品を調製するための、請求項33に記載の組成物の使用。
- 次の手順を含む、試料中のPCV2感染を検出するための診断キットを製造する方法:
i) 請求項1、請求項14、請求項31、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる方法を使って組換えタンパク質を製造する;
ii) 及び、該組換えタンパク質を適切な容器にパッケージングする。 - 請求項36に記載の方法であって、取扱説明書を組換えタンパク質をパッケージングする容器と一緒に含ませるステップをさらに含む方法。
- PCV2 ORF2 タンパク質、又はPCV2 ORF2 タンパク質に由来する連続する少なくとも10個のアミノ酸をもつ、その免疫原性部分を含む、PCV2感染に係わる臨床症状の重さを軽減するために有効な免疫原性組成物。
- 前記PCV2 ORF2タンパク質が次のいずれかである、請求項38に記載の組成物:
i) 配列番号5、配列番号6、配列番号9、配列番号10又は配列番号11からなる群から選ばれる配列を含むポリペプチド;
ii) i)のポリペプチドに少なくとも80%相同である任意のポリペプチド;
iii) i)及び/又はii)のポリペプチドの任意の免疫原性部分;
iv) 配列番号5、配列番号6、配列番号9配列番号10又は配列番号11の配列に含まれる少なくとも10残基の連続したアミノ酸からなる、iii)の免疫原性部分;
v) 配列番号3または配列番号4の配列を含むDNAによってコードされるポリペプチド;
vi) v)のポリヌクレオチドに少なくとも80%相同であるポリヌクレオチドによってコードされる任意のポリペプチド;
vii) v)及び/又はvi)のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの任意の免疫原性部分;
viii) vii)の免疫原性部分であって、該免疫原性部分が配列番号3又は配列番号4の配列に含まれる少なくとも30個の連続するヌクレオチドを含む免疫原性部分。 - 請求項38または39に記載の免疫原性組成物であって、不活化されたウイルスベクター及び細胞培養上清をさらに含む組成物。
- 前記不活化ウイルスベクターが、PCV2 ORF2タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスである、請求項38〜40のいずれかに記載の組成物。
- 請求項40または41に記載の免疫原性組成物であって、BEIを含む組成物。
- 請求項42の免疫原性組成物であって、チオ硫酸ナトリウムを含む組成物。
- 請求項39〜43のいずれかに記載の免疫原性組成物であって、担体、アジュバント、培地、不活化剤、希釈剤、浸透圧調節剤、免疫モジュレーター剤、抗体及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる追加の成分を含む免疫原性組成物。
- 前記組成物が、アジュバント、好ましくはカーボポールを含む、請求項44に記載の組成物。
- 前記組成物が、薬学的に許容できる塩、好ましくは食塩を含む、請求項45に記載の組成物。
- 前記組成物が、少なくとも0.2mcg/mlのPCV2 ORF2タンパク質を含む、請求項38〜46のいずれかに記載の組成物。
- 前記組成物が、少なくとも2μgのPCV2 ORF2タンパク質を含む、請求項38〜46のいずれかに記載の組成物。
- 請求項38〜48のいずれかに記載の免疫原性組成物の少なくとも1用量を含む容器であって、1用量が少なくとも2μgのPCV2 ORF2タンパク質を含む容器。
- 請求項38〜48のいずれかに記載の免疫原性組成物の10から250用量を含む容器であって、1用量が少なくとも2μgのPCV2 ORF2タンパク質を含む容器。
- 請求項49に記載の容器であって、さらに抗微生物学的活性剤を含む容器。
- 請求項49に記載の容器及びPCV2感染に関係する臨床症状の重篤さを軽減するための、子ブタに対する少なくとも1用量の免疫原性組成物の筋肉内投与に関する情報を含む取扱い説明書を含むキット。
- 前記取扱い説明書が、2回目の投与又は他のさらなる投与が直前の投与から少なくとも14日を越えるものである、少なくとも1用量の免疫原性組成物の2回目またはそれ以降の投与に関する情報を含む、請求項52に記載のキット。
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