CN107036866A - 一种可定量测定细菌分泌性溶血素活性的测定方法 - Google Patents

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李建军
吴建勇
杨学云
刘志强
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    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G01N21/3103—Atomic absorption analysis

Abstract

本发明属于生物实验方法的设计技术领域，具体涉及一种可定量测定细菌分泌性溶血素活性的测定方法，包括下述步骤：一、试剂及配制（一）血细胞保存液的制备；（二）缓冲生理盐水：贮存液制备；缓冲液制备；（三）1%绵羊红细胞制备及保存；（四）待测溶血素制备与保存；二、采用试管法进行测定操作（一）稀释溶血素；（二）配制溶血标准管；（三）溶血对照；（四）结果测定；或者二、采用微孔法进行测定操作（一）稀释溶血素；（二）配制溶血标准孔；（三）溶血对照；（四）结果测定。本测定方法能很好的定量测定细菌溶血素。

Description

一种可定量测定细菌分泌性溶血素活性的测定方法
技术领域
本发明属于生物实验方法的设计技术领域，具体涉及一种可定量测定细菌分泌性溶血素活性的测定方法。
背景技术
溶血素(hemolysin/haemolysin)，又称细胞溶素，是细菌分泌的能够使细胞溶解的毒素。溶血素属于穿孔毒素(pore-forming toxin)，又名攻膜毒素(Membranedisrupting type)。1981年，Fussle等人首次提出穿孔毒素的定义即跨细胞膜形成孔道的细菌蛋白毒素。根据溶血素结构、与结合细胞的方式、孔道形成机制和引起靶细胞反应的不同，又将众多溶血素分别归为重复子毒素家族(Repeats in toxin family，RTX)、硫醇活性胆固醇结合细胞溶素家族(Family of thiol-activated,cholesterol-bindingcytolysin)。还有个别溶血素未能归入家族当中，如葡萄球菌α-溶血素。虽然各种溶血素都存在一定的差异，但是它们之间还有很多共同特征：(1)分子结构都是单链多肽蛋白。(2)蛋白都由质粒编码。(3)溶血素都有溶解细胞作用。(4)作用机制都是以低聚物形式结合在细胞膜上形成孔道，进入细胞。(5)序列有一定的相似性，尤其同一家族溶血素分子结构、氨基酸序列更加相似。
据资料显示，现在大部分与兽医(医)学相关的病原体都可产生穿孔毒素蛋白，而这些蛋白很多已经被指定为溶血素，因为它们能溶解红细胞。很多革兰氏阳性菌和阴性菌都产生溶血素，溶血素不同于其他通过哺乳动物靶细胞内化的毒素，而是作用于细胞膜，造成其结构和功能的紊乱，使大量细胞内的成分泄漏，导致细胞死亡。溶血素不仅溶解红细胞，还损害其它多种类型的真核细胞，包括血小板、成纤维细胞、心肌细胞、单核细胞、粒细胞、内皮细胞等。此外，一些溶血素是公认的毒力因子，可使细菌产生致病力。
研究显示突变菌株分泌物失去了它们原有的孔道形成功能以后，在动物试验中显示了显著的毒力下降，如α-溶血素、E.coli溶血素和PLY。α-溶血素抗体可以明显的保护动物抵御金黄色葡萄球菌的各种感染。一些细菌的主要毒力因子即为溶血素，如猪链球菌溶血素(suilysin，SLY)和李斯特菌溶血素(1isteriolysin，LLO)，肠溶血素(Enterohaemolysin，Ehx)也是大肠杆菌O157毒力增强的原因之一。因此，溶血素可以作为评价细菌毒力的重要指标。
同时，细胞溶素对某些微生物的致病性有决定意义。分泌溶血素的细菌在中国并不罕见。安徽、福建、贵州、江苏、河南等地区都在采样时分离到了大肠杆菌O157菌株。猪链球菌近年来也时有发生，特别是2005年中国四川爆发的II型猪链球菌病，造成了感染人员的死亡，对畜牧业危害极大并引起群众恐慌，猪溶血素(suilysin)为该菌主要致病因子之一。另外，国内有关动物单核细胞增生李斯特菌病例的报道近年来也逐渐增多，波及全国十多个省市。作为一种重要的食源性传染病的致病菌，该菌能导致人和动物严重的致死性疾病，是通过其主要致病因子溶血素(1isteriolysin)作用于内皮细胞，导致细胞因子变化而产生致病作用。
目前对细菌溶血素的定性测定的方法很多，最简单的如5％绵羊血培养皿，培养24-48h后观察溶血情况，PCR方法检测细菌携带的各溶血素基因等，尚无报道溶血素的定量检测方法，尤其是对细菌外分泌性溶血素总量的检测。
本研究利用细菌分泌的溶血素可以溶解(穿孔)绵羊血红细胞的特点，将引起50％红细胞溶血所需的最小溶血素量定义为一个VH50U，可计算出待测细菌液体培养时上清中分泌的溶血素的量，以VH50U/mL表示，该方法可以用于反映细菌液体培养时外分泌性溶血素的总量，培养条件对细菌分泌性溶血素产量的影响和通过比较同一种不同菌株分泌的溶血素产量初步比较其毒力差异。
发明内容
本发明的目的在于：设计一种测定方法，能很好的定量测定细菌溶血素。
本发明的技术方案：一种可定量测定细菌分泌性溶血素活性的测定方法，该测定方法包括下述步骤：
一、试剂及配制
(一)血细胞保存液的制备：葡萄糖2.05g；柠橡酸钠0.8g；氯化钠0.42g；蒸馏100mL，以上成分混匀溶解后，用柠檬酸调节pH为6.1，115℃湿热灭菌15min，4℃保存备用；
(二)缓冲生理盐水：贮存液制备：十二水磷酸氢二钠2.85g；磷酸二氢钾0.27g；氯化钠17.00g；加蒸馏水至100毫升，4℃保存备用；缓冲液制备：5毫升贮存液加95毫升蒸馏水，再加10％硫酸镁0.1毫升，当日配制12小时内使用；
(三)1％绵羊红细胞制备及保存：
无菌采取绵羊血液于在等量的血细胞保存液中，4±2℃保存备用；使用前以3-10倍体积的缓冲液洗3次，1500转/分钟，前两次离心5min，最后一次10min，吸弃上清液，并使用缓冲液配成1％红细胞液，4±2℃可储存24小时备用；
(四)待测溶血素制备与保存
细菌液体培养物1-5mL，4℃，5000-8000×g离心5-10分钟，取上清，-20℃保存；
二、采用试管法进行测定操作
(一)稀释溶血素：待测溶血素50μL，加缓冲液5mL，稀释度为1:100；
(二)配制溶血标准管：1％绵羊红细胞1.6mL加2.4mL蒸馏水，混匀，即为全溶血管；取全溶血管液2mL加缓冲液2mL，即为50％溶血管；
(三)按下表所示，稀释的待测溶血素、缓冲液和红细胞依次加入试管中，混匀，置37℃水浴30分钟；第0管为非溶血对照；
细菌溶血素VH50测定试管法
(四)结果测定：取出试管，1500rpm/min离心2-5分钟，对照管应不溶血；肉眼比色，选与50％溶血标准管相近二管，再用分光光度计测，波长542nm、0.5cm比色杯OD值，确定与标准管最接近者为终点管，然后按下公式计算：细菌溶血素量(VH50U/mL)＝(1,000/VH50溶血素用量)×稀释度即可完成测定；
或者二、采用微孔法进行测定操作
(一)稀释溶血素：待测溶血素50μL，加缓冲液5mL，稀释度为1:100；
(二)配制溶血标准孔：1％绵羊红细胞800μL加1200μL蒸馏水，混匀，即为全溶血孔，取250μL加入全溶血孔；取全溶血孔液600μL加缓冲液600μL，即为50％溶血孔，取250μL加入50％溶血孔；
(三)按下表所示，稀释的待测溶血素、缓冲液和红细胞依次加入“V”型底微孔板的反应孔中，混匀，置37℃水浴30分钟；第0管为非溶血对孔；每个孔做三个以上复孔；
微孔法测定细菌溶血素VH50
(四)结果测定：取出微孔板，1500rpm/min离心5分钟，另取“U”型底微孔板，每孔吸取100μL到对应的“U”型底微孔板中，对照孔应不溶血；用分光光度计测，波长542nmOD值，计算复孔平均值，确定与标准50％溶血孔第一接近孔为终点孔，与终点孔紧邻且与标准50％溶血管的OD542值第二接近孔为次终点孔，根据终点孔和次终点孔建立Y＝aX+b线性方程，其中X为待测溶血素添加量，根据标准50％溶血管的OD542值计算待测溶血素用量；然后按下公式计算：细菌溶血素量(VH50U/mL)＝(1,000/VH50溶血素用量)×稀释度即可完成测定。
有益效果：利用细菌分泌的溶血素可以溶解(穿孔)绵羊血红细胞的特点，当红细胞和细菌产生的溶血素量一定时，在规定反应的时间内，红细胞溶解数量与溶血素蛋白分泌量量呈正相关。在接近50％溶血(VH50)时，二者之间近似直线关系，将50％红细胞溶血作为敏感的判断终点。定义引起50％红细胞溶血所需的最小溶血素量为一个VH50U，可计算出待测细菌液体培养时上清中分泌的溶血素的量，以VH50U/mL表示。
本方法中列举的用于定量测定细菌分泌性溶血素活性的试管法可以用于少量样本测试；列举的用于定量测定细菌分泌性溶血素活性的微孔法可用于大量样本的快速测定。用该方法可以定量测定细菌液体培养时外分泌性溶血素的产量，培养条件对细菌分泌性溶血素产量的影响和通过比较同一种不同菌株分泌的溶血素产量初步比较其毒力差异。
具体实施方式
实施例1、一种可定量测定细菌分泌性溶血素活性的测定方法，该测定方法包括下述步骤：
一、试剂及配制
(一)血细胞保存液的制备：葡萄糖2.05g；柠橡酸钠0.8g；氯化钠0.42g；蒸馏100mL，以上成分混匀溶解后，用柠檬酸调节pH为6.1，115℃湿热灭菌15min，4℃保存备用；
(二)缓冲生理盐水：贮存液制备：十二水磷酸氢二钠2.85g；磷酸二氢钾0.27g；氯化钠17.00g；加蒸馏水至100毫升，4℃保存备用；缓冲液制备：5毫升贮存液加95毫升蒸馏水，再加10％硫酸镁0.1毫升，当日配制12小时内使用；
(三)1％绵羊红细胞制备及保存：
无菌采取绵羊血液于在等量的血细胞保存液中，4±2℃可保存3周；使用前以3-10倍体积的缓冲液洗3次，1500转/分钟，前两次离心5min，最后一次10min，吸弃上清液，并使用缓冲液配成1％细胞悬液，制备好的红细胞液4±2℃可储存24小时备用；
(四)待测溶血素制备与保存
细菌液体培养物1-5mL，4℃，5000-8000×g离心5-10分钟，取上清，-20℃保存；
二、采用试管法进行测定操作
(一)稀释溶血素：待测溶血素50μL，加缓冲液5mL，稀释度为1:100；
(二)配制溶血标准管：1％绵羊红细胞1.6mL加2.4mL蒸馏水，混匀，即为全溶血管；取全溶血管液2mL加缓冲液2mL，即为50％溶血管；
(三)按下表所示，稀释的待测溶血素、缓冲液和红细胞依次加入试管中，混匀，置37℃水浴30分钟；第0管为非溶血对照；
细菌溶血素VH50测定试管法
(四)结果测定：取出试管，1500rpm/min离心2-5分钟，对照管应不溶血；肉眼比色，选与50％溶血标准管相近二管，再用分光光度计测，波长542nm、0.5cm比色杯OD值，确定与标准管最接近者为终点管，然后按下公式计算：细菌溶血素量(VH50U/mL)＝(1,000/VH50溶血素用量)×稀释度即可完成测定；
例如第3管为终点管：细菌溶血素量(VH50U/mL)＝(1,000/100)×100，待测溶血素的量为1,000VH50U/mL。
为使结果更为精确，可根据标准50％溶血管的OD542值，选择终点管(第3管)，在第2、4号管中选取最接近标准50％溶血管OD542值，建立Y(OD542值)＝aX(待测溶血素添加量)+b线性方程，根据标准50％溶血管的OD542值计算待测溶血素添加量。
或者
缩小待测溶血素量梯度，即第3管(100μL)为终点管或结果介于第3管与第4管之间，设置60、80、100、120、140、160μL，见下表，按照上述方法再次测定。
细菌溶血素VH50测定试管法(精细)
实施例2、与实施例1具有相同的步骤一，步骤二采用微孔法进行测定操作
(一)稀释溶血素：待测溶血素50μL，加缓冲液5mL，稀释度为1:100；
(二)配制溶血标准孔：1％绵羊红细胞800μL加1200μL蒸馏水，混匀，即为全溶血孔，取250μL加入全溶血孔；取全溶血孔液600μL加缓冲液600μL，即为50％溶血孔，取250μL加入50％溶血孔；
(三)按下表所示，稀释的待测溶血素、缓冲液和红细胞依次加入“V”型底微孔板的反应孔中，混匀，置37℃水浴30分钟；第0管为非溶血对孔；每个孔做三个以上复孔；
微孔法测定细菌溶血素VH50
(四)结果测定：取出微孔板，1500rpm/min离心5分钟，另取“U”型底微孔板，每孔吸取100μL到对应的“U”型底微孔板中，对照孔应不溶血；用分光光度计测，波长542nmOD值，计算复孔平均值，确定与标准50％溶血孔第一接近孔为终点孔，与终点孔紧邻且与标准50％溶血管的OD542值第二接近孔为次终点孔，根据终点孔和次终点孔建立Y＝aX+b线性方程，其中X为待测溶血素添加量，根据标准50％溶血管的OD542值计算待测溶血素用量；然后按下公式计算：细菌溶血素量(VH50U/mL)＝(1,000/VH50溶血素用量)×稀释度即可完成测定。
实施例3、金黄色葡萄球菌分泌性溶血素活性的定量测定
金黄色葡萄球菌可分泌α、β、γ、δ、ε等溶血素，不同菌株分泌溶血素的量和溶血素蛋白的活性存在差异。
1.材料方法
1.1菌株：新疆野外分离株XJ69、XJNA10、XJ92、XJ50和XJCP-1
1.2培养：50％甘油保存菌种，取50μL直接加入4mL哥伦比亚液体培养基中，37℃，170rpm振摇培养20h。
2.溶血素定量测定
按照实施例1的试管法操作步骤进行。
3.结果
金黄色葡萄球菌分泌性溶血素活性的测定
实施例4、培养条件对金黄色葡萄球菌分泌性溶血素产量的影响
金黄色葡萄球菌可分泌α、β、γ、δ、ε等溶血素，同一菌株在不同培养条件(培养基、培养时间、气体环境等)下分泌溶血素的量和活性存在差异，通过测定细菌分泌的溶血素的VH50U/mL可以比较不同培养条件对细菌分泌溶血素的影响。
1.材料方法
1.1菌株：新疆野外分离株XJ69、XJ92和XJ50
1.2培养：选择哥伦比亚液体培养基、马丁肉汤、脑心浸汤、LB液体四种培养基，其它培养条件相同，37℃，170rpm振摇培养20h。将各菌种均接种(50μL)到以上5种培养基(4mL)中，如下表：
2.前处理
按照以下流程进行准备：
(1)分别取各菌株不同培养基均匀培养物1mL，4℃，5,000-8,000×g离心1-2分钟，去上清；
(2)清洗，使用等体积应用液重悬，按照上述条件离心，弃去上清；
(3)重复步骤(2)2-3次；
(4)使用等体积应用液重悬，并稀释5～20倍，测定OD值(波长600nm)，使稀释后OD600值介于0.2～0.8，否则继续稀释；
(5)计算同一菌株在不同培养基中的OD600，OD600＝OD600(测定值)×稀释倍数；并确定同一菌株在不同培养基中培养后最大和最小OD600；
(6)以1mL最小OD600培养基的培养物为参考，取其它培养基培养物(X mL)并使用缓冲液补足到1mL，此时OD600值与参考一致。
X(取样量(mL))＝最小OD600培养物/取样培养物OD600
(7)将上述1mL调整后的培养物，5,000-8,000×g离心5-10分钟，取上清，-20℃保存。
2.溶血素测定
按照实施例2的微孔法操作步骤进行。
3.结果
相同培养条件下，不同金黄色葡萄球菌菌株在各培养基中分泌溶血素活性的测定
实施例5、通过不同金黄色葡萄球菌菌株分泌的溶血素活性的差异评价其毒力
大多数细菌(人和动物致病菌)可以分泌多种致病因子(毒素)，其中溶血素是其主要的致病因子，通过测定其分泌的溶血素的VH50U/mL可以初步比较不同菌株的毒力差异。
金黄色葡萄球菌可分泌多种致病因子，其中α、β、γ、δ、ε等溶血素是其主要的致病因子，不同菌株在相同培养条件下(培养基、培养时间、气体环境等一致)下分泌溶血素的量和活性存在差异，通过测定不同菌株分泌的溶血素的VH50U/mL可以初步比较不同菌株的毒力差异。
1.材料方法
1.1菌株：新疆野外分离株XJ69、XJNA10、XJ92和XJ50，通过小鼠的人工感染试验已确定其毒力为XJ69、XJNA10>XJ92>XJ50。
1.2培养
50％甘油保存菌种，取50μL直接加入4mL哥伦比亚液体培养基中，37℃，170rpm振摇培养20h。
2.测定前处理
按照以下流程进行准备：
(1)分别取各菌株均匀培养物1mL，4℃，5,000-8,000×g离心1-2分钟，去上清；
(2)清洗，使用等体积PBS(pH 7.2±0.2)重悬，按照上述条件离心，弃去上清；
(3)重复步骤(2)2-3次；
(4)使用等体积PBS(pH 7.2±0.2)重悬，并稀释5～20倍，测定OD值(波长600nm)，使稀释后OD600值介于0.2～0.8，否则继续稀释；
(5)计算不同菌株的OD600，OD600＝OD600(测定值)×稀释倍数；并确定最大和最小OD600；
(6)重新取1mL最小OD600的均匀培养物并作为参考，重新取其它菌株的均匀培养物(XmL)并使用缓冲液补足到1mL，此时OD600值与参考一致。
X取样量(mL)＝最小OD600培养物/取样培养物OD600
(7)将上述1mL调整后的培养物，5,000-8,000×g离心5-10分钟，取上清，-20℃保存。
2.溶血素测定
按照实施例1的试管法操作步骤进行。
3.结果
金黄色葡萄球菌分泌溶血素活性的测定
与通过小鼠的人工感染试验已确定的毒力比较结果XJ69、XJNA10>XJ92>XJ50基本一致。

Claims (1)

1.一种可定量测定细菌分泌性溶血素活性的测定方法，其特征在于：该测定方法包括下述步骤：
一、试剂及配制
(一)血细胞保存液的制备：葡萄糖2.05g；柠橡酸钠0.8g；氯化钠0.42g；蒸馏100mL，以上成分混匀溶解后，用柠檬酸调节pH为6.1，115℃湿热灭菌15min，4℃保存备用；
(二)缓冲生理盐水：贮存液制备：十二水磷酸氢二钠2.85g；磷酸二氢钾0.27g；氯化钠17.00g；加蒸馏水至100毫升，4℃保存备用；缓冲液制备：5毫升贮存液加95毫升蒸馏水，再加10％硫酸镁0.1毫升，当日配制12小时内使用；
(三)1％绵羊红细胞制备及保存：
无菌采取绵羊血液置于等量的血细胞保存液中，4±2℃保存备用；使用前以3-10倍体积的缓冲液洗3次，1500转/分钟，前两次离心5min，最后一次10min，吸弃上清液，并使用缓冲液配成1％绵羊红细胞液，4±2℃可储存24小时备用；
(四)待测溶血素制备与保存
细菌液体培养物1-5mL，4℃，5000-8000×g离心5-10分钟，取上清，-20℃保存；
二、采用试管法进行测定操作
(一)稀释溶血素：待测溶血素50μL，加缓冲液5mL，稀释度为1:100；
(二)配制溶血标准管：1％绵羊红细胞1.6mL加2.4mL蒸馏水，混匀，即为全溶血管；取全溶血管液2mL加缓冲液2mL，即为50％溶血管；
(三)按下表所示，稀释的待测溶血素、缓冲液和红细胞依次加入试管中，混匀，置37℃水浴30分钟；第0管为非溶血对照；
细菌毒素VH50测定试管法
(四)结果测定：取出试管，1500rpm/min离心2-5分钟，对照管应不溶血；肉眼比色，选与50％溶血标准管相近二管，再用分光光度计测，波长542nm、0.5cm比色杯OD值，确定与标准管最接近者为终点管，然后按下公式计算：细菌溶血素量(VH50U/mL)＝(1,000/VH50溶血素用量)×稀释度即可完成测定；
或者二、采用微孔法进行测定操作
(一)稀释溶血素：待测溶血素50μL，加缓冲液5mL，稀释度为1:100；
(二)配制溶血标准孔：1％绵羊红细胞800μL加1200μL蒸馏水，混匀，即为全溶血孔，取250μL加入全溶血孔；取全溶血孔液600μL加缓冲液600μL，即为50％溶血孔，取250μL加入50％溶血孔；
(三)按下表所示，稀释的待测溶血素、缓冲液和红细胞依次加入“V”型底微孔板的反应孔中，混匀，置37℃水浴30分钟；第0管为非溶血对孔；每个孔做三个以上复孔；
微孔法测定细菌溶血素VH50
(四)结果测定：取出微孔板，1500rpm/min离心5分钟，另取“U”型底微孔板，每孔吸取100μL到对应的“U”型底微孔板中，对照孔应不溶血；用分光光度计测，波长542nmOD值，计算复孔平均值，确定与标准50％溶血孔第一接近孔为终点孔，与终点孔紧邻且与标准50％溶血管的OD542值第二接近孔为次终点孔，根据终点孔和次终点孔建立Y＝aX+b线性方程，其中X为待测溶血素添加量，根据标准50％溶血管的OD542值计算待测溶血素用量；然后按下公式计算VH50值：细菌溶血素量(VH50U/mL)＝(1,000/VH50溶血素用量)×稀释度即可完成测定。
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