CN102614509A - 一种草鱼出血病口服疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草鱼出血病口服疫苗的制备方法，包括下列步骤：(1)通过基因工程方法制备带有草鱼出血病病毒结构蛋白VP6基因的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6；(2)采用扩增后的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6接种至五龄家蚕幼虫或蛹；(3)收集接种病毒4～6天后的五龄家蚕幼虫或蛹，采用冷冻干燥法制备获得冻干粉；(4)将步骤(3)获得的冻干粉与粉状鱼饲料均匀混合，即获得草鱼出血病口服疫苗，按重量计所述冻干粉在草鱼出血病口服疫苗中的含量为1～10%。本发明可以直接作为口服疫苗使用，具有制备工艺简单、成本低、方便使用，具有蛋白亚单位疫苗和核酸疫苗双重功能等优点。

Description

一种草鱼出血病口服疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种利用家蚕生物反应器制备草鱼出血病口服疫苗的方法。

背景技术

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国淡水养鱼的主要品种，其产量约占淡水养殖总产量的20%。但草鱼病害多，其中以草鱼出血病（hemorrhagic disease of grass carp）最甚，由草鱼出血病病毒（Grass Carp Reovirus, GCRV）引起。该病是鱼种培育阶段的最大病害，死亡率高达90%以上，给水产养殖业造成了巨大损失。

现有技术中，在草鱼出血病的免疫预防中，主要使用甲醛灭活疫苗。例如，取感染病毒死亡的草鱼，匀浆灭活后过滤，即得到病毒灭活疫苗；也可以采用细胞培养灭活疫苗。灭活疫苗能够对草鱼出血病起到预防作用，但是安全性较差，有毒力返祖现象出现。

基因工程疫苗具有抗原性强、保护时间长、安全性好、制备和运输方便等优点，已引起行业内的广泛关注。

家蚕杆状病毒表达载体系统(Bombyx mori baculovirus expression vector system )是真核表达系统，已有许多基因在该系统中成功表达。用该系统在家蚕中表达外源基因，表达水平高、产物生物活性好。同时杆状病毒也是一种良好的基因传递载体，已用于向哺乳类动物细胞传递基因研究。

目前，未见利用家蚕杆状病毒表达载体系统制备草鱼出血病口服疫苗的报道。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种采用基因工程方法制备草鱼出血病口服疫苗的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种草鱼出血病口服疫苗的制备方法，包括下列步骤：

(1) 通过基因工程方法制备带有草鱼出血病病毒结构蛋白VP6基因的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6；

(2) 将重组杆状病毒BmNPV-IIVP6感染家蚕培养细胞BmN进行扩增，采用扩增后的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6接种至五龄家蚕幼虫或蛹；

(3) 收集接种病毒4～6天后的五龄家蚕幼虫或蛹，采用冷冻干燥法制备获得冻干粉；

(4)将步骤(3)获得的冻干粉与粉状鱼饲料均匀混合，即获得草鱼出血病口服疫苗，按重量计所述冻干粉在草鱼出血病口服疫苗中的含量为1～10%。

上述技术方案中，通过基因工程方法获得重组的带有草鱼出血病病毒结构蛋白VP6基因的家蚕Bombyx mori重组杆状病毒，并用该病毒接种家蚕幼虫或蛹，使重组杆状病毒在虫体大量复制，同时草鱼出血病病毒结构蛋白VP6在家蚕幼虫或蛹中获得到高效表达。将高效表达VP6的幼虫或蚕蛹制成冻干粉，经动物试验证明，冻干粉按1%～10%与草鱼饲料混合，制成口服疫苗制剂，可诱导鱼体产生VP6特异性抗体，具有显著的免疫效果。所述的鱼饲料可以选择现有的任一种草鱼饲料，仅为口服目的加入。为混合方便，鱼饲料应为粉状或先加工成粉状，再与冻干粉充分混合均匀。

上述技术方案中，所述步骤(1)具体包括以下步骤：

①根据GenBank已公开的草鱼出血病病毒结构蛋白VP6的cDNA编码序列(GenBank登录号：AF403394)，合成5’端和3’端分别带EcoRI和HindⅢ位点的VP6基因的编码序列，克隆进T-载体，获pMD19T-VP6质粒；

②用EcoRI/HindⅢ双酶切消化pMD19T-VP6质粒，回收VP6基因片段，用EcoRI/HindⅢ双酶切消化供体质粒pFastBac-Dual，回收pFastBac-Dual片段，将VP6基因片段插入到pFastBac-Dual的EcoRI和HindⅢ之间，将VP6基因克隆进pFastBac-Dual载体中的杆状病毒多角体基因启动子下游获得pFastBac-ph-VP6重组质粒；

③以pMD19T-VP6质粒为模板，PCR合成5’端和3’端分别带XhoI和KpnI位点的VP6基因的编码序列，XhoI/KpnI 双酶切后克隆进用XhoI/KpnI双酶切的 pFastBac-ph-VP6中获 pFastBac-VP6-ph-VP6；

④根据GenBank已公开的团头鲂Megalobrama amblycephala的 β-肌动蛋白启动子序列(GenBank登录号：AY170122)合成5’端和3’端分别带SmaI和XhoI位点的β-肌动蛋白启动子序列，克隆进T-载体，获pMD19T-β-actin质粒；

⑤用SmaI/XhoI双酶切pMD19T-β-actin质粒，回收β-肌动蛋白启动子序列片段，SmaI/XhoI双酶切pFastBac-VP6-ph-VP6，将β-肌动蛋白启动子序列片段插入到pFastBac-VP6-ph-VP6的SmaI和XhoI之间，获得pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒；

⑥将pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒转化大肠杆菌BmDH10Bac感受态细胞，涂布于LB 琼脂培养平板上，挑取白色菌落培养，提取重组Bacmid 基因组Bacmid-IIVP6 DNA；

⑦将Bacmid-IIVP6 DNA由脂质体介导转染家蚕培养细胞BmN，培养细胞后取上清，获得重组杆状病毒BmNPV-IIVP6。

其中，所述步骤⑥中，LB 琼脂培养平板上含有四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG、和X-gal。

将pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒转化大肠杆菌BmDH10Bac感受态细胞，涂布于含四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG、X-gal的LB 琼脂培养平板上是为了方便重组Bacmid的筛选，本领域技术人员能够根据需要调整各组份的含量，通常四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG 和X-gal在LB 琼脂培养平板上的含量分别为10 µg/ml、50 µg/ml、7 µg/ml、40µg/ml和100 µg/ml。

上述技术方案中，所述步骤(3)中冻干粉的制作方法是，取收集的五龄家蚕幼虫或蛹，冰浴匀浆，加入3～5倍重量的生理盐水，混匀，过滤，滤液冷冻干燥至水份含量小于2wt%，粉碎过筛，获得冻干粉。

优选的技术方案，在接种病毒5天后收集五龄家蚕幼虫或蛹。

按重量计所述冻干粉在草鱼出血病口服疫苗中的含量为1～10%。

上文中，采用所述家蚕Bombyx mori重组杆状病毒接种家蚕幼虫或蛹的方法为：将重组杆状病毒BmNPV-IIVP6感染家蚕培养细胞BmN进行扩增，采用扩增后的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6接种至五龄家蚕幼虫或蛹。进一步地，取5天后家蚕或蛹的血淋巴，分析检测VP6表达水平，结果显示重组VP6占血淋巴总蛋白的5～5.5%左右。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1．由于本发明采用家蚕杆状病毒表达系统生产草鱼出血病口服疫苗，家蚕可食，家蚕杆状病毒对鱼类无致病性，表达VP6的家蚕幼虫和蛹可直接冷冻干燥，表达产物无需纯化，可以直接作为口服药物使用，因此具有制备工艺简单、成本低，口服疫苗方便使用等优点，同时可以避免采用注射免疫方案中捕捞鱼及注射对鱼体损伤的副作用。

2．由于用本发明技术方案获得的重组家蚕杆状病毒基因组中，同时具有杆状病毒多角体蛋白启动子控制VP6基因的表达元件和团头鲂的 β-肌动蛋白启动子控制VP6基因的表达元件，因此，该病毒接种家蚕后，病毒在家蚕中大量复制的同时可以大量表达VP6蛋白，而当鱼食下本发明技术方案获得的口服疫苗制剂后，重组VP6蛋白作为亚单位疫苗可以刺激鱼体产生特异性抗体；同时，重组杆状病毒可以进入鱼的细胞，在鱼体内通过团头鲂的 β-肌动蛋白启动子驱动VP6的表达，进一步产生免疫作用。即采用本发明技术方案有蛋白亚单位疫苗和核酸疫苗的双重作用。

3．本发明所得一种草鱼出血病口服疫苗制剂经动物试验证明可诱导鱼体产生VP6特异性抗体，具有显著的免疫效果。

附图说明

图1为实施例一中pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒的酶切鉴定图，其中，M.标准DNA分子质量(200-2000bp)；1-2：pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒 EcoRⅠ/Hind Ⅲ酶切；3-4：pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒SmaⅠ/XhoⅠ酶切；5-6：pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒XhoⅠ/KpnⅠ酶切。

图2为实施例一中P2代BmNPV-IIVP6病毒感染细胞引起的细胞病变图，其中A为正常没有感染病毒的细胞，B为感染BmNPV-IIVP6的细胞。

图3为实施例一中重组VP6蛋白的SDS-PAGE和Western blotting检测。M. 标准蛋白分子量. 1和1’. 正常5龄家蚕血液；2和2’. 感染BmNPV-IIVP6病毒5天后的5龄家蚕血液。SDS-PAGE胶的浓度为12%，一抗为鼠抗VP6抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠 IgG。

图4为实施例一中SDS-PAGE检测BmNPV-IIVP6病毒感染家蚕幼虫不同时相的VP6表达。M.标准分子量蛋白. N 正常5龄家蚕血液，W. 感染野生病毒5龄家蚕血液，24h，48h，72h，96h，120h. 分别为感染BmNPV-IIVP6病毒24，28，72，96，120小时5龄家蚕血液。

图5为实施例一中SDS-PAGE 胶灰度分析估计VP6在BmNPV-IIVP6病毒不同感染时相的表达水平。横坐标为病毒感染家蚕后的时间，纵坐标为VP6蛋白占血淋巴总蛋白的比例。

图6为实施例四中口服免疫后草鱼血液VP6特异性抗体检测。Group LV：低剂量组，含1%表达VP6蚕蛹冻干粉的鱼饲料；Group MV：中剂量组，含5%表达VP6蚕蛹冻干粉的鱼饲料；Group HV：高剂量组，含10%表达VP6蚕蛹冻干粉的鱼饲料；Group NV：非免疫组，含5%正常蚕蛹冻干粉的鱼饲料；Group CK：正常对照组，正常鱼饲料。横坐标为免疫后的周数，纵坐标为抗体的滴度。实验重复3次，*P < 0.05；**P < 0.01。

图7为实施例四中RT-PCR检测免疫后草鱼血液中的VP6基因的mRNA。M. 标准分子量DNA；泳道 1-3. 为分别饲喂含1%，5%和10%表达VP6基因的蚕蛹冻干粉鱼饲料的草鱼；泳道 4. 饲喂含5%正常蚕蛹冻干粉鱼饲料的草鱼；泳道5. 阳性对照(pFastBac-FA-VP6-ph-VP6质粒)。

图8为实施例四中免疫荧光检测免疫后草鱼肾脏组织中的VP6蛋白。a. 正常光线下的肾脏组织; e. 用DAPI染色的肾脏组织; f. Dylight 488标记的肾脏组织。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：表达草鱼出血病病毒(GCRV) VP6家蚕幼虫的制备

1. 用QIAGEN Viral RNA Mini Kit (Qiagen公司)提取草鱼出血病病毒基因组RNA，用RNA PCR KitVer.3.0 (Qiagen公司) 按产品录说明书将病毒RNA转化为cDNA，根据草鱼出血病病毒结构蛋白VP6的cDNA编码序列(GenBank登录号：AF403394)设计引物GCRV-EI-6 (GGCGAATTC ATGGCACAGCGTCAGTTTTTCGG，下划线表示 EcoRⅠ酶切位点）和GCRV-HD-6(TCGAAGCTTAGACGAACATCGCCTGCGC，下划线表示 HindⅢ酶切位点），通过PCR合成5’端和3’端分别带EcoRI和HindⅢ位点的VP6基因的编码序列，克隆进T-载体，获 pMD19T-VP6质粒。

2. 用EcoRI/HindⅢ双酶切消化pMD19T-VP6质粒，回收VP6基因片段(1.23 kb)，用EcoRI/HindⅢ双酶切消化供体质粒pFastBac-Dual，回收pFastBac-Dual片段，将VP6基因片段插入到pFastBac-Dual的EcoRI和HindⅢ之间，即将VP6基因克隆进pFastBac-Dual载体中的杆状病毒多角体基因启动子下游获得pFastBac-ph-VP6。

其中，质粒pFastBac-Dual是美国Invitrogen公司的产品，其产品名为PFASTBAC-DUAL EXP VECTOR；pFastBac-Dual载体属于Bac-to-Bac（Bacteria to Baculovirus）表达系统载体。

3. 设计引物GCRV-XH-6 (TAT CTC GAG ATG GCA CAG CGT CAG TTT TTC GG，下划线示 XhoⅠ 位点）和 GCRV-KN-6 (GCT GGT ACC TAG ACG AAC ATC GCC TGC GC，下划线示 KpnⅠ位点），以pMD19T-VP6质粒为模板，PCP合成5’端和3’端分别带XhoI和KpnI位点的VP6基因的编码序列，XhoI/KpnI 双酶切后克隆进用XhoI/KpnI双酶切的pFastBac-ph-VP6中获 pFastBac-VP6-ph-VP6质粒。

4. 根据GenBank已公开的团头鲂的 β-肌动蛋白启动子序列(GenBank登录号：AY170122)设计引物FA-SM (TCT CCC GGG CTC TTA CAG GAA ACG GGT C，下划线示SmaⅠ位点）和FA-XH (CTA CTC GAG ATT GGA GCT CAA AGT GAG G，下划线示XhoⅠ位点），以团头鲂基因组DNA为模板，PCR合成5’端和3’端分别带SmaI和XhoI位点的β-肌动蛋白启动子序列，克隆进T-载体，获pMD19T-β-actin质粒。

5. 用SmaI/XhoI双酶切pMD19T-β-actin质粒，回收β-肌动蛋白启动子序列片段（0.56 kb），SmaI/XhoI双酶切pFastBac-VP6-ph-VP6，将β-肌动蛋白启动子序列片段插入到pFastBac-VP6-ph-VP6的SmaI和XhoI之间，获得pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒。

鉴定结果参见图1：重组质粒 pFastBac-FA-VP6-ph-VP6 分别用 EcoRⅠ/HindⅢ 和 XhoⅠ/KpnⅠ 双酶切，均可切出与vp6 基因理论分子量相符的片段（1.23kb）；SmaⅠ/XhoⅠ双酶切可切出与β-肌动蛋白基因启动子(0.56kb)理论分子量相符的片段，表明外源基因已按设计要求被正确克隆。

6. pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒转化大肠杆菌BmDH10Bac感受态细胞，涂布于含四环素（10 µg/ml）、卡那霉素（50 µg/ml）、庆大霉素（7 µg/ml）、IPTG（40µg/ml）、X-gal（100 µg/ml）的LB 琼脂培养平板上。挑取白色菌落培养，提取重组Bacmid 基因组DNA，用M13 正向引物(5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3') 和 M13 反向引物 (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3') 对重组Bacmid-IIVP6进行PCR，可从重组Bacmid DNA中扩增出与理论分子量一致的目的条带（5.72 kb），说明已按要求正确构建了重组Bacmid，命名为Bacmid-IIVP6。

7. Bacmid-IIVP6 DNA(2μg）加入到98μl TC-100（无胎牛血清，GIBCO BRL 公司）中混匀，另取10μl FuGENE HD transfection reagent (Roche公司)加入到90μl TC-100（无胎牛血清）中混匀，再将前者滴加到后者中混匀放置30分钟后滴加到800μl的TC-100（无胎牛血清）中混匀，转染BmN 细胞。27℃培养3～4天，收取病毒感染的培养细胞上清，获P1代重组病毒BmNPV-IIVP6。取P1代病毒感染单层BmN细胞，培养5天后，收取病毒感染的培养细胞上清，获P2代重组病毒BmNPV-IIVP6，取P2代病毒感染单层BmN细胞，感染72小时细胞出现典型的细胞病变，感染4天后收取病毒感染的培养细胞上清，获P3代重组病毒BmNPV-IIVP6，4度避光保存备用。

P2代BmNPV-IIVP6病毒感染细胞引起的细胞病变参见图2。BmN细胞感染P2代BmNPV-IIVP6病毒72小时后，细胞停止生长繁殖，细胞变圆，细胞核膨大，后细胞逐渐失去贴壁性能。

8.用昆虫针醮取P3代重组病毒，从节间膜处穿刺接种5龄起蚕， 25℃左右正常饲养，5天后，取少量蚕血，进行SDS-PAGE和Western blotting检测重组VP6蛋白，5龄起蚕接种后，每24小时取血，进行SDS-PAGE，并通过灰度分析估计VP6表达水平。结果显示重组VP6蛋白的分子量为53kD左右(图3)，感染病毒72小时后，可明显检测到VP6特异性表达（图4），120小时VP6蛋白占血淋巴总蛋白的5%左右（图5）。

实施例二：表达草鱼出血病病毒(GCRV) VP6家蚕蛹的制备

1. 采用实施例一步骤7获得的P3代重组病毒BmNPV-IIVP6，感染BmN培养细胞，4天后收集细胞培养上清。

2. 用昆虫针醮取步骤1的细胞培养上清，环节处穿刺接蛹龄2天左右的家蚕蛹，25℃左右保护5天后，取少量蛹血，进行SDS-PAGE和Western blotting检测，并对SDS-PAGE胶通过灰度分析估计VP6的表达水平。结果显示重组VP6蛋白的分子量约为53kD， 感染5天后VP6蛋白表达水平最高，占蛹血淋巴总蛋白的5.5%左右。收集接种病毒5天后的家蚕蛹，-20℃保存。

实施例三：表达VP6家蚕蛹冻干粉的制备

1. 取实施例二步骤2的蚕蛹10kg，冰浴匀浆，加0.7%的生理盐水40kg，混匀，用纱布过滤去除粗杂质。

2. 滤液冷冻干燥至水份小于2%，粉碎过筛制成粉剂原料。

实施例四：口服含有VP6家蚕蛹粉诱导草鱼产生VP6特异性抗体的能力

1. 于实验前两周，选取健壮无病的同一批次草鱼鱼种(体长10-13 cm，体重23-28 g)，于 31± 1˚C 水温中充氧饲育。鱼每天喂商业化鱼饲料2次。

2. 含2.5%淀粉的商业化鱼饲料与实施例三步骤2的粉剂原料混合，分别制成含1%、5% 和 10%实施例三步骤2的粉剂原料的鱼饲料, 同时制作含5%正常蚕蛹冻干粉的鱼饲料。

3. 正常对照组鱼每天喂普通商业化鱼饲料，非免疫组鱼每天喂含含5%正常蚕蛹冻干粉的鱼饲料，免疫组鱼每天喂1%、5% 和 10%实施例三步骤2的粉剂原料的鱼饲料，分别称低剂量组，中剂量组和高剂量组，饲喂28天后，改喂正常商业化鱼饲料。每隔1周取鱼血用间接血凝法测定VP3抗体滴度。结果如图6所示，在免疫组，免疫后2－8周内均可检测到VP3抗体，免疫后第3周抗体达到最高水平，后逐渐下降，直至第9周，且抗体产生水平呈现免疫剂量依赖关系，而正常对照，非免疫组基本测不到特异性VP6抗体。表明口服表达VP6的蚕蛹冻干粉可诱导鱼产生VP6特异性抗体。草鱼口服疫苗3个月后，取草鱼血液，用Trizol Reagent (Takara公司)制取总RNA，用RNase-free Dnase

去除DNA污染后，用SuperScript III kit (Invitrogen公司)反转录成cDNA，然后用引物GCRV-XH-6/ GCRV-KN-6进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图7所示，在免疫后的鱼血液样品中可检测到VP6特异性mRNA，说明口服表达VP6蚕蛹冻干粉后， BmNPV-IIVP6重组病毒进入鱼体后，VP6基因能转录；草鱼口服表达VP6蚕蛹冻干粉免疫5天后，取肾组织用4%甲醛固定，然后用石腊包埋，切片先后与鼠抗VP6抗体、Dylight 488标记的 羊抗鼠 IgG(H+L) (Earthox公司反应)，然后再用DAPI（Sigma 公司）染色. 荧光显微镜观察结果显示，在口服免疫后的鱼肾脏组织切片中可观察到特异性绿色荧光，说明口服表达VP6蚕蛹冻干粉后， BmNPV-IIVP6重组病毒进入鱼体后， VP6基因能正确表达（图8），表明VP6蚕蛹冻干粉不仅具有蛋白亚单位疫苗的特性，同时也具有核酸疫苗的功能。

Claims (5)

1.一种草鱼出血病口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1) 通过基因工程方法制备带有草鱼出血病病毒结构蛋白VP6基因的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6；

(2) 将重组杆状病毒BmNPV-IIVP6感染家蚕培养细胞BmN进行扩增，采用扩增后的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6接种至五龄家蚕幼虫或蛹；

(3) 收集接种病毒4～6天后的五龄家蚕幼虫或蛹，采用冷冻干燥法制备获得冻干粉；

(4)将步骤(3)获得的冻干粉与粉状鱼饲料均匀混合，即获得草鱼出血病口服疫苗，按重量计所述冻干粉在草鱼出血病口服疫苗中的含量为1～10%。

2.根据权利要求1所述的草鱼出血病口服疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括以下步骤：

①根据GenBank已公开的草鱼出血病病毒结构蛋白VP6的cDNA编码序列，合成5’端和3’端分别带EcoRI和HindⅢ位点的VP6基因的编码序列，克隆进T-载体，获pMD19T-VP6质粒；

②用EcoRI/HindⅢ双酶切消化pMD19T-VP6质粒，回收VP6基因片段，用EcoRI/HindⅢ双酶切消化供体质粒pFastBac-Dual，回收pFastBac-Dual片段，将VP6基因片段插入到pFastBac-Dual的EcoRI和HindⅢ之间，将VP6基因克隆进pFastBac-Dual载体中的杆状病毒多角体基因启动子下游获得pFastBac-ph-VP6重组质粒；

③以pMD19T-VP6质粒为模板，PCR合成5’端和3’端分别带XhoI和KpnI位点的VP6基因的编码序列，XhoI/KpnI 双酶切后克隆进用XhoI/KpnI双酶切的 pFastBac-ph-VP6中获 pFastBac-VP6-ph-VP6；

④根据GenBank已公开的团头鲂Megalobrama amblycephala的 β-肌动蛋白启动子序列合成5’端和3’端分别带SmaI和XhoI位点的β-肌动蛋白启动子序列，克隆进T-载体，获pMD19T-β-actin质粒；

⑤用SmaI/XhoI双酶切pMD19T-β-actin质粒，回收β-肌动蛋白启动子序列片段，SmaI/XhoI双酶切pFastBac-VP6-ph-VP6，将β-肌动蛋白启动子序列片段插入到pFastBac-VP6-ph-VP6的SmaI和XhoI之间，获得pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒；

⑥将pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒转化大肠杆菌BmDH10Bac感受态细胞，涂布于含四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG和X-gal的LB 琼脂培养平板上，37℃培养1～2天，挑取白色菌落培养，提取重组Bacmid 基因组Bacmid-IIVP6 DNA；

⑦将Bacmid-IIVP6 DNA由脂质体介导转染家蚕培养细胞BmN，培养细胞后取上清，获得重组杆状病毒BmNPV-IIVP6。

3.根据权利要求1所述的草鱼出血病口服疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中冻干粉的制作方法是，取收集的五龄家蚕幼虫或蛹，冰浴匀浆，加入3～5倍重量的生理盐水，混匀，过滤，滤液冷冻干燥至水份含量小于2wt%，粉碎过筛，获得冻干粉。

4.根据权利要求3所述的草鱼出血病口服疫苗的制备方法，其特征在于：在接种病毒4～6天后收集五龄家蚕幼虫或蛹。

5.根据权利要求1所述的草鱼出血病口服疫苗的制备方法，其特征在于：按重量计所述冻干粉在草鱼出血病口服疫苗中的含量为1～10%。

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