CN111499698B - 犬i型腺病毒亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

犬i型腺病毒亚单位疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了犬I型腺病毒亚单位疫苗及其制备方法。本发明提供了具有免疫原性的抗原蛋白，该抗原蛋白由犬I型腺病毒五邻体基底基因节段编码，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。该抗原蛋白免疫性强，安全性好，能够有效保护犬抵御I型腺病毒的攻击，可以不用添加免疫佐剂，直接将该抗原蛋白作为犬I型腺病毒亚单位疫苗进行使用，注射小鼠体后能显著提高小鼠血清中特异性抗体ELISA效价，病毒中和抗体效价，提高脾脏T淋巴细胞增殖活性，证明抗原蛋白具有较好的免疫原性。用本发明亚单位疫苗免疫狐狸30天后攻毒CAdV‑1，狐狸的存活率为100％。

Description

犬I型腺病毒亚单位疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及犬I型腺病毒亚单位疫苗，尤其涉及犬I型腺病毒亚单位疫苗及其制备方法，属于犬I型腺病毒亚单位疫苗领域。
背景技术
犬腺病毒(Canine adenovirus，CAdV)是双链DNA病毒，包括Ⅰ型和Ⅱ型。犬Ⅰ型腺病毒(Canine ade-novirus type 1，CAdV－1)主要引起急性败血性肝炎(犬)和脑炎(熊和狐)。CAd V－1广泛分布于世界各地，其致病性强、感染谱广，除了犬和狐狸外，CAd V－1还能对野生肉食哺乳动物(狼、棕熊、黑熊、水獭)造成致死性感染。
CAdV-1耐受性强，传播速度快，宿主范围广泛，疫苗免疫是目前公认的预防CAdV-1感染最有效的方法。目前犬I型腺病毒的疫苗主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗和核酸疫苗。研究人员利用MDCK细胞培养的CAdV-1细胞毒，采用物理或化学方法，将免疫原性较强的CAdV-1毒株培养产物进行灭活处理，使其完全失去致病性但仍保留免疫原性，该灭活疫苗具有较强的免疫原性和安全性。由于CAdV-1灭活疫苗对CAdV-2保护效果较弱，CAdV-1灭活疫苗逐渐被市场所淘汰。研究人员CAdV-1在MDCK细胞上连续传代致弱，利用稳定的CAdV-1致弱毒株研制出早期的减毒活疫苗，该减毒活疫苗免疫持续时间较早期灭活疫苗有所提高，但免疫后致弱毒株仍有返强的风险，减毒CAdV-1疫苗容易造成免疫动物眼膜和肾脏的损伤。目前针对CAdV-1核酸疫苗包括以CAdV-1Loop1和Loop2作为中和表位基因和以pVAX1-CPG为真核表达载体的DNA疫苗和以E3区缺失的CAdV-2为载体，以犬副流感病毒(CPIV)F基因为主要抗原的重组犬腺病毒和犬副流感病毒二联苗。但CAdV-1基因疫苗的研究还面临着许多问题。如果能够研制一种犬I型腺病毒亚单位疫苗在应用时将会具有更高的安全性。
发明内容
本发明的目的之一是提供具有免疫原性的抗原蛋白；
本发明的目的之二是提供一种制备所述抗原蛋白的方法；
本发明的目的之是三提供以所述抗原蛋白为活性成分的犬I型腺病毒亚单位疫苗。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种具有免疫原性的抗原蛋白，该抗原蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，该抗原蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。
其中，含有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列的表达载体也属于本发明的保护范畴。
可以将SEQ ID No.2所示的氨基酸进行修饰或保守性替换得到具有类似功能的蛋白变体。所述蛋白变体与SEQ ID No.2所示的蛋白至少有90％以上连续氨基酸序列同源性或同一性。
所述“保守性替换”是用与原有氨基酸残基相比具有相似侧链的氨基酸进行替换。保守性替换应尽可能使氨基酸电荷或氨基酸侧链大小变化达到最小，从而使肽在整体上保持其空间构象但其生物活性有所改变。例如，一般的保守性替换可以是Asp替换为Glu、Asn或Gln；His替换为Lys、Arg或Phe；Asn替换为Gln(Gin)、Asp或Glu(Gli)；Ser替换为Cys、Thr或Gly。通常使用丙氨酸替换其它氨基酸。20种必需氨基酸可如下分组：具有非极性侧链的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；具有无电荷极性侧链的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；具有酸性侧链的天冬氨酸和谷氨酸；具有碱性侧链的赖氨酸、精氨酸和组氨酸。通过改变蛋白相应核酸序列的密码子来改变氨基酸。已知可通过替换肽结构中的某些氨基酸来得到这种多肽，以修饰或改善其抗原性或免疫原性。例如通过替换可变氨基酸，可稍微改变肽构象以提高活性或增强免疫反应。将某些多肽的氨基酸进行替换也可能会得到可连接到其它分子的残基，从而得到肽与其它分子形成的缀合物。一个实施方案中可使用多赖氨酸骨架作为载体，连接本发明的一个或多个相同或不同的肽。例如将6个肽分子连接到同一个多赖氨酸骨架上。
本发明所提供的抗原蛋白可缀合到或连接到其它肽或多糖分子上。例如可连接到本领域熟知的免疫原蛋白上。可用的免疫原蛋白包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、人血清白蛋白、人丙种球蛋白、鸡免疫球蛋白G和牛丙种球蛋白。也可选用作为疫苗的其它病原体的多糖或蛋白与抗原蛋白缀合或连接或者与其混合。
本发明所提供的SEQ ID No.2所示的抗原蛋白可通过本领域的多种方法制备。例如，可通过各种基因工程的方法制备得到，也可通过固相合成的方法直接合成得到所述的抗原蛋白。
作为参考，本发明提供了一种制备SEQ ID No.2所示的抗原蛋白的方法，包括：
(1)质粒pColdII-PB的构建：以分离的犬I型腺病毒的基因组为模板，用SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的反转录通用引物P1和P2进行PCR扩增，产物纯化后用SacI和PstI双酶切，回收1434bp片段；将质粒pColdII用SacI和PstI双酶切，回收3966片段；将上述回收的两个DNA片段连接，连接产物转化感受态大肠杆菌，筛选含有质粒pColdII-PB的阳性重组菌；
(2)抗原蛋白的诱导表达和纯化：将重组表达菌株pColdII-PB诱导表达，将所表达的蛋白纯化，即得。
本发明所提供的抗原蛋白安全性好、免疫性强，能够有效保护犬抵御I型腺病毒的攻击，可以不用添加免疫佐剂，直接将该抗原蛋白作为犬I型腺病毒亚单位疫苗进行使用。
当然，也可以将所述的抗原蛋白与合适的免疫佐剂进行混合得到疫苗组合物，合适的疫苗佐剂包括但不仅限于表面活性剂，例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基双十八烷基铵、N，N-双十八烷基-N′-N-双(2-羟乙基-丙二胺)、甲氧基十六烷基-甘油和普卢兰尼克多羟基化合物；聚阴离子，例如吡喃、硫酸右旋糖苷、聚丙烯酸、聚羧乙烯；肽，例如胞壁酰二肽、MPL、二甲基甘氨酸、吞噬刺激素；油乳剂、明矾等，以及上述物质的混合物。其它可能适用的佐剂包括大肠杆菌不耐热肠毒素B肽亚单位或霍乱肠毒素。其它可能适用的佐剂为本领域所熟知。最后可将免疫原产物包埋于脂质体内以用作疫苗制剂，或者将其与蛋白缀合，例如与匙孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)或其它聚合物缀合。
疫苗组合物可包含免疫刺激剂或佐剂，例如完全或不完全弗氏佐剂、氢氧化铝、脂质体、珠子、ISCOMs等。脂质体微粒由粘着在一起的水相同心层和油相层组成，活性蛋白分散或以其它方式存在于其中，而内部包裹有活性蛋白的脂质体是药物组合物。活性蛋白优选存在于脂质体的水相层和油相层，内部或外部，或者也可存在于非均一系统，该系统通常称为脂质体悬浮液。疏水层或者油相层通常但不是绝对包含磷脂(例如卵磷脂和鞘磷脂)，类固醇(例如胆固醇)，或多或少的离子型表面活性物质(例如联十六烷基磷酸盐、十八酰胺或者磷脂酸)，和/或其它疏水性物质。疫苗组合物优选包含有效量的活性成分，即抗原蛋白，以及免疫佐剂、合适量的运输载体，如果需要还有防腐剂、缓冲剂等。
可通过皮下注射或肌肉注射来导入本发明的亚单位疫苗，也可通过口服摄取或鼻腔接种。为免疫对象，可通过非肠道途径导入亚单位疫苗，通常通过皮下或肌肉注射到合适载体内。但也可使用其它导入模式，例如口服或鼻腔运送。疫苗制剂在载体内含有有效剂量的活性成分。本领域技术人员可方便的确定待导入疫苗的有效剂量。组合物中活性成分典型含量为从约1％到约95％(w/w)，或者如果合适则更高或更低。导入剂量依赖于待接种动物的年龄、体重和状况等因素。导入剂量也依赖于动物免疫系统产生抗体的能力，以及所需的保护程度。本领域技术人员可通过常规试验建立剂量反应曲线来方便的确定有效剂量。
本发明亚单位疫苗按照100ug/只背部皮下接种6周龄健康雌性Balb/c小鼠，通过提高小鼠血清中重组蛋白五邻体基底抗体和免疫细胞增殖，提高抗犬I型腺病毒感染的能力；所述小鼠血清的抗体为重组蛋白五邻体基底特异性抗体ELISA效价和病毒中和抗体效价，免疫细胞为T淋巴细胞。
本发明的亚单位疫苗蛋白注射小鼠体后能显著提高小鼠血清中重组蛋白五邻体基底特异性抗体ELISA效价、病毒中和抗体效价，提高脾脏T淋巴细胞增殖活性，说明该五邻体基底蛋白具有较好的免疫原性。
根据本发明亚单位疫苗的狐狸免疫试验结果可见，与对照组相比，疫苗组狐狸的血清抗体水平显著提高。与对照组相比，疫苗组狐狸的血清中和抗体水平在21天和30天时显著提高。疫苗组狐狸的血清中IL-4和IL-2含量显著高于对照组组狐狸，疫苗的淋巴细胞增殖活性高于对照组
根据本发明亚单位疫苗的攻毒试验结果可见，狐狸免疫30天后攻毒CAdV-1，疫苗组狐狸的体温低于对照组。CAdV-1攻毒后，PB组狐狸的肛门拭子中的CAdV-1 DNA逐渐降低，且低于对照组。CAdV-1攻毒后，疫苗组狐狸的存活率为100％。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1.本发明的亚单位疫苗所使用的犬I型腺病毒五邻体基底蛋白位于病毒衣壳结构的基底，具有良好的免疫原性，可诱导机体的特异性和非特异性免疫应答。
2.本发明的亚单位疫苗可诱导机体产生特异性抗体，有效对抗犬I型腺病毒的感染。
3.本发明的亚单位疫苗制备方法简单，使用时可以不用添加佐剂，可规模化生产。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
术语“同一性”指多核苷酸序列之间在百分比核苷酸位置同一性(即序列相似性或同一性)方面的相似性或百分同一性的水平。此处所用的术语同源性也指不同多核苷酸分子之间相似的功能特性的概念，例如具有相似功能的启动子可能具有同源的顺式元件。当多核苷酸分子在特定条件下特异性地杂交以形成双链体分子时，它们是同源的。在这些条件下(称为严谨杂交条件)一个多核苷酸分子可以用作鉴定共有同源性的另一个多核苷酸分子的探针或引物。
所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
附图说明
图1Knob和PB基因的PCR扩增重组质粒的鉴定结果；(A):1:DNA marker；2:PB基因；3:Knob基因；4:阴性对照；(B)：1:DNA marker；2:pColdΠ-PB质粒；3:pColdΠ-Knob质粒；4:阴性对照。
图2重组PB蛋白和Knob蛋白Western blot检验结果；1:蛋白marker；2:纯化蛋白；3:全细菌裂解液；4:细菌裂解液上清；5:未诱导对照。
图3重组His-Knob和His-PB蛋白在小鼠体内的免疫原性试验结果；(A)等型酶联免疫吸附试验显示血清抗体分别对HisKnob和His-PB蛋白有特异性反应；(B)重组His-Knob和His-PB蛋白免疫诱导的病毒中和抗体反应；(C)重组His-Knob和His-PB蛋白免疫21d后，分别诱导血清中不同细胞因子的浓度变化；(D)重组His-Knob和His-PB蛋白免疫后21天T淋巴细胞增殖活性；误差条表示平均值(SEM)的标准误差。采用单因素方差分析和Tukey-HSD法测定其统计学意义；*，在0.05水平上具有统计学意义；**，在0.01水平上具有统计学意义。
图4CAdV-1-PB亚单位疫苗的制备与评价试验结果；A:疫苗、PB及对照组狐狸血清抗体滴度；B:疫苗、PB及对照组狐狸的血清中和抗体的水平；C,D：疫苗、PB及对照小鼠血清中IL-4和IL-2含量；E：疫苗、PB及对照组的狐狸的T淋巴细胞增殖活性；F：CAdV-1攻毒后，疫苗、PB及对照的狐狸的体温变化；G：疫苗、PB及对照组的狐狸的肛门拭子中的CAdV-1 DNA含量；H：疫苗、PB及对照组的狐狸的生存率。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1犬I型腺病毒五邻体基底蛋白亚单位疫苗的制备
(1)质粒pColdII-PB的构建：利用CAdV-1 F1301病毒株的基因组为模板，设计PB和Knob引物，采用PCR方法扩增PB(1434bp)和Knob(519bp).PCR扩增结果见图1。
表1引物P1和P2的序列
表2引物Knob-F和Knob-R的的序列
产物纯化后用SacI和PstI双酶切，回收1434bp片段，同时将质粒pColdII用SacI和PstI双酶切，回收3966片段，将上述回收的两个DNA片段用T4DNA连接酶连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α后，在含氨苄的LB固体培养基上培养，筛选含有质粒pColdII-PB和pColdΠ-Knob(pColdΠ-Knob质粒的构建方法同pColdII-PB)的阳性重组菌。采用双酶切发鉴定了重组质粒pColdΠ-PB和pColdΠ-Knob；目的基因片段的长度与设计的片段长度一致。
(2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将重组表达菌株pColdII-PB按照1：100的比例转接到培养基中(含Amp)，37℃，200r/min，至OD600值达到0.4～0.6时，于15℃预冷20min，加入IPTG诱导剂(浓度为1mM)，15℃、200r/min连续培养24h后离心收集菌液，沸水浴充分变性后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证正确后，以相同条件大量表达重组菌株，表达完成后收集菌液，用5倍体积PBS重悬菌液后进行低温超声裂解(冰浴，超声5s，间隔5s，功率220W，破碎50次)，将收集到的超声上清置于His-Bind层析柱中，利用镍离子与His标签的相互作用对重组蛋白进行纯化，采用western blot方法进行验证了Knob和PB蛋白被成功表达(图2).Knob和PB蛋白经过纯化，获得SEQ ID No1所示碱基序列编码的PB蛋白亚单位疫苗蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No2所示。
试验例1重组PB蛋白和Knob蛋白的小鼠免疫试验
1.采用间接ELISA法检测重组Knob蛋白和重组PB蛋白的抗体滴度
用间接ELISA法检测免疫小鼠血清中PB和Knob特异性抗体。总的来说，与对照组相比，用PB和Knob蛋白免疫的小鼠的抗体水平显著升高(p<0.01)(图3A)。PB蛋白免疫组和Knob蛋白免疫组的特异性抗体水平无显著差异，在免疫30天后达到高峰。这些数据表明，这两种蛋白都能诱导机体出现抗体反应，引起CAdV-1抗体水平显著升高。
2中和抗体的检测
免疫后21天、28天检测PB组和Knob组血清中和抗体。总的来说，接种PB蛋白的小鼠在免疫后21天和28天的中和抗体水平显著高于Knob组(p<0.05)和对照组(p<0.01)(图3B)。
3免疫小鼠脾脏细胞因子的调节
细胞因子是许多免疫反应的重要介质。为探讨重组蛋白对细胞因子调节的影响，于接种后21天检测小鼠血清中Th1型(IL-2)、Th2型(IL-4)和肿瘤坏死细胞因子(TNF-α)的产生。结果表明，PB组和Knob组的IL-4、IL-2和TNF-α浓度均较对照组显著升高(p<0.01)，PB组的IL-4浓度较Knob组显著升高(p<0.05)。IL-2和TNF-α的浓度在PB组和Knob组之间无显著性差异(图3C)。
4 T淋巴细胞分析
第2次免疫后21天，每组取5只小鼠进行脾淋巴细胞分离，用CCK-8法测定脾淋巴细胞增殖活性。分析结果表明，与对照组相比，PB组和Knob组的淋巴细胞增殖活性均显著升高(p<0.01)。PB组淋巴细胞增殖活性明显高于Knob组(p<0.05)(图3D)。说明PB组的免疫效果强于Knob组。
试验例2重组PB蛋白狐狸免疫和攻毒试验
采用实施例1制备的重组PB蛋白免疫银黑狐，设立狐狸脑炎活疫苗组和PBS对照组。一周之后二次免疫。免疫后30天，攻毒CAdV-1。检测攻毒后狐狸的体温，中和抗体水平，肛门拭子的排毒和攻毒后狐狸的存活率。
免疫实验结果：与对照组相比，PB组狐狸的血清抗体水平显著提高(图4A)。与对照组相比，PB组狐狸的血清中和抗体水平在21天和30天时显著提高(图4B。PB组狐狸的血清中IL-4和IL-2含量显著高于对照组(图4C,D)。PB组狐狸的淋巴细胞增殖活性高于对照组(图4E).
攻毒实验结果：狐狸免疫30天后攻毒CAdV-1，PB组狐狸的体温低于对照组(图4F)。CAdV-1攻毒后，PB组狐狸的肛门拭子中的CAdV-1DNA逐渐降低，且低于对照组(图4G)。CAdV-1攻毒后，PB组狐狸的存活率为100％(图4H)。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院特产研究所
<120> 犬I型腺病毒亚单位疫苗及其制备方法
<130> JL-2001-202012A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> Canine ade-novirus type 1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1434)
<400> 1
atg gag ttt ccg tcg tct cca ccc ccg tct tat gaa acg gtg atg gca 48
Met Glu Phe Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Tyr Glu Thr Val Met Ala
1               5                   10                  15
caa gtg cct tca atc ctg gca ccg ctg gta cct ccg cgg tat aaa ggg 96
Gln Val Pro Ser Ile Leu Ala Pro Leu Val Pro Pro Arg Tyr Lys Gly
            20                  25                  30
gct aca gaa gga aga aac agt att cgt tat tcc cag ctg ccg cct ttg 144
Ala Thr Glu Gly Arg Asn Ser Ile Arg Tyr Ser Gln Leu Pro Pro Leu
        35                  40                  45
ttt gac act aca aag ctg tac ctt att gac aac aag tct tca gac att 192
Phe Asp Thr Thr Lys Leu Tyr Leu Ile Asp Asn Lys Ser Ser Asp Ile
    50                  55                  60
cag gct ctc aac tac caa aat gac cac agt aac ttc ttg aca act gta 240
Gln Ala Leu Asn Tyr Gln Asn Asp His Ser Asn Phe Leu Thr Thr Val
65                  70                  75                  80
gtg caa aat gct aat tac aca ccc atg gaa gcc agc acc cag tct ata 288
Val Gln Asn Ala Asn Tyr Thr Pro Met Glu Ala Ser Thr Gln Ser Ile
                85                  90                  95
cag ctg gat gag cgt tcg cgc tgg ggt ggg gac ttt agg tcc att ctg 336
Gln Leu Asp Glu Arg Ser Arg Trp Gly Gly Asp Phe Arg Ser Ile Leu
            100                 105                 110
cat atg aac atg ccc aat gtg aca gag tat atg ttt agt aat agt ttt 384
His Met Asn Met Pro Asn Val Thr Glu Tyr Met Phe Ser Asn Ser Phe
        115                 120                 125
aag gca tat ctt cct gct acg gca gac gcg tct ggc aaa gtg ctc acc 432
Lys Ala Tyr Leu Pro Ala Thr Ala Asp Ala Ser Gly Lys Val Leu Thr
    130                 135                 140
tat gaa tgg tat aca tta acc att ccc gag ggc aat tat tct gag gtg 480
Tyr Glu Trp Tyr Thr Leu Thr Ile Pro Glu Gly Asn Tyr Ser Glu Val
145                 150                 155                 160
atg ctt ttg gac ctg ctc aat aat gca gta gtt gaa aac tac ctg gca 528
Met Leu Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Val Val Glu Asn Tyr Leu Ala
                165                 170                 175
cat gga cgt cag cat aat gtg aag gag gag gac att ggc ctc aag ttt 576
His Gly Arg Gln His Asn Val Lys Glu Glu Asp Ile Gly Leu Lys Phe
            180                 185                 190
gac aca aga aac ttt tat tta gga ttt gac cct gaa act gaa ttg gtc 624
Asp Thr Arg Asn Phe Tyr Leu Gly Phe Asp Pro Glu Thr Glu Leu Val
        195                 200                 205
atg cct ggt ttt tat act aac gag gca ttt cac cct gac ata ata ctg 672
Met Pro Gly Phe Tyr Thr Asn Glu Ala Phe His Pro Asp Ile Ile Leu
    210                 215                 220
agt cca ggc tgt gca gtg gat ttt acc cac agt agg ctt aac aac ttt 720
Ser Pro Gly Cys Ala Val Asp Phe Thr His Ser Arg Leu Asn Asn Phe
225                 230                 235                 240
tta ggc att aga aaa agg ctg ccc tac cag gag gga ttc ata att aaa 768
Leu Gly Ile Arg Lys Arg Leu Pro Tyr Gln Glu Gly Phe Ile Ile Lys
                245                 250                 255
tgg gaa gac cta cag ggt ggt aat att cca gcc ctg tta gac ttg gaa 816
Trp Glu Asp Leu Gln Gly Gly Asn Ile Pro Ala Leu Leu Asp Leu Glu
            260                 265                 270
att tac aac ccc gac act cca ggc gac aac atc aca cca cta cta caa 864
Ile Tyr Asn Pro Asp Thr Pro Gly Asp Asn Ile Thr Pro Leu Leu Gln
        275                 280                 285
gac tcc aag gcg agg tcc tat cat gtg ggc gaa gat ccc agc gcg ggc 912
Asp Ser Lys Ala Arg Ser Tyr His Val Gly Glu Asp Pro Ser Ala Gly
    290                 295                 300
agt acc ttc act tca tat cgc agc tgg ttt ctg gcc tat aac tat gga 960
Ser Thr Phe Thr Ser Tyr Arg Ser Trp Phe Leu Ala Tyr Asn Tyr Gly
305                 310                 315                 320
ccc gtc gat ggt atc aag agc aaa act gtt ttg gtg gct cct gac att 1008
Pro Val Asp Gly Ile Lys Ser Lys Thr Val Leu Val Ala Pro Asp Ile
                325                 330                 335
act tgc gga gtt gag caa att tac tgg agc ctg cca gat atg gcg gtg 1056
Thr Cys Gly Val Glu Gln Ile Tyr Trp Ser Leu Pro Asp Met Ala Val
            340                 345                 350
gat cca gta acc ttt act tct agt cat aat cct agc agc tac cca gtg 1104
Asp Pro Val Thr Phe Thr Ser Ser His Asn Pro Ser Ser Tyr Pro Val
        355                 360                 365
gta ggt aca gaa ctg tta cca tta cta ccc cga agt ttt tac aat gga 1152
Val Gly Thr Glu Leu Leu Pro Leu Leu Pro Arg Ser Phe Tyr Asn Gly
    370                 375                 380
tct tca gtg tac agc cag cta ttg caa gaa agc act gct caa aca cat 1200
Ser Ser Val Tyr Ser Gln Leu Leu Gln Glu Ser Thr Ala Gln Thr His
385                 390                 395                 400
gtt ttt aat cgc ttt cct gaa aat gcc att ctg aag agg cct cct gcc 1248
Val Phe Asn Arg Phe Pro Glu Asn Ala Ile Leu Lys Arg Pro Pro Ala
                405                 410                 415
cca aca att atc agc att agc gag aac gta ccc gcc ctc agt aac cat 1296
Pro Thr Ile Ile Ser Ile Ser Glu Asn Val Pro Ala Leu Ser Asn His
            420                 425                 430
ggg acg ctg ccc tta aaa aac aac att cct ggg gtg cag cgg gta acc 1344
Gly Thr Leu Pro Leu Lys Asn Asn Ile Pro Gly Val Gln Arg Val Thr
        435                 440                 445
att aca gat gca aga aga aga gtg tgt ccc tac gtg tac aaa agc ttg 1392
Ile Thr Asp Ala Arg Arg Arg Val Cys Pro Tyr Val Tyr Lys Ser Leu
    450                 455                 460
ggg gtc gtt gta cct cgc gtg ctg tcc agt aaa aca ttc tag 1434
Gly Val Val Val Pro Arg Val Leu Ser Ser Lys Thr Phe
465                 470                 475
<210> 2
<211> 477
<212> PRT
<213> Canine ade-novirus type 1
<400> 2
Met Glu Phe Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Tyr Glu Thr Val Met Ala
1               5                   10                  15
Gln Val Pro Ser Ile Leu Ala Pro Leu Val Pro Pro Arg Tyr Lys Gly
            20                  25                  30
Ala Thr Glu Gly Arg Asn Ser Ile Arg Tyr Ser Gln Leu Pro Pro Leu
        35                  40                  45
Phe Asp Thr Thr Lys Leu Tyr Leu Ile Asp Asn Lys Ser Ser Asp Ile
    50                  55                  60
Gln Ala Leu Asn Tyr Gln Asn Asp His Ser Asn Phe Leu Thr Thr Val
65                  70                  75                  80
Val Gln Asn Ala Asn Tyr Thr Pro Met Glu Ala Ser Thr Gln Ser Ile
                85                  90                  95
Gln Leu Asp Glu Arg Ser Arg Trp Gly Gly Asp Phe Arg Ser Ile Leu
            100                 105                 110
His Met Asn Met Pro Asn Val Thr Glu Tyr Met Phe Ser Asn Ser Phe
        115                 120                 125
Lys Ala Tyr Leu Pro Ala Thr Ala Asp Ala Ser Gly Lys Val Leu Thr
    130                 135                 140
Tyr Glu Trp Tyr Thr Leu Thr Ile Pro Glu Gly Asn Tyr Ser Glu Val
145                 150                 155                 160
Met Leu Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Val Val Glu Asn Tyr Leu Ala
                165                 170                 175
His Gly Arg Gln His Asn Val Lys Glu Glu Asp Ile Gly Leu Lys Phe
            180                 185                 190
Asp Thr Arg Asn Phe Tyr Leu Gly Phe Asp Pro Glu Thr Glu Leu Val
        195                 200                 205
Met Pro Gly Phe Tyr Thr Asn Glu Ala Phe His Pro Asp Ile Ile Leu
    210                 215                 220
Ser Pro Gly Cys Ala Val Asp Phe Thr His Ser Arg Leu Asn Asn Phe
225                 230                 235                 240
Leu Gly Ile Arg Lys Arg Leu Pro Tyr Gln Glu Gly Phe Ile Ile Lys
                245                 250                 255
Trp Glu Asp Leu Gln Gly Gly Asn Ile Pro Ala Leu Leu Asp Leu Glu
            260                 265                 270
Ile Tyr Asn Pro Asp Thr Pro Gly Asp Asn Ile Thr Pro Leu Leu Gln
        275                 280                 285
Asp Ser Lys Ala Arg Ser Tyr His Val Gly Glu Asp Pro Ser Ala Gly
    290                 295                 300
Ser Thr Phe Thr Ser Tyr Arg Ser Trp Phe Leu Ala Tyr Asn Tyr Gly
305                 310                 315                 320
Pro Val Asp Gly Ile Lys Ser Lys Thr Val Leu Val Ala Pro Asp Ile
                325                 330                 335
Thr Cys Gly Val Glu Gln Ile Tyr Trp Ser Leu Pro Asp Met Ala Val
            340                 345                 350
Asp Pro Val Thr Phe Thr Ser Ser His Asn Pro Ser Ser Tyr Pro Val
        355                 360                 365
Val Gly Thr Glu Leu Leu Pro Leu Leu Pro Arg Ser Phe Tyr Asn Gly
    370                 375                 380
Ser Ser Val Tyr Ser Gln Leu Leu Gln Glu Ser Thr Ala Gln Thr His
385                 390                 395                 400
Val Phe Asn Arg Phe Pro Glu Asn Ala Ile Leu Lys Arg Pro Pro Ala
                405                 410                 415
Pro Thr Ile Ile Ser Ile Ser Glu Asn Val Pro Ala Leu Ser Asn His
            420                 425                 430
Gly Thr Leu Pro Leu Lys Asn Asn Ile Pro Gly Val Gln Arg Val Thr
        435                 440                 445
Ile Thr Asp Ala Arg Arg Arg Val Cys Pro Tyr Val Tyr Lys Ser Leu
    450                 455                 460
Gly Val Val Val Pro Arg Val Leu Ser Ser Lys Thr Phe
465                 470                 475
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
gcgagctcat ggagtttccg tcgtctcca 29
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
acaggtcatt ttgtaagatc gacgtcaa 28

Claims (4)

1.犬I型腺病毒亚单位疫苗，其特征在于，以SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的抗原蛋白为活性成分。
2.按照权利要求1所述的犬I型腺病毒亚单位疫苗，其特征在于，含有免疫佐剂。
3.SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的抗原蛋白在制备防治犬Ⅰ型腺病毒所导致疾病的药物中的用途。
4.核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的基因在制备防治犬Ⅰ型腺病毒所导致疾病的药物中的用途。
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