CN103320355A - 一种游动放线菌菌株及其在制备非达霉素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种游动放线菌菌株，以及该菌株在非达霉素生产中的应用。本发明提供的游动放线菌菌株为植物内生的游动放线菌（Actinoplanessp.）N12W0304，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC），保藏时间为2012年12月26日，保藏编号为CGMCCNo.7043。非达霉素的生产步骤为：制备动放线菌N12W0304的种子液与发酵液，发酵液经过离心得到菌丝体，菌丝体通过浸提、浓缩、溶解、过滤、树脂吸附、干燥得到非达霉素晶体粗品；将粗品再溶解，溶解液经液相色谱分离、减压蒸干，得非达霉素精品。在本发明提供的发酵条件下，菌株的非达霉素发酵单位大于1400mg/L，远高于目前已见报道的非达霉素发酵产量。本发明介绍的非达霉素分离工艺简便，适于工业化生产，产物总收率可达到60%。

Description

一种游动放线菌菌株及其在制备非达霉素中的应用

技术领域

本发明涉及微生物及其在制药领域中的应用。具体地说是游动放线菌及其在制备非达霉素中的应用。 

背景技术

非达霉素是由放线菌发酵产生的一类18元环大环内酯类抗生素，其主要是通过抑制细菌的RNA聚合酶而迅速产生抗难治梭状芽孢杆菌感染（CDI）作用。其治疗CDI优于现有药物。目前发现的非达霉素产生菌主要为指孢囊菌属（Dactylosporangium sp.）橙指孢囊菌哈姆登亚种（D.aurantiacum subsp.hamdenensis）NRRL18085菌株和游动放线菌属（Actinoplanes sp.）德干高原游动放线菌（A.deccanensis）ATCC21983菌株。目前有关非达霉素的研究主要涉及非达霉素的化学结构、剂型、晶型、用途、组合物，如CN200580048715.3、WO2009070779A1、USP 7906489B2、USP 7378508B2、USP 7863249B2等专利文献都是针对上述课题所作的研究。WO2007048059A2是针对非达霉素发酵菌株和发酵方法的为数不多的专利文献，但其发酵单位仅为50mg/L左右。由此可见，寻找非达霉素高效菌株、提高非达霉素发酵产量已成为人们亟待解决的重要课题之一。 

发明内容

本发明的目的就是提供一种非达霉素高效菌株，同时提供一种该菌株在制备非达霉素中的应用方法，以期有效提高非达霉素的发酵产量。 

本发明所提供的非达霉素高效菌株为游动放线菌菌株，其保藏名称为游动放线菌（Actinoplanes sp.）N12W0304，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期2012年12月26日，保藏编号为CGMCC No.7043，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

本发明所提供的游动放线菌株（Actinoplanes sp.）N12W0304，其在ISP2、ISP4、ISP5、ISP6、ISP7等不同培养基平板上菌落呈现肉色至浅粉色不同颜色，基丝生长良好、不断裂，无气丝，基丝上生有不规则状孢囊。 

本发明所提供的非达霉素高效菌株分离自仙鹤草叶样品的野生菌株，仙鹤草样品采集自云南（北纬23°22′39.648"，东经104°47′17.0808"，海拔1498.7432m），样品采集后保存于4℃， 并尽快分离。仙鹤草样品经自来水多次冲洗除去表面泥土后，在无菌条件下采用次氯酸钠、75%乙醇等进行表面消毒，表面消毒后的仙鹤草样品经无菌滤纸充分吸干水分，在无菌条件下粉碎后撒在分离培养基平板上，于28℃培养3-6周，待放线菌菌落长出后，挑取至高氏一号培养基（阮继生,刘志恒,梁丽糯,等.放线菌研究及应用[M].北京:科学出版社,1990:2-18），纯化后培养于ISP2斜面培养基。 

采用本发明所述应用方法，其非达霉素的发酵单位可达到1200mg/L以上。故其可在制备非达霉素中得到应用。 

本发明所提供的游动放线菌株在制备非达霉素中的应用方法，包括以下步骤： 

a、制备游动放线菌N12W0304种子液： 

将菌株N12W0304的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，27-34℃、转速180-220rpm培养48-72h获得种子液； 

其中所说的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-40.0克、葡萄糖0.5-5.0克，蛋白胨1.0-10.0克、牛肉膏1.0-10.0克、酵母浸粉1.0-10.0克，加水定容至1000ml；pH值7.0-7.2，121℃灭菌30min； 

b、制备游动放线菌的发酵液： 

将上述种子液以体积百分比5-15%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵温度28-32℃、发酵时间96-168h；，得发酵液； 

其中所说的发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖30.0-50.0克、脱脂大豆粉10.0-30.0克、牛肉膏1.0-10.0克、K₂HPO₄0.1-1.0克、FeSO₄·7H₂O0.1-1.0克、MgSO₄·7H₂O0.1-1.0克、NaCl1.0-5.0克、豆油1.0-2.0克，加水定容至1000ml，pH值7.0-7.5，121℃灭菌30min； 

c、将上述发酵液进行离心10-20min，弃去上清液，获得菌丝体； 

d、用有机溶剂对菌丝体浸提2-4次，每次2-4h，合并浸提液，减压浓缩，除去有机溶剂，得到浓缩液； 

e、浓缩液加入体积比浓度为10-25%的有机溶剂水溶液，搅拌5-25min，过滤，获得滤液； 

f、上述滤液导入大孔树脂，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集含非达霉素的流出液，减压浓缩，除去有机溶剂，剩余物用乙酸乙酯溶液萃取2-4次，合并萃取液，减压蒸干，获得非达霉素粗品； 

以上所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮中的任意一种。 

本发明方法再获得非达霉素粗品后，将非达霉素粗品再溶于有机溶剂中，用0.45μm滤 膜过滤后，高效液相色谱分离；色谱条件：制备柱为Daisogel-C1830×250mm10μm；流动相为体积比57%的乙腈水溶液、含0.05%的三氟乙酸；流速40ml/min；UV254nm检测，接收符合非达霉素色谱峰的流出液，合并，减压浓缩蒸干，由此获得非达霉素精品。 

本发明方法中所述的摇瓶发酵，其转速优选180-220rpm； 

所述的发酵罐发酵，其发酵优选条件为：罐压0.05±0.01Mpa、通气量10-30L/min，搅拌速度400-500rpm。 

所述的步骤d中的减压浓缩，其优选温度为30-50℃。 

所述步骤e中有机溶剂水溶液，其加入量与浓缩液的体积比优选1:8-15。 

所述的步骤f中的大孔树脂优选HP-20、XAD-16、XAD-1600、HZ816、D312、D101、AB-8中的一种。 

所述有机溶剂梯度洗脱，其梯度洗脱时有机溶剂的质量比浓度依次为20%、40%、60%。 

上述优选条件，其所获得的非达霉素产量更高。 

采用本发明所提供的游动放线菌菌株N12W0304，用于制备为非达霉素，其发酵单位高。且发酵组分较为单一，易于分离纯化，适于工业化生产。 

本发明所述应用，其非达霉素产物总收率可达到60%以上。 

附图说明

图1为本发明所提供的游动放线菌菌株N12W0304在ISP2培养基上培养14d的形态（光学显微镜，100×）。 

图2为本发明所提供的游动放线菌菌株N12W0304在ISP2培养基上培养14d的形态（扫描电子显微镜，5000×）。 

图3为本发明所提供的游动放线菌菌株N12W0304发酵液的HPLC分析图。 

图4为本发明所制备的非达霉素的紫外光谱图。 

图5为本发明所制备的非达霉素的ESI-MS图。 

图6为本发明所制备的非达霉素的¹H-NMR图。 

图7为本发明所制备的非达霉素的¹³C-NMR图。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 

下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市购产品。 

实施例1菌株的分离及鉴定 

1、菌株分离 

仙鹤草样品采集自云南（北纬23°22′39.648"，东经104°47′17.0808"，海拔1498.7432m），样品采集后保存于4℃，并迅速进行菌株的分离。 

仙鹤草样品经自来水多次冲洗除去表面泥土后，在无菌条件下依次采用如下程序进行表面消毒：0.01%Tween-20处理1min，有效氯含量为4.5%-5%的次氯酸钠处理3min，无菌2.5%硫代硫酸钠处理10min，75%乙醇处理5min，无菌水清洗3-4次，无菌10%碳酸氢钠浸泡10min。表面消毒后的仙鹤草样品经无菌滤纸充分吸干水分，在无菌条件下粉碎后撒在分离培养基平板上，于28℃培养3-6周，待放线菌菌落长出后，挑取至高氏一号培养基（阮继生,刘志恒,梁丽糯,等.放线菌研究及应用[M].北京:科学出版社,1990:2-18），纯化后培养于ISP2斜面培养基。 

分离及纯化培养基：采用5种分离培养基，分别为文献（Coombs JT,Franco CMM.Isolation and identification of actinobacteria from surface-sterilized wheat roots[J].Appl Environ Microbiol,2003,69:5603-5608）中的自来水酵母粉琼脂（TWX9）、酵母酪素琼脂（YECD），文献（Hayakawa MT,Nonomura H.Humic acid-vitamin agar,a new method for the selective isolation of soil actinomycetes[J].J Ferment Bioeng,1987,65:501-509）中的腐植酸维生素琼脂（HV），文献（Castillo U,Giles S,Strobel GA,et al.Scanning electron microscopy of some endophytic streptomycetes in snakevine-Kennedia nigriscans[J].Scanning,2005,27:73）中的1/10营养琼脂（NA）、水琼脂（WA）培养基。其中，除了WA外，其余培养基均补充放线菌酮和制霉菌素各50μg/mL。纯化采用高氏一号培养基。 

菌株N12W0304在ISP2斜面培养基上28℃培养14d左右，用20%甘油保存菌体于-80℃。 

2、菌株鉴定 

(1)形态观察 

菌株在ISP2、ISP4、ISP5、ISP6、ISP7等不同培养基平板上28℃培养14d，菌落呈现肉色至浅粉色不同颜色，基丝生长良好、不断裂，无气丝，基丝上生有不规则状孢囊（图1）。 

(2)培养特征 

将菌株N12W0304接种在ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6、ISP7等不同培养基平板上，于28℃培养，分别于7d、14d、21d观察其生长情况。菌株在不同培养基上的培养状态如表1所示。 

表1、菌株N12W0304在不同培养基上的生长状态（14d） 

培养基

生长

基丝

气丝

可溶性色素

[0052] 

ISP2	+++	I51’肉色	无	无
					ISP3	+	III14’瓜瓤粉	无	无
ISP4	+++	III17’金叶黄	无	无
					ISP5	++	III12’落英淡粉	无	无
ISP6	++	III13’淡粉	无	无
					ISP7	++	X76’乌梅紫	无	VII77’酱紫

注：+++表示生长很好，++表示生长良好，+表示生长一般。 

(3)菌株的生理生化特征 

参考《放线菌系统学》（徐丽华,李文均,刘志恒,等.放线菌系统学——原理、方法及实践[M].北京:科学出版社,2007）进行生理生化特征实验。 

菌株N12W0304对葡萄糖、蔗糖利用最好，阿拉伯糖、鼠李糖次之，对甘露糖、果糖利用较差，不利于木糖、纤维素。氧化酶实验阳性，过氧化氢酶实验阴性，尿酶实验阴性，明胶液化，牛奶凝固阴性，淀粉水解阳性，硝酸盐还原阳性，不产H₂S。 

(4)细胞壁化学组成 

采用微晶纤维素薄层层析法进行全细胞氨基酸及全细胞水解液糖型分析。菌株N12W0304全细胞水解液含meso-DAP、甘氨酸，细胞壁类型II型，全细胞糖型D型（木糖和阿拉伯糖）。 

实施例250L罐发酵非达霉素的制备 

(a)制备游动放线菌菌株N12W0304种子液 

将游动放线菌菌株N12W0304接种于种子培养基，32℃、转速220rpm培养48h获得种子液。 

种子培养基的制备方法为：玉米淀粉40.0克、葡萄糖4.0克，蛋白胨8.0克、牛肉膏5.0克、酵母浸粉5.0克，加自来水溶解、定容至1000ml，pH值7.0-7.2，121℃灭菌30min。 

(b)制备游动放线菌的发酵液 

将种子液以体积百分比10%的接种量接种装有发酵培养基的50L发酵罐，罐温28℃、罐压0.05±0.01Mpa、通气量20L/min，400rpm搅拌，发酵120h。 

发酵培养基的制备方法为：葡萄糖30.0克、脱脂大豆粉15.0克、牛肉膏3.0克、K₂HPO₄0.6克、FeSO₄·7H₂O0.6克、MgSO₄·7H₂O0.6克、NaCl4.0克、豆油1.5克，加自来水溶解定容至1000ml，pH值7.0-7.5，121℃灭菌30min。 

(c)取上述发酵液35L，3000rpm离心，上清弃去，获得菌丝体约2.6L。 

(d)菌丝体中加入13L乙醇，浸泡4h，浸提2次，合并浸提液，40℃减压浓缩至无乙醇，得到浓缩液约1L。 

(e)浓缩液加入10L的体积比浓度为20%的乙醇溶液，搅拌10min，无纺布过滤，获得滤液。 

(f)上述滤液上样导入HZ816大孔树脂，分别以2倍体积的、体积比浓度为依次为20%、40%、60%的乙醇溶液进行梯度洗脱，经检测，待含非达霉素的流出液流出时，有收集流出液。 

(g)将上述收集的流出液，在40℃条件下，减压浓缩，蒸去乙醇后，剩余物以3倍体积乙酸乙酯溶液萃取2次，合并乙酸乙酯相萃取液，减压蒸干，获得非达霉素粗品51.8g。 

实施例3精制非达霉素 

将实施例2所制备的非达霉素粗品51.8g溶于400ml甲醇中，0.45μm滤膜过滤后，采用HPLC分离。制备柱，Daisogel-C1830×250mm 10μm；流动相，57%乙腈水，含0.05%三氟乙酸；流速40ml/min；UV254nm检测。接非达霉素色谱峰（RT≈15～17min）的流出液合并，减压浓缩，得产物—非达霉素精品26.6g，含量97.0%，总收率61.4%。 

对产物进行鉴定，其结果如下： 

(1)外观：所制备的产物以白色粉末、玻璃状透明固体、结晶性粉末状态存在。 

(2)溶解性：所制备的产物溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯，难用于水、正己烷。 

(3)紫外光谱 

所制备的产物紫外光谱如图4所示。在230.9nm、268.6nm、320.0nm处有最大吸收峰，与文献报道的非达霉素的紫外光谱特征一致。 

(4)质谱 

所制备的产物ESI-MS图谱如图5所示。其分子离子峰[M+NH₄]⁺为1174.22，[M-H]^-为1105.02，与文献报道的非达霉素的结果一致。 

(5)核磁共振信号归属以及与文献的比较 

核磁共振测试仪器为Varian Inova500MHz，所制备的产物¹³C信号归属及与文献报道的比较如表1，图谱如图6、图7所示，与文献一致。 

表2所制备的产物¹³C信号归属以及与文献的比较 

编号	文献位移(δ,in CD3OD)	自测位移(δ,in CD3OD)
			1	169.1(Q)	169.11
2	125.6(Q)	125.61
			3	146.3(CH)	146.22
4	128.5(CH)	128.49

[0084] 

5	143.7(CH)	143.72
			6	37.3(CH2)	37.32
7	72.8(CH)	72.78
			8	137.0(Q)	137.03
9	124.6(CH)	124.58
			10	42.5(CH)	42.53
11	94.3(CH)	94.29
			12	136.9(Q)	136.95
13	134.6(CH)	134.58
			14	136.3(Q)	136.37
15	126.8(CH)	126.85
			16	28.4(CH2)	28.36
17	78.6(CH)	78.62
			18	68.3(CH)	68.26
19	14.6(CH3)	14.54
			20	63.9(CH2)	63.89
21	15.4(CH3)	15.4
			22	26.9(CH2)	26.9
23	11.3(CH3)	11.31
			24	13.9(CH3)	13.93
25	17.5(CH3)	17.53
			1′	102.2(CH	102.21
2′	71.6(CH)	71.57
			2′-OCH3	62.2(CH3)	62.19
3′	73.2(CH)	73.22
			4′	76.8(CH)	76.93
5′	82.5(CH)	82.47
			6′	18.1(CH3)	18.1
1"	97.1(CH)	97.18
			2"	73.5(CH)	73.48
3"	70.5(CH)	70.54
			4"	75.9(CH)	75.94
5"	74.5(Q)	74.53
			6"	28.7(CH3)	28.7
7"	18.2(CH3)	18.7
			1″′	170.1(Q)	169.75
2″′	110.7(Q)	112.61
			3″′	155.4(Q)*	154.01
4″′	108.9(Q)	108.79
			5″′	155.8(Q)*	154.68
6″′	115.7(Q)	114.87
			7″″	141.9(Q)	141.9
8″′	26.5(CH2)	26.38
			9″′	20.2(CH3)	20.26
1""	178.4(Q)	178.37

[0085] 

2""	35.4(CH)	35.39
			3""	19.1(CH3)**	19.13
4""	19.5(CH3)**	19.52

^*可互换；^**可互换 

综上所制备的产物可确认为非达霉素，分子式：C₅₂H₇₄Cl₂O₁₈，结构式如式1所示。 

(6)所制备的产物的其他几个理化参数 

MP143～145℃，[α]²⁵D-6.5°(c,8.2,MeOH)。纯态室温下稳定，溶液状态，特别是酸碱存在或阳光直射时稳定性较差。 

实施例4摇瓶发酵非达霉素的制备 

(a)制备游动放线菌N12W0304种子液 

将游动放线菌菌株N12W0304的斜面培养物接种于种子培养基，27℃、转速200rpm培养72h获得种子液。 

种子培养基的制备方法为：玉米淀粉20.0克、葡萄糖2.0克，蛋白胨5.0克、牛肉膏4.0克、酵母浸粉2.0克，加自来水溶解，定容至1000ml，pH值7.0-7.2，121℃灭菌30min。 

(b)制备游动放线菌的发酵液 

将种子液以体积比为5%的接种量接种装有发酵培养基的摇瓶，30℃、转速200rpm，发酵168h，得游动放线菌N12W0304发酵液。 

发酵培养基的制备方法为：葡萄糖50.0克、脱脂大豆粉20.0克、牛肉膏5.0克、K₂HPO₄0.3克、FeSO₄·7H₂O0.2克、MgSO₄·7H₂O0.2克、NaCl1.5克、豆油1.0克，加自来水溶解，定容至1000ml，pH值7.0-7.5，121℃灭菌30min。 

(c)将游动放线菌N12W0304的5L发酵液4000rpm离心，上清弃去，获得菌丝体约400ml。 

(d)菌丝体用2L乙醇浸提4h，浸提2次，合并浸提液。 

取样进行HPLC分析，色谱条件：色谱柱，UniSil10-120C184.6×250mm；流动相，体积比60%的乙腈水溶液，含0.05%三氟乙酸；流速1ml/min；进样量10μl；UV254nm检测。典型非达霉素发酵粗提物HPLC分析图谱见图3，非达霉素的保留时间为10.2min。浸提液于50℃减压浓缩至无乙醇，得到浓缩液约150ml。 

c.浓缩液加入1500ml的20%乙醇水，搅拌10min，无纺布过滤，获得滤液。 

d.上述滤液上样吸附于1L处理过的HZ816大孔树脂，分别以2倍体积的20%、40%、60%乙醇水溶液梯度洗脱，收集流出液。非达霉素集中于60%乙醇洗脱部分的开始阶段。 

e.上述流出液40℃减压浓缩，蒸去有机溶剂后，剩余物以3倍体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相萃取液，减压蒸干，获得非达霉素粗品7.8g。 

f.将非达霉素粗品溶于50ml甲醇中，0.45μm滤膜过滤后HPLC制备。制备柱，Daisogel-C1830×250mm 10μm；流动相，57%乙腈水，含0.05%三氟乙酸；流速40ml/min；进样量4ml/次；UV254nm检测。接非达霉素色谱峰（RT≈15～17min），合并，减压浓缩，得非达霉素精品3.7g，含量97.5%，总收率60.1%。 

Claims (8)

1.一种游动放线菌菌株，其特征在于所述菌株保藏名称是游动放线菌（Actinoplanes sp.）N12W0304，保藏单位中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2012年12月26日，保藏编号为CGMCC No.7043。

2.一种游动放线菌在制备非达霉素中的应用，其特征在于它包括以下步骤：

a、制备游动放线菌N12W0304种子液：

将菌株N12W0304的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，27-34 ℃、转速180-220 rpm培养48-72 h获得种子液；

其中所说的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-40.0克、葡萄糖0.5-5.0克，蛋白胨1.0-10.0克、牛肉膏1.0-10.0克、酵母浸粉1.0-10.0克，加水定容至1000 ml；pH值7.0-7.2，121 ℃灭菌30 min；

b、制备游动放线菌的发酵液：

将上述种子液以体积百分比5-15 %的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵温度28-32 ℃、发酵时间96-168 h，得发酵液；

其中所说的发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖30.0-50.0克、脱脂大豆粉10.0-30.0克、牛肉膏1.0-10.0克、K₂HPO₄ 0.1-1.0克、FeSO₄·7H₂O 0.1-1.0克、MgSO₄·7H₂O 0.1-1.0克、NaCl 1.0-5.0克、豆油1.0-2.0克，加水定容至1000 ml，pH值7.0-7.5，121 ℃灭菌30 min；

c、将上述发酵液进行离心10-20min，弃去上清液，获得菌丝体；

d、用有机溶剂对菌丝体浸提2-4次，每次2-4 h，合并浸提液，减压浓缩，除去有机溶剂，得到浓缩液；

e、浓缩液加入体积比浓度为10-25 %的有机溶剂水溶液，搅拌5-25 min，过滤，获得滤液；

f、上述滤液导入大孔树脂，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集含非达霉素的流出液，减压浓缩，除去有机溶剂，剩余物用乙酸乙酯溶液萃取2-4次，合并萃取液，减压蒸干，获得非达霉素粗品；

以上所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的游动放线菌在制备非达霉素中的应用，其特征在于获得非达霉素粗品后将非达霉素粗品溶于有机溶剂中，用0.45 μm滤膜过滤后，高效液相色谱分离；色谱条件：制备柱为Daisogel-C18 30×250 mm 10 μm；流动相为体积比57 %的乙腈水溶液、含0.05 %三氟乙酸；流速40 ml/min； UV254 nm检测，接收符合非达霉素色谱峰的流出液，合并，减压浓缩蒸干，得非达霉素精品。

4.根据权利要求2所述的游动放线菌在制备非达霉素中的应用，其特征在于所述的摇瓶发酵，其转速为180-220 rpm。

5.根据权利要求2所述的游动放线菌在制备非达霉素中的应用，其特征在于所述的发酵罐发酵，其罐压为0.05±0.01 Mpa、通气量为10-30 L/min，搅拌速度为400-500 rpm。

6.根据权利要求2所述的游动放线菌在制备非达霉素中的应用，其特征在于所述的步骤d所述的减压浓缩在30-50 ℃进行。

7.根据权利要求2所述的游动放线菌在制备非达霉素中的应用，其特征在于：步骤f所述的大孔树脂HP-20、XAD-16、XAD-1600、HZ816、D312、D101、AB-8中的一种。

8.根据权利要求2所述的游动放线菌在制备非达霉素中的应用，其特征在于所述有机溶剂梯度洗脱，其梯度洗脱时有机溶剂的质量比浓度依次为20 %、40 %、60 %。

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