ES2352324T3 - Nuevas estreptograminas. - Google Patents

Nuevas estreptograminas. Download PDF

Info

Publication number
ES2352324T3
ES2352324T3 ES95924396T ES95924396T ES2352324T3 ES 2352324 T3 ES2352324 T3 ES 2352324T3 ES 95924396 T ES95924396 T ES 95924396T ES 95924396 T ES95924396 T ES 95924396T ES 2352324 T3 ES2352324 T3 ES 2352324T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
zeta
pristinamycin
dimethylamino
des
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES95924396T
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Claude Barriere
Laurent Debussche
Veronique Blanc
Nathalie Bamas-Jacques
Joel Crouzet
Alain Famechon
Denis Thibaut
Francis Blanche
Gilles Dutruc-Rosset
Jean-Marc Paris
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9465182&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2352324(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Aventis Pharma SA filed Critical Aventis Pharma SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2352324T3 publication Critical patent/ES2352324T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/14—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D295/155—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with the ring nitrogen atoms and the carbon atoms with three bonds to hetero atoms separated by carbocyclic rings or by carbon chains interrupted by carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/34—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C07C229/36—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings with at least one amino group and one carboxyl group bound to the same carbon atom of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/40—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/42—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton with carboxyl groups linked to the six-membered aromatic ring, or to the condensed ring system containing that ring, by saturated carbon chains
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/12—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by halogen atoms or by nitro or nitroso groups
    • C07C233/15—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by halogen atoms or by nitro or nitroso groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/24—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C233/25—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/62—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atom of at least one of the thio groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of the carbon skeleton
    • C07C323/63—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atom of at least one of the thio groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVOS COMPUESTOS EMPARENTADOS CON LAS ESTREPTOGRAMINAS DEL GRUPO B, DE FORMULA GENERAL (I) Y A UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE ESTREPTOGRAMINAS POR MUTASINTESIS QUE EMPLEA UN MICROORGANISMO MUTADO PARA ALTERAR LA BIOSINTESIS DE AL MENOS UNO DE LOS PRECURSORES DE LAS ESTREPTOGRAMINAS DEL GRUPO B. SE REFIERE TAMBIEN A NUEVAS SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS IMPLICADAS EN LA BIOSINTESIS DE ESTOS PRECUROSRES Y A SUS UTILIZACIONES.

Description

Nuevas estreptograminas.
La presente invención se refiere principalmente a nuevos compuestos emparentados con las estreptograminas del grupo B.
Las estreptograminas forman un grupo homogéneo de antibióticos constituidos por una asociación de dos tipos de moléculas químicamente diferentes; por una parte macrolactonas poliinsaturadas (componentes del grupo A), y por otra parte depsipéptidos (componentes del grupo B). Este grupo comprende numerosos antibióticos conocidos con diferentes nombres en función de su origen, como las pristinamicinas, micamicinas, virginiamicinas (Cocito 1979, 1983).
Los componentes A y B tienen una actividad antibacteriana sinérgica que puede alcanzar 100 veces la de los compuestos separados y que, contrariamente a la de cada componente, es bactericida (Cocito 1979). Esta actividad es más particularmente eficaz contra las bacterias Gram-positivas, como los estafilococos y los estreptococos (Cocito 1979, Videau 1982). Los componentes A y B inhiben la síntesis proteica al fijarse a la subunidad 50S del ribosoma (Cocito 1979; Di Giambattista et al. 1989).
Hasta la fecha, el conocimiento de las vías de biosíntesis de cada uno de los componentes todavía es parcial aunque los estudios anteriores, presentados en la solicitud de patente PCT/FR93/00923 (o WO94/08014), habían permitido identificar varias proteínas y los genes estructurales correspondientes, implicados en la biosíntesis de los dos tipos de componentes (WO 93/20182).
\vskip1.000000\baselineskip
En los procesos de biosíntesis de las estreptograminas del grupo B, pueden distinguirse dos partes:
1)
Biosíntesis de los precursores, o de sus análogos, del macrociclo: ácido 3-hidroxipicolínico, ácido L-2-aminobutírico, 4-dimetilamino-L-fenilalanina, ácido L-pipecólico y L-fenilglicina.
2)
Formación del macrociclo a partir de los precursores citados anteriormente, de la L-treonina y de la L-prolina, o de sus análogos, opcionalmente con modificación o modificaciones posteriores, de tipo N-metilación peptídica, epimerización, hidroxilación y oxidación.
\vskip1.000000\baselineskip
La solicitud de patente PCT/FR9300923 o WO94/08014), tiene principalmente por objeto las enzimas que catalizan la incorporación de los precursores en la cadena peptídica de las estreptograminas B durante la elongación así como sus genes estructurales. Estos resultados han permitido poner de manifiesto el carácter de síntesis peptídica no ribosómica de los componentes de tipo B.
La patente US 4.156.734 describe composiciones que contienen un grupo arilo sustituido con una alanina azo, y un ácido arilhidrizino propiónico, principalmente 3-metilaminofenilalanina para tratar la hipertensión.
La presente invención se refiere más particularmente a nuevos compuestos emparentados con las estreptograminas del grupo B y más precisamente a nuevos compuestos de la familia de las pristinamicinas I (figuras 1 y 2), designados de ahora en adelante PI, o de la familia de las virginiamicinas S (figura 3).
El constituyente mayoritario de las pristinamicinas I (PI) es PI_{A} (figura 1) que representa aproximadamente el 94% de las PI, estando representado el aproximadamente 6% restante por constituyentes minoritarios del depsipéptido (PI_{B} a PI_{I}) cuyas estructuras se representan en la figura 2. La PI resulta esencialmente de la condensación de aminoácidos de los que algunos son indispensables para la síntesis proteica (treonina y prolina) y de los que otros son originales y se consideran ellos mismos como metabolitos secundarios (ácido L-2-aminobutírico, 4-dimetilamino-L-fenilalanina (DMPAPA), ácido L-pipecólico y L-fenilglicina para PI_{A}) así como un precursor aromático, el ácido 3-hidroxipicolínico.
En lo que respecta a los derivados de virginiamicinas S, resultan de la condensación de los mismos ácidos que para PI con la excepción de DMPAPA que se reemplaza por una fenilalanina (véase la figura 3).
La producción de estos diferentes compuestos por biosíntesis necesita, por lo tanto, la síntesis previa, por la cepa productora, de los precursores originales identificados anteriormente.
La presente invención resulta precisamente de un procedimiento de preparación original de estreptograminas que aplica, a título de cepa productora de estreptograminas, una cepa de microorganismo mutada con el fin de alterar la biosíntesis de los precursores de estreptograminas del grupo B. Según este procedimiento, dicha cepa mutante se cultiva en un medio complementado con un precursor original, diferente del precursor cuya biosíntesis está alterada. De manera inesperada, esto resulta en una producción de nuevos compuestos emparentados con las estreptograminas del grupo B, interesantes en el campo terapéutico.
Más precisamente, la presente invención se refiere a nuevos compuestos representados por la fórmula general I:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
\bullet
R_{2} y R_{4} representan, independiente el uno del otro, un átomo de hidrógeno o un grupo metilo,
\bullet
R_{3} representa un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo,
\bullet
X representa un grupo CO, CHOH o CH_{2} y
\bullet
R_{1} representa:
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
con
\bullet
para los derivados meta:
A, C, D y E representan un átomo de hidrógeno y
B puede representar:
\circ
un halógeno y preferentemente un átomo de flúor,
\circ
un grupo monoalquilamino o dialquilamino con alquilo representando preferentemente un grupo metilo o etilo,
\circ
un grupo éter. Se trata más particularmente de un grupo OR con R elegido preferentemente entre los grupos metilo, etilo, trifluorometilo y alilo,
\global\parskip0.960000\baselineskip
\circ
un grupo tioéter representado preferentemente por un grupo alquiltio, preferentemente con alilo representando un grupo metilo,
\circ
un grupo alquilo C_{1} a C_{3} o
\circ
un grupo trihalógenometilo y preferentemente trifluorometilo.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet
para los derivados para:
A, B, D y E representan un átomo de hidrógeno y
C puede representar:
\circ
un halógeno,
\circ
un grupo NR_{1}R_{2} con R_{1} y R_{2} representando independientemente el uno del otro un grupo elegido entre
\sqbullet
hidrógeno,
\sqbullet
un grupo alquilo C_{1} a C_{4} lineal o ramificado y cuando uno de los sustituyentes R_{1} o R_{2} representa un grupo metilo, el otro representa obligatoriamente un grupo etilo,
\sqbullet
un grupo alquil-cicloalquilmetilo con un cicloalquilo C_{3} a C_{4}
\sqbullet
un grupo cicloalquilo C_{3} a C_{4} sustituido opcionalmente,
\sqbullet
un grupo alquenilo C_{3} a C_{4} lineal o ramificado y cuando uno de los sustituyentes, R_{1} o R_{2}, representa un grupo alquenilo, el otro es diferente de un grupo metilo o de un cicloalquilo C_{3} a C_{6},
\circ
un grupo N-pirrolidinilo sustituido o no,
\circ
un grupo éter, se trata preferentemente de un grupo OR con R elegido preferentemente entre los grupos metilo, etilo sustituido opcionalmente con un átomo de cloro, trifluorometilo y alquenilo.
\circ
un grupo tioéter representado preferentemente por un grupo alquiltio preferentemente con alquilo representando un grupo alquilo C_{1} a C_{3}.
\circ
un grupo acilo o alcoxicarbonilo y más particularmente un grupo COR con R representado preferentemente un grupo alquilo C_{1} a C_{3} o un grupo alcoxi C_{1} a C_{3}.
\circ
un grupo alquilo C_{1} a C_{6}, lineal o ramificado, y preferentemente elegido entre los grupos metilo, isopropilo y terc-butilo,
\circ
un grupo alquiltiometilo y más preferentemente un grupo CH2SR con R representando preferentemente un grupo alquilo C_{1} a C_{3}
\circ
un grupo arilo y preferentemente un fenilo o
\circ
un grupo trihalógenometilo y preferentemente trifluorometilo.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet
para los derivados disustituidos meta-para:
A, D y E representan un átomo de hidrógeno y
B puede representar:
\circ
un halógeno y preferentemente un átomo de flúor,
\circ
un grupo monoalquilamino o dialquilamino con alquilo representando preferentemente un grupo metilo o etilo,
\circ
un grupo éter y preferentemente un grupo OR con R elegido preferentemente entre los grupos metilo, etilo y trifluorometilo,
\circ
un grupo tioéter y preferentemente alquiltio con alquilo representando preferentemente un grupo etilo, o
\circ
un grupo alquilo C_{1} a C_{3} y
\global\parskip1.000000\baselineskip
C puede representar:
\circ
un halógeno y preferentemente un átomo de flúor,
\circ
un grupo amino, monoalquilamino o dialquilamino con alquilo representando preferentemente un grupo metilo con la condición de que B sea diferente de un átomo de bromo o de cloro, o un grupo alilo sustituido o no,
\circ
un grupo éter y preferentemente un grupo OR con R elegido preferentemente entre los grupos metilo, etilo y trifluorometilo,
\circ
un grupo tioéter y preferentemente un grupo alquiltio preferentemente con alquilo representando un grupo metilo,
\circ
un grupo alquilo C_{1} a C_{6} o
\circ
un grupo trihalógenometilo y preferentemente trifluorometilo y
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet
para los derivados disustituidos orto-para:
B, E y D representan un átomo de hidrógeno y A y C, un grupo metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
A título de compuestos preferidos, se pueden citar más particularmente:
4\zeta-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
5\gamma-hidroxi 4\zeta-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
4\zeta-metil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-metil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
4\zeta-metoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-metoxicarbonil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-cloro-des(4\zeta-dmetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-bromo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-bromo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
4\zeta-yodo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-yodo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
4\zeta-trifluorometil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-trifluorometil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
4\zeta-terc-butil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-isopropil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-isopropil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{E}.
4\varepsilon-metilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\varepsilon-metoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\varepsilon-metoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
4\varepsilon-fluoro 4\zeta-metil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-amino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-dietilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-alilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-dialilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-alil etilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etil propilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etil isopropilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etil metilciclopropilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-(1-pirrolidinil)-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-trifluorometoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-aliloxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-metiltiometil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-(2-cloroetoxi)-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-acetil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H}
4\varepsilon-dimetilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\varepsilon-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\varepsilon-etoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
\vskip1.000000\baselineskip
Un procedimiento principalmente útil para preparar los compuestos de fórmula general I, se describe más adelante.
Más precisamente, este procedimiento para preparar las estreptograminas se caracteriza porque aplica una cepa de un microorganismo productor de estreptograminas, que posee al menos una modificación genética que afecta a la biosíntesis de un precursor de las estreptograminas del grupo B y porque dicha cepa mutante se cultiva en un medio de cultivo adecuado y complementado con al menos un precursor original, además del que su síntesis está alterada y porque se recuperan dichas estreptograminas.
Las cepas aplicadas en el marco de la presente invención son por lo tanto cepas productoras de estreptograminas, mutadas. La o las modificaciones genéticas mencionadas pueden estar localizadas bien a nivel de uno de los genes implicados en la biosíntesis de dichos precursores bien fuera de la región codificadora, por ejemplo en las regiones responsables de la expresión y/o la regulación transcripcional o post-transcripcional de dichos genes o en una región que pertenece al transcrito que contiene dichos genes.
Según un modo particular de la invención, las cepas mutantes poseen una o varias modificaciones genéticas a nivel de al menos uno de sus genes implicados en la biosíntesis de los precursores de las estreptograminas del grupo B.
Esta o estas modificaciones genéticas alteran la expresión de dicho gen, es decir, hacen que este gen, y llegado el caso otro de los genes implicados en la biosíntesis de los precursores, sea parcialmente o totalmente incapaz de codificar la enzima natural implicada en la biosíntesis de al menos un precursor. La incapacidad de dichos genes para codificar las proteínas naturales se puede manifestar bien por la producción de una proteína inactiva debido a modificaciones estructurales o conformacionales, bien por la ausencia de producción, bien por la producción de una proteína que tenga alterada una actividad enzimática o por la producción de la proteína natural a un nivel atenuado o según un modo de regulación deseado. El conjunto de estas manifestaciones posibles se traduce en una alteración es decir un bloqueo a nivel de la síntesis de al menos uno de los precursores de las estreptograminas del grupo B.
Los genes, susceptibles de mutarse en el marco de la presente invención, son preferentemente los genes implicados en la biosíntesis de los precursores siguientes: ácido L-2-aminobutírico, 4-dimetilamino-L-fenilalanina (DMPAPA), ácido L-pipecólico, L-fenilglicina y/o ácido 3-hidroxipicolínico (3-HPA).
Se trata más preferentemente de los genes papA, papM, papB (SEQ ID Nº 3), papC (SEQ ID Nº 2), hpaA (SEQ ID Nº 8), snbE (SEQ ID Nº 6) y pipA (SEQ ID Nº 5) descritos más adelante.
En lo que respecta a los genes papA y papM, ya se han descrito en la solicitud de patente PCT/FR93/0923. Se presentan en el cósmido pIBV2. El gen papA parece corresponder a un gen de la biosíntesis de la 4-amino-L-fenilalanina a partir de corismato. La 4-amino-L-fenilalanina se dimetila por el producto del gen papM. una N-metiltransferasa, para formar la 4-dimetilamino-L-fenilalanina, DMPAPA, que se incorpora en la pristinamicina I_{A}. Estos dos genes intervienen por lo tanto más particularmente a nivel de la síntesis del precursor de dicha DMPAPA.
En lo que respecta a los demás genes papB, papC, pipA, snbF y hpaA, se han identificado y caracterizado en el marco de la presente invención. Se reagrupan con los genes snbA, papA, y papM en una región cromosómica de aproximadamente 10 kb (figura 7).
Las homologías de secuencias puestas de manifiesto para las proteínas PapB y PapC, muestran que estas proteínas están igualmente implicadas en la biosíntesis del precursor DMPAPA, conjuntamente con las proteínas PapA y PapM. Los dos nuevos genes correspondientes, papB y papC, se han aislado e identificado por subclonaciones efectuadas a partir del cósmido pIBV2, descrito en la solicitud de patente PCT/FR93/0923 y de un plásmido pVRC900, derivado de pIBV2 por una deleción HindIII, igualmente descrito en la solicitud de patente PCT/FR93/00923 (o WO94/08014).
La comparación de la proteína codificada por el gen papC, con las secuencias proteicas contenidas en el banco Genpro pone de manifiesto una homología de 27% con la región implicada en la actividad prefenato deshidrogenasa de las proteínas bifuncionales TyrA de E. coli (Hudson y Davidson, 1984) y de Erwinia herbicola (biblioteca de datos EMBL, 1991). Esta región de TyrA cataliza la aromatización del prefenato en 4-hidroxifenilpiruvato en la biosíntesis de la tirosina. Una aromatización similar a partir de 4-desoxi 4-amino prefenato da lugar a 4-amino fenilpiruvato que interviene muy probablemente en la síntesis de DMPAPA. Ésta será catalizada por la proteína PapC (SEQ ID
nº 2).
En cuanto a la proteína PapB, posee una homología de 24 a 30% con la región implicada en la actividad corismato mutasa de las proteínas bifuncionales TyrA y PheA de E. coli (Hudson y Davidson, 1984) y de la proteína TyrA de Erwinia herbicola. Esta región cataliza la isomerización del corismato en prefenato en la biosíntesis de la tirosina y de la fenilalanina. La proteína PapB (SEQ ID nº 3) interviene probablemente a nivel de la isomerización similar a partir de 4-desoxi 4-amino corismato lo que da lugar a 4-desoxi 4-aminoprefenato en la síntesis de la DMPAPA.
En lo que respecta a los genes pipA, snbF y hpaA, están localizados en las regiones contenidas entre el gen snbA que codifica el ácido 3-hidroxipicolínico AMP ligasa, descrito en la solicitud de patente PCT/FR93/0923 y los genes papA o snbR. Se han localizado precisamente por subclonaciones efectuadas a partir del plásmido pVRC900 y del cósmido pIBV2, descritos en la solicitud de patente PCT/FR93/0923.
Comparando la proteína codificada por el gen hpaA y las secuencias proteicas contenidas en el banco Genpro, se ha puesto de manifiesto una homología de 30 a 40% con un grupo de proteínas probablemente implicadas (Thorson et al., 1993) en la transaminación de intermedios de biosíntesis de diferentes antibióticos (DnrJ, EryC1, TylB, StrS, PrgL). La síntesis del precursor 3-HPA que parece derivar de la lisina por otra vía distinta de la ciclodesaminación (véanse los ejemplos 1-2 y 2-1), necesita probablemente una etapa de transaminación susceptible de ser catalizada por el producto de este gen denominado hpaA (SEQ ID nº 8). Los resultados de mutación realizada en este gen muestran por otra parte sin duda la implicación de este gen en la síntesis del precursor 3-HPA.
La comparación del producto codificado por el gen denominado pipA con las secuencias proteicas contenidas en el banco Genpro pone de manifiesto una homología de 30% con la ornitina ciclodesaminasa de Agrobacterium tumefasciens (Schindier et al., 1989). Esta enzima interviene en la última etapa del catabolismo de la octopina; convierte la L-omitina en L-prolina por ciclo-desaminación. Los autores han mostrado por incorporación de lisina marcada, que el ácido 4-oxopipecólico y el ácido 3-hidroxipicolínico, encontrados tanto en la PI_{A} como en la virginiamicina S1, derivaban de la lisina (Molinero et al., 1989; Reed et al., 1989). Una reacción de ciclodesaminación de la lisina similar a la descrita para la ornitina dará lugar a la formación del ácido pipecólico. Teniendo en cuenta esta hipótesis, este producto se ha denominado PipA (SEQ ID nº 5). Los resultados de mutación en el gen pipA, presentados en los ejemplos siguientes, muestran la implicación del gen pipA en la única síntesis del ácido pipecólico. Se indica en particular que esta mutación no afecta la biosíntesis del ácido 3-hidroxipicolínico, que deriva también de la lisina y del que el ácido pipecólico podría ser un precursor.
Finalmente, comparando el producto del gen denominado snbF con las secuencias proteicas contenidas en el banco Genpro, se ha observado una homología de 30 a 40% con varias hidroxilasas de tipo citocromo P450, implicadas en la biosíntesis de metabolitos secundarios (Omer et al., 1990. Trower et al., 1992). Se prevén varias hidroxilaciones en la biosíntesis de los precursores de la pristinamicina I, principalmente a nivel de la biosíntesis de 3-HPA (hidroxilación en 3 del ácido picolínico) y del ácido 4-oxopipecólico (hidroxilación en 4 del ácido pipecólico). La proteína correspondiente se ha denominado SnbF (SEQ ID nº 6).
Los resultados de mutación en el gen pipA, con efectos polares sobre la expresión del gen snbF, muestran la implicación del gen snbF en la hidroxilación del resto ácido pipecólico de las estreptograminas del grupo B. Es así que la expresión del gen snbF está alterada por el sesgo de una modificación genética a nivel del gen pipA.
Preferentemente, la o las modificaciones genéticas vuelven a dicho gen parcial o totalmente incapaz de codificar la proteína natural.
Por modificación genética, se debe entender más particularmente toda supresión, sustitución, deleción o adición de una o varias bases en el gen o en los genes considerados. Se pueden obtener dichas modificaciones in vitro (en el ADN aislado) o in situ, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética o exponiendo dichos microorganismos a un tratamiento mediante agentes mutágenos. Por agentes mutágenos, se pueden citar, por ejemplo, agentes físicos tales como radiaciones energéticas (rayos X, \gamma, ultravioleta, etc..) o agentes químicos capaces de reaccionar con diferentes grupos funcionales de las bases de ADN y por ejemplo agentes alquilantes [etilmetanosulfonato (EMS), N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, N-nitroquinolein-1-óxido (NQO)], agentes bialquilantes, agentes intercalantes, etc... Por deleción, se entiende toda supresión de una parte o de la totalidad del gen considerado. Puede tratarse principalmente de una parte de la región que codifica dichas proteínas, y/o de todo o parte de la región promotora de la transcripción, de la traducción o del transcrito.
Las modificaciones genéticas pueden obtenerse igualmente por disrupción génica, por ejemplo según el protocolo descrito inicialmente por Rothstein [Meth. Enzymol. 101 (1983) 202] o ventajosamente por doble recombinación homóloga. En este caso, la totalidad de la secuencia codificadora se perturbará preferentemente para permitir llegado el caso la sustitución, por recombinación homóloga, de la secuencia genómica salvaje por una secuencia no funcional o mutante.
Según otro modo de realización, las modificaciones genéticas pueden consistir en poner el o los genes que codifican dichas proteínas bajo el control de un promotor regulado.
Las cepas de microorganismos mutantes descritas pueden obtenerse a partir de cualquier microorganismo productor de estreptograminas (Véase la tabla V). Según un modo de realización particular de la invención, se trata de una cepa que deriva de S. pristinaespiralis y más particularmente de S. pristinaespiralis SP92.
A título de cepa mutante preferida en el marco de la presente invención, se puede citar más particularmente la cepa SP92::pVRC508, mutada en la biosíntesis del precursor DMPAPA por disrupción por entrecruzamiento simple del gen papA o más preferentemente la cepa SP212, mutada en la biosíntesis del precursor DMPAPA por disrupción del gen papA por doble recombinación homóloga. Estas cepas no producen más PI salvo que se complementen con el precursor DMPAPA. De manera inesperada, cuando un precursor original, diferente de DMPAPA y capaz, llegado el caso después de metabolización, de incorporarse por la PI sintetasa III (proteína SnbD responsable de la incorporación de los restos L-prolina y DMPAPA) se añade al medio de producción, estas dos cepas se vuelven capaces de producir nuevas pristinamicinas I o virginiamicinas o de producir mayoritariamente un componente normalmente minoritario de la PI, principalmente PI_{B} (figura 2).
En el marco de la presente invención, se prepararon dos cepas mutantes más. Se trata respectivamente de la cepa SP92pipA::\Omegaam^{R} con disrupción en el gen pipA por recombinación homóloga y la cepa SP92hpaA::\Omegaam^{R} con disrupción en el gen hpaA. La cepa SP92pipA::\Omegaam^{R} por una parte, no produce más PI en las condiciones estándar de fermentación y por otra parte en presencia de ácido L-pipecólico permite la producción alta de un componente inicialmente minoritario de los componentes B de las estreptograminas en los que el ácido 4-oxopipecólico se reemplaza por el ácido L-pipecólico. En cuanto a la cepa S. pristinaespiralis SP92hpaA:: \Omegaam^{R}, no produce más PI en las condiciones estándar de fermentación pero es capaz de producir nuevas estreptograminas del grupo B, en presencia de precursores originales.
Complementado el medio de cultivo de las cepas mutantes según la invención, con al menos un precursor original, se comprueba que es posible orientar la biosíntesis bien hacia nuevas estreptograminas, bien hacia una forma minoritaria de ellas, o también privilegiar la formación de una de ellas.
Los precursores aplicados en el marco de la presente invención pueden ser derivados o análogos de aminoácidos y más particularmente de la fenilalanina así como ácidos orgánicos y principalmente ácidos alfa-cetocarboxílicos y más particularmente derivados del ácido fenilpirúvico.
Por supuesto, el precursor original es tal que provoca la alteración es decir el bloqueo, inducido según la invención, a nivel de la biosíntesis de uno de los precursores naturales de las estreptograminas del grupo B y da lugar a la síntesis de estreptograminas. Según un modo particular de la invención, este precursor original se elige de manera que esté emparentado con el precursor cuya biosíntesis está alterada. Así, en el caso particular de mutante bloqueado en la biosíntesis de DMPAPA, el precursor original es preferentemente un derivado de fenilalanina.
A título de precursores que convienen a la invención, se pueden citar principalmente los siguientes:
Fenilalanina, 4-dimetilaminofenilalanina, 4-metilaminofenilalanina, 4-aminofenilalanina, 4-dietilaminofenilalanina, 4-etilaminofenilalanina, 4-metiltiofenilalanina, 4-metilfenilalanina, 4-metoxifenilalanina, 4-trifluorometoxifenilalanina, 4-metoxicarbonilfenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-bromofenilalanina, 4-yodofenilalanina, 4-trifluorometilfenilalanina, 4-terc-butilfenilalanina, 4-isopropilfenilalanina, 3-metilaminofenilalanina, 3-metoxifenilalanina, 3-metiltiofenilalanina, 3-fluoro 4-metilfenilalanina, ácido L-pipecólico, ácido 4-terc-butilfenilpirúvico, ácido 4-metilaminofenilpirúvico, 2-naftilfenilalanina, 4-fluorofenilalanina, 3-fluorofenilalanina, 3-etoxifenilalanina, 2,4-dimetilfenilalanina, 3,4-dimetilfenilalanina, 3-metilfenilalanina, 4-fenilfenilalanina, 4-butilfenilalanina, 2-tienil-3-alanina, 3-trifluorometilfenilalanina, hidroxifenilalanina, 3-etilaminofenilalanina 4-alilaminofenilalanina, 4-dialilaminofenilalanina, 4-alil etilaminofenilalanina, 4-etil propilaminofenilalanina, 4-etil isopropilaminofenilalanina, 4-etil metilciclopropilaminofenilalanina, 4-(1-pirrolidinil)fenilalanina, 4-O-aliltirasina, 4-O-etiltirosina, 4-etiltiofenilalanina, 4-etiltiometilfenilalanina, 4-O-(2-cloroetil)tirosina, 4-acetil fenilalanina, 4-etil fenilalanina, 3-dimetilaminofenilalanina, 3-etoxi fenilalanina, 3-fluoro4-metilfenilalanina y 4-aminometilfenilalanina.
Entre estos precursores, 4-trifluorometoxifenilalanina, 3-metilaminofenilalanina, 3-metiltiofenilalanina, 3-fluoro4-metilfenilalanina, ácido 4-metilaminofenilpirúvico, 3-etoxifenilalanina, 4-alilaminofenilalanina, 4-dialilaminofenilalanina, 4-alil etilaminofenilalanina, 4-etil propilaminofenilalanina, 4-etil isopropilaminofenilalanina, 4-etilmetil-ciclopropilaminofenilalanina, 4-(1-pirrolidinil)fenilalanina, 4-etiltiometilfenilalanina, 4-O-(2-cloroetil)tirosina, 3-dimetilaminofenilalanina y 3-etilaminofenilalanina son nuevos y se han preparado y caracterizado en el marco de la presente invención. Se revelan particularmente útiles para preparar las estreptograminas según la invención.
El procedimiento reivindicado se comprueba que es particularmente interesante para preparar nuevas estreptograminas del grupo B o también para privilegiar la formación de determinadas de estas. A este respecto, es muy particularmente útil para preparar PIB.
Las asociaciones de un componente de las estreptograminas del grupo A y de un compuesto de fórmula general I, según la invención, constituyen composiciones particularmente interesantes en el campo terapéutico. Se emplean principalmente para los tratamientos de afecciones debidas a bacterias Gram-positivas (del género Staphylococos, Streptococos, Pneumococos, Enterococos) y Gram-negativas (del género Haemophilus, Gonococos, Meningococos). Es así que los compuestos según la invención sinergizan la acción antibacteriana de la pristinamicina IIB en Staphylococcus aureus IP8203 in vivo en el ratón, a dosis comprendidas principalmente entre 30 mg/kg y 100 mg/kg por vía oral, cuando se asocian en proporciones PI/PII del orden de 30/70.
La presente invención abarca cualquier composición farmacéutica que contiene al menos un compuesto de fórmula general I en asociación o no con una estreptogramina del grupo A.
Los ejemplos que figuran más adelante se presentan a título ilustrativo y no limitativo de la presente invención.
Lista de las figuras
Figura 1: Estructura de la pristinamicina I_{A}.
Figura 2: Estructura de los componentes minoritarios de la pristinamicina I.
Figura 3: Otros ejemplos de estructuras de componentes B de las estreptograminas.
Figura 4: Representación de la región PstI-XhoI de 2,9 kb.
Figura 5: Representación de la región XhoI-PstI de 4,5 kb.
Figura 6: Representación de la región HindIII-BglII de 1,6 kb.
Figura 7: Representación de la región BglII-XhoI de aproximadamente 10 kb.
Figura 8: Representación del plásmido pVRC415.
Figura 9: Representación del plásmido pVRC420.
Figura 10: Representación del plásmido pVRC411.
Figura 11: Representación del plásmido pVRC421.
Figura 12: Representación del plásmido pVRC414.
Figura 13: Estrategia de construcción de SP212.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Secuenciación e identificación de genes implicados en la biosíntesis de la pristinamicina I y de sus precursores
Identificación por secuenciación de los genes situados en posición 3' y en posición 5' del gen que codifica la enzima PapA descrito en la patente PCT/FR93/0923, así como de un gen situado en posición 3' del gen que codifica la enzima SnbA, igualmente descrito en la patente PCT/FR93/0923.
Este ejemplo describe como a partir del cósmido pIBV2, descrito en la patente PCT/FR93/0923, y que contiene los genes estructurales de las enzimas PapA y PapM, que intervienen en la síntesis del precursor 4-dimetilamino-L-fenilalanina (DMPAPA) de la pristinamicina I y el gen estructural de la enzima SnbA responsable de la activación del precursor aromático de la pristinamicina I, el ácido 3-hidroxipicolínico (3-HPA), se comprueba que es posible identificar por secuenciación alrededor de estos genes y por el estudio de los mutantes correspondientes, otros genes implicados en la biosíntesis del precursor DMPAPA, o en la biosíntesis de otros precursores de la pristinami-
cina I.
Con en este objeto, se efectuaron subclonaciones a partir del cósmido pIBV2, y del plásmido pVRC900, derivado de pIBV2 por una deleción HindIII. e igualmente descrito en la patente PCT/FR93/00923 (o WO94/08014).
Este ejemplo ilustra como pueden obtenerse las secuencias nucleotídicas de fragmentos situados en posición 3' y en posición 5' de los genes papA y snbA de S. pristinaespiralis.
Las técnicas de clonación de los fragmentos de ADN de interés en los vectores M13mp18/19 (Messing et al., 1981) son las técnicas clásicas de clonación en Escherichia coli y se describen en Maniatis et al. (1989).
\vskip1.000000\baselineskip
1-1 Secuenciación y análisis de la región en posición 3' del gen papA
Para secuenciar esta región, contenida entre los genes papA y papM. se subclonaron los fragmentos PstI-PstI de 1,5 kb, PstI-XhoI de 0,7 kb y XhoI-XhoI de 0,7 kb en los vectores M13mp18 y M13mp19 a partir del plásmido pVRC900. Los sitios de clonación se atravesaron por secuenciación sobre ADN bicatenario, utilizando los plásmidos pVRC900 y pVRC409 descritos en la patente PCT/FR93/00923 (o WO94/08014). Las clonaciones se realizaron como sigue. Aproximadamente 2 \mug del plásmido pVRC900 se cortaron con las enzimas de restricción PstI y/o XhoI (New England Biolabs) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Los fragmentos de restricciones así obtenidos se separaron en gel de agarosa 0,8% y los fragmentos de interés, PstI-PstI de 1,5 kb, PstI-XhoI de 0,7 kb y XhoI-XhoI de 0,7 kb se aislaron y purificaron por Geneclean (Bio101, La Jolla, California). Para cada clonación, aproximadamente 10 ng de M13mp19 y/o M13mp18 cortados con PstI y/o XhoI, se ligaron con 100 ng del fragmento a clonar, en las condiciones descritas por Maniatis et al. 1989. Después de transformar la cepa TG1 (K12, \Delta(lac-pro) supE thi hsd \DeltaS F traD36 proA^{+}B^{+} lacIq lacZ \DeltaM15; Gibson, 1984) y de seleccionar las placas de lisis en medio LB + X-gal + IPTG, según la técnica descrita por Maniatis et al. (1989), se aislaron los fagos que contienen los fragmentos deseados. Los diferentes insertos se secuenciaron por el método de reacción de terminación de cadena utilizando como sonda de síntesis el cebador universal o los oligonucleótidos sintéticos y complementarios de una secuencia de 20 nucleótidos del inserto a secuenciar. Las reacciones se hicieron utilizando didesoxinucleótidos fluorescentes (PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit-Applied Biosystem) y se analizaron en un secuenciador de ADN de tipo Applied Biosystems Modelo 373A. La recuperación entre estos diferentes insertos ha permitido establecer la secuencia nucleotídica total presente entre los genes papA y papM (SEQ ID
Nº 1).
A partir de esta secuencia nucleotídica, es posible determinar las fases abiertas de lectura e identificar así los genes implicados en la biosíntesis de la PI o de sus precursores en S. pristinaespiralis así como los polipéptidos codificados por estos genes.
Hemos investigado la presencia de fases abiertas de lectura en el fragmento PstI-XhoI de 2,9 kb que contiene la secuencia nucleotídica entre los genes papA y papM, utilizando el hecho de que el ADN de Streptomyces presenta un alto porcentaje de bases G y C así como un fuerte sesgo en el uso de los codones que componen las fases codificadoras (Bibb et al. 1984). El método de Staden y Mc Lachlan (1982) permite calcular la probabilidad de las fases codificadoras en función del uso de los codones de genes de Streptomyces ya secuenciados y reunidos en un fichero que contiene 19.673 codones obtenido a partir del servidor informático BISANCE (Dessen et al. 1990).
Este método ha permitido caracterizar en el fragmento PstI-XhoI de 2,9 kb, cuatro fases abiertas de lectura muy probables que se representan en la tabla siguiente (Tabla I). Se denominan fases 1 a 4 según su posición a partir del sitio PstI. Para cada una, se ha indicado su longitud en bases y su posición en el fragmento (estando situado el sitio PstI en la posición 1); para las fases abiertas de lectura 2 y 3, se ha indicado igualmente el tamaño en aminoácidos del polipéptido codificado. Las fases 1, 3 y 4 están codificadas por la misma cadena y la fase 2 por la cadena complementaria (figura 4). Las fases 1 y 4 corresponden respectivamente a la región C terminal de la proteína PapA y N terminal de la proteína PapM anteriormente identificadas y descritas en la patente PCT/FR93/00923 (o WO94/08014).
TABLA I
3
La comparación del producto de la fase 2 (Tabla I) con las secuencias proteicas contenidas en el banco Genpro pone de manifiesto una homología de 27% con la región implicada en la actividad prefenato deshidrogenasa de las proteínas bifuncionales TyrA de E. coli (Hudson y Davidson, 1984) y de Erwinia herbicola (biblioteca de datos EMBL, 1991). Esta región de TyrA cataliza la aromatización del prefenato en 4-hidroxifenilpiruvato en la biosíntesis de la tirosina. Una aromatización similar a partir de 4-desoxi 4-amino prefenato da lugar a 4-amino fenilpiruvato que interviene muy probablemente en la síntesis de DMPAPA. Esta reacción será catalizada por el producto de la fase 2, denominado PapC (SEQ ID nº 2).
La comparación del producto de la fase 3 (Tabla I) con las secuencias proteicas contenidas en el banco Genpro pone de manifiesto una homología de 24 a 30% con la región implicada en la actividad corismato mutasa de las proteínas bifuncionales TyrA y PheA de E. coli (Hudson y Davidson, 1984) y de la proteína TyrA de Erwinia herbicola. Esta región cataliza la isomerización del corismato en prefenato en la biosíntesis de la tirosina y de la fenilalanina. Una isomerización similar a partir de 4-desoxi 4-amino corismato da lugar a 4-desoxi 4-aminoprefenato que interviene muy probablemente en la síntesis de DMPAPA. Esta reacción será catalizada por el producto de la fase 3, denominado PapB (SEQ ID nº 3).
En el caso de TyrA y PheA las actividades corismato mutasa y prefenato dehidratasa o prefenato deshidrogenasa están catalizadas por la misma proteína. En S. pristinaespiralis, las actividades enzimáticas corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa están catalizadas por dos proteínas separadas, PapB y PapC respectivamente.
Las homologías de secuencias puestas de manifiesto para las proteínas PapB y PapC, muestran que estas dos proteínas están implicadas en la biosíntesis del derivado aromático DMPAPA, conjuntamente con las proteínas PapA y PapM. Lo mismo que para papA la disrupción de los genes papB y papC debe dar lugar a la construcción de cepas de S. pristinaespiralis incapaces de producir PI pero susceptibles de producir, en presencia de precursores originales, nuevas PI modificadas a nivel del resto DMPAPA.
\vskip1.000000\baselineskip
1-2. Secuenciación y análisis de la región en posición 5' del gen papA
Esta región está contenida entre el gen snbA que codifica el ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa, descrito en la patente PCT/FR93/00923 y el gen papA.
Las clonaciones se realizaron como se ha descrito en el ejemplo 1-1, a partir del plásmido pVRC900 y del cósmido pIBV2 descritos en la patente PCT/FR93/00923. Los fragmentos XhoI-XhoI de 1,3 kb, XhoI-XboI de 0,2 kb, XhoI-XhoI de 3,3 kb, HindIII-PstI de 1,1 kb y PstI-PstI de 2,2 kb se subclonaron en los vectores M13mp18 y M13mp19. Estas diferentes clonaciones han permitido atravesar todos los sitios de clonación. Los diferentes insertos se secuenciaron como se ha descrito en 1-1, utilizando como sonda de síntesis el cebador universal o los oligonucleótidos sintéticos, complementarios de una secuencia de 20 nucleótidos del inserto a secuenciar.
La recuperación entre estos diferentes insertos ha permitido establecer la secuencia nucleotídica total presente entre los genes snbA y papA (SEQ ID Nº 4).
A partir de esta secuencia nucleotídica, es posible determinar las fases abiertas de lectura e identificar los genes implicados en la biosíntesis de los precursores de PI de S. pristinaespiralis así como los polipéptidos codificados por estos genes.
Hemos investigado la presencia de fases abiertas de lectura en el fragmento XhoI-PstI de 4,5 kb que contiene la secuencia nucleotídica entre los genes snbA y papA. como se ha descrito en el ejemplo 1.1. Este método ha permitido caracterizar en el fragmento XhoI-PstI de 4,5 kb, cuatro fases abiertas de lectura muy probables que se representan en la tabla siguiente (Tabla II). Se denominan fases 1 a 4 según su posición a partir del sitio XhoI. Para cada una, se ha indicado su longitud en bases y su posición en el fragmento (estando situado el sitio XhoI en la posición 1); para las fases abiertas de lectura 2 y 3, se ha indicado igualmente el tamaño en aminoácidos del polipéptido codificado. Las fases 2, 3 y 4 están codificadas por la misma cadena y la fase 1 por la cadena complementaria (figura 5). Las fases 1 y 4 corresponden respectivamente a las regiones N terminales de las proteínas SnbA y PapA identificadas anteriormente y descritas en la patente PCT/FR93/00923 (o WO94/08014).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA II
4 
\vskip1.000000\baselineskip
La comparación del producto de la fase 2 (Tabla II) con las secuencias proteicas contenidas en el banco Genpro pone de manifiesto una homología de 30% con la ornitina ciclodesaminasa de Agrobacterium tumefasciens (Schindler et al., 1989). Esta enzima interviene en la última etapa del catabolismo de la octopina; convierte la L-omitina en L-prolina por ciclo-desaminación. Los autores han mostrado por incorporación de lisina marcada, que el ácido 4-oxopipecólico y el ácido 3-hidroxipicolínico, encontrados tanto en la PI_{A} como en la virginiamicina S1, derivaban de la lisina (Molinero et al., 1989; Reed et al., 1989). Una reacción de ciclodesaminación de la lisina similar a la descrita para la ornitina dará lugar a la formación del ácido pipecólico. Teniendo en cuenta esta hipótesis, el producto de la fase 2 se ha denominado PipA (SEQ ID nº 5). Los resultados de mutación en el gen pipA, presentados en 2-1, muestran la implicación del gen pipA en la única síntesis del ácido pipecólico porque esta mutación no afecta la biosíntesis del ácido 3-hidroxipicolínico, que también deriva de la lisina y del que el ácido pipecólico podría ser un
precursor.
La comparación del producto de la fase 3 (Tabla II) con las secuencias proteicas contenidas en el banco Genpro, pone de manifiesto una homología de 30 a 40% con varias hidroxilasas de tipo citocromo P450, implicadas en la biosíntesis de metabolitos secundarios (Omer et al., 1990. Trower et al., 1992). Se prevén varias hidroxilaciones en la biosíntesis de los precursores de la pristinamicina I, principalmente a nivel de la biosíntesis de 3-HPA (hidroxilación en 3 del ácido picolínico) y del ácido 4-oxopipecólico (hidroxilación en 4 del ácido pipecólico). Los resultados de mutación en el gen pipA. presentados en 2-1-3, muestran la implicación del producto de la fase 3 en la hidroxilación del resto ácido pipecólico de la PI_{E}. El gen correspondiente se ha denominado por lo tanto snbF y la proteína correspondiente SnbF (SEQ ID nº 6).
\vskip1.000000\baselineskip
1-3. Secuenciación de la región en posición 3' del gen snbA
Esta región está comprendida entre el gen snbA que codifica el ácido 3-hidroxipicolínico-adenilato-ligasa y el gen snbR, que codifica una proteína de membrana probablemente responsable del transporte y de la resistencia a la PI, las dos descritas en la patente PCT/FR93/00923. Las secuencias se han realizado a partir de un fragmento aislado del cósmido pIBV2, como se ha descrito en el ejemplo 1-1.
El fragmento HindIII-BglII de 1,6 kb se subclonó en los vectores M13mp18 y M13mp19, a partir del cósmido pIBV2. El inserto se secuenció como se ha descrito en 1-1, utilizando como sonda de síntesis el cebador universal o los oligonucleótidos sintéticos, complementarios de una secuencia de 20 nucleótidos del inserto a secuenciar. A partir de la secuencia nucleotídica así obtenida (SEQ ID nº 7), es posible determinar las fases abiertas de lectura e identificar los genes implicados en la biosíntesis de los precursores de la PI de S. pristinaespiralis así como los polipéptidos codificados por estos genes. Hemos investigado la presencia de fases abiertas de lectura en el fragmento HindIII- BglII de 1,6 kb correspondiente al final del gen snbA y a su región en posición 3', como se ha descrito en el ejemplo 1-1. Se ha puesto de manifiesto una fase abierta completa codificada por la misma cadena que el gen snbA (figura 6). Respecto a la posición 1 correspondiente al sitio HindIII, esta fase empieza en el nucleótido 249, 30 nucleótidos después del fin del gen snbA, y termina en el nucleótido 1.481. Su tamaño es de 1.233 nucleótidos correspondiente a una proteína de 411 aminoácidos.
La comparación del producto de esta fase abierta con las secuencias proteicas contenidas en el banco Genpro, ha puesto de manifiesto una homología de 30 a 40% con un grupo de proteínas probablemente implicadas (Thorson et al., 1993) en la transaminación de intermedios de biosíntesis de diferentes antibióticos (DnrJ, EryC1, TylB, StrS, PrgL). La síntesis del precursor 3-HPA que parece derivar de la lisina por otra vía distinta de la ciclodesaminación (véanse los ejemplos 1-2 y 2-1), podría necesitar una etapa de transaminación susceptible de ser catalizada por el producto de esta fase 3, denominado HpaA (SEQ ID nº 8). Los resultados de mutación en este gen, presentados en 2-2, muestran sin duda la implicación de este gen en la síntesis del precursor 3-HPA y confirman nuestra hipótesis.
Los genes papB, papC, pipA, snbF y hpaA descritos en la presente invención se reagrupan con los genes snbA, papA, y papM en una región cromosómica de aproximadamente 10 kb (figura 7). Esto confirma la presencia de un grupo de genes implicados en la biosíntesis de la P I y de sus precursores. El estudio de las regiones en posición 5' y en posición 3' de este grupo debería permitir identificar los demás genes de biosíntesis de los precursores de la PI, principalmente de la L-fenilglicina y del ácido L-2-aminobutírico.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Construcción de cepas recombinadas por disrupción de los genes identificados
Este ejemplo ilustra cómo es posible poner de manifiesto la implicación de los genes descritos en el ejemplo 1, en la biosíntesis de los precursores de las pristinamicinas, así como construir cepas de S. pristinaespiralis capaces de producir nuevas pristinamicinas. Estas cepas se obtienen por disrupción de los genes implicados en la biosíntesis del resto que se quiere sustituir y las nuevas pristinamicinas se producen complementando estos mutantes con precursores originales.
La cepa SP92::pVRC508 utilizada en la presente invención para producir nuevos derivados de PI reemplazando el precursor DMPAPA por otras moléculas, se describe en la patente PCT/FR93/00923 (WO94/08014). Resulta de la disrupción por entrecruzamiento simple del gen papA implicado en la biosíntesis del precursor de la DMPAPA y que se supone que interviene en una etapa precoz respecto a la transaminación del corismato. Esta disrupción tiene un carácter polar porque, en este mutante, la expresión del gen papM (PCT/FR93/00923 o WO 94/108014), situado 1, 5 kb en posición 3' del gen papA e implicado en la doble metilación de la 4-amino-L-fenilalanina en DMPAPA, es muy reducida. En efecto, la dosificación de la actividad de la enzima de metilación dependiente de SAM de la 4-amino-L-fenilalanina (PAPA) en DMPAPA indica para el mutante SP92::pVRC508 una actividad inferior a 5% de la actividad de la cepa salvaje.
En la presente invención, esta cepa SP92::pVRC508 permite en condiciones de fermentación y de complementación adecuadas producir nuevas pristinamicinas, modificadas a nivel del resto DMPAPA, como se presentará en el ejemplo 3. Los mutantes del mismo fenotipo pueden obtenerse por disrupción de los genes papB o papC descritos en la presente invención.
De una manera similar, se obtuvo otro tipo de cepa de S. pristinaespiralis, con disrupción en el gen papA y que posee el mismo fenotipo que la cepa SP92:pVRC508, por disrupción por entrecruzamiento doble del gen papA. Esta construcción se realizó a partir de un fragmento SphI-HindIII de 4,6kb, aislado del cósmido pIBV2 y que contiene la región 3' del gen pipA, los genes snbF y papA enteros así como la parte 3' del gen papC. Este fragmento se clonó en el vector suicida pDH5, capaz de replicarse solamente en E. coli, pero que contiene un marcador de resistencia que se expresa en Streptomyces (el gen de resistencia a tioestreptón o a nohihéptido, tsr). Este vector pDH5 ha sido desarrollado por Wohlebben et al. (1991 Nucleic Acid. Res. 19, 727-731). Se realizó una deleción BclI-BclI de 1,1 kb en el gen papA y se introdujo un fragmento HindIII-HindIII de 2,2 kb que contiene el gen amR (resistencia a la geneticina y a la apramicina) después de rellenar los extremos cohesivos. El vector recombinante se denominó pVRC414 y se presenta en la figura 12. Después de transformar la cepa productora de pristinamicinas con el plásmido pVRC414 los transformantes resistentes a la geneticina y sensibles a tioestreptón se aislaron y analizaron. Estos clones resultan de una doble recombinación homóloga entre las regiones de ADN de S. pristinaespiralis del plásmido pVRC414 y la región cromosómica de S. pristinaespiralis correspondiente a la descrita en la figura 13. Uno de estos clones se denominó SP212. Su fenotipo es idéntico al de la cepa SP92::pVRC508 en lo que respecta a la no producción de PI y su capacidad para producir nuevos antibióticos en presencia de precursores originales. Ventajosamente, este tipo de cepa, obtenida por doble entrecruzamiento, presenta una mejor estabilidad comparada con las cepas obtenidas por entrecruzamiento único.
\vskip1.000000\baselineskip
2-1. Construcción de un mutante de S. pristinaespiralis SP92 con disrupción en el gen pipA
Este ejemplo ilustra cómo es posible por disrupción del gen pipA construir una cepa de S. pristinaespiralis SP92 que no produce más PI en las condiciones estándar de fermentación y que es capaz de producir nuevas pristinamicinas, modificadas a nivel del resto ácido 4-oxopipecólico de la PIA, cuando se añaden a la fermentación los precursores originales.
Su construcción se realizó mediante un vector suicida que se replica solamente en E. coli, el vector pUC1318. Este vector no contiene marcador de resistencia que se expresa en Streptomyces. Su presencia en el genoma de Streptomyces no puede detectarse más que por hibridación en colonias.
\vskip1.000000\baselineskip
2-1-1. Construcción del plásmido pVRC420
Este ejemplo ilustra cómo es posible construir un plásmido que no se replica en S. pristinaespiralis SP92, que se puede utilizar para disrumpir por doble recombinación homóloga el gen pipA.
El plásmido pVRC420 se construyó para realizar el mutante cromosómico SP92 con disrupción en el gen pipA a partir del cósmido pIBV2 descrito en la patente PCT/FR93/0923. El cósmido pIBV2 se cortó con la enzima de restricción PstI y después de separar los fragmentos así generados por electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, un fragmento PstI-PstI de 2,8 kb, que contiene el principio de los genes snbA y snbF y la totalidad del gen pipA se aisló y purificó por Geneclean (Bio101, La Jolla, California). Se ligaron 50 ng del vector pUC1318 linealizados con una digestión PstI, con 200 ng del fragmento de 2,8 kb, como se ha descrito en el ejemplo 1. Un clon que contiene el fragmento deseado se aisló después de transformar la cepa TG1 y de seleccionar en medio LB + ampicilina 150 \mug/ml + X-gal + IPTG. El plásmido recombinante se denominó pVRC415 (figura 8). Un casete que contiene el gen am^{R}, que codifica para la resistencia a la apramicina o a la geneticina (Kuhstoss et al., 1991) se introdujo en el sitio único HindIII del plásmido pVRC415, estando situado este sitio 530 pb en posición 3' del principio del gen pipA. Esta construcción se realizó como sigue. Un fragmento de ADN de 2,5 kb que contiene el gen am^{R}, el promotor PermE (Bibb et al.,1985) así como los primeros 158 aminoácidos del gen de resistencia a la eritromicina, ermE se aisló por una doble digestión SalI-BglII a partir de un plásmido derivado de los plásmidos pIJ4026 (plásmido portador del gen ermE bajo el control del promotor PermE) y pHP45\Omegaam^{R}. Después de rellenar los extremos cohesivos 5' protuberantes SalI y BglII con la enzima Klenow según el protocolo descrito por Maniatis et al. 1989, el fragmento que contiene el gen am^{R} se clonó en el sitio HindIII del plásmido pVRC415, cuyos extremos cohesivos 5' protuberantes habían sido igualmente rellenados con la enzima Klenow, como se ha descrito anteriormente. El plásmido recombinante así obtenido se denominó pVRC420. Su mapa de restricción se presenta en la figura 9.
\vskip1.000000\baselineskip
2-1-2. Aislamiento del mutante SP92pipA::\Omegaam^{R}, con disrupción en el gen pipA por recombinación homóloga
Este ejemplo ilustra como se construyó el mutante de S. pristinaespiralis SP92 con disrupción en el gen pipA.
Este mutante se aisló por transformación de la cepa SP92 con el plásmido suicida pVRC420.
La preparación de los protoplastos, su transformación así como la extracción del ADN total de las cepas recombinadas se realizaron como se ha descrito por Hopwood et al. (1985).
La cepa SP92 se cultivó en medio YEME (Hopwood et al., 1985), 34% de sacarosa, 5 mM MgCl_{2}, glicina 0,25% durante 40 horas a 30ºC. El micelio se convirtió en protoplastos en presencia de lisozima y se utilizaron 5 X 1 \mug de pVRC420 para la transformación (mediante el método que utiliza el PEG) de los protoplastos. Después de una noche de regeneración de los protoplastos en medio R2YE (D. Hopwood et al. 1985), los recombinantes se seleccionaron al sembrar 3 ml del medio SNA (D. Hopwood et al. 1985) que contiene 1.500 \mug/ml de geneticina.
En las 5 transformaciones realizadas se aislaron 100 clones resistentes a la geneticina. Estos recombinantes resultan de la integración por recombinación homóloga simple o doble entre el gen pipA contenido en el cromosoma de la cepa SP92 y las partes del gen pipA contenidas en el fragmento de 5,3 kb contenido en el plásmido suicida pVRC420. Para seleccionar los recombinantes obtenidos por entrecruzamiento doble (es decir, que no contiene en su genoma la parte pUC1318 del plásmido pVRC420), se realizaron hibridaciones en colonias de 90 clones utilizando como sonda pUC19 marcado con [\alpha-^{32}P]dCTP, como se describe en Maniatis et al. (1989). Se seleccionaron 10 clones resistentes a la geneticina pero que no hibridan con el vector pUC19. Las esporas de los recombinantes se aislaron mediante siembra y crecimiento en el medio HT7 + 10 \mug/ml de geneticina y se resembraron en el mismo medio para obtener colonias aisladas. Con el fin de verificar la posición de la integración del plásmido pVRC420, se realizaron diferentes Southerns del ADN total de varios clones recombinantes, purificados como describen Hopwood et al. 1985, y se hibridaron con el fragmento PstI-PstI de 2,8 kb utilizado como sonda después de marcaje con [\alpha-^{32}P]dCTP. Los resultados confirman que estos recombinantes se obtuvieron por entrecruzamiento doble entre el vector pVRC420 y el cromosoma de la cepa SP92, dando lugar al reemplazamiento del fragmento PstI-PstI de 2,8 kb, que contiene el gen pipA por un fragmento PstI-PstI de 5,3 kb que contiene el gen pipA con disrupción por la introducción del gen am^{R}. Uno de estos mutantes se denominó SP92pipA::\Omegaam^{R}.
\vskip1.000000\baselineskip
2-1-3. Producción de pristinamicinas por el mutante SP92pipA::\Omegaam^{R}
Este ejemplo ilustra cómo se determina que el mutante de S. pristinaespiralis SP92 con disrupción en el gen pipA por la integración del plásmido pVR420 por una parte no produce más PI en las condiciones estándar de fermentación y por otra parte permite la producción alta de una forma minoritaria de los componentes B de las estreptograminas en los que el ácido 4-oxopipecólico se reemplaza por el ácido pipecólico.
El mutante SP92pipA::\Omegaam^{R}, así como la cepa SP92, como cepa testigo, se cultivaron en medio de producción líquido. La fermentación se realizó como sigue: se añaden 0,5 ml de una suspensión de esporas de la cepa citada anteriormente en condiciones estériles a 40 ml de un medio de inóculo en un matraz de 300 ml. El medio de inóculo está constituido por 10 g/l de Corn Steep, 15 g/l de sacarosa, 10 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l de K_{2}HPO_{4}, 3 g/l de NaCl, 0,2 g/l de MgSO_{4}-7H_{2}O y 1,25 g/l de CaCO_{3}. El pH se ajusta a 6,9 con sosa antes de introducir el carbonato de calcio. Los matraces se agitan durante 44 h a 27ºC en un agitador rotatorio con una velocidad de 325 rpm. Se añaden 2,5 ml del cultivo anterior de 44 h en esterilidad a 30 ml de medio de producción en un matraz de 300 ml. El medio de producción está constituido por 25 g/l de harina de soja, 7,5 g/l de almidón, 22,5 g/l de glucosa, 3,5 g/l de levadura de forraje, 0,5 g/l de sulfato de cinc y 6 g/l de carbonato de calcio. El pH se ajusta a 6,0 con ácido clorhídrico antes de introducir el carbonato de calcio. Los matraces se agitan durante 24, 28 y 32 horas a 27ºC. A cada tiempo, se pesan 10 g de mosto en un matraz liso, a los que se les añaden 20 ml de fase móvil compuesta por acetonitrilo al 34% y 66% de una disolución de KH_{2}PO_{4} 0,1 M (ajustado a pH 2,9 con H_{3}PO_{4} concentrado) lo que permite la extracción de las pristinamicinas. Después de agitar, se centrifuga todo y las pristinamicinas contenidas en el sobrenadante se dosifican por HPLC inyectando 150 \mul del sobrenadante de centrifugación en una columna Nucléosil 5-C8 de 4,6 x 150 mm eluida con una mezcla de 40% de acetonitrilo y de 60% de tampón fosfato 0,1 M pH 2,9. Las pristinamicinas I se detectan gracias a su absorbancia UV a 206 nm.
Los resultados mostraron que en las condiciones de fermentación realizadas, el mutante SP92pipA::\Omegaam^{R} no produce PI, esto a 24, 28 y 32 hrs de fermentación, mientras que el testigo SP92 produjo para los 3 tiempos ensayados, una cantidad estándar de PI. Para las dos cepas, la cantidad de PII producida permaneció igual. El mutante SP92pipA::\Omegaam^{R} se bloquea bien en una etapa de biosíntesis PI. Se realizaron ensayos complementarios de fermentación añadiendo al cabo de 16 horas al cultivo en medio de producción, los diferentes precursores de la PI, separadamente o juntos. Los resultados de estas complementaciones han permitido mostrar que cuando se añaden al medio de fermentación 100 mg/l de ácido pipecólico y 100 mg/l de DMPAPA, simultáneamente, el mutante produce un derivado normalmente menor de la PI, la PI_{E} (en el que la cantidad producida en inferior a 5% en SP92), a un nivel equivalente a la producción de PI_{A} por la cepa testigo. Esta producción no tiene lugar si el ácido pipecólico y la DMPAPA se añaden separadamente. La PI_{E} difiere de la PI_{A} (componente principal de la PI) por la ausencia de la función cetona en 4 en el ácido pipecólico. El hecho de que la complementación del mutante SP92pipA::\Omegaam^{R} no pudiera realizarse más que añadiendo simultáneamente el ácido pipecólico y la DMPAPA, indica que los genes papA y probablemente papB y papM presentaban disrupción por efecto polar de la construcción. En efecto, todos estos genes están situados en posición 3' de pipA, y son probablemente cotranscritos con pipA. La disrupción de este último conlleva por lo tanto la disrupción de los genes pap y consecuentemente la ausencia de síntesis de la DMPAPA. El hecho de que la complementación del mutante SP92pipA::\Omegaam^{R} por el ácido pipecólico, conlleve la producción de PI_{E} y no de PI_{A}, da lugar a dos conclusiones: la primera es que la construcción del ciclo de la PI se hace por incorporación del ácido pipecólico y no del ácido 4-oxopipecólico y que tiene lugar posteriormente una hidroxilación que genera la función cetona en 4. La segunda es que esta hidroxilación se realiza probablemente por la enzima SnbF, cuyo gen estructural se sitúa directamente en posición 3' del gen pipA. En efecto, la polaridad evidente de la disrupción del gen pipA, sobre los genes pap, implica probablemente un efecto polar sobre el gen snbF, situado entre pipA y los genes pap, que se traduce en la inhibición de la función de hidroxilación del resto ácido pipecólico de la PI_{E} en ácido 4-hidroxipipecólico encontrado en PI_{F} y PI_{G} (figura 2) y se oxida en ácido 4-oxopipecólico en PI_{A}.
La realización de dicho mutante ha permitido construir una cepa de S. pristinaespiralis incapaz de producir PI salvo en presencia de los precursores de PI, DMPAPA y ácido pipecólico, a partir de los cuales es capaz de producir en cantidad equivalente a la cepa de partida un derivado de PI normalmente minoritario en la mezcla de pristinamicina. Asimismo, en presencia de precursores originales o de una mezcla de precursores originales y de los precursores normalmente presentes en la PI, esta cepa podrá producir nuevas pristinamicinas, modificadas en uno de los dos o en los dos restos DMPAPA y ácido 4-oxopipecólico.
\vskip1.000000\baselineskip
2-2. Construcción de un mutante de S. pristinaespiralis SP92 con disrupción en el gen hpaA
Este ejemplo ilustra cómo es posible por disrupción del gen hpaA construir una cepa de S. pristinaespiralis SP92 que no produce más PI en las condiciones estándar de fermentación y que es capaz de producir nuevas pristinamicinas, modificadas a nivel del precursor 3-HPA, cuando se añaden a la fermentación los precursores originales.
Su construcción se realizó mediante un plásmido que no se replica en S. pristinaespiralis SP92, que puede utilizarse para disrumpir por doble recombinación homóloga el gen hpaA.
\vskip1.000000\baselineskip
2-2-1. construcción del plásmido suicida pVRC421
La construcción del plásmido pVRC421 se realizó mediante un vector suicida, capaz de replicarse en E. coli solamente, pero que contiene un marcador de resistencia que se expresa en Streptomyces, el gen de resistencia al tioestreptón o al nosihéptido, tsr. Este vector, pDH5, ha sido desarrollado por Hillemann et al. (1991).
El plásmido pVRC421 se construyó para realizar el mutante cromosómico SP92 con disrupción en el gen hpaA a partir del cósmido pIBV2 descrito en la patente PCT/FR93/0923. El pIBV2 se digirió con la enzima de restricción SphI y después de separar los fragmentos así generados por electroforesis en gel de agarosa al 0,6%, un fragmento SphI-SphI de 4,8 kb, que contiene la totalidad del gen hpaA y casi la totalidad del gen snbA se aisló y se purificó por Geneclean como se ha descrito más arriba. Se ligaron 50 ng del vector pDH5 linealizados con una digestión SphI, con 200 ng del fragmento de 4,8 kb, como se describe posteriormente. Un clon que contiene el fragmento deseado se aisló después de transformar la cepa TG1 y de seleccionar en medio LB + ampicilina 150 \mug/ml + IPTG + X-gal. El plásmido recombinante se denominó pVRC411 (figura 10). Un casete que contiene el gen am^{R}, que codifica para la resistencia a la apramicina o a la geneticina se introdujo en el sitio único PflmI del plásmido pVRC411, estando situado este sitio 610 pb en posición 3' del principio del gen hpaA. Esta construcción se realizó como sigue. Un fragmento de ADN de 2,2 kb que contiene el gen am^{R} se aisló después de digerir el plásmido pHP45\Omegaam^{R} que contiene el gen am^{R}, con HindIII. Después de rellenar los extremos cohesivos 5' protuberantes HindIII con la enzima Klenow según el protocolo descrito por Maniatis et al. 1989, el fragmento que contiene el gen am^{R} se clonó en el sitio PflmI del plásmido pVRC411, cuyos extremos cohesivos 3' protuberantes habían sido convertidos en romos con la enzima T4 polimerasa, como se describe en Maniatis et al. 1989. El plásmido recombinante así obtenido se denominó pVRC421. Su mapa de restricción se presenta en la figura 11.
\vskip1.000000\baselineskip
2-2-2. Aislamiento del mutante SP92hpaA::\Omegaam^{R}, con disrupción en el gen hpaA por recombinación homóloga
Este ejemplo ilustra como se construyó el mutante de S. pristinaespiralis SP92 con disrupción en el gen hpaA.
Este mutante se aisló por transformación de la cepa SP92 con el plásmido suicida pVRC421.
La preparación de los protoplastos y su transformación se realizaron como se ha descrito anteriormente.
La cepa SP92 se cultivó en medio YEME, 34% de sacarosa, 5 mM MgCl_{2}, glicina 0,25% durante 40 horas a 30ºC. El micelio se convirtió en protoplastos en presencia de lisozima y se utilizaron 5 X 1 \mug de pVRC421 para la transformación (mediante el método que utiliza el PEG) de los protoplastos. Después de una noche de regeneración de los protoplastos en medio R2YE, los recombinantes se seleccionaron al sembrar 3 ml del medio SNA que contiene 1.500 \mug/ml de geneticina.
En las 5 transformaciones realizadas se aislaron 600 clones resistentes a la geneticina. Estos recombinantes resultan de la integración por recombinación homóloga simple o doble entre el gen hpaA contenido en el cromosoma de la cepa SP92 y el fragmento de 6 kb del plásmido suicida pVRC421. Para seleccionar los recombinantes obtenidos por entrecruzamiento doble (es decir, los clones que no contienen en su genoma la parte pDH5 del plásmido pVRC421), los clones se repicaron en medio HT7 que contiene 400 \mug/ml de tioestreptón. Se seleccionaron 6 clones resistentes a la geneticina pero sensibles al tioestreptón. Las esporas de los recombinantes se aislaron mediante siembra y crecimiento en el medio HT7 + 10 \mug/ml de geneticina y se resembraron en el mismo medio para obtener colonias aisladas. Con el fin de verificar la posición de la integración del plásmido pVRC421, se realizaron diferentes Southerns del ADN total de los 6 clones recombinantes, purificados como describen Hopwood et al.1985, y se hibridaron con el fragmento SphI-SphI de 4,8 kb utilizado como sonda después de marcaje con [\alpha-^{32}P]dCTP. Los resultados confirman que estos recombinantes se obtuvieron por entrecruzamiento doble entre el vector pVRC421 y el cromosoma de la cepa SP92, dando lugar al reemplazamiento del fragmento SphI-SphI de 4,8 kb, que contiene el gen hpaA por un fragmento SphI-SphI de 6 kb que contiene el gen hpaA con disrupción por el gen am^{R}. Uno de estos mutantes se denominó SP92hpaA:: \Omegaam^{R}.
\vskip1.000000\baselineskip
2-2-3. Producción de pristinamicinas por el mutante SP92hpaA::\Omegaam^{R}
Este ejemplo ilustra cómo se determinó que el mutante de S. pristinaespiralis SP92, con disrupción en el gen hpaA por la integración del plásmido pVRC421, ya no produce PI en las condiciones estándar de fermentación.
El mutante SP92hpaA::\Omegaam^{R}, así como la cepa SP92, como cepa testigo, se cultivaron en medio de producción líquido. La fermentación se realizó como se ha descrito en el ejemplo 2-1-3 y las pristinamicinas se extrajeron y dosificaron como se ha descrito anteriormente. Los resultados mostraron que en las condiciones de fermentación realizadas, el mutante SP92hpaA::\Omegaam^{R} no produce PI, esto a 24, 28 y 32 hrs de fermentación, mientras que el testigo produjo para los 3 tiempos ensayados, una cantidad estándar de PI. Para las dos cepas, la cantidad de PII producida permaneció igual. El mutante SP92hpaA::\Omegaam^{R} se bloquea bien en una etapa de biosíntesis PI. Se realizaron ensayos complementarios de fermentación añadiendo al cabo de 16 horas al cultivo en medio de producción, los diferentes precursores de la PI, separadamente o juntos. Cuando se añaden al medio de fermentación 100 mg/l de ácido 3-hidroxipicolínico, el mutante produce PI_{A} a un nivel equivalente a la producción de PI por la cepa testigo. El hecho de que la complementación del mutante SP92hpaA::\Omegaam^{R} no pueda realizarse más que añadiendo ácido 3-hidroxipicolínico, muestra que el gen hpaA está implicado en la síntesis de este precursor.
La construcción de este mutante ha permitido realizar una cepa de S. pristinaespiralis mutada para su producción de PI, pero que en presencia del precursor 3-HPA es capaz de producir PI en cantidad equivalente a la cepa de partida. De la misma forma que en los ejemplos anteriores, se prevé que a partir de dicho mutante y en presencia de precursores originales se puedan producir nuevas pristinamicinas modificadas a nivel del resto ácido 3-hidroxipicolínico.
\newpage
Ejemplo 3
Producción de compuestos de fórmula general I por el mutante SP92::pVRC508
Este ejemplo ilustra como el mutante de S. pristinaespiralis SP92 con disrupción en el gen papA por la integración del plásmido pVRC508 es capaz de sintetizar nuevas estreptograminas en presencia de precursores añadidos en el medio de producción. Estos precursores pueden ser derivados de aminoácidos y más particularmente de fenilalanina pero también de ácidos \alpha-cetocarboxílicos y más particularmente de ácido fenilpirúvico.
El mutante SP92::pVRC508 se cultivó en medio de producción líquido. La fermentación se realizó como sigue: se añaden 0,5 ml de una suspensión de esporas de la cepa citada anteriormente en condiciones estériles a 40 ml de un medio de inóculo en un matraz de 300 ml. El medio de inóculo está constituido por 10 g/l de Corn Steep, 15 g/l de sacarosa, 10 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l de K_{2}HPO_{4}, 3 g/l de NaCl, 0,2 g/l de MgSO_{4}-7H_{2}O y 1,25 g/l de CaCO_{3}. El pH se ajusta a 6,9 con sosa antes de introducir el carbonato de calcio. Los matraces se agitan durante 44 h a 27ºC en un agitador rotatorio con una velocidad de 325 rpm. Se añaden 2,5 ml del cultivo anterior de 44 h en esterilidad a 30 ml de medio de producción en un matraz de 300 ml. El medio de producción está constituido por 25 g/l de harina de soja, 7,5 g/l de almidón, 22,5 g/l de glucosa, 3,5 g/l de levadura de forraje, 0,5 g/l de sulfato de cinc y 6 g/l de carbonato de calcio. El pH se ajusta a 6,0 con ácido clorhídrico antes de introducir el carbonato de calcio. Los matraces se agitan a 27ºC en un agitador rotatorio con una velocidad de 325 rpm. Al cabo de 16 h, se añade al cultivo 1 ml de una disolución de uno de los precursores listados en la tabla 3 (generalmente 5 ó 10 g/l). El cultivo se para 8 ó 24 h más tarde. Tan pronto como se calculó el volumen del mosto, le añadimos 2 volúmenes de fase móvil compuesta por 34% de acetonitrilo y 66% de una disolución de 0,1 M de KH_{2}PO_{4} (ajustada a pH 2,9 con H_{3}PO_{4} concentrado) lo que permite la extracción de las pristinamicinas. Después de agitar, el conjunto se centrifuga y las pristinamicinas contenidas en el sobrenadante se extraen y se purifican como se describe en el ejemplo 4. Estas se dosifican igualmente por HPLC inyectando 150 \mul del sobrenadante de centrifugación en una columna Nucleosil 5-C8 de 4,6 x 150 mm eluida con una mezcla de 40% de acetonitrilo y de 60% de tampón fosfato 0,1 M pH 2,9. Las nuevas pristinamicinas I se detectan gracias a su absorbancia UV a 206 nm y opcionalmente gracias a su emisión de fluorescencia (filtro 370 nm, excitación a 306 nm).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA III
5
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla siguiente (Tabla IV) indica los tiempos de retención relativos de las nuevas P I producidas tomando como referencia la PI_{A}. Los tiempos de retención absolutos se determinaron a 25ºC en el sistema HPLC descrito anteriormente; varían ligeramente de una inyección a otra por una parte y en función de la temperatura por otra
parte.
TABLA IV
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
La nueva P I de t_{R} 4,35 para la 4-Isopropilfenilalanina corresponde a una neo P I_{E} descrita en el ejemplo 14.
La nueva P 1 de t_{R} 1,63 para la 4-Metiltiofenilalanina corresponde a una 5\gamma-hidroxi neo P I_{H} descrita en el ejem-
plo 5.
Por otra parte, el mutante SP92::pVRC508 se fermentó en presencia de 4-dimetilamino fenilalanina. En estas condiciones de complementación, el mutante SP92::pVRC508 produce una cantidad de pristinamicinas I_{A} equivalente a la producida por la cepa SP92.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Preparación de la pristinamicina I_{B} [4\zeta-metilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}] y de la 4\zeta-amino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} 4.1: Preparación de la pristinamicina I_{B} [4\zeta-metilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}]
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 10 g/l en agua de 4-metilaminofenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 34-1. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la pristinamicina I_{B} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 6 ml de una mezcla 65% agua y 35% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 65% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 35% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la pristinamicina I_{B} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 52 anillos de pristinamicina I_{B}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,71 (dd, J= 16 y 6 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 0,92 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), de 1,10 a 1,40 (mt, 2H: 3 \beta_{2} y 3 \gamma_{2}), 1,34 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,03 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,22 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,33 (d ancho, J= 16 Hz, 1H: 5 \delta_{1}), 2,40 (d, J= 16 Hz, 1H: 5 \beta_{1}), 2,82 (mt, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 2,81 (s, 3H: 4 NCH_{3} en para del fenilo), 2,90 (dd, J= 12 y 4 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,29 (s, 3H: 4 NCH_{3}), de 3,20 a 3,45 y 3,60 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 3,40 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 4,57 (dd, J= 7 y 8 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,75 (dd ancho, J= 13 y 7 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,83 (mt, 1H: 2\alpha), 4,89 (d ancho, J= 10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,24 (dd, J=12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,32 (d ancho, J= 6 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,89 (d, J= 9 Hz, 1H: 6 \alpha), 5,90 (q ancho, J= 7,5 Hz, 1H: 1\beta), 6,53 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 2), 6,53 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\varepsilon), 7,03 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\delta), de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,46 (mt, 2H: 1' H_{5} y 1' H_{4}), 7,85 (dd, J = 5,5 y 2 Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,44 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,76 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 6), 11,63 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
4.2: Preparación de la 4\zeta-amino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 5 g/l en agua de 4-aminofenilalanina (S). Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 6 ml de una mezcla 65% agua y 35% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 65% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 35% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 5 mg de 4\zeta-amino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,72 (dd, J= 16 y 5,5 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 0,90 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), de 1,10 a 1,40 (mt, 2H: 3 \beta_{2} y 3 \gamma_{2}), 1,33 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,02 (mt, 1H, 3 \beta1), 2,19 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,33 (d y, J= 16 Hz, 1H: 5 \delta_{1}), 2,42 (d, J=16 Hz, 1H: 5 \beta_{1}), 2,81 (dt, J= 13 y 4 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 2,90 (dd, J= 12 y 4 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,24 (s, 3H: NCH_{3} 4), de 3,20 a 3,40 y 3,54 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 3,30 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 3,72 (mf, 2H: ArNH_{2}), 4,54 (dd, J= 7,5 y 7 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,73 (dd y, J= 13 y 8 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,82 (mt, 1H: 2\alpha), 4,89 (d y, J= 10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,22 (dd, J= 12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,32 (d y, J= 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,89 (mt, 2H: 6 \alpha y 1\beta), 6,51 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), 6,61 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\varepsilon), 6,98 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\delta), de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,45 (dd, J= 8,5 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{4}), 7,48 (dd, J= 8,5 y 4 Hz, 1H: 1' H_{5}), 7,82 (dd, J = 4 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,43 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,76 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,63 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Preparación de la 4\zeta-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}, de la 4\zeta-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H} y de la 5\gammahidroxi 4\zeta-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 10 g/l en sosa 0,1 N de 4-metiltiofenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 33. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. Se obtienen 65 mg de resto seco. Éste se recoge con 6 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en 2 veces en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 55% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 45% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 45 mg de 4\zeta-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,68 (dd, J= 16 y 5,5 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 0,93 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), 1,13 (mt, 1H: 3 \beta_{2}), de 1,25 a 1,40 (mt, 1H: 3 \gamma_{2}), 1,33 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1.55 a 1.85 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,02 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,18 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,38 (d y, J= 16,5 Hz, 1H: 5 \delta_{1}), 2,46 (s, 3H: SCH_{3}), 2,48 (d, J=16 Hz, 1H, 5 \beta_{1}), 2,85 (dt, J= 13,5 y 4 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 3,00 (dd, J= 12 y 5 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,23 (s, 3H: NCH_{3} 4), 3,37 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 \beta_{1}, 3,37 y 3,58 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 4,55 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,77 (dd y, J= 13,5 y 8 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,86 (mt, 1H: 2\alpha), 4,89 (dd, J= 10 y 1,5 Hz, 1H: 1\alpha), 5,30 (d y, J= 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,32 (dd, J= 12 y 5 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,90 (d, J= 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha), 5,92 (dq, J= 7,5 y 1,5 Hz, 1H:1\beta), 6,55 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), 7,13 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\delta), de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,19 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\varepsilon), 7,45 (mt, 2H: 1' H_{4} y 1' H_{5}), 7,76 (t, J = 5 Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,42 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,76 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,65 (s, 1H: OH).
A partir de las fracciones resultantes de la columna de sílice descrita anteriormente, que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{H}, se aíslan 10 mg de 4\zeta-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H} operando la cromatografía en columna semi-preparativa como se ha descrito anteriormente pero llevando la proporción de acetonitrilo de la fase eluyente a 50%.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,32 (mt, 1H, 5 \beta_{2}), 0,93 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), de 1,20 a 1,35 (mt, 2H: 3 \beta_{2} y 3 \gamma_{2}), 1,30(d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,35 a 2,05 (mt, 9H: 3 \gamma_{1} - 3 \beta_{1} - CH_{2} 2 \beta - CH_{2} 5 \delta - CH_{2} 5\gamma y 5 \beta_{1}), 2,44 (dt, J= 13,5 y 1,5 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 2,49 (s, 3H: SCH_{3}), 2,99 (dd, J= 12 y 5 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,09 (dd, J= 12,5 y 12 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 3,54 y 3,64 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 4,17 (dd, J= 7 y 6 Hz, 1H: 3 \alpha), 4,49 (d y, J= 13,5 Hz: 1H: 5 \varepsilon_{1}), de 4,70 a 4,80 (mt, 3H: 2\alpha - 5 \alpha y 4 \alpha), 4,84 (dd, J=10 y 1,5 Hz, 1H: 1\alpha), 5,51 (d, J= 7 Hz, 1H: 6 \alpha), 5,73 (mt, 1H: 1\beta), 6,65 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), 7,10 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\delta), 7,22(d, J= 8 Hz, 2H: 4\varepsilon), de 7,20 a 7,40 (mt, 7H: H Aromáticos 6 - 1' H_{4} y 1' H_{5}), 7,87 (d, J=4 Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,55 (mf, 1H: NH 6), 8,55 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 11,70 (s, 1H: OH).
A partir de las fracciones resultantes de la columna de sílice descrita anteriormente, que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I, se aíslan 3 mg de 5\gamma-hidroxi 4\zeta-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina ^{I} H operando la cromatografía en columna semi-preparativa como se ha descrito anteriormente manteniendo la proporción de acetonitrilo de la fase eluyente a 45%.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): se observa un isómero claramente mayoritario: el -OH en 5 \gamma en posición axial. 0,37 (d mt, J= 16 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 0,93 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), de 1,20 a 1,45 (mt, 2H: 3 \beta_{2} y 3 \gamma_{2}), 1,31 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,40 a 1,85 (mt, 5H: 3 \gamma_{1} - CH_{2} 2 \beta y CH_{2} 5 \delta), 1,98 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,17 (d, J= 16 Hz, 1H: 5 \beta_{1}), 2,50 (s, 3H: SCH_{3}), 2,77 (dt, J= 13,5 y 2 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 2,99 (dd, J= 12 y 4 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,11 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), de 3,45 a 3,70 (mt, 2H: CH_{2} 3 \delta), 3,73 (mt, 1H: 5 \gamma en posición ecuatorial), 4,13 (t, J= 7 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,37 (d y, J= 13,5 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), de 4,75 a 4,95 (mt, 3H: 2 \alpha - 4 \alpha y 5 \alpha), 4,89 (dd, J= 10 y 1 Hz, 1H: 1\alpha), 5,70 (d, J= 8 Hz, 1H: 6 \alpha), 5,80 (dq, J= 7,5 y 1 Hz, 1H: 1\beta), 6,37 (d, J= 5 Hz, 1H: NH 4), 6,71 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 2), 7,10 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\delta), 7,22(d, J= 8 Hz, 2H: 4 \varepsilon), de 7,20 a 7,40 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,43 (dd, J= 8,5 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{4}), 7,47 (dd, J= 8,5 y 4 Hz, 1H: 1'H_{5}), 7,89 (dd, J = 4 y 1,5 Hz, 1H: 1'H_{6}), 8,55 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 9,15 (d, J= 8 Hz, 1H: NH 6), 11,70 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6
Preparación de la 4\zeta-metil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} y de la 4\zeta-metil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 5 g/l en sosa 0,1 N de 4-metilfenilalanina (R,S). Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. Se obtienen 49 mg de resto seco. Éste se recoge con 6 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en 2 veces en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 55% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 45% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 44 mg de 4\zeta-metil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,52 (dd, J= 16 y 6 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 0,93 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), 1,15 (mt, 1H: 3 \beta_{2}), del,20 a 1,40 (mt, 1H: 3 \gamma_{2}),1,35 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,04 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,18 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), de 2,25 a 2,45 (mt, 2H: 5 \delta_{1} y 5 \beta_{1}), 2,36 (s, 3H: ArCH_{3}), 2,83 (dt, J= 13 y 4 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 2,99 (dd, J= 13 y 4 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,28 (s, 3H: NCH_{3}4), 3,31 y 3,59 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 3,40 (t, J= 13 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 4,59 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,74 (dd y, J= 13 y 7 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,85 (mt, 1H: 2\alpha), 4,89 (d y, J= 10 Hz, 1H: 1\alpha), de 5,25 a 5,35 (mt, 2H: 5 \alpha y 4 \alpha), de 5,85 a 5,95 (mt, 2H: 6 \alpha y 1\beta), 6,52 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), 7,14 (AB límite, J= 9 Hz, 4H: 4\delta y 4\varepsilon), de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,50 (mt, 2H: 1'H_{4} y 1'H_{5}), 7,81 (dd, J = 4 y 2Hz, 1H: 1'H_{6}), 8,41 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,74 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 6), 11,63 (s, 1H: OH).
A partir de las fracciones resultantes de la columna de sílice descrita anteriormente, que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{H}, se aíslan 21 mg de 4\zeta-metil-des(4-dimetilamino)pristinamicina I_{H} (espectrometría de masa: M+H^{+}= 810) operando la cromatografía en columna semi-preparativa como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7
Preparación de la 4\zeta-metoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 12 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 5 g/l en sosa 0,1 N de 4-metoxifenilalanina (R,S). Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 0,35 litros de mosto producidos en los 12 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. Se obtienen 14 mg de resto seco. Éste se recoge con 3 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 60% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 40% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 12 mg de 4\zeta-metoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, d en ppm, ref. TMS): 0,63 (dd, J= 16 y 5,5 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 0,96 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), 1,17 (mt, 1H: 3 \beta_{2}), de1,30 a 1,45 (mt, 1H: 3 \gamma_{2}), 1,38 (d, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,55 a 1,85 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,05 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,20 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,40 (d ancho, J = 16 Hz, 1H: 5 \delta_{1}), 2,47 (d, J= 16 Hz, 1H: 5 \beta_{1}), 2,88 (dt, J= 13 y 4 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 2,99 (dd, J= 12,5 y 5 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,30 (s, 3H: NCH_{3} 4), 3,32 y 3,60 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 3,40 (t, J= 12,5 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 3,80 (s, 3H: OCH_{3}), 4,60 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,80 (dd y, J= 13 y 8,5 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,88 (mt, 1H: 2\alpha), 4,92 (d y, J= 10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,31 (dd, J= 12,5 y 5 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,34 (d y, J= 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,90(d, J= 9 Hz, 1H: 6 \alpha), 5,93 (q y, J= 7,5 Hz,1H: 1\beta), 6,54 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 2), 6,87 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\varepsilon), 7,16 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\delta), de 7,15 a 7,40 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,50 (mt, 2H: 1' H_{5} y 1' H_{4}), 7,80 (dd, J = 4 y 2,5 Hz, 1H: l' H_{6}), 8,43 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,78 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 6), 11,65 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8
Preparación de la 4\zeta-metoxicarbonil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 10 g/l de 4-metoxicarbonilfenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 33. Al final de las 24 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. Se obtienen 14 mg de resto seco. Éste se recoge con 3 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 55% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 45% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 9 mg de 4\zeta-metoxicarbonil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinami-
cina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,70 (dd, J=16 y 6 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 0,93 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), 1,08 (mt, 1H: 3 \beta_{2}), de 1,30 a 1,40 (mt, 1H: 3 \gamma_{2}), 1,33 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,55 a 1,85 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,02 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,13 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,40 (d y, J= 16,5 Hz, 1H: 5 \delta_{1}), 2,48 (d, J=16 Hz, 1H, 5 \beta_{1}), 2,89 (dt, J= 14,5 y 4,5 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 3,10 (dd, J= 13,5 y 6 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,24 (s, 3H: NCH_{3} 4), 3,38 y 3,61 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 3,47 (t, J= 13,5 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 3,96 (s, 3H: COOCH_{3}), 4,55 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,78 (dd y, J= 14,5 y 8 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,86 (mt, 1H: 2\alpha), 4,89 (d y, J= 10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,33 (d y, J= 6 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,42 (dd, J= 13,5 y 6 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,92 (d (J= 9,5 Hz) y mt, 1H cada uno: respectivamente 6 \alpha y 1\beta), 6,52 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 2), de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,28 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\delta), 7,43 (dd, J= 9 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{4}), 7,47 (dd, J= 9 y 5 Hz, 1H: l' H_{5}), 7,66 (d, J = 5 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{6}), 7,98 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\varepsilon), 8,38 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,76 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,70 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9
Preparación de la 4\zeta-cloro-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 10 g/l en sosa 0,1 N de 4-clorofenilalanina (R,S). Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 3 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 60% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 40% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtiene 1 mg de 4\zeta-cloro-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), 0,95 (dd, J= 16 y 5 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 1,09 (mt, 1H: 3 \beta_{2}), de 1,20 a 1,40 (mt, 1H: 3 \gamma_{2}),1,35 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,02 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,17 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,43 (d y, J= 16 Hz, 1H: 5 \delta_{1}), 2,59 (d, J=16 Hz, 1H, 5 \beta_{1}), 2,90 (dt, J= 13,5 y 4 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 3,04 (dd, J= 13 y 6 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,21 (s, 3H: 4 NCH_{3}), 3,36 (t, J=13 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 3,39 y 3,59 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 4,53 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,76 (dd y, J= 13,5 y 8 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,86 (mt, 1H: 2\alpha), 4,87(d y, J= 10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,38 (mt, 2H: 5 \alpha y 4 \alpha), 5,93 (mt, 2H: 6 \alpha y 1\beta), 6,52 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 2), 7,12 (d, J = 8 Hz, 2H: 4\delta), de 7,15 a 7,35 (mt, 7H: H Aromáticos 6 y 4\varepsilon), 7,38 (dd, J= 9 y 4,5 Hz, 1H:1' H_{5}), 7,43 (d y, J= 9 Hz, 1H:1' H_{4}), 7,68 (dd, J = 4,5 y 1 Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,36 (d, J=10 Hz, 1H: NH 1), 8,75 (d, J= 9 Hz,1H: NH 6), 11,65 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10
Preparación de la 4\zeta-bromo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} y de la 4\zeta-bromo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 10 g/l en sosa 0,1 N de 4-bromofenilalanina (R,S). Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 6 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en 2 veces en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 60% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 40% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 6 mg de 4\zeta-bromo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), 0,95 (dd, J= 16 y 5 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 1,10 (mt, 1H: 3 \beta_{2}), 1,35 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), 1,36 (mt, 1H: 3 \gamma_{2}), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,02 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,18 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,43 (d y, J= 16 Hz, 1H: 5 \delta_{1}), 2,59 (d, J=16 Hz, 1H, 5 \beta_{1}), 2,90 (dt, J= 13 y 4 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 3,02 (dd, J= 13 y 5,5 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,21 (s, 3H: 4 NCH_{3}), 3,33 (dd, J= 13 - 11 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 3,39 y 3,59 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 4,53 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,76 (dd y, J= 13 y 7 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,86 (mt, 1H: 2\alpha), 4,89 (d y, J= 10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,37 (d y, J= 5 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,39 (dd, J= 11 y 5,5 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,92 (mt, 2H: 6 \alpha y 1\beta), 6,56 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), 7,08 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\delta), de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,40 (mt, 4H: 1' H_{4} - 1' H_{5} y 4\varepsilon), 7,70 (d y, J = 5 Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,40 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,77 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 6), 11,68 (s, 1H: OH).
A partir de las fracciones resultantes de la columna de sílice descrita anteriormente, que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{H}, se aíslan 3 mg de 4\zeta-bromo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H} (espectrometría de masa: M+H^{+}= 874) operando la cromatografía en columna semi-preparativa como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 11
Preparación de la 4\zeta-yodo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} y de la 4\zeta-yodo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 10 g/l en sosa de 4-yodofenilalanina (R,S). Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 6 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en 2 veces en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 60% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 40% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 12 mg de 4\zeta-yodo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), 0,95 (dd, J= 16 y 5,5 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 1,10 (mt, 1H: 3 \beta_{2}), 1,35 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), 1,38 (mt, 1H: 3 \gamma_{2}), de 1,55 a 1,85 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,02 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,17 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,43 (d ancho, J= 16,5 Hz, 1H: 5 \delta_{1}), 2,60 (d, J=16 Hz, 1H, 5 \beta_{1}), 2,89 (dt, J= 14 y 4,5 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 3,02 (dd, J= 13 y 5,5 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,21 (s, 3H: NCH_{3} 4), 3,31 (dd, J= 13 y 11 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 3,39 y 3,59 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 4,53 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,75 (dd ancho, J= 14 y 8 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,83 (mt, 1H: 2\alpha), 4,88 (d ancho, J= 10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,37 (d ancho, J= 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,39 (dd, J= 11 y 5,5 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,92 (mt, 2H: 6 \alpha y 1\beta), 6,54 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), 6,94 (d, J = 7,5 Hz, 2H: 4\delta), de 7,15 a 7,50 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,36 (dd, J = 9 y 4 Hz, 1H: 1' H_{5}), 7,43 (d ancho, J= 9 Hz, 1H: 1' H_{4}), 7,62 (d, J= 7,5 Hz, 2H: 4\varepsilon), 7,68 (d, J = 4 Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,38 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,76 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 6), 11,60 (s, 1H: OH).
A partir de las fracciones resultantes de la columna de sílice descrita anteriormente, que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{H}, se aíslan 6 mg de 4\zeta-yodo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H} (espectrometría de masa: M+H^{+}= 922) operando la cromatografía en columna semi-preparativa como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 12
Preparación de la 4\zeta-trifluorometil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} y de la 4\zeta-trifluorometil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 5 g/l en sosa 0,1 N de 4-trifluorometilfenilalanina (S). Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 3 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 55% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 45% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 5 mg de 4\zeta-trifluorometil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,86 (dd, J=16 y 5,5 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 0,91 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), 1,13 (mt, 1H: 3 \beta_{2}), 1,31 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), 1,42 (mt, 1H: 3 \gamma_{2}), de 1,55 a 1,80 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,02 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,15 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,40 (d ancho, J= 16,5 Hz, 1H: 5 \delta_{1}), 2,55 (d, J=16 Hz, 1H, 5 \beta_{1}), 2,88 (dt, J= 14 y 4 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 3,18 (s, 3H: NCH_{3} 4), 3,20 y 3,31 (2 dd, respectivamente J=13 y 6 Hz y J= 13 y 10 Hz,, 1H cada uno: 4 \beta_{2} y 4 \beta_{1}), 3,42 y 3,60 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 4,50 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,73 (dd ancho, J=14 y 7,5 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,83 (mt, 1H: 2\alpha), 4,91 (d ancho, J= 10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,40 (d ancho, J= 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,55 (dd, J= 10 y 6 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,87 (d, J= 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha), 5,90 (q ancho, J= 7,5 Hz, 1H:1\beta), 6,68 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), de 7,15 a 7,40 (mt, 9 H: 4\delta - H Aromáticos 6 - 1' H_{5} y 1' H_{4}), 7,52 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\varepsilon), 7,68 (d, J = 4 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,43 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,76 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,70 (s, 1H:
OH).
A partir de las fracciones resultantes de la columna de sílice descrita anteriormente, que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{H}, se aíslan 4 mg de \zeta-trifluorometil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H} (espectrometría de masa: M+H^{+}= 864) operando la cromatografía en columna semi-preparativa como se ha descrito anterior-
mente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 13
Preparación de la 4\zeta-terc-butil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 5 g/l en sosa 0,1 N de 4-terc-butilfenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 35-1. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en 2 veces en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 55% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 45% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 30 mg de 4\zeta-terc-butil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS, ref. TMS): 0,21 (dd, J=16 y 5,5 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 0,91 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), 1,17 (mt, 1H: 3 \beta_{2}), de1,20 a 1,40 (mt, 1H: 3 \gamma_{2}), 1,33 (s, 9H: CH_{3} de terc-butilo), 1,35 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,04 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,13 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,30 (mt, 2H: 5 \delta_{1} y 5 \beta_{1}), 2,80 (dt, J= 13 y 4 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 3,00 (dd, J= 12 y 4 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,29 (s, 3H: NCH_{3} 4), 3,31 y 3,59 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 3,40 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 4,57 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,74 (dd ancho, J= 13 y 7 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,85 (mt, 1H: 2\alpha), 4,90 (d ancho, J=10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,21 (d ancho, J= 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,25 (dd, J= 12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,87(d, J= 9 Hz, 1H: 6 \alpha), 5,92 (q ancho, J= 7,5 Hz, 1H: 1 1H: 1'H_{6}), 8,45 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,74 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 6), 11,65 (s, 1H: OH).
\newpage
Ejemplo 14
Preparación de la 4\zeta-isopropil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} y de la 4\zeta-isopropil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{E}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 10 g/l en sosa 0,1 N de 4-isopropilfenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 36-1. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. Se obtienen 61 mg de resto seco. Éste se recoge con 9 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en 3 veces en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 55% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 45% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 51 mg de 4\zeta-isopropil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1}H (250 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS, ref. TMS): 0,31 (dd, J=16 y 5,5 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 0,91 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), de 1,00 a 1,45 (mt, 2H: 3 \beta_{2} y 3 \gamma_{2}), 1,25 (d, J= 7,5 Hz, 6H: CH_{3} del isopropilo), 1,35 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), de 1,95 a 2,20 (mt, 2H, 3 \beta_{1} y 5 \delta_{2}), 2,30 (mt, 2H: 5 \delta_{1} y 5 \beta_{1}), 2,80 (dt, J= 13 y 4 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 2,88 (mt, 1H: CH del isopropilo), 2,98 (dd, J=12 y 4 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,30 (s, 3H: NCH_{3} 4), 3,32 y 3,55 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 3,38 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 4,55 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,72 (dd ancho, J= 13 y 7 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,85 (mt, 1H: 2\alpha), 4,88 (d ancho, J= 10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,21 (d ancho, J= 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,25 (dd, J= 12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,87(d, J= 9 Hz, 1H: 6 \alpha), 5,90 (q ancho, J= 7,5 Hz, 1H: 1\beta), 6,50 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), de 7,05 a 7,35 (mt, 9H: H Aromáticos 6 - 4\varepsilon y 4\delta), 7,50 (mt, 2H: 1' H_{5} y 1' H_{4}), 7,86 (dd, J = 4 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,40 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 1), 8,72 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 6), 11,60 (s, 1H: OH).
A partir de las mismas fracciones resultantes de la columna de sílice descrita anteriormente, que contienen igualmente el nuevo derivado de pristinamicina I_{E}, se aíslan 5 mg de \zeta-isopropil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{E} operando la cromatografía en columna semi-preparativa como se ha descrito anteriormente.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,20 (mt, 1H, 5 \beta_{2}), 0,92 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), de 1,15 a 1,40 (mt, 2H: 3 \beta_{2} y 3 \gamma_{2}), 1,24(d, J= 7,5 Hz, 6H: CH_{3} del isopropilo), 1,34 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,35 a 2,05 (mt, 9H: 3 \gamma_{1} - 3 \beta_{1} - CH_{2} 2 \beta - CH_{2} 5 \delta - CH_{2} 5\gamma y 5 \beta_{1}), 2,45 (dt, J= 13 y 1,5 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 2,89 (mt, 1H: ArCH), 3,09 (dd, J= 14 y 7 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,17 (s, 3H: NCH_{3} 4),3,25 (dd, J=14 y 9 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 3,32 y 3,52 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 4,55 (mt, 2H: 3 \alpha y 5 \varepsilon_{1}), 4,80 (mt, 1H: 2\alpha), 4,89 (dd, J= 10 y 1,5 Hz, 1H: 1\alpha), 4,90 (mt, 1H: 5 \alpha), 5,35 (dd, J= 9 y 7 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,60 (d, J= 8 Hz, 1H: 6 \alpha), 5,89 (dq, J= 7,5 y 1,5 Hz, 1H: 1\beta), 6,65 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), 7,08 (d, J= 8 Hz, 2H: 45), 7,14 (d, J= 8 Hz, 2H: 4\varepsilon), de 7,20 a 7,40 (mt, 7H: H Aromáticos 6 - 1' H_{4} y 1' H_{5}), 7,77 (d ancho, J=4 Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,46 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,48 (d, J= 8 Hz, 1H: NH 6), 11,70 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 15
Preparación de la 4\varepsilon-metilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 10 g/l en agua de 3-metilaminofenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 35-3. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. Se obtienen 19 mg de resto seco. Éste se recoge con 3 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 55% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 45% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 8 mg de 4\varepsilon-metilamino-des(4\varepsilon-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de RM.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), 1,00 (dd, J= 16 y 6 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 1,17 (mt, 1H: 3 \beta_{2}), de 1,25 a 1,40 (mt, 2H: 3 \gamma_{2}),1,35 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,55 a 1,80 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,03 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,23 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,39 (d ancho, J= 16 Hz, 1H: 5 \delta_{1}), 2,52 (d, J= 16 Hz, 1H: 5 \beta_{1}), 2,78 (s, 3H: ArNCH_{3} 4), 2,85 (dt, J= 13 y 4 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 2,99 (dd, J= 13 y 4,5 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,23 (s, 3H: NCH_{3} 4), 3,25 (t, J= 13 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 3,38 y 3,58 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 4,05 (mf, 1H: ArNH), 4,58 (dd, J= 6,5 y 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,76 (dd ancho, J=13 y 8 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,85 (mt, 1H: 2\alpha), 4,87(d y, J= 10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,35 (dd, J= 13 y 4,5 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,38 (d ancho, J= 6 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,90 (d, J=9,5 Hz, 1H: 6 \alpha), 5,91 (mt, 1H: 1\beta), 6,36 (s ancho, 1H: H 2 del aromático en 4), de 6,45 a 6,55 (mt, 2H: H 4 y H 6 del aromático en 4), 6,53 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 2), 7,12 (t, J= 8 Hz, 1H: H 5 del aromático en 4), de 7,15 a 7,45 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,35 (mt, 2H: 1' H_{4} y 1' H_{5}), 7,75 (t, J = 3 Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,40 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,78 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,60 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 16
Preparación de la 4\varepsilon-metoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} y de la 4\varepsilon-metoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 5 g/l en sosa 0,1 N de 3-metoxifenilalanina (S). Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. Se obtienen 41 mg de resto seco. Éste se recoge con 6 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en 2 veces en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 55% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 45% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 28 mg de 4\varepsilon-metoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,52 (dd, J=16 y 5,5 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 0,90 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), de 1,10 a 1,34 (mt, 2H: 3 \beta_{2} y 3 \gamma_{2}), 1,34 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1\gamma), de 1,50 a 1,80 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} \beta), 2,04 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,20 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,35 (d ancho, J= 16 Hz, 1H: 5 \delta_{1}), 2,38 (d, J=16 Hz, 1H: 5 \beta_{1}), 2,83 (dt, J= 13 y 4 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 2,97 (dd, J= 12 y 4 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,28 (s, 3H: NCH_{3} 4), 3,28 y 3,56 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 3,40 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 3,80 (s, 3H: OCH_{3}), 4,58 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,76 (dd ancho, J= 13 y 8 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,85 (mt, 1H: 2\alpha), 4,90 (d ancho, J=10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,27 (dd, J= 12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,30 (d ancho, J= 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,89 (d, J= 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha), 5,91 (q ancho, J= 7,5 Hz, 1H: 1\beta), 6,51 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 2), de 6,80 a 6,90 (mt, 3H: H 2 - H 4 y H 6 del aromático en 4), de 7,15 a 7,40 (mt, 6H: H 5 del aromático en 4 y H Aromáticos 6), 7,45 (d ancho, J= 9 Hz, 1H: 1' H_{4}), 7,50 (dd, J= 9 y 4 Hz, 1H:1' H_{5}), 7,80 (d ancho, J = 4 Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,40 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,73 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,62 (s, 1H: OH).
A partir de las fracciones resultantes de la columna de sílice descrita anteriormente, que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{H}, se aíslan 7 mg de 4\varepsilon-metoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H} (espectrometría de masa: M+H^{+}= 826) operando la cromatografía en columna semi-preparativa como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 17
Preparación de 4\varepsilon-fluoro 4\zeta-metil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 10 g/l en sosa 0,1 N de 3-fluoro-4-metilfenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 34-5. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. Se obtienen 15 mg de resto seco. Éste se recoge con 3 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 55% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 45% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 9 mg de 4\varepsilon-fluoro 4\zeta-metil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,60 (dd, J= 16 y 5,5 Hz, 1H, 5 \beta_{2}), 0,91 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 2 \gamma), 1,12 (mt, 1H: 3 \beta_{2}), de 1,25 a 1,35 (mt, 1H: 3 \gamma_{2}), 1,33 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH_{3} 1 \gamma), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 \gamma_{1} y CH_{2} 2 \beta), 2,02 (mt, 1H, 3 \beta_{1}), 2,13 (mt, 1H, 5 \delta_{2}), 2,27 (s, 3H: ArCH_{3}), 2,36 (d ancho, J= 16 Hz, 1H: 5 \delta_{1}), 2,45 (d, J= 16 Hz, 1H: 5 \beta_{1}), 2,85 (dt, J= 13 y 4,5 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{2}), 2,97 (dd, J= 12,5 y 4,5 Hz, 1H: 4 \beta_{2}), 3,23 (s, 3H: NCH_{3} 4), 3,30 y 3,56 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} 3 \delta), 3,37 (t, J= 12,5 Hz, 1H: 4 \beta_{1}), 4,55 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 \alpha), 4,75 (dd ancho, J= 13 y 8 Hz, 1H: 5 \varepsilon_{1}), 4,83 (mt, 1H: 2\alpha), 4,89 (d ancho, J= 10 Hz, 1H: 1\alpha), 5,29 (dd, J= 12,5 y 4,5 Hz, 1H: 4 \alpha), 5,32 (d y, J= 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha), 5,89 (d, J= 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha), 5,92 (mt, 1H: 1\beta), 6,49 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 2), 6,90 (mt, 2H: H 2 y H 6 del aromático en 4), 7,11 (t, J= 8 Hz, 1H: H 5 del aromático en 4), de 7,10 a 7,30 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,43 (dd, J= 8,5 y 1 Hz, 1H: 1' H_{4}), 7,49 (dd, J= 8,5 y 4,5 Hz, 1H: 1' H_{5}), 7,75 (dd, J = 4,5 y 1Hz, 1H: 1' H_{6}), 8,48 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,70 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,60 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 18
Preparación de la 4\zeta-etilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 50 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en sosa 0,1 N de dihidrocloruro de 4-etilaminofenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 33. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,5 litros de mosto producidos en los 50 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\zeta-etilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 65% agua y 35% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 60% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 40% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\zeta-etilamino-des (4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 10 mg de 4\zeta-etilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,72 (dd, J = 16 y 6 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 1,15 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); de 1,20 a 1,40 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,27 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} del etilo); 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); de 1,50 a 1,65 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,60 y 1,74 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,21 y 2,33 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,40 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 (3); 2,82 (dt, J = 13 y 4,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 2,89 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); 3,10 (mt, 2H: NCH_{2} del etilo); de 3,20 a 3,35 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \delta); 3,26 (s, 3H: NCH_{3}); 3,31 (t, J = 12 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,54 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 3,67 (mt, 1H: NH); 4,56 (dd, J = 6,5 y 7 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,75 (dd ancho, J = 13 y 8 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 4,84 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,90 (d ancho, J = 10 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,24 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha); 5,32 (d ancho, J = 6 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,90 (mt, 1H: 1 \beta); 6,52 (d, J = 8 Hz, 3H: NH en 2 y H Aromáticos en 4 \varepsilon); 7,00 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \delta); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos en 6); 7,46 (AB límite, 2H: 1' H_{4} y 1' H_{5}); 7,84 (dd, J = 4 y 1 Hz, 1H: 1' H_{6}); 8,45 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,77 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 6); 11,65 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 19
Preparación de la 4\zeta-dietilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 50 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en sosa 0,1 N de dihidrocloruro de 4-dietilaminofenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 33. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,5 litros de mosto producidos en los 50 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\zeta-dietilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en dos veces en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 68% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 32% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\zeta-dietilamino-des (4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 50 mg de 4\zeta-dietilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,65 (dd, J = 16 y 6 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 1,14 (t, J = 7 Hz, 6H: CH_{3} del etilo); 1,15 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); 1,26 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); 1,55 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,63 y 1,75 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,22 y 2,31 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,37 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,80 (dt, J = 13 y 4,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 e); 2,89 (dd, J = 12,5 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); de 3,20 a 3,40 (mt, 6H: NCH_{2} del etilo - 1H del CH_{2} en 3 \delta y el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,27 (s, 3H: NCH_{3}); 3,55 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 4,58 (dd, J = 8 y 6 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,76 (dd ancho, J = 13 y 7,5 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 4,84 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,89 (dd, J = 10 y 1 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,21 (dd, J = 12,5 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha); 5,28 (d ancho, J = 6 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,87 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,90 (mt, 1H: 1 \beta); 6,52 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 2); 6,60 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \varepsilon); 7,02 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \delta); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos en 6); 7,46 (AB límite, 2H: 1' H_{4} y 1' H_{5}); 7,88 (dd, J = 4,5 y 2,5 Hz, 1H: 1' H_{6}); 8,43 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,76 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 6); 11,62 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 20
Preparación de la 4\zeta-dialilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 94 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en agua de dihidrocloruro de 4-dialilaminofenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 38-1. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 2,8 litros de mosto producidos en los 94 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\zeta-dialilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 52% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 48% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\zeta-dialilamino-des (4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 15 mg de 4\zeta-dialilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,55 (dd, J = 16 y 6 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 1,18 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); 1,25 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,34 (d, J = 6,5 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); 1,59 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,68 y 1,78 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 2 \beta); 2,04 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,25 y 2,34 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,40 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,83 (dt, J = 13 y 4,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 2,92 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); de 3,20 a 3,30 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \delta); 3,29 (s, 3H: NCH_{3}); 3,33 (t, J = 12 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,57 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 3,93 (AB límite, 4H: NCH_{2} del alilo); 4,60 (dd, J = 8 y 6,5Hz, 1H: 3 \alpha); 4,78 (dd ancho, J = 13 y 7,5 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 e); 4,87 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,92 (dd, J = 10 y 1 Hz, 1H: 1 \alpha); de 5,10 a 5,25 (mt, 5H: 4 \alpha y =CH_{2} del alilo); 5,28 (d ancho, J = 6 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,85 (mt, 2H: CH= del alilo); 5,92 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,94 (mt, 1H: 1 \beta); 6,54 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 2); 6,65 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \varepsilon); 7,05 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \delta); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos en 6); 7,51 (AB límite, 2H: 1' H_{4} y 1' H_{5}); 7,88 (dd, J = 4 y 2 Hz, 1H: 1' H_{6}); 8,43 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,77 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 6); 11,65 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 21
Preparación de la 4\zeta-aliletilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 26 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en sosa 0,1 N de dihidrocloruro de 4-aliletilaminofenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 39-4. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 0,78 litros de mosto producidos en los 26 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\zeta-aliletilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 52% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 48% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\zeta-aliletilamino-des (4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 20 mg de 4\zeta-aliletilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,58 (dd, J = 16 y 6 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 1,16 (t, J = 7 Hz, 3H: CH_{3} del etilo); 1,16 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); 1,25 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); 1,54 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,63 y 1,75 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,23 y 2,31 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,37 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,80 (dt, J = 13 y 4,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 2,87 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); de 3,15 a 3,30 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \delta); 3,26 (s, 3H: NCH_{3}); 3,30 (t, J = 12 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,36 (mt, 2H: NCH_{2} del etilo); 3,54 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 3,90 (AB límite, 2H: NCH_{2} del alilo); 4,57 (dd, J = 8 y 6 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,76 (dd ancho, J = 13 y 7,5 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 4,84 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,89 (dd, J = 10 y 1 Hz, 1H: 1 \alpha); de 5,05 a 5,20 (mt, 3H: 4 \alpha y =CH_{2} del alilo); 5,27 (d ancho, J = 6 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,83 (mt, 1H: CH= del alilo); 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,91 (mt, 1H: 1 \beta); 6,50 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 2); 6,60 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \varepsilon); 7,02 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \delta); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos en 6); 7,47 (AB límite, 2H: 1' H_{4} y 1' H_{5}); 7,88 (dd, J = 4 y 2 Hz, 1H: 1' H_{6}); 8,41 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,75 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 6); 11,62 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 22
Preparación de la 4\zeta-etil propilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en sosa 0,1 N de dihidrocloruro de 4-etilpropilaminofenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 39-6. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\zeta-etil propilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 63% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 37% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\zeta-etil propilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 16 mg de 4\zeta-etil propilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,67 (dd, J = 16 y 6 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 0,95 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} del propilo); 1,14 (t, J = 7 Hz, 3H: CH_{3} del etilo); 1,15 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); 1,25 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); de 1,45 a 1,65 (mt, 3H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma y CH_{2} propilo); 1,63 y 1,75 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,23 et 2,33 (respectivement mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,37 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,80 (dt, J = 13 y 5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 2,89 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); de 3,10 a 3,25 (mt, 3H: 1H del CH_{2} en 3 \delta y NCH_{2} del propilo); 3,26 (s, 3H: NCH_{3}); de 3,25 a 3,40 (mt, 2H: NCH_{2} del etilo); 3,34 (t, J = 12 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,54 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 4,57 (dd, J = 7,5 y 6 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,76 (dd ancho, J = 13 y 7,5 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 4,84 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,89 (dd, J = 10 y 1 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,21 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha); 5,28 (d ancho, J = 6 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,91 (mt, 1H: 1 \beta); 6,48 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 2); 6,60 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \varepsilon); 7,03 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \delta); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos en 6); 7,47 (AB límite, 2H: 1' H_{4} y 1' H_{5}); 7,89 (mt, 1H: 1' H_{6}); 8,42 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,76 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 6); 11,62 (s,
1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 23
Preparación de la 4\zeta-trifluorometoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en agua de hidrocloruro de 4-O-trifluorometiltirosina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 34-8. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\zeta-trifluorometoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en dos veces en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 60% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 40% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\zeta-trifluorometoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 46,5 mg de 4\zeta-trifluorometoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,77 (dd, J = 16 y 5,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 1,08 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); de 1,30 a 1,40 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); de 1,55 a 1,70 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,65 y 1,76 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 (3); 2,11 y 2,40 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,54 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,88 (dt, J = 13 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 e); 3,08 (dd, J = 12 y 5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); 3,22 (s, 3H: NCH_{3}); de 3,30 a 3,45 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \delta); 3,39 (t, J = 12 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,59 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 4,53 (t, J = 7,5 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,75 (dd ancho, J = 13 y 8 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 e); 4,85 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,89 (dd, J = 10 y 1,5 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,35 (d ancho, J = 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,41 (dd, J = 12 y 5 Hz, 1H: 4 \alpha); 5,92 (d, J = 10 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,93 (mt, 1H: 1 \beta); 6,53 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 2); de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos en 6); 7,16 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \varepsilon); 7,26 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \delta); 7,37 (dd, J = 8,5 y 4 Hz, 1H: 1' H_{5}); 7,42 (dd, J = 8,5 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{4}); 7,70 (dd, J = 4 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{6}); 8,37 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,75 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 6); 11,66 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 24
Preparación de la 4\zeta-aliloxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 90 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en ácido clorhídrico 0,1 N de hidrocloruro de 4-O-aliltirosina (S) sintetizada como en el ejemplo 33. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 2,7 litros de mosto producidos en los 90 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\zeta-aliloxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 52% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 48% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\zeta-aliloxi-des (4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 29 mg de 4\zeta-aliloxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,63 (dd, J = 16 y 6 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 1,13 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); 1,29 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,33 (d, J = 6,5 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); 1,57 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,65 y 1,74 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2}, en 2 \beta) ; 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,14 y 2,34 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,43 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,85 (dt, J = 13 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 2,95 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); 3,25 (s, 3H: NCH_{3}); 3,33 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \delta); 3,36 (t, J = 12 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,56 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 4,51 (AB límite, 2H: OCH_{2} del alilo); 4,56 (t, J = 7,5 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,75 (dd ancho, J = 13 y 8 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 e); 4,84 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,88 (dd, J = 10 y 1 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,27 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha); 5,32 (d ancho, J = 6 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,30 y 5,40 (respectivamente, mt y dd, J = 17 y 1,5 Hz, 1H cada uno: =CH_{2} de alilo); 5,89 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,91 (mt, 1H: 1 \beta); 6,02 (mt, 1H: CH= del alilo); 6,50 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 2); 6,85 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \varepsilon); 7,12 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \delta); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos en 6); 7,45 (dd, J = 8,5 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{4}); 7,57 (dd, J = 8,5 y 4 Hz, 1H: 1' H_{5}); 7,77 (dd, J = 4 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{6}); 8,41 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,74 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 6); 11,63 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 25
Preparación de la 4\zeta-etoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 90 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en ácido clorhídrico 0,1 N de hidrocloruro de 4-O-etiltirosina (S) sintetizada como en el ejemplo 33. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 2,7 litros de mosto producidos en los 90 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\zeta-etoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 52% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 48% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\zeta-etoxi-des (4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 29 mg de 4\zeta-etoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,64 (dd, J = 16 y 5,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 1,12 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); 1,25 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); 1,42 (t, J = 7 Hz, 3H: CH_{3} del etilo); 1,57 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,63 y 1,74 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,16 y 2,35 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,43 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,83 (dt, J = 13 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 2,93 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); de 3,15 a 3,30 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \delta); 3,24 (s, 3H: NCH_{3}); 3,35 (t, J = 12 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,55 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 3,95 (AB límite, 2H: OCH_{2} del etilo); 4,56 (dd, J = 7,5 y 6 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,75 (dd ancho, J = 13 y 8 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 4,84 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,87 (dd, J = 10 y 1 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,26 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha); 5,32 (d ancho, J = 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,88 (d, J = 10 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,92 (mt, 1H: 1 \beta); 6,48 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 2); 6,83 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \varepsilon); 7,10 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \delta); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos en 6); 7,44 (dd, J = 8,5 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{4}); 7,57 (dd, J = 8,5 y 4,5 Hz, 1H: 1' H_{5}); 7,77 (dd, J = 4,5 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{6}); 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,75 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 6); 11,60 (s, 1H: OH).
Ejemplo 26
Preparación de la 4\zeta-(2-cloroetoxi)-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en agua de hidrocloruro de 4-O-(2-cloroetil)tirosina (S) sintetizada como en el ejemplo 42-1. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\zeta-(2-cloroetoxi)-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 60% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 40% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\zeta-(2-cloroetoxi)-des (4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 3,2 mg de 4\zeta-(2-cloroetoxi)-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de RM.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,66 (dd, J = 16 y 5,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 1,13 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); 1,28 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); 1,57 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,66 y 1,76 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,16 y 2,37 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,47 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,86 (dt, J = 13 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 2,95 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); 3,23 (s, 3H: NCH_{3}); 3,32 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \delta); 3,37 (t, J = 12 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,57 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 3,82 (t, J = 6 Hz, 2H: CH_{2}Cl); 4,19 (AB límite, 2H: OCH_{2} del etilo); 4,55 (dd, J = 7,5 y 7 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,75 (dd ancho, J = 13 y 8 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 4,84 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,87 (d ancho, J = 10 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,28 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha); 5,32 (d ancho, J = 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,88 (d, J = 10 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,90 (mt, 1H: 1 \beta); 6,50 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 2); 6,86 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \varepsilon); 7,13 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \delta); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos en 6); 7,45 (AB límite, 2H: 1' H_{4} y 1' H_{5}) 7,75 (dd, J = 4 y 2 Hz, 1H: 1' H_{6}); -8,38 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,74 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 6); 11,62 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 27
Preparación de la 4\zeta-acetil-des 4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en sosa 0,1 N de 4-acetil fenilalanina (S) sintetizada como en el ejemplo 33. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\zeta-acetil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 60% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 40% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\zeta-acetil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 4,2 mg de 4\zeta-acetil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,73 (dd, J = 16 y 6 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 1,12 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); de 1,25 a 1,45 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); 1,62 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma); de 1,60 a 1,85 (mt, 2H CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 (3); 2,20 y 2,42 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,52 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,60 (s, 3H: ArCOCH_{3}); 2,88 (dt, J = 13 y 4,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 3,13 (dd, J = 13,5 y 5,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); 3,21 (s, 3H: NCH_{3}); de 3,30 a 3,50 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); de 3,30 a 3,50 y 3,63 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 3 \delta); 4,53 (t, J = 7,5 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,75 (dd ancho, J = 13 y 8 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 4,84 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,88 (dd, J = 10 y 1 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,35 (d ancho, J = 6 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,43 (dd, J = 10,5 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha); 5,90 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,92 (mt, 1H: 1 \beta); 6,56 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 2); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos en 6); 7,28 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \delta); 7,38 (dd, J = 8,5 y 2 Hz, 1H: 1' H_{4}); 7,42 (dd, J = 8,5 y 4,5 Hz, 1H: 1' H_{5}); 7,66 (dd, J = 4,5 y 2 Hz, 1H: 1' H_{6}); 7,88 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \varepsilon); 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,74 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 6); 11,65 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 28
Preparación de la 4\varepsilon-dimetilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en sosa 0,1 N de dihidrocloruro de 3-dimetilaminofenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 35-10. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\varepsilon-dimetilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 3 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 57% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 43% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\varepsilon-dimetilamino-des (4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 1,1 mg de 4\varepsilon-dimetilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,63 (dd, J = 16 y 5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 1,13 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); de 1,20 a 1,35 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); 1,57 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,63 y 1,76 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,08 y 2,31 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,35 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,81 (dt, J = 13 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 2,90 (s, 6H: N(CH_{3})_{2}); 2,97 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); de 3,20 a 3,30 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \delta); 3,28 (s, 3H: NCH_{3}); 3,37 (t, J = 12 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,57 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 4,58 (t, J = 7,5 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,74 (dd ancho, J = 13 y 8 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 4,86 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,89 (d ancho, J = 10 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,27 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha); 5,29 (d ancho, J = 5 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,89 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,90 (mt, 1H: 1 \beta); 6,50 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 2); de 6,50 a 6,70 (mt, 3H: H Aromáticos en orto y en para del dimetilamino); de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos en 6); 7,20 (t, J = ml de una disolución a 20 g/l en sosa 0,1 N de hidrocloruro de 3-metiltiofenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 34-11. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,68 litros de mosto producidos en los 56 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice
(30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 54% agua y 46% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 55% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 45% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 20 mg de 4\varepsilon-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,56 (dd, J = 16 y 5,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 1,13 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); 1,28 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); 1,58 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,62 y 1,74 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,25 y 2,35 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,39 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,43 (s, 3H: SCH_{3}); 2,82 (dt, J = 13 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 2,98 (dd, J = 12 y 4,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); 3,26 (s, 3H: NCH_{3}); 3,30 (t, J = 12 Hz 1H: 1H del CH_{2} en 3 \delta); 3,38 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,57 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 4,56 (t, J = 7,5 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,74 (dd ancho, J = 13 y 8 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 4,84 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,89 (dd, J = 10 y 1 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,29 (dd, J = 12 y 4,5 Hz, 1H: 4 \alpha); 5,32 (d ancho, J = 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,90 (mt, 1H: 1 \beta); 6,51 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 2); 6,99 (d ancho, J = 8 Hz, 1H: H Aromático en para del metiltio); 7,10 y 7,15 (respectivamente s ancho y d ancho, J = 8 Hz, 1H cada uno: H Aromáticos en orto del metiltio); de 7,15 a 7,35 (mt, 6H: H Aromáticos en 6 y H Aromáticos en meta del metiltio); 7,43 (d ancho, J = 8 Hz, 1H: 1' H_{4}); 7,52 (dd, J = 8 y 4 Hz, 1H: 1' H_{5}); 7,79 (d ancho, J = 4 Hz, 1H: 1' H_{6}); 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,73 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 6); 11,62 (s, 1H: OH).
\newpage
Ejemplo 30
Preparación de la 4\varepsilon-etoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 60 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en sosa 0,2 N de hidrocloruro de 3-O-etiltirosina (S) sintetizada como en el ejemplo 37-1. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 1,8 litros de mosto producidos en los 60 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el nuevo derivado de pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. Se obtienen 19 mg de resto seco. Éste se recoge con 3 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 60% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 40% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la nueva pristinamicina se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 15,8 mg de 4\varepsilon-O-etoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,55 (dd, J = 16 y 5,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); 1,12 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \beta); 1,20 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,31 (d, J = 6,5 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); 1,49 (t, J = 7 Hz, 3H: CH_{3} del etilo); 1,54 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,63 y 1,73 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,22 y 2,33 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); 2,46 (d, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,83 (dt, J = 13 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 2,95 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); 3,22 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \delta); 3,27 (s, 3H: NCH_{3}); 3,39 (t, J = 12 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,53 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 3,93 y 4,03 (2 mts, 1H cada uno: OCH_{2} del etilo); 4,56 (dd, J = 7 y 5,5 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,75 (dd ancho, J = 13 y 8 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 4,82 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,88 (dd, J = 10 y 1 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,23 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha); 5,23 (d ancho, J = 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,87 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,92 (mt, 1H: 1 \beta); 6,47 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 2); 6,80 (mt, 3H: H Aromáticos en orto y en para del etoxi); de 7,10 a 7,35 (mt, 6H: H Aromáticos en 6 y H Aromáticos en meta del etoxi); 7,43 (dd, J = 8 y 1 Hz, 1H: 1' H_{4}); 7,50 (dd, J = 8 y 4 Hz, 1H: 1' H_{5}); 7,77 (dd, J = 4 y 1 Hz, 1H: 1' H_{6}); 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,70 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 6); 11,60 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 31
Preparación de la 4\zeta-etiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 2 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en sosa 0,1 N de hidrocloruro de 4-etiltiofenilalanina (S) sintetizada como en el ejemplo 33. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 60 ml de mosto producidos en los 2 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con 0,5 volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\zeta-etiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 60% agua y 40% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 52% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 48% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\zeta-etiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen ? mg de 4\zeta-etiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Espectro de R.M.N. ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm); 0,68 (dd, J = 16 y 6 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); de 1,10 a 1,40 (mt, 5H: 1H del CH_{2} en 3 \beta y 1H del CH_{2} en 3 \gamma y CH_{3} del etilo); 1,32 (d, J = 7 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); de 1,45 a 1,85 (mt, 3H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma y CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 (3); 2,18 y 2,37 (respectivamente mt y d ancho, J = 16,5 Hz, 1H cada uno : CH_{2} en 5 \delta); 2,45 (d ancho, J = 16 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,85 (dt, J = 13 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 2,90 (mt, 2H: ArSCH_{2} etilo); 2,98 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); 3,25 (s, 3H: NCH_{3}); 3,35 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \delta); 3,39 (t, J = 12 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,57 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 4,55 (t, J = 7,5 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,75 (dd ancho, J = 13 y 7,5 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 4,85 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,89 (dd, J = 10 y 1 Hz, 1H: 1 \alpha); de 5,25 a 5,40 (mt, 2H: 5 \alpha y 4 \alpha); 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,91 (mt, 1H: 1 \beta); 6,55 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 2); 7,10 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \delta); de 7,10 a 7,35 (mt, 7H: H Aromáticos en 6 y 4 \varepsilon); 7,44 (AB límite, 2H: 1' H_{4} y 1' H_{5}); 7,74 (mt, 1H: 1' H_{6}); 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,75 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH en 6); 11,62 (s,
1H: OH).
\newpage
Ejemplo 32
Preparación de la 4\zeta-etil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
Se realiza a escala de 2 erlenmeyers como se ha descrito en el ejemplo 3 un cultivo de la cepa SP92::pVRC508 en medio de producción con la adición a las 16 h de 1 ml de una disolución a 20 g/l en sosa 0,1 N de 4-etilfenilalanina (R,S) sintetizada como en el ejemplo 33. Al final de las 40 h de cultivo, se extraen los 60 ml de mosto producidos en los 2 erlenmeyers con 2 volúmenes de una mezcla de 66% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 34% de acetonitrilo y se centrifugan. El sobrenadante se extrae 2 veces con volúmenes de diclorometano. Las fases clorometilénicas se lavan con agua, se combinan, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan. El extracto seco se recoge con 20 ml de diclorometano y se inyecta en una columna de sílice (30 g) montada en diclorometano y eluida sucesivamente y gradualmente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen la 4\zeta-etil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se evaporan. El resto seco se recoge con 7 ml de una mezcla 52% agua y 48% acetonitrilo y se inyecta en una columna semi-preparativa Nucleosil 7 \mu C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluida en una mezcla de 52% de tampón fosfato 100 mM pH 2,9 y 48% de acetonitrilo. Las fracciones que contienen la 4\zeta-etil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} se reagrupan y se extraen con un volumen de diclorometano. La fase orgánica se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se evapora. Se obtienen 0,50 mg de 4\zeta-etil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
Espectro de R.M.N. ^{1} H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm, ref. TMS): 0,42 (dd, J = 16 y 5,5 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); de 1,10 a 1,40 (mt, 2H: 1H del CH_{2} en 3 \beta y 1H del CH_{2} en 3 \gamma); 1,23 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} del etilo); 1,35 (d, J = 7 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); de 1,45 a 1,85 (mt, 3H: el otro H del CH_{2} en 3 \gamma y CH_{2} en 2 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,15 y de 2,25 a 2,40 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 5 \delta); de 2,25 a 2,40 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,60 (q, J = 7,5 Hz, 2H: ArCH_{2} del etilo); 2,83 (dt, J = 13 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 e); 2,98 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 4 \beta); de 3,25 a 3,35 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 3 \delta); 3,27 (s, 3H: NCH_{3}); 3,39 (t, J = 12 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 4 \beta); 3,59 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \delta); 4,58 (dd, J = 7 y 6,5 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,75 (dd ancho, J = 13 y 8 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 e); 4,87 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,89 (dd, J = 10 y 1 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,24 (d ancho, J = 5,5 Hz, 1H: 5 \alpha); 5,29 (dd, J = 12 y 4 Hz, 1H: 4 \alpha); 5,88 (d, J = 10 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,92 (mt, 1H: 1 \beta); 6,73 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 2); de 7,10 a 7,35 (mt, 9H: H Aromáticos en 6 - 4 \varepsilon y 4 \delta); 7,44 (dd, J = 8,5 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{4}); 7,50 (dd, J = 8,5 y 4,5 Hz, 1H: 1' H_{5}); 7,80 (dd, J = 4,5 y 1,5 Hz, 1H: 1' H_{6}); 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 8,75 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 6); 11,66 (s, 1H: OH).
A partir de las mismas fracciones resultantes de la columna de sílice descrita anteriormente, que contienen igualmente el nuevo derivado de pristinamicina I_{H}, se aíslan 0,3 mg de \zeta-etil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H} operando la cromatografía en columna semi-preparativa como se ha descrito anteriormente.
Espectro de R.M.N. ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}, \delta en ppm); 0,04 (mt, 1H: 1H del CH_{2} en 5 \beta); 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} en 2 \gamma); de 1,10 a 1,40 (mt, 2H: 1H del CH_{2} en 5 \delta y 1H del CH_{2} en 5 \gamma); 1,18 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH_{3} del etilo); 1,30 (d, J = 6,5 Hz, 3H: CH_{3} en 1 \gamma); de 1,45 a 1,85 (mt, 7H: el otro H del CH_{2} en 5 \gamma - el otro H del CH_{2} en 5 \delta - 1H del CH_{2} en 3 \beta - CH_{2} en 3 \gamma y CH_{2} en 2 \beta); 1,81 (d ancho, J = 13 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \beta); 2,02 (mt, 1H: el otro H del CH_{2} en 3 \beta); 2,40 (dt, J = 13 y 4 Hz, 1H: 1H del CH_{2} en 5 e); 2,65 (q, J = 7,5 Hz, 2H: Ar CH_{2} del etilo); 2,97 y 3,09 (respectivamente dd y t, J = 12 y 5 Hz y J = 12 Hz, 1H cada uno: CH_{2} en 4 \beta); 3,50 y 3,60 (2 mts, 1H cada uno: CH_{2} en 3 \delta); 4,13 (dd, J = 8 y 5 Hz, 1H: 3 \alpha); 4,49 (d ancho, J = 13 Hz, 1H: el otro H del CH_{2} en 5 \varepsilon); 4,70 (mt, 2H: 5 \alpha y 4 \alpha); 4,77 (mt, 1H: 2 \alpha); 4,83 (dd, J = 10 y 1 Hz, 1H: 1 \alpha); 5,50 (d, J = 7 Hz, 1H: 6 \alpha); 5,74 (mt, 1H: 1 \beta); 6,09 (d, J = 4 Hz, 1H: NH en 4); 6,72 (mt, 1H: NH en 2); 7,07 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 e); 7,15 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos en 4 \delta); de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos en 6); 7,40 (dd, J = 8 y 1 Hz, 1H: 1' H_{4}); 7,45 (dd, J = 8 y 4 Hz, 1H: 1' H_{5}); 7,92 (dd, J = 4 y 1 Hz, 1H: 1' H_{6}); 8,40 (mt, 1H: NH en 6); 8,50 (d, J = 10 Hz, 1H: NH en 1); 11,72 (s, 1H: OH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 33
Preparación de derivados de fenilalanina y de ácido fenilpirúvico ya descritos
La fenilalanina y los derivados 4-metoxifenilalanina, 4-bromofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-yodofenilalanina, 4-trifluorometilfenilalanina, 4-aminofenilalanina, 3-metoxifenilalanina utilizados son comerciales.
Los derivados siguientes de fenilalanina pueden prepararse según los métodos descritos en la bibliografía.
\vskip1.000000\baselineskip
4-Dimetilaminofenilalanina (RS)
D.F. Elliott, A.T. Fuller, C.R. Harrington, J. Chem. Soc., 1948, 85-89.
\vskip1.000000\baselineskip
4-Dietilaminofenilalanina (RS)
Moldaver B.L., Pushkareva Z.V., Zhur. Obshchei Khim,. 31, 1560-1569 (1961);
C. A. 1961, 22226f.; J.A Stock, J. Chem. Soc, 1959, 90-97
\vskip1.000000\baselineskip
4-Etilaminofenilalanina (RS)
F. Bergel, J.A. Stock, J. Chem. Soc, 1959, 90-97.
\vskip1.000000\baselineskip
4-Fenilfenilalanina (RS)
J.V. Braun, J. Nelles, Berichte, 66B, 193, 1464-1470.
\vskip1.000000\baselineskip
4-Metilfenilalanina (RS)
R.R., Herr, T. Enjoki, J.P. Dailey, J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4229-4231.
\vskip1.000000\baselineskip
4-Metiltiofenilalanina (RS) y 4-Etiltiofenilalanina (R,S)
R.L. Colescott, R.R. Herr, J.P. Dailey J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4232-4235.
\vskip1.000000\baselineskip
4-Metoxicarbonilfenilalanina (RS)
H. Cleland, J. Org. Chem., 1969, 34, 747.
\vskip1.000000\baselineskip
2,4 Dimetilfenilalanina (RS)
R.R., Herr, T. Enjoki, J.P. Dailey, J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4229-4231.
\vskip1.000000\baselineskip
3,4 Dimetilfenilalanina (RS)
RR., Herr, T. Enjoki, J.P. Dailey, J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4229-4231.
\vskip1.000000\baselineskip
3-Trifluorometilfenilalanina (RS), hidrocloruro
R. Filler y H. Novar, J. Org. Chem, 1960, 25, 733-736.
\vskip1.000000\baselineskip
4-Aminometil fenilalanina (S)
G.E. Stokker, W.F. Hoffman y C.F. Homnick, J. Org. Chem., 1993, 58, 5015-5017.
\vskip1.000000\baselineskip
3-Metilfenilalanina (R,S)
J.H Burckhalter, V.C Stephens, J.A.C.S. 1951, 73, 56-58.
\vskip1.000000\baselineskip
4-Acetil fenilalanina (R,S)
J.I. Degaw et al., J. Med. Che., 1969, 11, 225-227
\vskip1.000000\baselineskip
4-O-Alil tirosina (S)
A. Loffet, H. Zang, Int. J. Pept. Protein Res., 1993, 42, 346
\vskip1.000000\baselineskip
4-O-Etil tirosina (S)
Y. Sasaki et al, Chem. Pharm, Bull., 1982, 30,4435
\vskip1.000000\baselineskip
4-Etil fenilalanina (RS)
A. Zhuze et al., Coll., Czech. Chem. Commmm., 1965, 62, 2648
\vskip1.000000\baselineskip
El ácido 4-terc-butilfenilpirúvico puede prepararse según
R. Breslow, J.W. Canary, M. Varney, S.T. Waddell y D. Yang, J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 5212-5219.
\vskip1.000000\baselineskip
Los demás derivados de fenilalanina se prepararon según los ejemplos 34 a 42 indicados más adelante. En estos ejemplos, las cromatografías flash se efectúan bajo una presión de nitrógeno media de 50 kPa, utilizando una sílice con una granulometría 40-53 \mum, según Still et al., J. Org. Chem., 43, 2923, (1978).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 34
Preparación de derivados de fenilalanina y de un derivado de ácido fenilpirúvico por el método A
9
34-1: 4-Metilaminofenilalanina (RS), dihidrocloruro
A 3,70 g de N-acetil 4-metilaminofenilalaninato de metilo se añaden 37 ml de ácido clorhídrico 12 N y la mezcla se calienta a reflujo con agitación durante 8 h. Después de una noche a temperatura ambiente, el medio de reacción se concentra a sequedad bajo presión reducida (50 kPa), se recoge con una mezcla de 50 ml de tolueno y 50 ml de etanol y se concentra de nuevo. Después de secar en desecador bajo presión reducida (2,6 kPa), se obtienen 4,18 g (100%) de dihidrocloruro de 4-metilaminofenilalanina (RS) en forma de un sólido beige claro higroscópico que funde a 158ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
34-2: N-Acetil 4-metilaminofenilalaninato de metilo (RS)
A 4 g de 4-metilamino2-acetamido cinamato de metilo situado bajo atmósfera de nitrógeno en un autoclave, se añaden 0,4 g de paladio sobre carbón al 10% y 50 ml de etanol absoluto. La mezcla se pone bajo una presión de 5,5 bares de hidrógeno y se calienta 15 h a 50ºC con agitación. Después de estabilizar la temperatura a 26ºC y de volver a presión atmosférica, el medio de reacción se filtra sobre Clarcel®, se lava con etanol y se concentra a sequedad bajo presión reducida (2,6 kPa). Se obtienen así 3,73 g de N-acetil 4-metilaminofenilalaninato de metilo en forma de cristales blancos que funden a 118ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
34-3: 4-Metilamino 2-acetamido cinamato de metilo
En un matraz de tres bocas situado bajo nitrógeno se añaden 5,75 g de 2-acetamido acrilato de metilo, 0,185 g de acetato de paladio, 8,1 g de cloruro de tetrabutil amonio y 6,03 g de hidrógenocarbonato de sodio y se añaden a esta mezcla 6,5 g de 4-yodo N-metilanilina en disolución en 200 ml de DMF. La mezcla se calienta 16 h 30 mn a 82ºC y después de enfriar se vierte sobre 1.000 ml de agua destilada. El medio se recoge con 250 ml de CH_{2}Cl_{2}, la fase orgánica se decanta y la fase acuosa se lava 2 veces con 250 ml de CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas se reúnen, se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran bajo presión reducida (50 kPa) a 70ºC para proporcionar un aceite marrón que se purifica por cromatografía flash (eluyente AcOEt/ciclohexano y AcOEt puro).
Se obtienen así 4 g de 4-metilamino 2-acetamido cinamato de metilo, en forma de un sólido amarillo (Sílice Merck 5719, Rf= 0,48) que se utiliza tal cual.
La N-metil-p-yodoanilina puede prepararse según: S. Krishnamurthy, Tetrahedron Letters, 33, 3315-3318, 1982.
\vskip1.000000\baselineskip
34-4: Ácido 4-metilamino fenilpirúvico
Se ponen en un matraz 2,4 g de 4-metilamino 2-acetamido cinamato de metilo y 32 ml de ácido clorhídrico 12 N. La mezcla se calienta a reflujo 3 h, se enfría y se lava 2 veces con 20 ml de éter dietílico. La fase acuosa se enfría a -10ºC y el precipitado obtenido se filtra y se lava con un mínimo de ácido clorhídrico frío. El sólido obtenido se seca en un desecador bajo presión reducida para proporcionar 1,1 g de ácido 4-metilamino fenilpirúvico en forma de un sólido beige claro que funde a 210ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
34-5: 3-Fluoro 4-metilfenilalanina (R,S), hidrocloruro
Operando como en el ejemplo 34-1 pero a partir de 1,6 g de N-Acetil (3-fluoro-4 metil)fenilalaninato de metilo, se obtienen 0,6 g de hidrocloruro de 3-fluoro 4-metil fenilalanina (R,S) en forma de cristales blancos que funden a una temperatura superior a 260ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
34-6: N-Acetil (3-fluoro-4 metil)fenilalaninato de metilo (R.S)
Operando como en el ejemplo 34-2 pero a partir de 1,9 g de (4-metil 3-fluoro)2-acetamido cinamato de metilo, de 0,2 g de paladio sobre carbón al 10% en 230 ml de etanol, se obtienen 1,6 g de N-acetil (3-fluoro-4 metil)fenilalaninato de metilo en forma de un aceite incoloro (Sílice Merck 5719, Rf= 0,46; eluyente CH_{2}Cl_{2}/AcOEt 50/50).
\vskip1.000000\baselineskip
34-7: (3-Fluoro 4-metil)2-acetamido cinamato de metilo
Operando como en el ejemplo 34-3 pero a partir de 3,6 g de 2-acetamido acrilato de metilo, 0,12 g de acetato de paladio, 5,2 g de cloruro de tetrabutil amonio, de 3,8 g de hidrógenocarbonato de sodio y de 4 g de 2-fluoro 4-bromo tolueno en disolución en 120 ml de DMF anhidro, se obtienen 2,6 g de (3-fluoro 4-metil)2-acetamido cinamato de metilo en forma de un sólido blanco que funde a 163ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
34-8: 4-Trifluorometoxifenilalanina (R,S), hidrocloruro o O-trifluorometil tirosina, hidrocloruro (R,S)
Operando como en el ejemplo 34-1 pero a partir de 3 g de N-Acetil (4-trifluorometoxi)fenilalaninato de metilo y de 30 ml de ácido clorhídrico 12 N, se obtienen 1,5 g de hidrocloruro de 4-trifluorometoxi fenilalanina (RS) en forma de cristales blancos que funden a 260ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
34-9: N-Acetil (4-trifluorometoxi)fenilalaninato de metilo (R,S)
Operando como en el ejemplo 34-2 pero a partir de 3,1 g de (4-trifluorometoxi)2-acetamido cinamato de metilo, de 0,3 g de paladio sobre carbón al 10% en 50 ml de etanol, se obtienen 3 g de N-acetil (4-trifluorometoxi)fenilalaninato de metilo en forma de un sólido blanco que funde a 80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
34-10: 4-Trifluorometoxi-2-acetamido cinamato de metilo
Operando como en el ejemplo 34-3 pero a partir de 4,3 g de 2-acetamido acrilato de metilo, 0,14 g de acetato de paladio, 6,1 g de cloruro de tetrabutil amonio, de 4,6 g de hidrógenocarbonato de sodio y de 5 g de 4-trifluorometoxi bromo benceno en disolución en 150 ml de DMF anhidro.
Se obtienen 3,1 g de (4-trifluorometoxi)2-acetamido cinamato de metilo en forma de un sólido blanco que funde a 135ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
34-11: 3-Metiltiofenilalanina (RS), hidrocloruro
Operando como en el ejemplo 34-1 pero a partir de 3,3 g de N-acetil-3-metiltio fenilalaninato de metilo y de 40 ml de ácido clorhídrico 12 N, se obtienen 1,38 g de hidrocloruro de 3-metiltio fenilalanina (RS) en forma de cristales blancos que funden a 190ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
34-12: N-Acetil 3-metiltio fenilalaninato de metilo (RS)
Se ponen en un matraz 3,72 g de 3-metiltio 2-acetamido cinamato de metilo en disolución en 100 ml de metanol y 30 ml de tetrahidrofurano y se añaden 1,4 g de magnesio. Después de 20 mn de reacción, se enfría el medio con un baño de hielo y se añaden de nuevo 1,4 g de magnesio. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 18 h, se vierte sobre 1,4 1 de agua destilada y 300 ml de CH_{2}Cl_{2} y se filtra sobre Carcel®. La fase acuosa se ajusta a pH 6 por la adición de ácido clorhídrico 12 N, se decanta y se lava con 100 ml de CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas se reúnen, se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran a sequedad bajo presión reducida para proporcionar 3,42 g de N-acetil 3-metiltio fenilalaninato de metilo en forma de un aceite incoloro (Sílice Merck 5719, Rf= 0,5; AcOEt).
\vskip1.000000\baselineskip
34-13: 3-Metiltio-2-acetamido cinamato de metilo
Operando como en el ejemplo 34-3 pero a partir de 5,6 g de 2-acetamido acrilato de metilo, 0,18 g de acetato de paladio, 8,2 g de cloruro de tetrabutil amonio, de 5,86 g de hidrógenocarbonato de sodio y de 6,5 g de 3-yodo 1-metiltiobenceno en disolución en 160 ml de DMF anhidro, se obtienen 4,8 g de (3-metiltio)2-acetamido cinamato de metilo en forma de un sólido blanco que funde a 139ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
34-14: 3-Yodometiltiobenceno
Se ponen con agitación en un matraz de tres bocas 20 ml de agua destilada y 20 ml de ácido clorhídrico 12 N y se añaden con una bureta de vertido 10 ml de 3-metiltio anilina. La mezcla se templa para asegurar la disolución y se enfría a 5ºC. Se añaden lentamente con una bureta de vertido 5,86 g de nitrito de sodio en disolución en 15 ml de agua manteniendo la temperatura entre 5 y 8ºC. 20 mn después de terminar la adición, se añaden 13,57 g de yoduro de potasio en disolución en 15 ml de agua en 10 mn y la mezcla se agita 15 h a temperatura ambiente. El aceite formado se separa de la fase acuosa por decantación y se añade una disolución acuosa de tiosulfato de sodio. La fase acuosa se decanta y el producto se extrae con 100 ml de diclorometano. La fase orgánica se lava con 100 ml de agua, la fase acuosa se ajusta a pH 9 con sosa concentrada y se decanta. La fase orgánica se lava 2 veces con 100 ml de agua, se decanta, se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra a sequedad bajo presión reducida (50 kPa) a 40ºC. El producto resultante se purifica por cromatografía flash (eluyente ciclohexano) para proporcionar 13 g de 3-yodo 1-metiltiobenceno en forma de un líquido amarillo (Sílice Merck 5719, Rf= 0,8/ciclohexano).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 35
Preparación de derivados de fenilalanina por el método B 
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
35-1: 4-terc-Butilfenilalanina (RS)
En un matraz de tres bocas con un refrigerante en la parte superior se añaden 25 g de 4-(terc butil)bencil acetamidomalonato de dietilo y 250 ml de ácido clorhídrico al 37%. La mezcla se agita y se calienta a reflujo hasta que no hay liberación gaseosa. Después de enfriar el medio de reacción, el precipitado obtenido se filtra y se recristaliza en acetonitrilo para proporcionar 25, 6 g de hidrocloruro de 4-terc-butilfenilalanina (R,S) en forma de un sólido blanco que funde a 234ºC. (Véase igualmente Journal of the Takeda Research Laboratories Vol. 43; Nº 3/4, Dic1984 p53-76).
\vskip1.000000\baselineskip
35-2: 4-(terc butil)bencil acetamidomalonato de dietilo
En un matraz de tres bocas con un refrigerante en la parte superior, se añaden bajo atmósfera de nitrógeno, 25 g de bromuro de 4-terc-butil bencilo, 50 ml de tolueno anhidro y 3,1 g de hidruro de sodio en suspensión en aceite al 80% y 21,8 g de acetamido malonato de dietilo. La mezcla se calienta a 110ºC durante 17 h. Después de enfriar, se añaden lentamente mediante una bureta de vertido 15 ml de etanol absoluto y 15 ml de etanol al 50% y 50 ml de agua. La fase orgánica se decanta y la fase acuosa se lava 3 veces con 50 ml de éter dietílico. Las fases orgánicas se reúnen, se lavan con agua y se secan sobre sulfato de sodio. Después de filtrar y de concentrar bajo presión reducida, el producto se cristaliza en éter de petróleo para proporcionar 25 g de 4-(terc-butil)bencil acetamidomalonato de dietilo en forma de un sólido blanco que funde a 80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
35-3: 3-Metilaminofenilalanina (R,S), dihidrocloruro
Operando como en el ejemplo 35-1 pero a partir de 1,17 g 3-metilamino bencil acetamidomalonato de dietilo y 20 ml de ácido clorhídrico 12 N, se obtienen 1, 03 g de un sólido amarillo beige. Éste se disuelve en 20 ml de etanol absoluto y se le añaden 0,4 g de negro animal. La disolución se filtra sobre Carcel®, se filtra y se concentra bajo presión reducida (50 kPa). La misma operación se repite con 1 g de negro animal y el sólido obtenido se tritura en 20 ml de éter. Después de filtrar y de secar bajo presión reducida (2,7 kPa) a 50ºC, se obtienen 0,65 g de dihidrocloruro de 3-metilaminofenilalanina (R,S) en forma de un polvo blanco que funde hacia 135ºC (descomposi-
ción).
\vskip1.000000\baselineskip
35-4: 3-Metilamino bencil acetamidomalonato de dietilo
Se ponen en un matraz de tres bocas mantenido bajo atmósfera de nitrógeno 3,11 ml de anhídrido acético. Se añaden en 3 mn a 0ºC, 1,51 ml de ácido fórmico y se calienta a 50ºC durante 2 horas. Se deja que la mezcla vuelva a temperatura ambiente agitando durante 3 h 20 y se añaden 4 ml de THF anhidro bajo nitrógeno y se enfría a - 20ºC. Se añade en 10 mn, una disolución de 4 g de 3-aminobencil acetamidomalonato de dietilo en una mezcla de 15 ml de THF anhidro y de 15 ml de diclorometano anhidro. La agitación se continúa 1 h 10 mn a -20ºC y a 20ºC durante 16 h. la mezcla de reacción se concentra a sequedad bajo presión reducida (50 kPa) a 30ºC y se coevapora con 30 ml de tolueno anhidro para proporcionar un sólido blanco que se disuelve en una mezcla de 10 ml de THF anhidro y de 20 ml de dicloro 1,2 etano anhidro y se pone en un matraz de tres bocas bajo nitrógeno.
El medio se enfría a -5ºC y se añaden 1,55 ml de complejo borano-dimetilsulfuro (disolución 2M en THF) en 10 mn. Se deja que el medio vuelva a temperatura ambiente y la disolución se calienta 3 h a reflujo y se agita 15 h a temperatura ambiente. El medio de reacción se enfría a 0ºC y se añaden en 25 mn, 10 ml de MeOH. Se agita 45 mn a 0ºC y 30 mn a temperatura ambiente. Se enfría a 0ºC y se hace burbujear HCl gas hasta pH 2. Se calienta 1 h a reflujo y la mezcla se concentra a sequedad bajo presión reducida a 30ºC para proporcionar 5 g de un producto que se recoge con 30 ml de una disolución acuosa de NaHCO_{3} y de 30 ml de CH_{2}Cl_{2}. La fase orgánica se decanta y la fase acuosa se lava con 20 ml de agua. Las fases orgánicas se reúnen, se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran a sequedad bajo presión reducida (2,6 kPa) par proporcionar 3,43 g de un aceite amarillo que se purifica por cromatografía flash (eluyente AcOEt-ciclohexano 50/50). Se obtienen así después de secar bajo presión reducida (2,7 kPa) a 20ºC, 1,18 g de 3-metilamino bencil acetamidomalonato de dietilo en forma de un sólido beige claro que funde a 122ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
35-5: 3-Aminobencil acetamidomalonato de dietilo
El 3-amino bencil acetamidomalonato de dietilo puede prepararse como se describe en:
T.S. Osdene, D.N. Ward, W.H. Chapman y H. Rakoff, J. Am. Chem. Soc., 81, 1959, 3100-3102.
\vskip1.000000\baselineskip
35-6: 3-Etilaminofenilalanina (R,S), dihidrocloruro
Operando como en el ejemplo 34-1 pero a partir de 2 g de N-acetil 3-etilamino fenilalaninato de etilo (R,S) y de 30 ml de ácido clorhídrico 12 N, se obtienen 1,7 g de dihidrocloruro de 3-etilamino fenilalanina (R,S) en forma de un sólido beige claro higroscópico que contiene 10% molar de dihidrocloruro de 3-dietilamino fenilalanina (R,S).
\vskip1.000000\baselineskip
35-7: N-Acetil 3-etilamino fenilalaninato de etilo (RS)
Se ponen en un matraz bajo atmósfera de nitrógeno, 3 g de N-acetil 3-amino fenilalaninato de etilo (R,S), 40 ml de etanol y 14 g de níquel de Raney previamente lavado con agua destilada y con etanol. La mezcla se calienta a reflujo 19 h, se enfría, se filtra sobre Carcel® y se concentra a sequedad bajo presión reducida (50 kPa) para proporcionar 3,07 g de un aceite incoloro que se purifica por cromatografía flash (eluyente AcOEt) para proporcionar 2,1 g de N-acetil 3-etilamino fenilalaninato de etilo (R,S) en forma de un aceite incoloro (Sílice Merck 5719, Rf= 0,6:AcOEt) que contiene 10% de N-acetil 3-dietilaminio fenilalaninato de etilo (R,S).
\vskip1.000000\baselineskip
35-8: N-acetil 3-amino fenilalaninato de etilo (R.S)
25 g de una mezcla de N-acetil 3-nitro fenilalaninato de etilo (R,S) (75% mol./mol.) y de 3-nitro bencil acetamidomalonato de dietilo (25% mol./mol.) se ponen bajo nitrógeno en un autoclave. Se añaden 2,5 g de paladio sobre carbón al 10% y 200 ml de diclorometano. La mezcla se pone bajo una presión de 9 bares de hidrógeno y se agita a 18ºC durante 4 h. Después de volver a la presión atmosférica, el medio de reacción se filtra sobre Clarcel®, se lava con diclorometano y se concentra a sequedad bajo presión reducida (50 kPa) para proporcionar un sólido que se recristaliza en 450 ml de agua destilada a reflujo en presencia de 4 g de negro animal 3S. Después de filtrar en caliente sobre Claroel® la cristalización se deja a 4ºC, los cristales se filtran y se secan para proporcionar 9,9 g de N-acetil 3-amino fenilalaninato de etilo (R,S) en forma de un sólido beige claro que funde a 106ºC y que contiene 5% de 3-amino bencil acetamido malonato de dietilo.
\vskip1.000000\baselineskip
35-9: N-acetil 3-nitro fenilalaninato de etilo (R,S) y 3-nitro benzol acetamidomalonato de dietilo.
En un matraz de tres bocas con un refrigerante en la parte superior se ponen bajo atmósfera de nitrógeno, 600 ml de etanol absoluto y 7,9 g de sodio. Después de la disolución total, se añaden 74,5 g de acetamido malonato de dietilo y 60 g de cloruro de 4-nitro bencilo en 200 ml de etanol anhidro. La mezcla se calienta a reflujo durante 16 h 30 mn. Después de enfriar el medio de reacción se concentra bajo presión reducida (50 kPa) y se recoge con una mezcla de 500 ml de CH_{2}Cl_{2} y de 500 ml de agua. El pH se ajusta a 7 por la adición de ácido sulfúrico 0,5 N y la fase orgánica se decanta y la fase acuosa se lava 2 veces con 200 ml de CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas se reúnen, se lavan con 200 ml de agua saturada en bicarbonato de sodio, se decantan y se secan sobre sulfato de magnesio. Después de filtrar y de concentrar bajo presión reducida (50 kPa), el producto se recristaliza en 600 ml de etanol a reflujo para proporcionar después de cristalizar a temperatura ambiente, de filtrar y de secar, 70,4 g de 3-nitro bencil acetamidomalonato de dietilo en forma de cristales blancos que funden a 156ºC. Las aguas madre se concentran y se purifican por cromatografía flash (eluyente AcOEt) para proporcionar 25,6 g de una mezcla de N-acetil 3-nitro fenilalaninato de etilo (75% mol/mol) y de 3-nitro bencil acetamidomalonato de dietilo (25% mol/mol) en forma de un sólido beige claro que se utiliza tal cual en la etapa siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
35-10: 3-Dimetilamino fenilalanina (RS), dihidrocloruro
Operando como en el ejemplo 35-1 pero a partir de 0,72 g de N-acetil 3-dimetilamino fenilalaninato de etilo (RS) y de 8,6 ml de ácido clorhídrico a 10 N, se obtiene después de evaporar un sólido que se tritura en 50 ml de acetona, se filtra y se seca bajo presión reducida (2,7 kPa) a 40ºC. Se obtienen 0,68 g (93%) de dihidrocloruro de 3-dimetilamino fenilalanina (RS) en forma de un sólido blanco que funde hacia 120ºC (descomposición).
\vskip1.000000\baselineskip
35-11: N-acetil 3-dimetilamino fenilalaninato de etilo (RS)
Se ponen en un matraz de tres bocas bajo atmósfera de nitrógeno, 4 g de N-acetil 3-amino fenilalaninato de etilo (RS), preparado como se describe en el ejemplo 35-8 en 15 ml de DMF y se añaden 5,5 ml de trietilamina y 2,5 ml de yoduro de metilo y 4 ml de diclorometano manteniendo la temperatura hacia 30ºC mediante un baño de hielo. La mezcla se calienta 18 h a 35ºC. Se añade lentamente 1 ml de yoduro de metilo en disolución en 1 ml de DMF manteniendo la temperatura hacia 30ºC, y 2,2 ml de trietilamina y la mezcla se calienta 5 h adicionales a 35ºC. La mezcla se lleva a temperatura ambiente, se extrae con 100 ml de acetato de etilo y 150 l de agua destilada. La fase acuosa se decanta y se vuelve a lavar 2 veces con 70 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas se reúnen, se lavan 2 veces con 80 ml de agua destilada y con 50 ml de agua destilada saturada en NaCl. La fase orgánica se decanta, se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra a sequedad bajo presión reducida para proporcionar 2,4 g de un producto que se purifica por cromatografía flash (diclorometano, MeOH 90/10). Se obtienen así 0,72 g (16%) de 3-N-acetil 3-dimetilamino fenilalaninato de etilo (RS) en forma de cristales amarillos.
\newpage
Ejemplo 36
Preparación de derivados de fenilalanina por el método C
11
36-1: 4-Isopropilfenilalanina (R,S)
Se ponen en un matraz de tres bocas 7 g de fósforo rojo y 8 g de 4-(isopropil benciliden)2-metil 5-oxazolona en 45 ml de anhídrido acético y se añaden lentamente con agitación mediante una bureta de vertido 35 ml de ácido yodhídrico al 57%. Al final de la adición, la mezcla se calienta 3 h 30 mn a reflujo y se deja 3 días a temperatura ambiente. El medio de reacción se filtra, el sólido obtenido se lava 2 veces con 10 ml de ácido acético y el filtrado se concentra a sequedad bajo presión reducida. El resto obtenido se recoge con 100 ml de agua destilada, se concentra a sequedad bajo presión reducida para proporcionar un sólido que se recoge en 50 ml de agua destilada y se extrae 3 veces con 50 ml de éter dietílico después de añadir 0,5 g de sulfito de sodio. El éter se decanta y la fase acuosa se pone bajo presión reducida para eliminar las trazas de éter dietílico. Se añaden a la fase acuosa 2 g de negro animal, se calienta a 40-50ºC, se filtra sobre Clarcel® y se lava con un mínimo de agua. El pH se ajusta a 5 por adición, a 4ºC, de amoniaco al 32%. El precipitado obtenido se filtra en frío, se lava 2 veces con 10 ml de agua, 10 ml de etanol y 2 veces con 10 ml de éter para proporcionar después de secar bajo presión reducida a 20ºC, 3,97 g de 4-isopropilfenilalanina (R,S) en forma de un sólido blanco que funde a una temperatura superior a 260ºC. (Véase igualmente Journal of the Takeda Research Laboratories Vol. 43; Nº 3/4, Dic1984 p53-76).
\vskip1.000000\baselineskip
36-2: 4-(isopropil benciliden)2-metil 5-oxazolona
Se ponen en un matraz, equipado con un refrigerante, 18,52 g de N-acetilglicina, 10,6 g de acetato de sodio, 20 ml de 4-isopropilbenzaldehído y 57 ml de anhídrido acético. Se agita 30 mn y la mezcla se agita 1 h a 110ºC y 15 h a temperatura ambiente. El medio de reacción se vierte sobre 600 ml de agua y 400 ml de éter de petróleo previamente calentado a 50ºC. La fase orgánica se decanta y la fase acuosa se lava 2 veces con 150 ml de éter de petróleo.
Las fases orgánicas se reúnen, se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran bajo presión reducida hasta 100 ml y la obtención de un precipitado. Éste se filtra, se lava 2 veces con 50 ml de pentano para proporcionar 8,2 g de 4-(isopropil benciliden)2-metil 5-oxazolona en forma de un sólido amarillo que funde a 77ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
36-3: 4-butilfenilalanina (R,S)
Operando como en el ejemplo 36-1 pero a partir de 1,49 g de fósforo rojo, de 1,8 g de 4-(butil benciliden)2-metil 5-oxazolona en 9,23 ml de anhídrido acético y de 7,39 ml de ácido yodhídrico al 57%, se obtienen 0,35 g de 4-butilfenilalanina (R,S) en forma de un sólido beige claro que funde a una temperatura superior a 260ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
36-4: 4-(butil benciliden)2-metil 5-oxazolona
Operando como en el ejemplo 36-2 pero a partir de 8,43 g de N-acetilglicina, 4,92 g de acetato de sodio, 9,8 g de 4-butilbenzaldehído y 26 ml de anhídrido acético, se obtienen 1,89 g de.4-(butil benciliden)2-metil 5-oxazolona, en forma de un sólido amarillo que funde a 74ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 37
Preparación de un derivado de fenilalanina por el método D 37-1: 3-Etoxi fenilalanina (R,S), hidrocloruro (ó 3-O-Etiltirosina (R,S), hidrocloruro)
Se pone en un matraz 1 g de N-terc butoxi carbonil 3-etoxi fenilalanina (R,S) en disolución en 3,6 ml de dioxano clorhídrico y la mezcla se agita 5 h a temperatura ambiente. El precipitado formado se filtra, se lava con dioxano y con éter y se seca bajo presión reducida (2,7 kPa) a 40ºC para proporcionar 0,65 g de 3-etoxi fenilalanina (R,S), hidrocloruro en forma de un sólido blanco que funde a 200ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
37-2: N-terc Butoxi carbonil 3-etoxi fenilalanina (R,S)
Se ponen en un matraz 1,33 g de N-terc butoxi carbonil 3-etoxi fenilalaninato de etilo (R,S) en disolución en 8 ml de metanol y se añaden 8 ml de sosa 1 N. Después de 18 h de agitación a temperatura ambiente, la mezcla se evapora bajo presión reducida y se acidifica con 8,56 ml de ácido clorhídrico 1 N. El producto se extrae 2 veces con 10 ml de acetato de etilo, las fases orgánicas se reúnen, se lavan 2 veces con 10 ml de agua, se secan, se filtran y se concentran a sequedad bajo presión reducida para proporcionar 1 g de N-terc butoxi carbonil 3-etoxi fenilalanina (R,S) en forma de un aceite amarillo (Sílice Merck 5719, Rf= 0,7, eluyente: tolueno 80/MeOH 10/dietilamina 10).
\vskip1.000000\baselineskip
37-3: N-terc Butoxi carbonil 3-etoxi fenilalaninato de etilo (R,S)
Se ponen en un matraz de tres bocas bajo atmósfera de nitrógeno, 1,5 g de N-terc butoxi carbonil 3-tirosina (R,S) en disolución en 7,5 ml de DMF seco y se añaden 0,508 g de hidruro de sodio al 50% en aceite. Después de 2 h de agitación a temperatura ambiente se añaden 0,86 ml de yodoetano y la mezcla se agita 4 h a temperatura ambiente. El medio se filtra, el sólido resultante se lava 3 veces con 10 ml de agua y 2 veces con 10 ml de éter de petróleo para proporcionar después de secar bajo presión reducida (2,7 kPa) a 30ºC, 1,33 g de N-terc butoxi carbonil 3-etoxi fenilalaninato de etilo (R,S) en forma de un sólido blanco.
\vskip1.000000\baselineskip
37-4: N-terc Butoxi carbonil 3-tirosina (R,S)
Se ponen con agitación en un matraz de tres bocas, 18 g de 3-tirosina (R,S) en disolución en 180 ml de dioxano y se añaden 99 ml de sosa 1 N y 26 g de di-terc butil dicarbonato en disolución en 160 ml de dioxano. Después de 36 h de agitación, el medio se concentra bajo presión reducida a 30ºC, se recoge con 100 ml de agua destilada, se acidifica con ácido clorhídrico 1 N hasta pH 5 y se extrae 2 veces con 200 ml de acetato de etilo. La fase orgánica se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra a sequedad bajo presión reducida a 30ºC, para proporcionar 30 g de N-terc butoxi carbonil 3-tirosina (R,S) en forma de un sólido blanco (Sílice Merck 5719, Rf= 0,25, eluyente: tolueno 80/MeOH 10, dietilamina 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 38
Preparación de derivados de fenilalanina por el método E 38-1: 4-Dialilaminofenilalanina (RS), dihidrocloruro
Operando como en el ejemplo 35-1 pero a partir de 5,8 g de 4-dialilaminobencil acetamido malonato de dietilo y de 48 ml de ácido clorhídrico 10 N, se obtiene después de evaporar un sólido que se tritura en 50 ml de acetona, se filtra y se tritura en 10 ml de diclorometano, se filtra y se lava 3 veces con 10 ml de éter etílico. Después de secar bajo presión reducida (2,7 kPa) a 40ºC, se obtienen 4,41 g de dihidrocloruro de 4-dialilaminofenilalanina (RS) en forma de un sólido blanco hueso que funde hacia 135ºC (descomposición).
\vskip1.000000\baselineskip
38-2: 4-Alilaminofenilalanina (RS), dihidrocloruro
Operando como en el ejemplo 35-1 pero a partir de 3,27 g de 4-alilaminobencil acetamido malonato de dietilo y de 30 ml de ácido clorhídrico 10 N, se obtiene después de evaporar un sólido que se tritura en 50 ml de acetona, se filtra y se seca bajo presión reducida (2,7 kPa) a 40ºC. Se obtienen 2,3 g de dihidrocloruro de 4-alilaminofenilalanina (RS) en forma de un sólido blanco que funde hacia 134ºC (descomposición).
\vskip1.000000\baselineskip
38-3: 4-Dialilaminobencil acetamido malonato de dietilo y 4-Alilaminobencil acetamido malonato de dietilo
Se ponen en un matraz de tres bocas con una bureta de vertido en la parte superior y mantenido bajo atmósfera de nitrógeno 10 g de 4-aminobencilacetamidomalonato de dietilo en disolución en 150 ml de DMF. Se añaden lentamente a temperatura ambiente, 6,57 ml de bromuro de alilo y 10,76 ml de trietilamina con agitación. Después de 19 h de agitación se añaden de nuevo 1,31 ml de bromuro de alilo y 2,15 ml de trietilamina y la mezcla se agita 26 h. El medio de reacción se vierte sobre 1,5 l de agua destilada y se extrae con 11 de acetato de etilo. La fase acuosa se decanta y se lava 2 veces con 500 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas se reúnen, se lavan con 500 ml de agua destilada y con 500 ml de agua saturada en cloruro de sodio, se decantan, se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran a sequedad para proporcionar un aceite marrón que se purifica por cromatografía flash (eluyente CH_{2}Cl_{2} 90/AcOEt 10) para proporcionar 6,66 g de 4-dialilaminobencil acetamido malonato de dietilo en forma de un sólido beige que funde a 94-96ºC (Rf =0,6 AcOEt 50/ciclohexano 50) y 3,49 g de 4-alilaminobencil acetamido malonato de dietilo en forma de un sólido beige que funde a 104-106ºC (Rf =0,45 AcOEt 50/ciclohexano 50)
El 4-aminobencil acetamido malonato de dietilo puede prepararse como se describe en J.B. Burckhalter, VC Stephens, J. Am. Chem. Soc., 56, 1951, 73.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 39
Preparación de derivados de fenilalanina por el método F 
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
39-1: 4-Etil isopropil fenilalanina (RS), dihidrocloruro
Operando como en el ejemplo 35-1 pero a partir de 2,9 g de 4-etil isopropilbencil acetamido malonato de dietilo y de 24,6 ml de ácido clorhídrico 10 N, se obtiene después de evaporar un sólido que se tritura en 20 ml de acetona, se filtra y se seca bajo presión reducida (2,7 kPa) a 40ºC. Se obtienen 2 g de dihidrocloruro de 4-etil isopropilaminofenilalanina (RS) en forma de un sólido blanco que funde hacia 147ºC (descomposición).
\vskip1.000000\baselineskip
39-2: 4-Etil isopropil aminobencil acetamido malonato de dietilo
Se ponen en un matraz de tres bocas mantenido bajo atmósfera de nitrógeno, 15 g de 4-etil aminobencilacetamido malonato de dietilo en 70 ml de THF, se añaden 6,4 ml de 2-yodopropano y 8,4 ml de 1,5-diazabiciclo[4-3-0]non-5-eno y la mezcla se calienta 24 h a 60ºC. Se añaden 2,13 ml de 2-yodopropano, 8,4 ml de 1,5-diazabiciclo[4-3-0]non-5-eno y la mezcla se calienta 24 h adicionales a 60ºC.
La mezcla se lleva a temperatura ambiente, se extrae con 50 ml de diclorometano y 50 ml de agua destilada. La fase acuosa se decanta y se vuelve a lavar 2 veces con 30 ml de diclorometano. Las fases orgánicas se reúnen, se lavan con 60 ml de agua destilada y con 50 ml de agua destilada saturada en NaCl. La fase orgánica se decanta, se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra a sequedad bajo presión reducida para proporcionar 16,2 g de un producto que se purifica por cromatografía flash (diclorometano, MeOH 90/10). Se obtienen así 4,59 g de un producto que se recristaliza en 45 ml de ciclohexano para proporcionar 3,44 g de 4-etil isopropil aminobencil acetamido malonato de dietilo en forma de cristales blancos que funden a 80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
39-3: 4-Etilaminobencilacetamido malonato de dietilo
El 4-etil aminobencilacetamido malonato de dietilo puede prepararse operando como en el ejemplo 35-7 pero a partir de 22 g de 4-aminobencil acetamidomalonato de dietilo, 500 ml de etanol y 70 g de níquel de raney. Se obtienen así 23,8 g de 4-etilamino bencilacetamido malonato de dietilo en forma de un sólido blanco hueso que funde a
136ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
39-4: 4-Alil etilaminofenilalanina (R,S), dihidrocloruro
Operando como en el ejemplo 35-1 pero a partir de 4,54 g de 4-alil etilbencil acetamido malonato de dietilo y de 37,9 ml de ácido clorhídrico a 10 N, se obtiene después de evaporar un sólido que se seca bajo presión reducida (2,7 kPa) a 40ºC. Se obtienen 3,67 g de dihidrocloruro de 4-alil etilaminofenilalanina (RS) en forma de un sólido marrón que funde hacia 130ºC (descomposición).
\vskip1.000000\baselineskip
39-5: 4-Alil etilaminobencil acetamido malonato de dietilo
Operando como en el ejemplo 39-2 pero a partir de 8 g de 4-etilaminobencilacetamido malonato de dietilo, 4 ml de bromuro de alilo, 5,82 ml de 1,5-diazabiciclo[4-3-0]non-5-eno, en 50 ml de THF, se obtienen después de purificar por cromatografía flash (eluyente CH_{2}Cl_{2}/AcOEt 90-10 en volumen) 5, 6 g de un sólido que se recristaliza en 35 ml de ciclohexano. Se obtienen así 5,43 g de 4-alil etilaminobencil acetamido malonato de dietilo en forma de un sólido blanco que funde a 86ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
39-6: 4-Etil propilaminofenilalanina (RS), dihidrocloruro
Operando como en el ejemplo 35-1 pero a partir de 2,5 g de 4-etil propilaminobencil acetamido malonato de dietilo y de 21 ml de ácido clorhídrico a 10 N, se obtiene después de evaporar un sólido que se seca bajo presión reducida (2,7 kPa) a 40ºC. Se obtienen 2 g (97%) de dihidrocloruro de 4-etil propilaminofenilalanina (RS) en forma de un sólido blanco que funde hacia 147ºC (descomposición).
\vskip1.000000\baselineskip
39-7: 4-Etil propilaminobencil acetamido malonato de dietilo
Operando como en el ejemplo 39-2 pero a partir de 10 g de 4-etilaminobencilacetamido malonato de dietilo, 5,6 ml de 1-yodo propano, 7,2 ml de 1,5-diazabiciclo[4-3-0]non-5-eno, en 70 ml de THF, se obtienen después de 36 horas de reacción y de purificación por cromatografía flash (eluyente CH_{2}Cl_{2}/MeOH 97-3 en volumen), 2,8 g de un sólido que se recristaliza en 26 ml de ciclohexano. Se obtienen así 2,9 g de 4-etil propilaminobencil acetamido malonato de dietilo en forma de un sólido blanco que funde a 84-86ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
39-8: 4-Etil metilciclopropilaminofenilalanina (RS), dihidrocloruro
Operando como en el ejemplo 35-1 pero a partir de 3 g de 4-etil metilciclopropilaminobencil acetamido malonato de dietilo y de 25 ml de ácido clorhídrico 10 N, se obtiene después de 3 días de reacción y de evaporar un sólido que se tritura en 40 ml de acetona, se filtra y se seca bajo presión reducida (2,7 kPa) a 40ºC. Se obtienen 2,24 g de dihidrocloruro de 4-etil metilciclopropilaminofenilalanina (RS) en forma de un sólido blanco que funde hacia 140ºC (descomposición).
\vskip1.000000\baselineskip
39-9: 4-Etil metilciclopropilaminobencil acetamido malonato de dietilo
Operando como en el ejemplo 39-2 pero a partir de 8 g de 4-etilaminobencilacetamido malonato de dietilo, 2,6 ml de bromometilciclopropano, 2,97 ml de 1,5-diazabiciclo[4-3-0]non-5-eno, en 50 ml de THF, se obtienen después de 3 días de reacción y de purificación por cromatografía flash (eluyente CH_{2}Cl_{2}/AcOEt 90-10 en volumen), 3,3 g de 4-etil metilciclopropilaminobencil acetamido malonato de dietilo en forma de un sólido blanco que funde a
112-114ºC.
\newpage
Ejemplo 40
Preparación de derivados de fenilalanina por el método G 
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
40-1: 4-(1-pirrolidinil)fenilalanina (RS), dihidrocloruro
Operando como en el ejemplo 35-1 pero a partir de 1,5 g de 4-(1-pirrolidinil)bencil acetamido malonato de dietilo y de 40 ml de ácido clorhídrico 5 N, se obtiene después de evaporar un sólido que se tritura en 15 ml de acetona, se filtra y se seca bajo presión reducida (2,7 kPa) a 40ºC. Se obtienen 0,6 g de dihidrocloruro de 4-(1-pirrolidinil)fenilalanina (RS) en forma de un sólido blanco hueso.
\vskip1.000000\baselineskip
40-2: 4-(1-pirrolidinil)bencil acetamidomalonato de dietilo
Se ponen en un autoclave 4 g de 4-(1-pirrolil)bencil acetamidomalonato de dietilo en disolución en 100 ml de MeOH y 1 g de paladio sobre carbón al 10%. Después de haber purgado 3 veces con nitrógeno, el producto se hidrogena bajo una presión de 14 bares de hidrógeno a 19ºC. Después de 25 horas de agitación, la hidrogenación se para, el producto se filtra sobre Clarcel®, se lava con diclorometano y la disolución se concentra bajo presión reducida para proporcionar 3,85 g de un sólido que se tritura en una mezcla de 50 ml de heptano y de 10 ml de éter etílico. El sólido obtenido se filtra, se seca y se purifica por cromatografía flash (eluyente CH_{2}Cl_{2}/acetona 90/10 en volumen) para proporcionar 1,6 g de 4-(1-pirrolidinil)bencil acetamidomalonato de dietilo en forma de un sólido blanco que funde a 132ºC
\vskip1.000000\baselineskip
40-3: 4-(1-pirrolil)bencil acetamidomalonato de dietilo
Se ponen en un matraz de tres bocas mantenido bajo nitrógeno, 4,6 g de 4-aminobencil acetamidomalonato de dietilo en 104 ml de ácido acético. Se añaden 7,02 g de acetato de sodio y 1,87 ml de 2,5-dimetoxitetrahidrofurano. La mezcla se calienta a 65ºC durante 1 h 15 mn, se enfría y se extrae con 100 ml de diclorometano y 100 ml de agua destilada. La fase acuosa se decanta y se lava 3 veces con 100 ml de diclorometano. Las fases orgánicas se reúnen, se lavan con 100 ml de agua y con 100 ml de una disolución saturada en NaCl, se decantan y se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se evaporan a sequedad bajo presión reducida (50 kPa) para proporcionar 6,2 g de un sólido que se purifica por cromatografía flash (eluyente CH_{2}Cl_{2}/acetona 75/25 en volumen). Se obtienen así 3,57 g de 4-(1-pirrolil)bencil acetamidomalonato de dietilo en forma de un sólido beige que funde a 110ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 41
Preparación de derivados de fenilalanina por el método H 41-1: 4-Etiltiometil fenilalanina (RS)
Se ponen en un matraz de tres bocas mantenido bajo nitrógeno, 300 ml de metanol anhidro y se añaden con agitación 1, 72 g de metilato de sodio y 5,55 ml de etil mercaptano. El disolvente se concentra bajo presión reducida a 40ºC para proporcionar 8,5 g de la sal de sodio del etilmercaptano que se pone en disolución en 100 ml de THF anhidro. Se añaden a temperatura ambiente 3,6 g de 4-clorometil fenilalanina (RS) y la mezcla se calienta a reflujo durante 18 h. El disolvente se evapora bajo presión reducida a 40ºC y el resto se recoge con 100 ml de agua destilada. La disolución turbia obtenida se acidifica con 5 ml de ácido acético. El precipitado obtenido se filtra, se lava con agua destilada y se seca a 60ºC bajo presión reducida para proporcionar 3,6 g de un sólido que se purifica por cromatografía flash (eluyente AcOEt 60, AcOH 12, agua 10). Se obtienen así 256 mg de 4-etiltiometil fenilalanina (RS) en forma de un sólido blanco que funde a 251ºC.
La 4-clorometil fenilalanina (RS) puede obtenerse por analogía con la 4-clorometil fenilalanina (S) descrita en: R Gonzalez-Muniz, F. Cornille, F. Bergemn, D. Ficheux, J. Pothier, C. Durieux y B. Roques, Int. J. Pept. Protein. Res., 1991,37 (41), 331-340.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 42
Preparación de derivados de fenilalanina por el método I 42-1: 4-O-(2-Cloroetil)tirosina (S), hidrocloruro
Se ponen en un matraz, 5 g de N-terc-butoxi carbonil-4-O-(2-cloroetil)tirosina (S) en disolución en 50 ml de dioxano clorhídrico. Después de 28 horas de agitación, la mezcla se concentra a sequedad bajo presión reducida. El resto obtenido se recoge con 50 ml de éter, se agita y se filtra. El sólido obtenido se lava 2 veces con 25 ml de éter y se seca bajo presión reducida para proporcionar 1,58 g de hidrocloruro de 4-O-(2-cloroetil)tirosina (S) en forma de un sólido blanco que funde a 260ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
42-2: N-terc-butoxi carbonil-4-O-(2-cloroetil)tirosina (S)
Se ponen en un matraz de tres bocas bajo atmósfera de nitrógeno, 14 g de N-terc-butoxicarbonil tirosina (S), en disolución en 140 ml de DMF. Se añaden 4,8 g de hidruro de sodio al 50% en aceite lentamente con espátula. Después de 2 h de agitación a temperatura ambiente, se añaden 16,87 g de 1-tosil 2-cloroetanol. Después de 2 días de agitación, se añaden 2,4 g de hidruro de sodio al 50% en aceite y 8,4 ml adicionales de 1-tosil 2-cloroetanol. La misma operación se efectúa después de 24 h y la agitación se continúa 24 h adicionales. La reacción se para por adición de 100 ml de agua destilada y la mezcla de reacción se concentra a sequedad bajo presión reducida. El resto obtenido se recoge con 100 ml de agua destilada y se extrae 3 veces con 100 ml de acetato de etilo. La fase acuosa se decanta, se acidifica con 50 ml de HCl 1 N hasta pH3 y el producto se extrae 3 veces con 100 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas se reúnen, se lavan 2 veces con 50 ml de agua, se decantan, se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran a sequedad bajo presión reducida para proporcionar 13,51 g de N-terc-butoxi carbonil-4-O-(2-cloroetil)tirosina (S) en forma de un aceite marrón (Rf 0,5, tolueno 70%/metanol 20%/dietilamina 10%) utilizado tal cual en la etapa
siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA V
14
15
Abreviaturas utilizadas
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
Bibliografía
\bulletBibb M. J., Findlay P. R. y Johnson M. W. (1984) Gene, 30: 157-166.
\bulletBibb M. J., Janssen G. R., y Ward J. M. (1985) Gene, 38: 215-226.
\bulletCocito C. G. (1979) Microbiol Rev, 43: 145-198.
\bulletCocito C. G. (1983) En Antibiotics, 6: (Ed. F. E. Hahn), 296-332.
\bulletDessen P. C., Fondrat C., Valencien C. y Mugnier C. (1990) Comp. Appl. in Biosciences, 6: 355-356.
\bullet Di Giambattista M., Chinali G. y Cocito C. G. (1989) J. Antim. Chemother., 24: 485-507.
\bulletGibson TJ. (1984) Tesis doctoral, Cambridge University, Inglaterra.
\bulletHillemann D., Pülher A. y Wohlleben W. (1991) Nucl. Acids Res., 19: 727-731.
\bulletHopwood D. A., Bibb M. J., Chater K. F., Kieser T., Bruton C. J., Kieser H. M., Lydiate D. J., Smith C. P., Ward J. M. y Scrempf H. (1985) A laboratory manual., The John Innes Fondation, Norwich, Inglaterra.
\bulletHudson G. S. y Davidson B. E. (1984) J. Mol. Biol., 180: 1023-1051.
\bulletKuhstoss S., Richardson M. A., y Rao R. N. (1991) Gene 97: 143-146.
\bulletManiatis T., Fritsh E. F. y Sambrook J. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N. Y.,
\bulletMessing J., Crea R. y Seeburg P. H. (1981) Nucleic Acids Res., 9: 309.
\bulletMolinero A. A., Kingston D. G. I., y Reed J. W. (1989) J. Nat. Prod., 52: 99-108.
\bulletOmer C. A., Lenstra R., Litle P. J., Dean J., Tepperman J. M., Leto K. J., Romesser J. A., y O'Keefe D. P. (1990) J. Bact. 172: 3335-3345.
\bulletReed J. W., Purvis M. B., Kingston D. G. I., Biot A., y Gosselé F. (1989) J. Org. Chem. 54: 1161-1165.
\bulletStaden R. y McLachlan A. D. (1982) Nucleic Acids Res., 10: 141-156.
\bulletSchindler U., Sans N., y Schrôder J. (1989) J. Bact. 171: 847-854.
\bulletThorson J. S.; Lo S. F., y Liu H-W. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 6993-6994.
\bulletVideau D. (1982) Path. Biol., 30: 529-534.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: RHONE-POULENC RORER S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 20, avenue Raymond ARON
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: ANTONY
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 92165
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVAS ESTREPTOGRAMINAS Y PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE ESTREPTOGRAMINAS POR MUTASÍNTESIS.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2888 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
18
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 888 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
21
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 387 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4496 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4
24
25
26
27
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1065 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
29
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1194 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6
31
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1561 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
33
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1233 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
35
36

Claims (3)

1. Compuesto caracterizado porque está representado por la fórmula general I
37
en la que:
-
R_{2} y R_{4} representan, independiente el uno del otro, un átomo de hidrógeno o un grupo metilo,
-
R_{3} representa un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo,
-
X representa un grupo CO, CHOH o CH_{2} y
-
R_{1} representa:
38
con
-
para los derivados meta:
A, C, D y E representan un átomo de hidrógeno y
B puede representar:
-
un halógeno y preferentemente un átomo de flúor,
-
un grupo monoalquilamino o dialquilamino con alquilo representando preferentemente un grupo metilo o etilo,
-
un grupo éter.
-
un grupo tioéter,
-
un grupo alquilo C_{1} a C_{3} o
-
un grupo trihalógenometilo y preferentemente trifluorometilo.
\vskip1.000000\baselineskip
-
para los derivados para:
A, B, D y E representan un átomo de hidrógeno y
C puede representar.
-
un halógeno,
-
un grupo NR_{5}R_{6} con R_{5} y R_{6} representando independientemente el uno del otro un grupo elegido entre
-
hidrógeno,
-
un grupo alquilo C_{1} a C_{4} lineal o ramificado y cuando uno de los sustituyentes R_{5} o R_{6} representa un grupo metilo, el otro representa obligatoriamente un grupo etilo,
-
un grupo alquil-cicloalquilmetilo con un cicloalquilo C_{3} a C_{4}
-
un grupo cicloalquilo C_{3} a C_{4} sustituido opcionalmente,
-
un grupo alquenilo C_{1} a C_{4} lineal o ramificado y cuando uno de los sustituyentes R_{5} o R_{6} representa un grupo alquenilo, el otro es diferente de un grupo metilo o de un grupo cicloalquilo C_{3} a C_{6},
-
un grupo N-pirrolidinilo sustituido o no,
-
un grupo éter,
-
un grupo tioéter,
-
un grupo acilo o alcoxicarbonilo,
-
un grupo alquilo C_{1} a C_{6}, lineal o ramificado, y preferentemente elegido entre los grupos metilo, isopropilo y terc-butilo,
-
un grupo alquiltiometilo,
-
un grupo arilo y preferentemente un fenilo o
-
un grupo trihalógenometilo y preferentemente trifluorometilo y
\vskip1.000000\baselineskip
-
para los derivados disustituidos meta-para:
A, D y E representan un átomo de hidrógeno y
B puede representar:
-
un halógeno y preferentemente un átomo de flúor,
-
un grupo monoalquilamino o dialquilamino con alquilo representando preferentemente un grupo metilo o etilo,
-
un grupo éter,
-
un grupo tioéter,
-
un grupo alquilo C_{1} a C_{3} y
C puede representar.
-
un halógeno y preferentemente un átomo de flúor,
-
un grupo amino, monoalquilamino o dialquilamino con alquilo representando preferentemente un grupo metilo con la condición de que B sea diferente de un átomo de bromo o de cloro, o un grupo alilo sustituido o no,
-
un grupo éter,
-
un grupo tioéter,
-
un grupo alquilo C_{1} a C_{6} o
-
un grupo trihalógenometilo y preferentemente trifluorometilo y
\vskip1.000000\baselineskip
-
para los derivados disustituidos orto-para:
B, E y D representan un átomo de hidrógeno y A y C, un grupo metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Compuesto según la reivindicación 1 caracterizado porque se trata preferentemente de:
4\zeta-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
5\gamma-hidroxi 4\zeta-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
4\zeta-metil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-metil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
4\zeta-metoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-metoxicarbonil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-cloro-des(4\zeta-imetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-bromo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-bromo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
4\zeta-yodo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-yodo-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
4\zeta-trifluorometil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-trifluorometil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
4\zeta-terc-butil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-isopropil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\zeta-isopropil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{E},
4\varepsilon-metilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\varepsilon-metoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A},
4\varepsilon-metoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H},
4\varepsilon-fluoro 4\zeta-metil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-amino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-dietilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-alilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-dialilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-alil etilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etil propilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etil isopropilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etil metilciclopropilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-(1-pirrolidinil)-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-trifluorometoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-aliloxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-metiltiometil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-(2-cloroetoxi)-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-acetil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\zeta-etil-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{H}
4\varepsilon-dimetilamino-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}
4\varepsilon-metiltio-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A} y
4\varepsilon-etoxi-des(4\zeta-dimetilamino)pristinamicina I_{A}.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Composición farmacéutica caracterizada porque contiene al menos un compuesto según la reivindicación 1 ó 2 en asociación o no con una estreptogramina del grupo A.
ES95924396T 1994-07-08 1995-07-04 Nuevas estreptograminas. Expired - Lifetime ES2352324T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9408478A FR2722210B1 (fr) 1994-07-08 1994-07-08 Nouvelles streptogramines et procede de preparation de streptogramines par mutasynthese
FR9408478 1994-07-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2352324T3 true ES2352324T3 (es) 2011-02-17

Family

ID=9465182

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES95924396T Expired - Lifetime ES2352324T3 (es) 1994-07-08 1995-07-04 Nuevas estreptograminas.

Country Status (33)

Country Link
US (2) US6352839B1 (es)
EP (2) EP2248901A1 (es)
JP (1) JPH10502532A (es)
KR (2) KR100379100B1 (es)
CN (1) CN1152338A (es)
AP (1) AP562A (es)
AT (1) ATE480626T1 (es)
AU (1) AU712397B2 (es)
BR (1) BR9508714A (es)
CA (1) CA2193130C (es)
CO (1) CO4410252A1 (es)
CZ (1) CZ5297A3 (es)
DE (1) DE69536102D1 (es)
DK (1) DK0770132T3 (es)
DZ (1) DZ1910A1 (es)
ES (1) ES2352324T3 (es)
FR (1) FR2722210B1 (es)
HU (1) HU220964B1 (es)
IL (1) IL114489A0 (es)
MA (1) MA23610A1 (es)
MX (1) MX9700257A (es)
NO (1) NO970047D0 (es)
NZ (1) NZ289153A (es)
PE (1) PE28596A1 (es)
PL (1) PL318193A1 (es)
PT (1) PT770132E (es)
RU (1) RU2205183C2 (es)
SK (1) SK597A3 (es)
TN (1) TNSN95077A1 (es)
TR (1) TR199500830A2 (es)
UY (1) UY23996A1 (es)
WO (1) WO1996001901A1 (es)
ZA (1) ZA955688B (es)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6524812B1 (en) 1993-10-07 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Genes encoding resistance to DNA alkylating agents
US6495348B1 (en) 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
WO1997022711A1 (en) 1995-12-19 1997-06-26 Regents Of The University Of Minnesota Metabolic engineering of polyhydroxyalkanoate monomer synthases
FR2775288B1 (fr) * 1998-02-26 2000-03-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Derives de streptogramines, leur preparation et les compositons qui les contiennent
CN101293920B (zh) 1998-05-01 2012-07-18 诺华疫苗和诊断公司 脑膜炎奈瑟球菌抗原和组合物
FR2796949B1 (fr) 1999-07-27 2001-09-21 Aventis Pharma Sa Derives de streptogramines, leur preparation et les compositions qui les contiennent
FR2796950B1 (fr) * 1999-07-27 2001-09-21 Aventis Pharma Sa Derives de streptogramines, leur preparation et les compositions qui les contiennent
EP1204676B1 (fr) * 1999-07-27 2003-10-22 Aventis Pharma S.A. Derives de streptogramines, leur preparation et les compositions qui les contiennent
EP1223215A4 (en) * 1999-09-29 2005-06-15 Meiji Seika Kaisha TRANSFORMANT PRODUCING FUNCTIONAL GROUP-MODIFIED SECONDARY METABOLITE AND NEW GENES OF BIOSYNTHESIS
EP1375639B1 (en) * 2001-03-22 2007-02-28 Gakkou Houjin Kitasato Gakuen Selection media for beauveriolide i or beauveriolide iii and process for selectively producing these substances
FR2825717B1 (fr) * 2001-06-08 2005-02-18 Rhodia Chimie Sa Preparation stereoselective de l-acides amines cycliques
FR2841563B1 (fr) * 2002-06-28 2006-09-01 Aventis Pharma Sa Nouveaux variants du polypeptide papm de bacteries du genre streptomyces
WO2006117536A1 (en) * 2005-05-04 2006-11-09 Tmo Renewables Limited Thermophilic microorganisms with inactivated lactate dehydrogenase gene (ldh) for ethanol production
US7470664B2 (en) * 2005-07-20 2008-12-30 Merck & Co., Inc. HCV NS3 protease inhibitors
US20080317670A1 (en) * 2005-12-14 2008-12-25 Ambrx, Inc. Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-Natural Amino Acids and Polypeptides
US7776535B2 (en) 2006-02-06 2010-08-17 Franklin And Marshall College Site-specific incorporation of fluorinated amino acids into proteins
US7548705B2 (en) * 2007-04-03 2009-06-16 Xerox Corporation Systems and methods for marking test patches for calibrating and/or visually confirming color accuracy of a marking device
WO2015098774A1 (ja) * 2013-12-26 2015-07-02 株式会社カネカ 光学活性環状イミノ酸の製造方法
CN112442507B (zh) * 2019-09-05 2022-09-30 武汉合生科技有限公司 马度米星化合物的生物合成基因簇及其应用
CN112970782A (zh) * 2019-12-16 2021-06-18 德强生物股份有限公司 一种劳意德链霉菌发酵得到的农药制剂及其制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4156734A (en) 1976-02-13 1979-05-29 Merck & Co., Inc. Antihypertensive compositions containing an aryl-substituted alanine azo and an arylhydrazino-propionic acid
US4082736A (en) * 1976-04-26 1978-04-04 Syntex (U.S.A.) Inc. Novel immunological adjuvant compounds and methods of preparation thereof
DE3322402A1 (de) 1983-06-22 1985-01-03 Jagenberg Ag Vorrichtung zum falten und verschliessen des kopfes einer von einer innenseitig mit einer thermoplastischen kunststoffschicht ueberzogenen kartonbahn bzw. einer aus einem zuschnitt gebildeten faltschachtel in einer falt- und schweissstation
FR2549062B1 (fr) * 1983-07-13 1985-10-25 Rhone Poulenc Sante Nouveaux derives de synergistines, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
FR2689518B1 (fr) * 1992-04-01 1995-04-07 Rhone Poulenc Rorer Sa Microorganismes, procédé de préparation et utilisation.
FR2696189B1 (fr) * 1992-09-25 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Polypeptides impliqués dans la biosynthèse des streptogramines, séquences nucléotidiques codant pour ces polypeptides et leur utilisation.

Also Published As

Publication number Publication date
EP0770132A1 (fr) 1997-05-02
PE28596A1 (es) 1996-07-06
SK597A3 (en) 1997-08-06
DZ1910A1 (fr) 2002-02-17
NZ289153A (en) 1999-02-25
IL114489A0 (en) 1995-11-27
AU712397B2 (en) 1999-11-04
MX9700257A (es) 1997-05-31
CZ5297A3 (en) 1997-05-14
US6833382B2 (en) 2004-12-21
ZA955688B (en) 1996-02-26
UY23996A1 (es) 1995-09-08
NO970047L (no) 1997-01-07
AU2891295A (en) 1996-02-09
CO4410252A1 (es) 1997-01-09
BR9508714A (pt) 1998-06-02
HU220964B1 (hu) 2002-07-29
FR2722210A1 (fr) 1996-01-12
WO1996001901A1 (fr) 1996-01-25
KR100420238B1 (ko) 2004-02-26
FR2722210B1 (fr) 1996-08-14
EP0770132B1 (fr) 2010-09-08
EP2248901A1 (fr) 2010-11-10
TNSN95077A1 (fr) 1996-02-06
RU2205183C2 (ru) 2003-05-27
PL318193A1 (en) 1997-05-26
PT770132E (pt) 2010-12-09
DK0770132T3 (da) 2011-01-10
KR100379100B1 (ko) 2003-10-08
ATE480626T1 (de) 2010-09-15
US20020142947A1 (en) 2002-10-03
US6352839B1 (en) 2002-03-05
AP562A (en) 1996-11-20
CA2193130A1 (fr) 1996-01-25
CN1152338A (zh) 1997-06-18
AP9500752A0 (en) 1995-07-31
TR199500830A2 (tr) 1996-06-21
HUT77341A (hu) 1998-03-30
DE69536102D1 (de) 2010-10-21
NO970047D0 (no) 1997-01-07
CA2193130C (fr) 2010-10-19
MA23610A1 (fr) 1996-04-01
JPH10502532A (ja) 1998-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2352324T3 (es) Nuevas estreptograminas.
Rosteck Jr et al. Homology between proteins controlling Streptomyces fradiae tylosin resistance and ATP-binding transport
FI117674B (fi) Polypeptidit, jotka liittyvät streptogramiinien biosynteesiin, näitä polypeptidejä koodittavat nukleotidisekvenssit, ja niiden käyttö
Ramel et al. Biosynthesis of the proteasome inhibitor syringolin A: the ureido group joining two amino acids originates from bicarbonate
ES2271973T3 (es) Grupo de genes de la biosintesis de la rifamicina.
US5071835A (en) Ribonucleotide reductase inhibitors
Paris et al. The chemistry of pristinamycins
CA2378868A1 (en) Process for deacylation of lipodepsipeptides
Zwick et al. Concise Chemoenzymatic Total Synthesis of GE81112 B1
KR102553290B1 (ko) 식물체의 트리아실글리세롤 생합성 증가 방법
JP2003518387A (ja) 遺伝子発現に関する方法および材料
IE41605B1 (en) A tetrapeptide amide and acid addition salts thereof
Murata The trpF nucleotide sequence and its promoter analysis in Pseudomonas aeruginosa
Sarkar Developing an Enzymatic Toolbox to Generate Drug-Like Peptides
Niedrauer Part I. A Photolabile Backbone-Amide Linker for Solid-Phase Synthesis of C-Terminally Modified Peptides Part II. Class-II HMG-CoA Reductase Inhibitors For Use as Antimicrobials
JP5422832B2 (ja) 不活化遺伝子再活性化ペプチド
Cagir Derivatives of deglycobleomycin and luotonin A
Higgins Synthesis of the unnatural amino acid N'-L-lysine-ferrocenyl acetamide and site specific incorporation into transcription factor IIIA
Lambert The incorporation of an unnatural amino acid chelate in transcriptional factor IIIA
Cohen Regulation of Amino Acids Biosynthesis in Prokaryotes