PT770132E - Novas estreptograminas - Google Patents

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PT770132E
PT770132E PT95924396T PT95924396T PT770132E PT 770132 E PT770132 E PT 770132E PT 95924396 T PT95924396 T PT 95924396T PT 95924396 T PT95924396 T PT 95924396T PT 770132 E PT770132 E PT 770132E
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Francis Blanche
Denis Thibaut
Gilles Dutruc-Rosset
Jean-Claude Barriere
Jean-Marc Paris
Joel Crouzet
Laurent Debussche
Veronique Blanc
Nathalie Bamas-Jacques
Alain Famechon
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Aventis Pharma Sa
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Description

DESCRIÇÃO "NOVAS ESTREPTOGRAMINAS" A presente invenção refere-se principalmente a novos compostos relacionados com as estreptograminas do grupo B.
As estreptograminas formam um grupo homogéneo de antibióticos constituídos por uma associação de dois tipos de moléculas quimicamente diferentes; por um lado, macrolactonas poli-insaturadas (componentes do grupo A) e por outro lado depsipéptidos (componentes do grupo B) . Este grupo compreende muitos antibióticos conhecidos sob diferentes nomes, em função da sua origem, entre as quais pristinamicinas, micamicinas, virginiamicinas (Cocito 1979, 1983) .
Os componentes A e B têm uma actividade antibacteriana sinérgica que pode atingir 100 vezes a dos componentes separados e que, contrariamente à de cada componente, é bactericida (Cocito 1979). Esta actividade é, particularmente, mais eficaz contra as bactérias Gram positivas, como os estafilococos e os estreptococos (Cocito 1979, Videau 1982). Os componentes A e B inibem a síntese proteica fixando-se à sub-unidade 50S do ribossoma (Cocito 1979; Di Giambattista et al. 1989). O conhecimento das vias de biossíntese de cada um dos componentes permanece parcial até ao momento, embora estudos anteriores apresentados no pedido de patente PCT/FR93/00923 (ou WO94/08014), tenham permitido identificar várias proteínas e os 1 genes estruturais correspondentes, envolvidos na biossintese dos dois tipos de componentes (documento WO 93/20182).
No processo da biossintese das estreptograminas do grupo B, podem ser distinguidas duas partes: 1) Biossintese de precursores, ou dos seus análogos, do macrociclo: ácido 3-hidroxipicolínico, ácido L-2-aminobutírico, 4-dimetilamino-L-fenilalanina, ácido-L-pipecólico, L-fenilglicina. 2) Formação do macrociclo a partir dos precursores referidos acima, L-treonina e L-prolina ou dos seus análogos, com eventualmente modificação(ões) subsequente(s), do tipo N-metilação peptidica, epimerisação, hidroxilação e oxidação. O pedido de patente PCT/FR9300923 (ou W094/08014), tem nomeadamente como objecto as enzimas que catalisam a incorporação dos precursores na cadeia peptidica das estreptograminas B no decorrer do alongamento, assim como os seus genes estruturais. Estes resultados permitiram evidenciar o carácter da síntese peptidica não-ribossómica dos componentes do tipo B. A patente US 4156734 descreve composições contendo um grupo arilo substituído com uma alanina azo e um ácido aril-hidrizino propriónico, nomeadamente 3-metilaminofenilalanina para tratar a hipertensão. A presente invenção refere-se mais particularmente a novos compostos relacionados com as estreptograminas do grupo B e mais 2 precisamente a novos compostos da família das pristinamicinas I (figuras 1 e 2), designadas abaixo por PI ou da família do virginiamicinas S (figura 3) . 0 componente maioritário das pristinamicinas I (PI) é a PIA (figura 1) que representa cerca de 94% das pi, sendo as cerca de 6% restantes representadas por constituintes minoritários do depsipéptido (PIB a PIi), cujas estruturas estão representadas na figura 2. A PI resulta essencialmente da condensação de aminoácidos em que alguns são indispensáveis para a síntese proteica (treonina e prolina) e em que outros são originais e são considerados por si só como metabolitos secundários (ácido L-2-aminobutírico, 4-dimetilamino-L-fenilalanina (DMPAPA), ácido L-pipecólico e L-fenilglicina para a PIA), assim como de um precursor aromático, o ácido 3-hidroxipicolínico.
No que se refere aos derivados de virginiamicinas S, estes resultam da condensação dos mesmos ácidos que para a PI, excepto por a DMPAPA ser substituída com uma fenilalanina (ver a figura 3) . A produção destes diferentes compostos por biossíntese necessita, consequentemente, da síntese prévia, pela estirpe produtora, dos precursores originais identificados acima. A presente invenção resulta precisamente de um processo de preparação original de estreptograminas que utiliza, como estirpe produtora de estreptograminas, uma estirpe de microrganismo mutado de forma a alterar a biossíntese dos precursores de estreptograminas do grupo B. De acordo com este processo, a referida estirpe mutante é cultivada num meio suplementado com um precursor original, diferente do precursor 3 cuja biossíntese é alterada. De um modo inesperado, resulta uma produção de novos compostos relacionados com as estreptograminas do grupo B, interessantes a nível terapêutico.
Mais precisamente, a presente invenção refere-se a novos compostos representados pela fórmula geral I:
I em que: R2 e R.4 representam, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo, R3 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxilo, X representa um grupo CO, CHOH ou CH2 e Ri representa: 4
com para os derivados meta: A, C, D e E representam um átomo de hidrogénio e podendo B representar: um halogéneo e, de um modo preferido, um átomo de flúor, um grupo monoalquilamino ou dialquilamino com alquilo representando, de um modo preferido, um grupo metilo ou etilo, um grupo éter. Trata-se mais particularmente de um grupo OR com R seleccionado, de um modo preferido, de entre os grupos metilo, etilo, trifluorometilo e alilo, um grupo tioéter representado, de um modo preferido, por um grupo alquiltio, de um modo preferido, com alilo representando um grupo metilo, um grupo alquilo em Ci a C3 ou 5 grupo tri-halogenometilo e, de um modo preferido, trifluorometilo. para os derivados para: A, B, D e E representam um átomo de hidrogénio e podendo C representar: um halogéneo, um grupo NRiR2 com Ri e R2 representando, independentemente um do outro, um grupo seleccionado de entre hidrogénio, um grupo alquilo em Ci a C4 linear ou ramificado com quando um dos substituintes Ri ou R2 representa um grupo metilo, o outro representa obrigatoriamente um grupo etilo, um grupo alquil-cicloalquilmetilo com um cicloalquilo em C3 a C4 um grupo cicloalquilo em C3 a C4 eventualmente substituído, um grupo alcenilo em C3 a C4 linear ou ramificado com, quando um dos substituintes, R4 ou R2, representa um grupo alcenilo, o outro é diferente 6 de um grupo metilo ou de um cicloalquilo em C3 a C6, um grupo N-pirrolidinilo substituído ou não, um grupo éter, trata-se, de um modo preferido, de um grupo OR com R seleccionado, de um modo preferido, de entre os grupos metilo, etilo eventualmente substituído com um átomo de cloro, trifluorometilo e alcenilo. um grupo tioéter representado, de um modo preferido, por um grupo alquiltio, de um modo preferido, com alquilo representando um grupo alquilo em Ci a C3. um grupo acilo ou alcoxicarbonilo e, mais particularmente, um grupo COR com R representando, de um modo preferido, um grupo alquilo em Ci a C3 ou um grupo alcoxilo em Ci a C3. um grupo alquilo em Ci a C6, linear ou ramificado e seleccionado, de um modo preferido, de entre os grupos metilo, isopropilo e terc-butilo, um grupo alquiltiometilo e, de um modo mais preferido, um grupo CH2SR com R representando, de um modo preferido, um grupo alquilo em Ci a C3 um grupo arilo e, de um modo preferido, um fenilo ou um grupo tri-halogenometilo e, de um modo preferido, trifluorometilo. 7 para os derivados meta-para dissubstituídos: A, D e E representam um átomo de hidrogénio e podendo B representar: um halogéneo e, de um modo preferido, um átomo de flúor, um grupo monoalquilamino ou dialquilamino com alquilo representando, de um modo preferido, um grupo metilo ou etilo, um grupo éter e, de um modo preferido, um grupo OR com R seleccionado, de um modo preferido, de entre os grupos metilo, etilo e trifluorometilo, um grupo tioéter e, de um modo preferido, alquiltio com alquilo representando, de um modo preferido, um grupo etilo ou um grupo alquilo em Ci a C3 e podendo C representar: um halogéneo e, de um modo preferido, um átomo de flúor, um grupo amino, monoalquilamino ou dialquilamino com alquilo representando, de um modo preferido, um grupo metilo na condição de que B seja diferente de átomo de bromo ou de cloro ou grupo alilo substituído ou não, 8 um grupo éter e, de um modo preferido, um grupo OR com R seleccionado, de um modo preferido, de entre os grupos metilo, etilo e trifluorometilo, um grupo tioéter e, de um modo preferido, um grupo alquiltio, de um modo preferido, com alquilo representando um grupo metilo, um grupo alquilo em Ci a C6 ou um grupo tri-halogenometilo e, de um modo preferido, trifluorometilo e para os derivados orto-para dissubstituídos: B, E e D representam um átomo de hidrogénio e A e C, um grupo metilo. A titulo de compostos preferidos, podem-se referir mais particularmente: 4ζ-metiltio-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA, 4ζ-metiltio-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IH, 5Y-hidroxi4ζ-metiltio-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IH, 4ζ-ηιβ^1-Ρβ5 (4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA, 4ζ-η^ί1-Ρθ3 (4ζ-dimetilamino)pristinamicina IH, 9 4ζ-ηΐΘΐ:οχί-άθ3 (4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ, 4ζ-metoxicarbonil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4ζ-σ1θΓθ-άθ3(4ζ-dmetilamino)pristinamicina ΙΑ/ 4ζ-bromo-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ, 4ζ-bromo-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΗ, 4ζ-ίοάο-άβε(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ, 4ζ-ίοάο-άθ3(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΗ, 4ζ-trifluorometil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4ζ-trifluorometil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΗ 4ζ-terc-butil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ, 4ζ-isopropil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ, 4ζ-isopropil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΕ.
4s-metilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ιΑ, 4s-metoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4s-metoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina lH, 4s-fluoro 4ζ-metil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina I 4ζ-3πύηο-(ΐΘ3 (4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4ζ-etilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4ζ-dietilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4ζ-alilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4ζ-dialilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4ζ-alil-etilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4ζ-εηί1 propilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4ζ-etilisopropilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4ζ-θίί1 metilciclopropilamino-des(4ζ-dimetilamino) pristinamicina ΙΑ
4ζ-(1-pirrolidinil) -des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-trifluorometoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4 ζ-aliloxi-des(4 ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-etoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4 ζ-etiltio-des(4 ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-metiltiometil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-(2-cloroetoxi)-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 11 4ζ-30θ1:ί1-άθ3 (4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4ζ-etil-des(4ζ-dimetilamino)ρristinamicina ΙΑ 4ζ-etil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΗ 4£-dimetilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4s-metiltio-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ 4s-etoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina ΙΑ É descrito abaixo um processo particularmente útil para preparar os compostos de fórmula geral I.
Mais precisamente, este processo para preparar estreptograminas é caracterizado por utilizar uma estirpe de uma microrganismo produtor de estreptogramina, possuindo, pelo menos, uma mutação genética afectando a biossíntese de um precursor das estreptograminas do grupo B e em que a referida estirpe mutante é cultivada numa meio de cultura adequado e suplementado com, pelo menos, um precursor original, além daquele cuja biossíntese é alterada e por se recuperar as referidas estreptograminas.
As estirpes utilizadas no âmbito da presente invenção são consequentemente estirpes produtoras de estreptogramina, mutadas. A referida ou as referidas modificações genéticas podem estar localizadas quer ao nível de um dos genes envolvidos na biossíntese dos referidos precursores fora da região codificante, por exemplo, nas regiões responsáveis pela expressão e/ou o regulação da transcrição ou pós-transcrição dos 12 referidos genes ou numa região pertencendo ao transcrito contendo os referidos genes.
De acordo com um modo particular da invenção, as estirpes mutantes possuem uma ou mais modificações genéticas ao nivel de, pelo menos, um dos seus genes envolvidos na biossíntese dos precursores das estreptograminas do grupo B.
Esta ou estas modificações genéticas alteram a expressão do do referido gene ou seja tornam este gene e, se necessário, um outro dos genes envolvidos na biossintese dos precursores, parcial ou totalmente incapazes para codificar a enzima natural envolvida na biossíntese de, pelo menos, um precursor. A incapacidade dos referidos genes para codificar para proteínas naturais pode manifestar-se pela produção de uma proteína inactiva devido a modificações estruturais ou conformacionais ou pela ausência de produção ou pela produção de uma proteína tendo uma actividade enzimática alterada ou ainda pela produção da proteína natural num nível atenuado ou de acordo com um modo pretendido de regulação. 0 conjunto destas manifestações possíveis resulta numa alteração ou mesmo num bloqueio ao nível da síntese de, pelo menos, um dos precursores das estreptograminas do grupo B.
Os genes susceptíveis de serem mutados no âmbito da presente invenção são, de um modo preferido, os genes envolvidos na biossíntese dos precursores seguintes: ácido L-2-aminobutírico, 4-dimetilamino-L-fenilalanina (DMPAPA), ácido L-pipecólico, L-fenilglicina e/ou ácido 3-hidroxipicolínico (3-HPA). 13
Trata-se, de um modo mais preferido, dos genes papA, papM, papB (SEQ ID N°3), papC (SEQ ID N°2), hpaA (SEQ ID N°8), snbE (SEQ ID N°6) e pipA (SEQ ID N°5) descritos abaixo.
No que se refere aos genes papA e papM, estes foram já descritos no pedido de patente PCT/FR93/0923. Estes estão presentes no cosmídeo pIBV2. 0 gene papA parece corresponder a um gene da biossíntese da 4-amino-L-fenilalanina a partir do corismato. A 4-amino-L-fenilalanina é, em seguida, dimetilada pelo produto do gene papM. uma N-metiltransferase, para formar 4-dimetilamino-L-fenilalanina, DMPAPA, que é, em seguida, incorporada na pristinamicina IA. Estes dois genes intervêm pois mais particularmente ao nível da síntese do precursor conhecido COmo DMPAPA.
No que se refere a outros genes papB, papC, pipA, snbF e hpaA, estes foram identificados e caracterizados no âmbito da presente invenção. Estes são agrupados com os genes snbA, papA e papM numa região cromossómica de cerca de 10 kb (figura 7).
As homologias de sequência detectadas para as proteínas PapB e PapC, mostram que estas proteínas estão igualmente envolvidas na biossíntese do precursor DMPAPA, juntamente com as proteínas PapA e PapM. Os dois novos genes correspondentes, papB e papC, foram isolados e identificados por sub-clonagens realizadas a partir do cosmídeo pIBV2, descrito no pedido de patente PCT/FR93/0923 e de um plasmídeo pVRC900, derivado de pIBV2 por uma eliminação HindIII, igualmente descrito no pedido de patente PCT/FR93/00923 (ou WO94/08014) . A comparação entre a proteína codificada pelo gene papC e as sequências proteicas contidas na base de dados Genpro revela 14 uma homologia de 27% com a região envolvida na actividade da prefenato desidrogenase das proteínas bifuncionais TyrA de E. coli (Hudson e Davidson, 1984) e de Erwinia herbicola (base de dados EMBL, 1991). Esta região de TyrA catalisa a aromatização do prefenato em 4-hidroxifenilpiruvato na biossíntese da tirosina. Uma aromatização semelhante a partir de 4-desoxi 4-amino prefenato originando 4-amino-fenilpiruvato intervém muito provavelmente na síntese da DMPAPA. Esta será catalisada pela proteína PapC (SEQ ID N° 2).
No que se refere à proteína PapB, esta possui uma homologia de 24 a 30% com a região envolvida na actividade da corismato mutase das proteínas bifuncionais TyrA e PheA de E. coli (Hudson e Davidson, 1984) e da proteína TyrA de Erwinia herbicola. Esta região catalisa a isomerização do corismato em prefenato na biossíntese da tirosina e da fenilalanina. A proteína PapB (SEQ ID N° 3) intervém provavelmente ao nível da isomerização semelhante a partir do 4-desoxi-4-amino-corismato originando o 4-desoxi-4-aminoprefenato na síntese da DMPAPA.
No que se refere aos genes pípA, snbF e hpaA, estes foram localizados nas regiões contidas entre o gene snbA codificante para a ácido 3-hidroxipicolínico AMP ligase, descrita no pedido de patente PCT/FR93/0923 e os genes papA ou snbR. Estes foram localizados precisamente por sub-clonagens realizadas a partir do plasmídeo pVRC900 e do cosmídeo plBV2, descritos no pedido de patente PCT/FR93/0923.
Comparando a proteína codificada pelo gene o hpaA e as sequências proteicas contidas na base de dados Genpro, foi detectada uma homologia de 30 a 40% com um grupo de proteínas provavelmente envolvidas (Thorson et al., 1993) na transaminação 15 de intermediários da biossintese de vários antibióticos (DnrJ, EryCl, TylB, StrS, PrgL) A síntese do precursor 3-HPA que parece derivar da lisina por uma outra via que não a ciclodesaminação (ver exemplos 1-2 e 2-1), necessita provavelmente de uma etapa de transaminação susceptível de ser catalisada pelo produto deste gene designado hpaA (SEQ id N° 8) . Os resultados da mutação realizada neste gene mostram, além disso inequivocamente, o envolvimento deste gene na síntese do precursor 3-HPA. A comparação do produto codificado pelo gene conhecido como pipA com as sequências proteicas contidas na base de dados Genpro revela uma homologia de 30% com a ciclodesaminase ornitina de Agrobacterium tumefascians (Schindier et al., 1989) Esta enzima intervém na última etapa do catabolismo da octopina; esta converte L-omitina em L-prolina por ciclo-desaminação. A requerente demonstrou por incorporação de lisina marcada que o ácido 4-oxopipecólico e o ácido 3-hidroxipicolínico, encontrados na PIA e na virginiamicina Sl, derivam da lisina (Molinero et al., 1989; Reed et al., 1989). Uma reacção de ciclodesaminação da lisina semelhante à descrita para a ornitina levaria à formação de ácido pipecólico. Tendo em consideração esta hipótese este produto foi designado PipA (SEQ ID N° 5) . Os resultados da mutação no gene pipA, apresentado nos exemplos abaixo, mostram o envolvimento do gene pipA na própria síntese do ácido pipecólico. Em particular, é verificado que esta mutação não afecta a biossintese do ácido 3-hidroxipicolínico que deriva também da lisina e do qual o ácido pipecólico podia ser um precursor.
Finalmente, comparando o produto do gene conhecido como snbF com as sequências proteicas contidas na base de dados 16
Genpro, foi verificada uma homologia de 30 a 40% com várias hidroxilases do tipo citocromo P450, envolvidas na biossintese de metabolitos secundários (Omer et al., 1990. Trower et al.r 1992) . São possíveis várias hidroxilações na biossintese dos precursores da pristinamicina I, nomeadamente ao nível da biossintese de 3-hpa (hidroxilação em 3 do ácido picolínico) e do ácido 4-oxopipecólico (hidroxilação em 4 do ácido pipecólico). A proteína correspondente foi designada SnbF (SEQ ID N° 6) .
Os resultados da mutação no gene pipA, com efeitos polares sobre a expressão do gene snbF, mostram o envolvimento do gene snbF na hidroxilação do resíduo ácido pipecólico das estreptograminas do grupo B. Deste modo, a expressão do gene snbF é alterada através de uma mutação genética ao nível do gene pipA.
De um modo preferido, a ou as modificações genéticas tornam o referido gene parcial ou totalmente incapaz de codificar para para a proteína natural.
Por modificação genética, deve-se entender mais particularmente qualquer supressão, substituição, eliminação ou adição de uma ou mais bases nos genes considerados. Essas modificações podem ser obtidas in vitro (em ADN isolado) ou in situ, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética ou ainda, expondo os referidos microrganismos a um tratamento utilizando agentes mutagénicos. Como agentes mutagénicos, podem-se referir, por exemplo, os agentes físicos, tal como as radiações energéticas (raios x, γ, ultra violeta, etc.) ou os agentes químicos capazes de reagir com vários grupos funcionais das bases de ADN e, por exemplo, agentes alquilantes 17 [etilmetanossulfonato (EMS), N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina, N-nitroquinoleina-l-óxido (NQO)], agentes bialquilantes, agentes intercalantes, etc. Por eliminação, entende-se qualquer supressão de uma parte ou da totalidade do gene considerado. Pode-se tratar nomeadamente de uma parte da região codificante para as referidas proteínas e/ou da totalidade ou de parte da região promotora da transcrição, tradução ou, ainda, do transcrito.
Podem ser igualmente obtidas modificações genéticas por interrupção génica, por exemplo, de acordo com o protocolo inicialmente descrito por Rothstein [Meth. Enzymol. 101 (1983) 202] ou vantajosamente por recombinação homóloga dupla. Neste caso, a totalidade da sequência codificante será, de um modo preferido, perturbado para permitir se necessário, a substituição, por recombinação homóloga, da sequência genómica selvagem por uma sequência não-funcional ou mutante.
De acordo com uma outra forma de realização, as modificações genéticas podem consistir na colocação do ou dos genes codificantes das referidas proteínas sob o controlo de um promotor regulado.
As estirpes de microrganismos mutantes descritas podem ser obtidas a partir de qualquer microrganismo produtor de estreptogramina (ver a tabela V). De acordo com um modo particular de realização da invenção, trata-se de uma estirpe que deriva de S. pristinaespiralis e, mais particularmente, de S. pristinaespiralis SP92. A título de estirpe mutante preferida, no âmbito da presente invenção, podem-se referir mais particularmente a 18 estirpe SP92::pVRC508, mutada na biossíntese do precursor DMPAPA por interrupção por cruzamento simples do gene papA ou ainda, de um modo mais preferido, a estirpe SP212, mutada na biossíntese do precursor DMPAPA por interrupção do gene papA por recombinação homóloga dupla. Estas estirpes não produzem PI, a menos que estas sejam suplementadas com o precursor DMPAPA. De um modo inesperado, quando um precursor original, diferente da DMPAPA e capaz, após metabolização, se necessário, de ser incorporado pela sintetase III com PI (proteína SnbD responsável pela incorporação dos resíduos de L-prolina e de DMPAPA) é adicionado ao meio de produção, estas duas estirpes tornam-se capazes de produzir novas pristinamicinas I ou virginiamicinas ou de produzir maioritariamente um componente normalmente minoritário da PI, nomeadamente, a PiB (figura 2).
No âmbito da presente invenção, foram preparadas duas outras estirpes mutantes. Trata-se, respectivamente, da estirpe SP92pípA::QamR interrompida no gene pipA por recombinação homóloga e da estirpe SP92hpaA::QamR interrompida no gene hpaA. A estirpe SP92pipA: :QamR por um lado, não produz mais PI nas condições convencionais de fermentação e, por outro, na presença de ácido L-pipecólico, permite uma produção significativa de um componente inicialmente minoritário dos componentes B das estreptograminas em que o ácido 4-oxopipecólico é substituído pelo ácido L-pipecólico. No que se refere à estirpe SP92hpaA: :QamR de S. pristinaespiralis, esta não produz PI nas condições da fermentação convencionais, mas é capaz de produzir novas estreptograminas do grupo B, na presença de precursores originais.
Por suplementação do meio de cultura de estirpes mutantes de acordo com a invenção com, pelo menos, um precursor original, 19 torna-se possível orientar a biossíntese para novas estreptograminas ou para uma sua forma minoritária ou ainda privilegiar a sua formação.
Os precursores utilizados no âmbito da presente invenção podem ser derivados ou análogos de aminoácidos e mais particularmente da fenilalanina, assim como ácidos orgânicos e nomeadamente ácidos alfa-cetocarboxílicos e mais particularmente derivados do ácido fenilpirúvico.
Obviamente, o precursor original é tal que proporciona a alteração e mesmo o bloqueio, induzido de acordo com a invenção, ao nível da biossíntese de um dos precursores naturais das estreptograminas do grupo B e conduz à síntese de estreptograminas. De acordo com um modo particular da invenção, este precursor original é seleccionado de forma a ser relacionado com o precursor cuja biossíntese é alterada. Deste modo, no caso particular de um mutante bloqueado na biossíntese da DMPAPA, o precursor original é, de um modo preferido, um derivado da fenilalanina. A titulo de precursores convenientes à invenção, podem-se referir nomeadamente os seguintes:
Fenilalanina, 4-metilaminofenilalanina, 4-dietilaminofenilalanina, 4-metiltiofenilalanina, 4-metoxifenilalanina, 4-metoxicarbonilfenilalanina, 4-bromofenilalanina, 4-trifluorometilfenilalanina, 4-dimetilaminofenilalanina, 4-aminofenilalanina, 4-etilaminofenilalanina, 4-metilfenilalanina, 4-trifluorometoxifenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-iodofenilalanina, 4-terc-butilfenilalanina, 20 4-isopropilfenilalanina, 3-metoxifenilalanina, 3-fluoro 4-metilfenilalanina, 3-metilaminofenilalanina, 3-metiltiofenilalanina, ácido L-pipecólico, ácido 4-terc-butilfenilpirúvico, ácido 4-metilaminofenilpirúvico, 4-fluorofenilalanina, 3- etoxifenilalanina, 3,4-dimetilfenilalanina, 4- fenilfenilalanina, 2-tienil-3-alanina, hidroxifenilalanina, 4-alilaminofenilalanina, 4-aliletilaminofenilalanina, 2- naftilfenilalanina, 3- fluorofenilalanina, 2, 4-dimetilfenilalanina, 3- metilfenilalanina, 4- butilfenilalanina, 3-trifluorometilfenilalanina, 3- etilaminofenilalanina 4- dialilaminofenilalanina, 4-etil propilaminofenilalanina, 4-etil-4-(1-pirrolidinil) 4-0-etiltirosina, 4-etil isopropilaminofenilalanina, metilciclopropilaminofenilalanina, fenilalanina, 4-0-aliltirasina, 4-etiltiofenilalanina, 4-etiltiometilfenilalanina, 4-0-(2-cloroetil) tirosina, 4-acetil-fenilalanina, 4-etil-fenilalanina, 3-dimetilaminofenilalanina, 3-etoxi-fenilalanina, 3-fluoro4-metilfenilalanina e 4-aminometilfenilalanina.
Entre estes precursores, 4-trifluorometoxifenilalanina, 3-metilaminofenilalanina, 3-metiltiofenilalanina, 3-fluoro4-metilfenilalanina, ácido 4-metilaminofenilpirúvico, 3- etoxifenilalanina, 4-alilaminofenilalanina, 4- dialilaminofenilalanina, 4-alil-etilaminofenilalanina, 4-etil propilaminofenilalanina, 4-etilisopropilaminofenilalanina, 4-etilmetil-ciclopropilaminofenilalanina, 4-(1-pirrolidinil)-fenilalanina, 4-etiltiometilfenilalanina, 4-0-(2-cloroetil)tirosina, 3-dimetilaminofenilalanina e 3-etilaminofenilalanina são novos e foram preparados e 21 caracterizados no âmbito da presente invenção. Estes revelam-se particularmente úteis para preparar estreptograminas de acordo com a invenção. 0 processo reivindicado revela-se particularmente interessante para preparar novas estreptograminas do grupo B ou ainda para privilegiar a formação de algumas destas. Por essa razão é particularmente útil preparar a PIB.
As associações entre um componente das estreptograminas do grupo A e um composto de fórmula geral I, de acordo com a invenção, constituem composições particularmente interessantes ao nivel terapêutico. Estas são nomeadamente utilizadas para os tratamentos de afecções devidas a bactérias Gram-positivas (do género Estafilococos, Estreptococos, Pneumococos, Enterococos) e Gram-negativas (do género Haemophilus, Gonococos, Meningococos). É deste modo que os compostos de acordo com a invenção sinergizam in vivo a acção antibacteriana da pristinamicina IIB sobre Staphylococcus aureus IP8203 em murganhos, em doses principalmente compreendidas entre 30 mg/kg e 100 mg/kg por via oral, quando estes estão associados em proporções PI/PII de cerca de 30/70. A presente invenção estende-se a qualquer composição farmacêutica contendo, pelo menos, um composto de fórmula geral I em associação ou não com uma estreptogramina do grupo A.
Os exemplos que aparecem abaixo são apresentados a título ilustrativo e não limitativo da presente invenção. 22 LISTA DE FIGURAS.
Figura 1: Estrutura da pristinamicina Ia.
Figura 2: Estrutura dos componentes minoritários da pristinamicina I.
Figura 3: Outros exemplos de estruturas de componentes B das estreptograminas.
Figura 4: Representação da região PstI-Xhol com 2,9 kb.
Figura 5: Representação da região Xhol-PstI com 4,5 kb.
Figura 6: Representação da região HindIII-BglII com 1,6 kb.
Figura 7: Representação da região BglII-Xhol com cerca de 10 kb.
Figura 8: Representação do plasmideo pVRC415.
Figura 9: Representação do plasmideo pVRC420.
Figura 10: Representação do plasmideo pVRC411.
Figura 11: Representação do plasmideo pVRC421.
Figura 12: Representação do plasmideo pVRC414.
Figura 13: Estratégia de construção de SP212. 23 EXEMPLO 1: Sequenciação e identificação de genes envolvidos na biossíntese da pristinamicina I e dos seus precursores.
Identificação por sequenciação de genes localizados a jusante e a montante do gene codificante para a enzima PapA descrita na patente PCT/FR93/0923, assim como de um gene localizado a jusante do gene codificante para a enzima SnbA, igualmente descrita na patente PCT/FR93/0923.
Este exemplo descreve como se verifica ser possível identificar por sequenciação em redor destes genes e estudo dos mutantes correspondentes, outros genes envolvidos na biossíntese do precursor DMPAPA ou na biossíntese de outros precursores da pristinamicina I, a partir do cosmídeo piBV2, descrito na patente PCT/FR93/0923 e contendo os genes estruturais das enzimas PapA e PapM, intervindo na síntese do precursor 4-dimetilamino-L-fenilalanina (DMPAPA) da pristinamicina I e do gene de estrutura da enzima SnbA responsável pela activação do precursor aromático da pristinamicina I, o ácido 3-hidroxipicolínico (3-HPA).
Para esta finalidade foram realizadas sub-clonagens a partir do cosmídeo pIBV2 e do plasmídeo pVRC900, derivado de pIBV2 por uma eliminação HindIII, e igualmente descrita na patente PCT/FR93/00923 (ou W094/08014).
Este exemplo ilustra como podem ser obtidas as sequências nucleotídicas de fragmentos situados a jusante e a montante dos genes papA e snbA de S. prístínaespíralís.
As técnicas de clonagem dos fragmentos de ADN de interesse nos vectores Ml3mpl8/19 (Messing et al., 1981) são as técnicas 24 covencionais de clonagem em Escherichia coli e são descritas em Maniatis et al. (1989). 1-1 Sequenciação e análise da região a jusante do gene papA.
Para sequenciar esta região, contida entre os genes papA e papM. os fragmentos PstI-PstI com 1,5 kb, PstI-Xhol com 0,7 kb e xhol-xhol com 0,7 kb foram subclonados nos vectores Ml3mpl8 e Ml3mpl9 a partir do plasmídeo pVRC900. Os locais de clonagem foram percorridos por sequenciação de ADN em cadeia dupla, utilizando os plasmideos pVRC900 e pVRC409 descritos na patente PCT/FR93/00923 (ou WO94/08014). As clonagens foram realizadas como se segue. Foram cortadas cerca de 2 pg do plasmídeo pVRC900 pelas enzimas de restrição PstI e/ou Xhol (New England Biolabs) nas condições recomendadas pelo fornecedor. Os fragmentos de restrição, deste modo obtidos, foram separados em gel de agarose a 0,8% e os fragmentos de interesse, PstI-PstI com 1,5 kb, PstI-Xhol com 0,7 kb e Xhol-Xhol com 0,7 kb foram isolados e purificados por Geneclean (BiolOl, La Jolla, Califórnia). Para cada clonagem, foram ligados cerca de 10 ng de M13mpl9 e/ou Ml3mpl8 cortado com PstI e/ou Xhol, com 100 ng do fragmento a clonar, nas condições descritas por Maniatis et al. 1989. Após a transformação da estirpe TG1 (K12, δ (lac-pro) supE thi hsd 5S F traD36 proA+B+ laclq lacZ 5M15; Gibson, 1984) e selecção das placas de lise em LB + X-gal + IPTG, de acordo com a técnica descrita por Maniatis et al. (1989), foram isolados os fagos contendo os fragmentos pretendidos. As diferentes inserções foram sequenciadas pelo método da reacção de terminação da cadeia, utilizando como iniciador de síntese o inicador universal ou os oligonucléotidos sintéticos e complementar a uma 25 sequência de 20 nucleótidos da inserção a sequenciar. As reacções foram realizadas utilizando didesoxinucleótidos fluorescentes (Kit PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing -Applied Biosystem) e foram analisadas num sequenciador de ADN do tipo Applied Biosystems Modelo 373A. A sobreposição entre estas diferentes inserções permitiu estabelecer a sequência nucleotídica total presente entre os genes papA e papM (SEQ ID N°l). É possível determinar as grelha de leitura aberta e identificar deste modo genes envolvidos na biossíntese da PI ou dos seus precursores em S. pristinaespiralis, assim como os polipéptidos codificados por estes genes, a partir desta sequência nucleotídica. A requerente pesquisou a presença de grelhas de leitura aberta no interior do fragmento Pstl-Xhol com 2,9 kb, contendo a sequência nucleotídica entre os genes papA e papM, utilizando o facto do ADN de Streptomyces apresentar uma elevada percentagem de bases G e C, assim como um enviesamento significativo na utilização de codões que constituem as grelhas codificantes (Bibb et al. 1984). O método de Staden e Mc Lachlan (1982) permite calcular a probabilidade das grelhas codificantes de acordo com a utilização de codões de genes de Streptomyces já sequenciados e reunidos num ficheiro contendo 19673 codões obtido a partir do servidor informático BISANCE (Dessen et al. 1990) .
Este método permitiu caracterizar no interior do fragmento Pstl-Xhol com 2,9 kb, quatro grelhas de leitura de leitura aberta altamente prováveis que estão representadas na tabela seguinte (TABELA I) . Estas são denominadas grelhas de leitura 1 26 a 4, de acordo com a sua posição a partir do local PstI. Para cada um, indicou-se o seu comprimento em bases e a sua posição no interior do fragmento (estando o local Pst I localizado na posição 1); para as grelhas de leitura aberta 2 e 3, foi igualmente indicado o tamanho em aminoácidos do polipéptido codificado. As grelhas de leitura 1, 3 e 4 são codificadas pela mesma cadeia e a fase 2 pela cadeia complementar (figura 4) . As fases 1 e 4 correspondem, respectivamente, às regiões do terminal C da proteína PapA e do terminal N da proteína PapM, anteriormente identificada e descrita na patente pct/FR.93/00923 (ou WO94/08014).
TABELA I Número da grelha de leitura e/ou nome do gene Posição Número de nucleótidos Número de aminoácidos 1 (PapA) 1-684 684 - 2 (PapC)(inv) 949-1836 888 296 3 (PapB) 1873-2259 387 129 4 (PapM) 2259-2887 629 - A comparação entre o produto da grelha de leitura 2 (TABELA I) e as sequências proteicas contidas na base de dados Genpro revela uma homologia de 27% com a região envolvida na actividade da prefenato desidrogenase das proteínas bifuncionais TyrA de E. coli (Hudson e Davidson, 1984) e de Erwinia herbicola (base de dados EMBL, 1991) . Esta região de TyrA catalisa a aromatização do prefenato em 4-hidroxifenilpiruvato na biossíntese da tirosina. Um aromatização semelhante a partir de 4-desoxi-4-amino-prefenato originando 4-amino-fenilpiruvato 27 intervém, muito provavelmente, na síntese da DMPAPA. Esta reacção será catalisada pelo produto da grelha de leitura 2, designado PapC (SEQ ID N° 2). A comparação entre o produto da grelha de leitura 3 (TABELA I) e as sequências proteicas contidas na base de dados Genpro revela uma homologia de 24 a 30% com a região envolvida na actividade da corismato mutase das proteínas bifuncionais TyrA e PheA de E. coli (Hudson e Davidson, 1984) e da proteína TyrA de Erwinia herbicola. Esta região catalisa a isomerização do corismato em prefenato na biossíntese da tirosina e fenilalanina. Uma isomerização semelhante a partir de 4-desoxi-4-amino-corismato originando 4-desoxi-4-aminoprefenato intervém muito provavelmente na síntese da DMPAPA. Esta reacção será catalisada pelo produto da grelha de leitura 3, designado PapB (SEQ ID N° 3).
No caso de TyrA e PheA as actividades da corismato mutase e da prefenato desidratase ou da prefenato desidrogenase são catalisadas pela mesma proteína. Em S. pristinaespiralis, as actividades enzimáticas da corismato mutase e da prefenato desidrogenase são catalisadas por duas proteínas separadas, respectivamente, PapB e PapC.
As homologias de sequências detectadas para as proteínas PapB e PapC, mostram que estas duas proteínas estão envolvidas na biossíntese do derivado aromático DMPAPA, juntamente com as proteínas PapA e PapM. Tal como para papa, a interrupção dos genes papB e papC deve levar à construção de estirpes de S. pristinaespiralis incapazes de produzirem a PI mas susceptíveis de produzirem na presença de precursores originais das novas PI modificadas ao nível do resíduo DMPAPA. 28 1-2. Sequenciação e análise da região a montante do gene papA.
Esta região está contida entre o gene snbA codificante para a ácido 3-hidroxipicolinico-AMP ligase, descrito na patente PCT/FR93/00923 e o gene papA.
As clonagens foram realizadas como descrito no exemplo 1-1, a partir do plasmideo pVRC900 e do cosmideo pIBV2 descrito na patente PCT/FR93/00923. Os fragmentos Xhol-Xhol com 1,3 kb, Xhol-Xbol com 0,2 kb, Xhol-Xhol com 3,3 kb, HindlII-Pstl com 1,1 kb e PstI-PstI com 2,2 kb foram subclonados nos vectores Ml3mpl8 e Ml3mpl9. Estas diferentes clonagens permitiram percorrer todos os locais da clonagem. A diferentes inserções foram sequenciadas como descrito em 1-1, utilizando como iniciador de síntese o iniciador universal ou oligonucleótidos sintéticos, complementares a uma sequência de 20 nucleótidos da inserção a sequenciar. A sobreposição entre estas várias inserções permitiu estabelecer a sequência nucleotídica total presente entre os genes snbA e papA (SEQ ID N° 4). A partir desta sequência nucleotídica, é possível determinar as grelha de leitura abertas e identificar genes envolvidos na biossíntese dos precursores da PI de S. pristinaespiralis, assim como os polipéptidos codificados por estes genes. A requerente pesquisou a presença de grelhas de leitura aberta no interior do fragmento Xhol-PstI com 4,5 kb contendo a sequência nucleotídica entre os genes snbA e papa, como descrito 29 no exemplo 1,1. Este método permitiu caracterizar quatro grelhas de leitura abertas altamente prováveis, no interior do fragmento Xhol-PstI com 4,5 kb, que estão representadas na tabela seguinte (TABELA II). Estas são denominadas grelhas de leitura 1 a 4 de acordo com a sua posição a partir do local Xhol. Para cada uma, indicou-se o seu comprimento em bases e a sua posição no interior do fragmento (estando o local Xhol localizado na posição 1); para as grelhas de leitura aberta 2 e 3, indicou-se igualmente o tamanho em aminoácidos do polipéptido codificado. As grelhas de leitura 2, 3 e 4 são codificadas pela mesma cadeia e a grelha de leitura 1 pela cadeia complementar (figura 5) . As grelhas de leitura 1 e 4 correspondem respectivamente às regiões do terminal N das proteínas SnbA e PapA, anteriormente identificadas e descritas na patente PCT/FR93/00923 (ou WO94/08014).
TABELA II Número da grelha de leitura e/ou nome do gene Posição Número de nucleótidos Número de aminoácidos 1 (SnbA) (inv) 1-329 329 - 2 (PipA) 607-1671 1065 355 3 (SnbF) 1800-2993 1194 398 4 (PAPA) 3018-4496 1479 - A comparação entre o produto da grelha de leitura 2 (TABELA II) e as sequências proteicas contidas na base de dados Genpro, revela uma homologia de 30% com a ornitina ciclodesaminase de Agrobacterium tumefascians (Schindler et al., 1989). Esta enzima intervém na última etapa do catabolismo da octopina; esta converte L-ornitina em L-prolina por ciclo- 30 desaminação. A r demonequerente demonstrou por incorporação de lisina marcada que o ácido 4-oxopipecólico e o ácido 3- hidroxipicolínico, encontrados na PIa e na virginiamicina Sl, derivam da lisina (Molinero et al., 1989; Reed et al., 1989). Uma reacção de ciclodesaminação da lisina semelhante à descrita para a ornitina irá levar à formação de ácido pipecólico. Tendo em consideração esta hipótese, o produto grelha de leitura de 2 foi designado PipA (SEQ ID N° 5) . Os resultados da mutação no gene pipA, apresentados em 2-1, mostram o envolvimento do gene pipA na própria sintese do ácido pipecólico, uma vez que esta mutação não afecta a biossintese do ácido 3-hidroxipicolinico que deriva também da lisina e do qual o ácido pipecólico pode ter sido precursor. A comparação do produto da grelha de leitura 3 (TABELA II) as sequências proteicas contidas na base de dados Genpro revela com uma homologia de 30 a 40% com várias hidroxilases do tipo citocromo P450 envolvidas na biossintese de metabolitos secundários (Omer et al., 1990. Trower et al., 1992). São possíveis várias hidroxilações na biossintese dos precursores da pristinamicina I, nomeadamente ao nivel da biossintese do 3-HPA (hidroxilação em 3 do ácido picolinico) e do ácido 4- oxopipecólico (hidroxilação em 4 do ácido pipecólico) . Os resultados da mutação no gene pipa, apresentados em 2-1-3, mostram o envolvimento do produto da grelha de leitura 3 na hidroxilação do resíduo de ácido pipecólico da PIe. O gene correspondente foi consequentemente designado snbF e a proteína correspondente SnbF (SEQ ID N° 6). 31 1-3. Sequenciação da região a jusante do gene snbA.
Esta região está compreeendida entre o gene snbA codificante para a ácido 3-hidroxipicolinico-adenilato ligase e o gene snbR, codificante para uma proteína membranar provavelmente responsável pelo transporte e pela resistência à PI, ambos descritos na patente PCT/FR93/00923. As sequências foram realizadas a partir de um fragmento isolado do cosmídeo pIBV2, como descrito no exemplo 1-1. 0 fragmento HindlII-BglII com 1,6 kb foi subclonado nos vectores Ml3mpl8 e Ml3mpl9, a partir do cosmídeo pIBV2. A inserção foi sequenciada como descrito em 1-1, utilizando como iniciador de síntese o iniciador universal ou oligonucleótidos sintéticos, complementar a uma sequência de 20 nucleótidos da inserção a sequenciar. É possível determinar as grelhas de leitura abertas e identificar genes envolvidos na biossíntese dos precursores da PI de S. pristinaespiralis assim como os polipéptidos codificados por estes genes, a partir da sequência nucleotídica deste modo obtida (SEQ ID N° 7) . A requerente pesquisou a presença de grelhas de leitura aberta no interior do fragmento Hindlll-Bglll com 1,6 kb correspondentes ao final do gene snbA e à sua região a jusante, como descrito no exemplo 1-1. Foi detectada uma grelha de leitura aberta completa, codificada pela mesma cadeia que o gene snbA (figura 6) . Em comparação com a posição 1, correspondente ao local Hindlll, esta grelha de leitura inicia no nucleótido 249, 30 nucleótidos após o final do gene snbA e termina no nucleótido 1481. O seu tamanho é de 1233 nucleótidos correspondente a uma proteína com 411 aminoácidos. 32 A comparação do produto desta grelha de leitura aberta com as sequências proteicas contidas na base de dados Genpro, revela uma homologia de 30 a 40% com um grupo de proteínas provavelmente envolvidas (Thorson et al., 1993) na transaminação de intermediários da biossintese de vários antibióticos (DnrJ, EryCl, TylB, StrS, PrgL) . A síntese do precursor 3-HPA que parece derivar da lisina por uma outra via que não a ciclodesaminação (ver exemplos 1-2 e 2-1), pode requerer uma etapa de transaminação susceptível de ser catalisada pelo produto desta grelha de leitura 3, designado HpaA (SEQ id N° 8). Os resultados da mutação neste gene, apresentados em 2-2, mostram inequivocamente o envolvimento deste gene na síntese do precursor 3-HPA e confirmam a hipótese dos requerentes.
Os genes papB, papC, pipA, snbF e hpaA descritos na presente invenção são agrupados com os genes snbA, papA e papM numa região cromossómica com cerca de 10 kb (figura 7) . Isto confirma a presença de um grupo de genes envolvidos na biossintese da PI e dos seus precursores. O estudo das regiões a montante e a jusante deste grupo deverá permitir identificar outros genes da biossintese dos precursores da PI, nomeadamente da L-fenilglicina e do ácido L-2-aminobutírico. EXEMPLO 2: Construção de estirpes recombinantes por interrupção de genes identificados.
Este exemplo ilustra como é possível detectar o envolvimento de genes descritos no exemplo 1, na biossintese dos precursores da pristinamicinas, assim como construir estirpes de S. pristinaespiralis capazes de produzir novas pristinamicinas. Estas estirpes são obtidas por interrupção de genes envolvidos 33 na biossíntese do resíduo que se pretende substituir e as novas pristinamicinas são produzidas por complementação destes mutantes com precursores originais. A estirpe SP92::pVRC508 utilizada na presente invenção para produzir novos derivados da Pi, substituindo o precursor DMPAPA por outras moléculas, é descrita na patente PCT/FR93/00923 (documento WO94/08014). Esta resulta da interrupção por cruzamento simples do gene papA envolvido na biossíntese do precursor da DMPAPA e suposto de intervir numa etapa precoce no que se refere à transaminação do corismato. Esta interrupção tem um carácter polar dado que, neste mutante, a expressão do gene papM (documento PCT/FR93/00923 ou WO 94/108014), situado 1,5 kb a jusante do gene papA e envolvido na metilação dupla da 4-amino-L-fenilalanina em DMPAPA, é muito reduzida. De facto o doseamento da actividade da enzima de metilação dependente de SAM da 4-amino-L-fenilalanina (PAPA) em DMPAPA indica uma actividade inferior a 5% da actividade da estirpe selvagem para o mutante SP92::pVRC508.
Na presente invenção, esta estirpe SP92::pVRC508 permite produzir novas pristinamicinas, modificadas ao nivel do resíduo de DMPAPA, como será apresentado no exemplo 3, em condições de fermentação e de complementação adequadas. Podem ser obtidos mutantes com o mesmo fenótipo por interrupção dos genes papB ou papC descritos na presente invenção.
De um modo semelhante, foi obtido um outro tipo de estirpe de S. pristinaespiralis, interrompida no gene papA e possuindo o mesmo fenótipo que a estirpe SP92:pVRC508, por interrupção do gene papA por cruzamento duplo. Esta construção foi realizada a partir de um fragmento Sphl-HindIII com 4,6 kb, isolado a partir 34 do cosmídeo pIBV2 e contendo a região 3' do gene pipA, os genes snbF e papA na totalidade assim como a parte 3' do gene papC. Este fragmento foi clonado no vector suicida pDH5, capaz de se replicar apenas em E. coli, mas contendo um marcador de resistência que é expresso em Streptomyces (o gene de resistência à tiostreptona ou o noiéptido, tsr). Este vector pDH5 foi desenvolvido por Wohlebben et al. (1991 Nucleic Acid. Res. 19, 727-731). Foi, em seguida, realizada uma eliminação
Bcll-Bcll de 1,1 kb no gene papA e foi introduzido um fragmento Hindlll-HindlII com 2,2 kb contendo o gene amR (resistência à geneticina e à apramicina) após preenchimento das extremidades coesivas. 0 vector recombinante foi designado pVRC414 e é apresentado na figura 12. Após transformação da estirpe produtora de pristinamicinas pelo plasmídeo pVRC414 foram isolados e analisados transformantes resistentes à geneticina e sensíveis à tiostreptona. Estes clones resultam de uma recombinação dupla homóloga entre as regiões de ADN de S. pristinaespiralis do plasmídeo pVRC414 e a região cromossómica de S. pristinaespiralis correspondente, tal como descrito na figura 13. Um destes clones foi designado SP212. 0 seu fenótipo é idêntico ao da estirpe SP92::pVRC508 no que refere à não produção de PI e à sua capacidade para produzir novos antibióticos na presença de precursores originais. Vantajosamente, este tipo de estirpe, obtido por cruzamento duplo, apresenta uma melhor estabilidade, comparativamente às estirpes obtidas por cruzamento simples. 35 2-1. Construção de um mutante de S. pristinaespiralis SP92 interrompido no gene pipA.
Este exemplo ilustra como é possível construir uma estirpe de S. pristinaespiralis SP92 por interrupção do gene pipA que deixa de produzir pi sob condições da fermentação convencionais e que é capaz de produzir novas pristinamicinas, modificadas ao nivel do resíduo de ácido 4-oxopipecólico da PIA, quando são adicionados precursores originais à fermentação. A sua construção foi realizada utilizando um vector suicida que replica apenas em E.coli, o vector pUC1318. Este vector não contém um marcador de resistência que se expresse em Streptomyces. A sua presença no genoma de Streptomyces pode ser apenas detectada por hibridação em colónias. 2-1-1. Construção do plasmideo pVRC420:
Este exemplo ilustra como é possível construir um plasmideo que se replica em S. pristinaespiralis SP92 que pode ser utilizado para interromper o gene pipA por recombinação homóloga dupla. 0 plasmideo pVRC420 foi construído para preparar o mutante cromossómico SP92 interrompido no gene pipA a partir do cosmídeo pIBV2 descrito na patente PCT/FR93/0923. 0 cosmídeo pIBV2 foi cortado com a enzima de restrição PstI e após separação dos fragmentos deste modo produzidos por electroforese em gel de agarose a 0,8%, foi isolado um fragmento PstI-PstI com 2,8 kb, contendo o início dos genes snbA e snbF e a totalidade do gene pipA e foi purificado por Geneclean (BiolOl, La Jolla, 36
Califórnia) . Foram ligadas 50 ng do vector pUC1318 linearizado por digestão com PstI, com 200 ng do fragmento com 2,8 kb, como descrito no exemplo 1. Foi isolado um clone contendo o fragmento pretendido após transformação da estirpe TG1 e selecção em meio LB + ampicilina 150 pg/mL + X-gal + IPTG. O plasmideo recombinante foi denominado pVRC415 (figura 8). Foi então inserida uma cassete contendo o gene amR, codificante para resistência à apramicina ou à geneticina (Kuhstoss et al., 1991) no local único HindlII do plasmideo pVRC415, estando este local localizado 530 pb a jusante do início do gene pipA. Esta construção foi realizada como se segue. Foi isolado um fragmento com ADN com 2,5 kb contendo o gene amR, o promotor PermE (Bibb et al., 1985) assim como os 158 primeiros aminoácidos do gene de resistência à eritromicina, ermE por uma digestão dupla SalI-BglII a partir de um plasmideo derivado do plasmídeos pIJ4026 (plasmideo contendo o gene ermE sob controlo do promotor PermE) e pHP45QamR. Após o preenchimento pela enzima de Klenow das extremidades coesivas 5' produzidas por Sall e Bglll de acordo com o protocolo descrito por Maniatis et al. 1989, o fragmento contendo o gene amR foi clonado no local HindlII do plasmideo pVRC415, cujas extremidades coesivas 5' produzidas tinham sido igualmente produzidas pela enzima de Klenow, como descrito anteriormente. O plasmideo recombinante, deste modo obtido, foi designado pVRC420. O seu mapa de restrição é apresentado na figura 9. 2-1-2. Isolamento do mutante SP92pípA::QamR, interrompido no gene pipA por recombinação homóloga.
Este exemplo ilustra como foi construído o mutante de S. pristinaespiralis SP92 interrompido no gene pipA. 37
Este mutante foi isolado por transformação da estirpe SP92 com o plasmideo suicida pVRC420. A preparação do protoplastos, a sua transformação assim como a extracção do ADN total das estirpes recombinantes foram realizadas como descrito por Hopwood et al. (1985). A estirpe SP92 foi cultivada em meio YEME (Hopwood et al., 1985), sacarose a 34%, MgCl2 a 5 mM, glicina a 0,25%, durante 40 horas a 30 °C. O micélio foi reduzido a protoplastos na presença de lisozima e foram utilizados 5 x 1 pg de pVRC420 para a transformação de protoplastos (pelo método utilizando PEG) . Após uma noite de regeneração dos protoplastos em meio R2YE (D. Hopwood et al. 1985), os recombinantes foram seleccionados por espalhamento de 3 mL de meio SNA (D. Hopwood et al. 1985) contendo geneticina 1500 pg/mL.
Foram isolados 100 clones resistentes à geneticina nas 5 transformações realizadas. Estas recombinações resultam da integração por recombinação simples ou dupla homóloga entre o gene pipA contido no cromossoma da estirpe SP92 e as partes do gene pipA contidas no fragmento com 5,3 kb contidas no plasmideo suicida pVRC420. Foram realizadas hibridações em colónia de 90 clones tendo como sonda pUC19 marcado com [a-32P]dCTP, como descrito em Maniatis et al. (1989), para seleccionar recombinantes obtidos por cruzamento duplo (ou seja não contendo no seu genoma a parte pUC1318 do plasmideo pVRC420). Foram seleccionados 10 clones resistentes à geneticina mas não hibridando com o vector puci9. Os esporos recombinantes foram isolados por espalhamento e crescimento em meio HT7 + geneticina a 10 pg/mL e foram espalhados novamente no mesmo meio para obter colónias isoladas. Foram realizados diferentes transferências de 38
Southern do ADN total de vários clones recombinantes, purificados como descrito por Hopwood et al. 1985 e hibridados com o fragmento Pstl-Pstl com 2,8 kb, utilizado como sonda após marcação com [a-32P]dCTP para verificar a posição da integração do plasmideo pVRC420. Os resultados confirmam que estes recombinantes foram obtidos por cruzamento duplo entre o vector pVRC420 e o cromossoma da estirpe SP92, levando à substituição do fragmento Pstl-Pstl com 2,8 kb, contendo o gene pipA por um fragmento Pstl-Pstl com 5,3 kb contendo o gene pipA interrompido pela introdução do gene amR. Um destes mutantes foi denominado SP92pípA::QamR. 2-1-3. Produção da pristinamicinas pelo mutante SP92pípA::QamR.
Este exemplo ilustra como é determinado que o mutante de S. pristinaespiralis SP92 interrompido no gene pipA pela integração do plasmideo pVR420, por um lado, deixa de produzir a PI nas condições convencionais de fermentação e, por outro, permite a produção significativa da forma minoritária dos componentes B das estreptograminas em que o ácido 4-oxopipecólico está substituído pelo ácido pipecólico.
Foram cultivados o mutante SP92pipA::ΩamR, assim como a estirpe SP92, como estirpe de controlo, em meio líquido de produção. A fermentação foi realizada como se segue: são adicionados 0,5 mL de uma suspensão de esporos da estirpe anteriormente referida em condições estéreis a 40 mL de meio inoculo num erlenmeyer com chicanas de 300 mL. O meio inoculo é constituído por Corn Steep a 10 g/L, sacarose a 15 g/L, (NH4)2S04 a 10 g/L, K2HP04 a 1 g/L, NaCl a 3 g/L, 0,2 a g/L de MgS04.7H20 e 39
CaC03 a 1,25 g/L. 0 pH é ajustado para 6,9 com hidróxido de sódio antes da introdução de carbonato de cálcio. Os erlenmeyers são agitados durante 44 h a 27 °C num agitador rotativo à velocidade de 325 rpm. São adicionados esterilmente 2,5 mL da cultura anterior com 44 h a 30 mL de meio de produção num erlenmeyer de 300 mL. O meio de produção é constituído por farinha de soja a 25 g/L, amido a 7,5 g/L, glicose a 22,5 g/L, levedura forrageira a 3,5 g/L, sulfato de zinco a 0,5 g/L e carbonato de cálcio a 6 g/L. O pH é ajustado para 6,0 com ácido clorídrico antes da introdução de carbonato de cálcio. Os erlenmeyers são agitados durante 24, 28 e 32 horas a 27 °C. Em cada tempo, são pesadas 10 g de meio de fermentação num erlenmeyer liso, à quais são adicionados 20 mL da fase móvel constituída por acetonitrilo a 34% e uma solução de KH2P04 0,1 M a 66% (ajustada para pH 2,9 com H3PO4 concentrado) permitindo a extracção das pristinamicinas. Após agitação, o total é centrifugado e as pristinamicinas contidas no sobrenadante são doseadas por CLHP, injectando 150 pL de sobrenadante de centrifugação numa coluna Nucleosil 5-C8 de 4,6 x 150 mm eluída com uma mistura de acetonitrilo a 40% e de tampão fosfato 0,1 M pH 2,9 a 60%. As pristinamicinas I são detectadas através da sua absorvência no UV a 206 nm.
Os resultados mostraram que nas condições de fermentação utilizadas, o mutante SP92pipA::QanP não produziu PI, isto às 24, 28 e 32 horas de fermentação, enquanto o controlo SP92 produziu para os 3 tempos testados, uma quantidade normal de PI. Para as duas estirpes, a quantidade de PIi produzida permaneceu a mesma. O mutante SP92pipA::QamR está bem bloqueado numa etapa da biossíntese da PI. Foram realizados testes complementares de fermentação adicionando vários precursores da PI, separadamente ou em conjunto, à cultura em meio de produção ao fim de 16 horas. Os resultados destas complementações permitiram mostrar que 40 quando se adiciona, simultaneamente, ácido pipecólico a 100 mg/L e DMPAPA a 100 mg/L ao meio da fermentação o mutante produziu um derivado normalmente menor da PI, a PIE (cuja quantidade produzida é inferior a 5% em SP92), a um nivel equivalente à produção de PIA pela estirpe de controlo. Esta produção não se realiza se o ácido pipecólico e a DMPAPA forem adicionados separadamente. A PIE difere da PIA (o componente principal da PI) pela ausência da função cetona em 4 no ácido pipecólico. O facto da complementação do mutante SP92pipA::QamR poder ser apenas realizada por adição simultânea de ácido pipecólico e de DMPAPA, indica que os genes papA e provavelmente papB e papM foram interrompidos pelo efeito polar da construção. De facto, todos estes genes estão localizados a jusante de pipA e são provavelmente cotranscritos com pipA. A interrupção deste último envolve consequentemente a interrupção dos genes pap e consequentemente a ausência de síntese da DMPAPA. O facto da complementação do mutante SP92pipA::QamR pelo ácido pipecólico, envolver a produção de PIE e não de PIA, leva a duas conclusões: a primeira consiste na construção do anel da PI ser realizada por incorporação de ácido pipecólico e não de ácido 4-oxopipecólico e que tem então ulteriormente lugar uma hidroxilação produzindo a função cetona em 4. A segunda consiste nesta hidroxilação ser provavelmente realizada pela enzima SnbF, cujo gene estrutural está localizado directamente a jusante do gene pipA. De facto, a polaridade evidente da interrupção do gene pipA, sobre os genes PAPA, implica provavelmente um efeito polar no gene snbF, localizado entre os genes pipA e pap, o que resulta na inibição da função de hidroxilação do resíduo ácido pipecólico da PiE no ácido 4-hidroxipipecólico encontrado nas PIF e PIG (figura 2), depois oxidado em ácido 4-oxopipecólico na PIA. 41 A realização desse mutante permitiu construir uma estirpe de S. pristinaespiralis incapaz de produzir a PI, excepto na presença de precursores da PI, DMPAPA e ácido pipecólico, a partir dos quais esta é capaz de produzir um derivado da PI normalmente minoritário na mistura da pristinamicina em quantidade equivalente à estirpe inicial. Mesmo na presença de precursores originais ou de uma mistura de precursores originais e de precursores normalmente presentes na PI, esta estirpe poderá produzir novas pristinamicinas, modificadas num ou no outro ou em ambos os resíduos DMPAPA e ácido 4-oxopipecólico. 2-2. Construção de um mutante de S. pristinaespiralis SP92 interrompido no gene hpaA.
Este exemplo ilustra como é possível construir por interrupção do gene hpaA uma estirpe de S. pristinaespiralis SP92 que deixa de produzir a PI sob condições convencionais de fermentação e que é capaz de produzir novas pristinamicinas, modificadas ao nível do precursor 3-HPA, quando são adicionados precursores originais à fermentação. A sua construção foi realizada com o auxílio de um plasmídeo que não se replica em S. pristinaespiralis SP92 que pode ser utilizado para interromper o gene hpaA por recombinação homóloga dupla. 2-2-1. construção do plasmídeo suicida pVRC421 A construção do plasmídeo pVRC421 foi realizada utilizando um vector suicida, capaz de se replicar apenas em E.coli, mas 42 contendo um marcador de resistência que é expresso em Streptomyces, o gene de resistência à tiostreptona ou ao nosiéptido, tsr. Este vector, pDH5, foi desenvolvido por Hillemann et al. (1991). 0 plasmideo pVRC421 foi construído para preparar o mutante cromossómico SP92 interrompido no gene hpaA, a partir do cosmideo pIBV2 descrito na patente PCT/FR93/0923. 0 pIBV2 foi digerido com a enzima de restrição Sphl e após separação dos fragmentos deste modo produzidos por electroforese em gel de agarose a 0,6%, foi isolado um fragmento Sphl-Sphl com 4,8 kb, contendo a totalidade do gene hpaA e a quase totalidade do gene snbA e foi purificado por Geneclean, como descrito acima. Foram ligadas 50 ng do vector pDH5 linearizado por digestão com Sphl, com 200 ng do fragmento com 4,8 kb, como descrito anteriormente. Foi isolado um clone contendo o fragmento pretendido após transformação da estirpe TG1 e selecção em meio LB + ampicilina 150 pg/mL + IPTG + X-gal. O plasmideo recombinante foi denominado pVRC411 (figura 10) . Foi então inserida uma cassete contendo o gene amR codificante para a resistência à apramicina ou à geneticina no local único Pflml do plasmideo pVRC411, estando este local localizado 610 pb a jusante do inicio do gene hpaA. Esta construção foi realizada como se segue. Foi isolado um fragmento com ADN com 2,2 kb contendo o gene amR após digestão com HindiII do plasmideo pHP45QamR contendo o gene amR. Após o preenchimento das extremidades coesivas 5' produzidas com HindIII com a enzima de Klenow de acordo com o protocolo descrito por Maniatis et al. 1989, o fragmento contendo o gene amR foi clonado no local Pflml do plasmideo pVRC411, cujas extremidades coesivas 3' produzidas, tinham sido tornadas rombas pela enzima polimerase de T4, como descrito em Maniatis et al. 43 1989. 0 plasmídeo recombinante, deste modo obtido, foi designado pVRC421. 0 seu mapa de restrição é apresentado na figura 11. 2-2-2. Isolamento do mutante SP92hpaA::QamR, interrompido no gene hpaA por recombinação homóloga.
Este exemplo ilustra como foi construído o mutante de S. pristinaespiralis SP92, interrompido no gene hpaA.
Este mutante foi isolado por transformação da estirpe SP92 com o plasmídeo suicida pVRC421. A preparação de protoplastos e a sua transformação foram realizadas como descrito anteriormente. A estirpe SP92 foi cultivada em meio YEME, sacarose a 34%, MgCl2 a 5 mM, glicina a 0,25% durante 40 horas a 30 °C. O micélio foi reduzido a protoplastos na presença de lisozima e foram utilizados 5 x 1 pg de pVRC421 na transformação (pelo método utilizando PEG) dos protoplastos. Após uma noite de regeneração doa protoplastos em meio R2YE, os recombinantes foram seleccionados por espalhamento de 3 mL de meio SNA contendo geneticina 1500 pg/mL.
Foram isolados 600 clones resistentes à geneticina nas 5 transformações realizadas. Estes recombinantes resultam da integração por recombinação simples ou dupla homóloga entre o gene hpaA contido no cromossoma da estirpe SP92 e o fragmento com 6 kb do plasmídeo suicida pVRC421. Para seleccionar os recombinantes obtidos pelo cruzamento duplo (ou sejam os clones que já não contêm a parte pDH5 do plasmídeo pVRC421 no seu 44 genoma), os clones foram replicados em meio HT7 contendo tiostreptona a 400 pg/mL. Foram seleccionados 6 clones resistentes à geneticina mas sensíveis à tiostreptona. Os esporos recombinantes foram isolados por espalhamento e crescimento em meio HT7 + geneticina a 10 pg/mL e foram espalhados novamente no mesmo meio para obter colónias isoladas. Foram realizados Southerns diferentes do ADN total dos 6 clones recombinantes, purificados como descrito por Hopwood et al. 1985 e foram hibridados com o fragmento Sphl-Sphl com 4,8 kb utilizado como sonda após marcação com [a-32 P]dCTP, para verificar a posição da integração do plasmídeo pVRC421. Os resultados confirmam que estes recombinantes foram obtidos pelo cruzamento duplo - entre o vector pVRC421 e o cromossoma da estirpe SP92, levando à substituição do fragmento Sphl-Sphl com 4,8 kb, contendo o gene hpaA por um fragmento Sphl-Sphl com 6 kb contendo o gene hpaA interrompido pelo gene amR. Um destes mutantes foi denominado SP92hpaA::QamR. 2-2-3. Produção da pristinamicinas pelo mutante SP92hpaA::QamR.
Este exemplo ilustra como é determinado que o mutante de S. prístínaespíralis SP92 interrompido no gene hpaA pela integração do plasmídeo pVR421, deixa de produzir PI sob as condições de fermentação convencionais.
Foi cultivado o mutante SP92hpaA::QamR, assim como a estirpe SP92, como estirpe controlo, em meio líquido de produção. A fermentação foi realizada como descrito para o exemplo 2-1-3, depois as pristinamicinas foram extraídas e foram doseadas como descrito anteriormente. Os resultados mostraram que nas 45 condições da fermentação realizadas, o mutante SP92hpaA::QamR não produziu PI, isto a 24, 28 e 32 horas de fermentação, enquanto o controlo produziu uma quantidade normal de PI, para os 3 tempos testados. Para as duas estirpes, a quantidade de PII produzida permaneceu a mesma. 0 mutante SP92hpaA::QamR é adequadamente bloqueado numa etapa da biossintese da Pi. Foram realizados testes complementares de fermentação adicionando vários precursores da PI à cultura em meio de produção, ao fim de 16, horas, separadamente ou em conjunto. Quando se adiciona ácido 3-hidroxipicolínico 100 mg/L ao meio da fermentação, o mutante produz então a PIA a a um nivel equivalente à produção da PI pela estirpe de controlo. O facto da complementação do mutante SP92hpaA::QamR poder ser apenas realizada adicionando ácido 3-hidroxipicolínico, mostra que o gene hpaA está envolvido na síntese deste precursor. A construção deste mutante permitiu preparar uma estirpe de S. prístínaespíralís mutada para a sua produção da PI, mas que é capaz de produzir PI em quantidade equivalente à da estirpe inicial, na presença do precursor 3-HPA. Tal como nos exemplos anteriores, é perspectivada a produção de novas pristinamicinas modificadas ao nível do resíduo de ácido 3-hidroxipicolínico a partir desse mutante e na presença de precursores originais. EXEMPLO 3: Produção de compostos de fórmula geral I pelo mutante SP92::pVRC508.
Este exemplo ilustra como o mutante de S. pristinaespiralis SP92 interrompido no gene papA pela integração do plasmídeo pVRC508 é capaz de sintetizar novas estreptograminas na presença de precursores adicionados ao meio de produção. Estes 46 precursores podem ser derivados de aminoácidos e, mais particularmente, de fenilalanina mas também de ácidos α-cetocarboxílicos e, mais particularmente, do ácido fenilpirúvico. 0 mutante SP92::pVRC508 foi cultivado em meio liquido de produção. A fermentação foi realizada como se segue: são adicionados 0,5 mL de uma suspensão de esporos da estirpe anteriormente referida em condições estéreis a 40 mL de meio inoculo num erlenmeyer com chicanas de 300 mL. O meio inoculo é constituído por Corn Steep a 10 g/L, sacarose a 15 g/L, (NH4)2S04 a 10 g/L, K2HP04 a 1 g/L, NaCl a 3 g/L, de MgS04.7H20 a 0,2 g/L e CaC03 a 1,25 g/L. O pH é ajustado para 6,9 com hidróxido de sódio antes da introdução de carbonato de cálcio. Os erlenmeyers são agitados durante 44 h a 27 °C num agitador rotativo, à velocidade de 325 rpm. São adicionados 2,5 mL da cultura anterior com 44 h esterilmente a 30 mL de meio de produção num erlenmeyer de 300 mL. O meio de produção é constituído por farinha de soja a 25 g/L, amido a 7,5 g/L, glicose a 22,5 g/L, levedura forrageira a 3,5 g/L, sulfato de zinco a 0,5 g/L e carbonato de cálcio a 6 g/L. O pH é ajustado para 6,0 com ácido clorídrico antes da introdução de carbonato de cálcio. Os erlenmeyers são agitados, a 27 °C, num agitador rotativo à velocidade de 325 rpm. Ao fim de 16 h, é adicionado à cultura 1 mL de uma solução de um dos precursores listados na tabela 3 (geralmente 5 ou 10 g/L) . Esta é inactivada após 8 ou 24 h. O meio de fermentação é quantificado e adicionam-se 2 volumes de fase móvel constituída por acetonitrilo a 34% e uma solução de KH2po4 0,1 M a 66% (ajustado para pH 2,9 com H3P04 concentrado) permitindo a extracção das pristinamicinas. Após agitação, o conjunto é centrifugado e as pristinamicinas contidas no sobrenadante são extraídas e purificadas como descrito no 47 exemplo 4. Estas são igualmente doseadas por CLHP injectando 150 pL de sobrenadante de centrifugação numa coluna Nucleosil 5-C8 de 4,6 x 150 mm eluída com uma mistura de acetonitrilo a 40% e de tampão fosfato 0,1 M pH 2,9 a 60%. As novas pristinamicinas I são detectadas através da sua absorvência em UV a 206 nm e, eventualmente, através da sua emissão de fluorescência (filtro 370 nm, excitação a 306 nm).
TABELA III PRECURSOR ORIGEM Fenilalanina Janssen 4-Dimetilaminofenilalanina Exemplo 33 4-Metilaminofenilalanina Exemplo 34-1 4-Aminofenilalanina Janssen 22.794.96 4-Dietilaminofenilalanina Exemplo 33 4-Etilaminofenilalanina Exemplo 33 4-Metiltiofenilalanina Exemplo 33 4-Metilfenilalanina J.P. S101-312-4/Exemplo 33 4-Metoxifenilalanina Janssen 16.975.97 4-Trifluocometoxifenilalanina Exemplo 34-8 4-Metoxicarbonilfenilalanina Exemplo 33 4-Clorofenilalanina Janssen 15.728.14 4-Bromofenilalanina Janssen 22.779.81 4-Iodofenilalanina Bachem F 1675 4-Trifluorometilfenilalanina P. C. R. Inc. 12 445-3 4-terc-Butilfenilalanina Exemplo 35-1 4-Isopropilfenilalanina Exemplo 36-1 48 (continuação) PRECURSOR ORIGEM 3-Metilaminofenilalanina Exemplo 35-3 3-Metoxifenilalanina J. P. S. 101-313-2 3-Metiltiofenilalanina Exemplo 34-11 3-Fluoro 4-Metilfenilalanina Exemplo 34-5 Ácido-terc-Butilfenilpirúvico Exemplo 33 Ácido-Metilaminofenilpirúvico Exemplo 34-4 2-Naftilfenilalanina Bachem F 1865 4-Fluorofenilalanina Bachem F 1535 3-Fluorofenilalanina Bachem F 2135 3-Etoxifenilalanina Exemplo 37-1 2,4-Dimetilfenilalanina Exemplo 33 3,4-Dimetilfenilalanina Exemplo 33 3-Metilfenilalanina Exemplo 33 4-Fenilfenilalanina Exemplo 33 4-Butilfenilalanina Exemplo 36-3 2-Tienil-3-alanina Aldrich 28.728.8 3-Trifluorometilfenilalanina Exemplo 33 3-Hidroxifenilalanina Aldrich T 9.039.5 3-Etilaminofenilalanina Exemplo 35-6 4-Antinometilfenilalanina Exemplo 33 4 Alilaminofenilalanina Exemplo 38-2 4 Dialilaminofenilalanina Exemplo 38-1 4 Aliletilaminofenilalanina Exemplo 39-4 4 Etilpropilaminofenilalanina Exemplo 39-6 4-Etilisopropilaminofenilalanina Exemplo 39-1 4-Etilmetilciclopropilaminofenilalanina Examplo 39-8 4-(1-pirrolidinil)fenilalanina Exemplo 40-1 4-0-aliltirosina Exemplo 33 49 (continuação) PRECURSOR ORIGEM 4-O-Etiltirosina Exemplo 33 4-Etiltiofenilalanina Exemplo 33 4-Etiltiometilfenilalanina Exemplo 41-1 4-0-(2-Cloroetil)tirosina Exemplo 42-1 4-Acetilfenilalanina Exemplo 33 4-Etilfenilalanina Exemplo 33 3-Dimetilaminofenilalanina Exemplo 35-10 A tabela seguinte (TABELA IV) indica os tempos de retenção relativos de novas PI produzidas tomando como referência a PIA. Os tempos de retenção absolutos foram determinados a 25 °C no sistema CLHP descrito acima; estes variam ligeiramente, por um lado, entre injecções e, por outro, de acordo com a temperatura.
TABELA IV
Precursor tR (tempo de retenção relativo) das novas PI (Neo PI) Neo PA Neo PIH Outras neo PI 4-Metilaminofenilalanina 0, 85 4-Aminofenilalanina 0,64 4-Metiltiofenilalanina 1, 93 2, 73 1,63 4-Metilfenilalanina 1, 77 2,65 4-Metoxifenilalanina 1, 46 4-Metoxicarbonilfenilalanina 1, 49 50 (continuação)
Precursor tR (tempo de retenção relativo) das novas PI (Neo PI) 4-Clorofenilalanina 2, 04 4-Bromofenilalanina 2, 16 4-Iodofenilalanina 2, 42 4-Trifluorometilfenilalanina 2,56 3, 74 4-terc-Butilfenilalanina 3,34 4-Isopropilfenilalanina 2, 80 4,35 3-Metilaminofenilalanina 1, 15 3-Metoxifenilalanina 1, 49 2, 04 3-Fluoro-4-Metilfenilalanina 2, 93 Ácido 4-terc-Butilfenil-pirúvico 3,34 Ácido 4-Metilaminofenil-pirúvico 0, 85 4-Etilamino fenilalanina 0, 94 4-Dietilaminofenilalanina 0,61 4-Alilaminofenilalanina 1, 83 4-Dialilaminofenilalanina 2,64 4-Alil-etilaminofenilalanina 2,4 4-Etilpropilaminofenilalanina 1, 06 4-Etilisopropilaminofenilalanina 0, 89 4-Etilmetilciclopropilaminofenilalanina 1,1 4-(1-pirrolidinil)fenilalanina 2, 0 4-0-Trifluorometiltirosina 2, 42 4-0-aliltirosina 2,62 4-0-Etiltirosina 2,2 4-Etiltiofenilalanina 1, 96 4-Metiltiometilfenilalanina 1, 98 4-0-(2-Cloroetil)tirosina 2, 45 4-Acetil-fenilalanina 1,61 4-Etil-fenilalanina 1, 86 2, 40 3-Dimetilaminofenilalanina 1, 49 51 (continuação)
Precursor tR (tempo de retenção relativo) das novas PI (Neo PI) 3-Metiltiofenilalanina 1,93 3-O-Etiltirosina 00 Γ- ?—1 A nova PI com um tR de 4,35 para a 4-isopropilfenilalanina corresponde a uma neo PI descrita no exemplo 14. A nova Pl com tR de 1,63 para a 4-Metiltiof enilalanina corresponde a uma 5Y-hidroxi neo PIH descrita no exemplo 5.
Para além disso o mutante SP92::pVRC508 foi fermentado na presença de 4-dimetilamino fenilalanina. Nestas condições da complementação o mutante SP92::pVRC508 produz uma quantidade da pristinamicinas Ia equivalente à produzida pela estirpe SP92.
EXEMPLO 4: Preparação da pristinamicina IB [4ζ-metilamino-des (4ζ-dimetilamino)pristinamicina lA] e da 4ζ-8πιϊηο-άθ8 (4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4.1: Preparação da pristinamicina lB [^-metilamino-des (4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA]
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-metilaminofenilalanina (R, S) 10 g/L em água sintetizada como no exemplo 34-1. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 52 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a pristinamicina IB são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 6 mL de uma mistura de água a 65% e acetonitrilo a 35% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 65% e acetonitrilo a 35%. As fracções contendo pristinamicina IB são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 52 mg de pristinamicina IB.
Espectro de R. Μ. N. de (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0, 71 (dd, J= 16 < 2 6 Hz, 1H, 5 β2) , 0,92 (t, J= 7, ,5 Hz, 3H: ch3 : 2 Y) , de 1,10 i a 1, 40 (mt, 2H: 3 β2 e 3 γ2), 1,34 (d, J= 7, 5 Hz, 3H: CH3 1 Y) , de 1, 50 a 1, 85 (mt, 3H: 3 γι e CH2 2 β), 2, 03 (mt, 1H, 3 βι), 2 ,22 (mt, 1H, 5 δ2), 2,33 (d largo, J= 16 Hz, 1H: 5 δι) , 2, 40 (d, J= 16 Hz, 1H: 5 βχ) , 2,82 (mt, 1H: 5 ε2) , 2,81 (s, 3H: 4 nch3 em para do fenilo), 2, 90 (dd, J= 12 e 4 Hz, 1H: 4 β2), 3 ,29 (s , 3H : 4 NCH3) , de 3,20 a 3, 45 e 3,60 (2 mts, 1H cada um : CH: 2 3 δ), 3,40 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 βι), 4,57 (dd, J= 7 e 8 Hz, 1H, 3 a) , 4, 75 (dd largo, J= 13 e 7 Hz, 1H: 5 εχ) , 4,83 (mt, 1H : 2a), 4,89 (d largo , J= 10 Hz , 1H: la), 5,24 (dd, J=12 e 4 Hz, 1H: 4 a), 5,32 (d largo, J= 6 Hz, 1H: 5 a), 5,89 (d, J: = 9 Hz, 1H: 6 a), ) 5,90 (q largo, J= 7 ,5 Hz, 1H: 1β), 53 6,53 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 2), 6,53 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε), 7,03 (d, J= 8 Hz, 2H: 45), de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,46 (mt, 2H: 1' H5 e 1' H4), 7,85 (dd, J = 5,5 e 2 Hz, 1H: 1' H6), 8,44 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,76 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 6), 11,63 (s, 1H: OH).
4.2: Preparação da 4ζ-3ΐηίηο-άθ3 (4ζ-άίιηθϋΐ3ΐηίηο) pristinamicina IA
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-aminofenilalanina (S) 5 g/L em água. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de silica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O residuo seco é retomado com 6 mL de uma mistura de água a 65% e acetonitrilo a 35% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 65% e acetonitrilo a 35%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é 54 evaporada. Obtêm-se 5 mg de 4ζ-amino-des(4ζ-dimetilamino) pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. de XH (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0,72 (dd, J= 16 e 5,5 Hz, 1H, 5 β2), 0,90 (t, J= 7,5 Hz, 3h: CH3 2 γ), de 1,10 a 1,40 (mt, 2H: 3 β2 e 3 γ2), 1,33 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ) , de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 γι e CH2 2 β) , 2,02 (mt, 1H, 3 βΐ), 2,19 (mt, 1H, 5 δ2), 2,33 (d largo, J= 16 Hz, 1H: 5 δ3), 2,42 (d, J=16 Hz, 1H: 5 βι), 2,81 (dt, J= 13 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 2,90 (dd, J= 12 e 4 Hz, 1H: 4 β2), 3,24 (s, 3H: NCH3 4), de 3,20 a 3,40 e 3,54 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 δ), 3,30 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 βι), 3,72 (mf, 2H: ArNH2), 4,54 (dd, J= 7,5 e 7 Hz, 1H, 3 a), 4,73 (dd largo, J= 13 e 8 Hz, 1H: 5 ει), 4,82 (mt, 1H: 2a), 4,89 (d largo, J= 10 Hz, 1H: la), 5,22 (dd, J= 12 e 4 Hz, 1H: 4 a), 5,32 (d largo, J= 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5,89 (mt, 2H: 6 a e 1β), 6,51 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), 6,61 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε), 6,98 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), de 7,15 à 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,45 (dd, J= 8,5 e 1,5 Hz, 1H: 1' H4), 7,48 (dd, J= 8,5 e 4 Hz, 1H: 1' Hs), 7,82 (dd, J = 4 e 1,5 Hz, 1H: 1' H6), 8,43 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,76 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,63 (s, 1H: OH).
EXEMPLO 5: Preparação da 4ζ-metiltio-des(4ζ-dimetilamino) pristinamicina IA, da 4ζ-metiltio-des(4ζ-dimetilamino) pristinamicina lH e da Syhidroxi 4ζ-metiltio-des(4ζ-dimetilamino) pristinamicina IH
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-metiltiofenilalanina (R, S) a 10 g/L em hidróxido de sódio 55 0,1 N sintetizada como no exemplo 33. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. Obtêm-se 65 mg de resíduo seco. Este é retomado com 6 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado em 2 vezes numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 55% e acetonitrilo a 45%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 45 mg de 4ζ-metiltio-des (4ζ-άίη^ίΐ3ΐηίηο)ρ^3^η3ΐηίοίη3 IA.
Espectro de R. Μ. N. de (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0,68 (dd, J= 16 e 5,5 Hz, 1H, 5 β2), 0,93 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1,13 (mt, 1H: 3 β2), de 1,25 a 1,40 (mt, 1H: 3 γ2), 1,33 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ), de 1,55 a 1,85 (mt, 3H: 3 y2 e CH2 2 β), 2,02 (mt, 1H, 3 βι), 2,18 (mt, 1H, 5 δ2), 2,38 (d largo, J= 16,5 Hz, 1H: 5 δχ) , 2,46 (s, 3H: SCH3) , 2,48 (d, J=16 Hz, 1H, 5 βι), 2,85 (dt, J= 13,5 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 3,00 (dd, J= 12 e 5 Hz, 1H: 4 β2), 3,23 (s, 3H: NCH3 4 ), 3,37 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 βι, 3,37 e 3,58 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 δ), 4,55 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4,77 (dd largo, J= 13,5 e 8 Hz, 56 1Η: 5 ει), 4,86 (mt, 1H: 2α), 4,89 (dd, J= 10 e 1,5 Hz, 1H: la), 5,30 (d largo, J= 5,5 Hz, IH: 5 Oí) , 5,32 (dd, J= 12 e 5 Hz, IH: 4 a), 5, 90 (d, J= 9,5 Hz, IH: 6 a), 5, 92 (dq, J= 7,5 e 1,5 Hz, IH:1β), 6,55 (d, J= 9,5 Hz, IH: NH 2), 7,13 (d, J= 8 Hz, 2H: 45), de 7,15 à 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,19 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε), 7,45 (mt, 2H: 1' h4 e 1' h5), 7,76 (t, J = 5 Hz, 1H: 1' H6), 8,42 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,76 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,65 (s, 1H: OH). São isoladas 10 mg de 4 ζ-metiltio-des (4ζ-άϊπιβ^ΐ3πιϊηο) pristinamicina Ih a partir das fracções provenientes da coluna de silica descrita acima, contendo o novo derivado da pristinamicina IH, realizando a cromatografia em coluna semi-preparativa como descrito acima, mas levando a proporção de acetonitrilo da fase eluente a 50%.
Espectro de R. M. N. de 1H (4 00 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0,32 (mt, IH, 5 β2), 0, 93 (t , o = 7,5 Hz, 3H: CH3 2 y) , de 1,20 a 1,35 (mt, 2H : 3 β2 e 3 γ2) , 1,30(d, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ), de 1,35 à 2,05 (mt, 9H: : 3 Yi - 3 βχ - CH 2 2 β - CH2 5 ô - ch2 5γ e 5 βχ), 2, 44 (dt, , J= 13 ,5 e 1,5 Hz, IH: 5 ε2), 2,49 (s, 3H: SCH3), 2,99 (dd, J= 12 e 5 Hz , IH: 4 β2), 3,09 (dd, J= 12 , 5 e 12 Hz , IH: 4 βχ), 3, 54 e 3 ,64 (2 mt s, IH cada um: CH2 3 δ), 4,17 (dd, J= 7 e 6 Hz, IH: 3 a) , 4, 49 (d largo, J= 13,5 Hz: IH: 5 El) , de 4, r 70 a 4,80 (mt, 3H: 2a - 5 α e 4 a), 4,84 (dd, J=10 e 1,5 Hz, IH: la), 5,. 51 (d, J= 7 Hz, IH : 6 a), 5, 75 ! (mt, IH: ΐβ), 6,65 (d, J= 9,5 Hz, IH : NH 2) / 7,10 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), 7,22 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε ), de 7,20 1 a 7, 40 (mt, 7H: H Aromáticos 6 - 1' H4 e 1' Hs), 7 ,87 (d , J= = 4 Hz, IH: : 1 ' H6), 8,55 (mf, IH: NH 6), 8,55 (d, J= 10 Hz , IH: NH D, 11, 70 (s , IH: OH). 57 São isoladas 3 mg de 5Y-hidroxil 4ζ-metiltio-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina I H, a partir das fracções provenientes da coluna de sílica descrita acima, contendo o novo derivado da pristinamicina I, realizando a cromatografia em coluna semi-preparativa como descrito acima mantendo a proporção de acetonitrilo da fase eluente a 45%.
Espectro de R. Μ. N. de (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS): observa-se um isómero significativamente maioritário: -OH em i 5 γ em posição axial. 0,37 (d mt, J= 16 Hz, 1H, 5 β 2), 0 ,93 (t r J= 7,5 Hz, 3H: CH3 2 Y) , de 1,20 a 1, , 45 (mt, 2H: 3 β 2 e 3 Y2) , 1,31 (d, J= 7,5 Hz, 3H: ch3 1 Y), de 1, 4C 1 a 1,85 (mt, 5H: 3 Yi - CH2 2 β e CH2 5 δ), 1,98 (mt, 1H, 3 βχ) , 2 ,17 (d, J = 16 Hz, 1H: 5 βι) , 2,50 (s , 3H: SCH3) , 2, r 77 (dt, J= 13,5 e 2 Hz, 1H: 5 ε2) , 2,99 (dd, J= 12 e 4 Hz, 1H: 4 β2), 3, 11 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 βι) , de 3 , 45 a 3 ,70 (mt ., 2H: CH2 3 δ) , 3 ,73 (mt, 1H: 5 γ em po sição equatorial) , 4,13 (t, J= 7 Hz, 1H, 3 a) , 4,37 (d largo, J= : 13,5 Hz, 1H: 5 ε i), de 4,75 a 4 ,95 (mt, 3H: 2a - 4 a e 5 a), 4, 89 (dd, J= 10 e 1 Hz, 1H: la), 5,70 (d, J= 8 Hz, 1H: 6 a), 5, 80 (dq, J = 7,5 e 1 Hz, 1H: 1β), 6,37 (d, J= 5 Hz, 1H: NH 4), 6, 71 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 2), 7, 10 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), 7,22 (d, J= : 8 Hz, 2H : 4 ε), de 7,20 a 7 ,40 (mt, 5H: E [ Aromáticos 6), 7 ,43 (dd, J= 8,5 e 1,5 1 Hz, 1H: 1' H4) , 7,47 (dd, J= 8,5 e 4 Hz, 1H: 1' H5) . 7,89 (dd, J = 4 e 1,5 Hz, 1H: l'H6), 8, 55 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 1), 9,15 (d, J= 8 Hz, 1H: NH 6), 11,70 (s, 1H: OH). 58 EXEMPLO 6: Preparação da 4ζ-πΐθΐ;ΐ1-άθ3 ^-dimetilamino) pristinamicina IA e da 4ζ-metil-des (4ζ-dimetilaπιino) pristinamicina IH.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-metilfenilalanina (R, S), a 5 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N.
No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. Obtêm-se 49 mg de resíduo seco. Este é retomado com 6 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado em 2 vezes numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 55% e acetonitrilo a 45%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 44 mg de 4ζ-metil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA.
Espectro de R. M. N. de XH ( 40C i MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0,52 (dd, J= 16 e 6 Hz, 1H, 5 β2), 0,93 (t, J= = 7, 5 Hz, . 3H: CH3 2 Y), 1 ,15 (mt, 1H: 3 β2), del .20 a 1,40 (mt, 1H : 3 Y2) , 1,35 59 (d, J= 7,5 Hz, 3H: ch3 1 Y) , de 1,50 a 1,85 (mt, 3Η: 3 Yi e ch2 2 β), 2,04 (mt, 1H, 3 βι), , 2, 18 (mt, 1H, 5 δ2), de 2,25 a
2, 45 (mt, 2H: 5 δι e 5 βι), 2,36 (s, 3H: ArCH3) , 2, 83 (dt, J = 13 e 4 H z, 1H: 5 £2) , 2,99 (dd, J= 13 e 4 Hz, 1H: 4 p2) r 3, 28 (s, 3H : NCH34) i, 3, 31 e 3,59 (2 mts, 1H cada um: : CH2 3 δ), 3, 40 (t, J= 13 Hz, 1H: 4 βι ), 4, r 59 (t, . J= 7,5 H z, 1H, 3 a), 4, 74 (dd largo , J= 13 e 7 Hz , 1H: 5 £i), 4, 85 (mt, 1H: 2a), L l, 89 (d largo, J= 10 Hz, 1H: la), de 5, 25 a 5,35 (mt, 2H: 5 a e 4 a), de 5, 85 a 5, 95 (mt, 2H: 6 a e 1β), 6, 52 (d, J= = 9,5 Hz, 1H: NH 1 2), r 7, 14 (AB limite, J= 9 Hz, 4H: 4δ e 4ε), de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,50 (mt, 2H: l'H4 e l'H5), 7,81 (dd, J = 4 e 2Hz, 1H: l'H6), 8,41 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,74 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 6), 11,63 (s, 1H: OH). São isoladas 21 mg de 4ζ-πιβ^1-άβ3 (4-dimetilamino) pristinamicina IH (espectrometria de massa: M + H+ = 810), a partir das fracções provenientes da coluna de silica, descrita acima, contendo o novo derivado da pristinamicina lH, realizando a cromatografia em coluna semi-preparativa como descrito acima. EXEMPLO 7: Preparação da 4 ζ-metoxi-des ^-dimetilamino) pristinamicina IA.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 12 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-metoxifenilalanina (R, S) a 5 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N. No final de 40 h de cultura, são extraídos 0,35 litros de meio de fermentação provenientes dos 12 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 60 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. Obtêm-se 14 mg de resíduo seco. Este é retomado com 3 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 60% e acetonitrilo a 40%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 12 mg de 4ζ-metoxi-des ^-dimetilamino)pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. de 1h (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : o, 63 (dd, J= 16 e 5, ,5 Hz, 1H, 5 β2), 0, 96 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 ; 2 Y),l,l 7 (mt, 1H: 3 β2), de 1,30 a 1, 45 (mt, 1H: 3 Y2) · 1,38 (d, J= = 7,5 Hz, 3H: CH3 1 Y) , de 1,55 a 1,85 (mt, 3H: 3 Yi e CH2 2 β) I 2,05 (mt, 1H, 3 βι), 2,20 (mt, 1H, 5 δ2) . 2,40 (d largo, , J L6 Hz, 1H: 5 δι) , 2,47 (d, J= 16 Hz, 1H: 5 βι), 2,88 (dt, J= 13 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 2 ,99 (dd, J= 12, , 5 e 5 Hz, 1H: 4 β2), 3, 30 (s, 3H: NCH3 4) , 3,32 e 3,60 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 δ), 3, 40 (t, J= 12,5 Hz, 1H: 4 βι) , 3,80 (s, 3H: OCH3), 4,60 (t, J = 7 ',5 Hz, 1H, 3 a), 4,80 (dd largo, J= 13 e 8 ,5 Hz, 1H: 5 Si) . 4, 88 (mt, 1H: 2a), 4 :, 92 (d largo, J= 10 Hz , 1H: la), 5,31 (dd, J= 12, , 5 e 5 Hz, 1H: 4 a), 5,34 (d largo, J= 5 ,5 Hz, 1H: 5 a), 5, 90 (d, J = 9 Hz, 1H: : 6 a), 5,93 (q largo , J= 7,5 Hz , 1H: 1β), 6,54 (d, J= 9 Hz, 1H : NH 2 )r 6,87 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε), 7,16 (d, J= = 8 H 2 :, 2H: 4δ), de 7,15 a 7,40 (mt, 5H: H Aromát icos 61 6), 7,50 (mt, 2H: 1' Hs e 1' H4), 7,80 (dd, J = 4 e 2,5 Hz, 1H: 1' H6), 8 ,43 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1) , CO CO (d, J= 9 Hz, 1H: NH 6), 11,65 (s, 1H: OH) . EXEMPLO 8: Preparação da 4ζ-π^οχϊσΕΓΐ3οηϊ1-άθ3 (4ζ-dimetilamino)pristinamicina lA.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-metoxicarbonilfenilalanina (R, S) a 10 g/L, sintetizada como no exemplo 33. No final de 24 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. Obtêm-se 14 mg de resíduo seco. Este é retomado com 3 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 55% e acetonitrilo a 45%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, 62 depois é evaporada. Obtêm-se 9 mg de 4ζ-metoxicarbonil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. de (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : ο, 70 (dd, J=16 e 6 Hz , 1H, 5 β2), 0,93 (t, J= 7 ,5 Hz, 3H: ch3 2 Y) , : L, 08 (mt, 1H: 3 β2), de 1,30 a 1,40 (mt, 1H: 3 Y2) , 1,33 (d, j= = 7,5 Hz, 3H: CH3 1 Y), de ι 1,55 a 1,85 (mt, 3H: 3 Yi e CH2 2 β) r 2,02 (mt, 1H, 3 βι), 2, 13 ι (mt, 1H, 5 δ2) , 2,40 (d largo, , J = 16,5 Hz, 1H: 5 δι! ), 2,48 (d, J=16 Hz, 1H, 5 βι), 2,89 (dt, ι J= 14, 5 e 4,5 Hz, 1H: 5 ε2), 3, ,10 (dd, J= 13,5 e 6 Hz, 1H: 4 β2 ), 3, ,24 (s ,3H: NCH3 4), 3,38 e 3,61 (2 mts, 1H cada um: : CH2 3 δ) / 3, 47 (t, J= 13,5 Hz, : 1H: 4 βι) , 3, 96 (s, 3H: COOCH3) . 4,55 (t, J = 7,5 Hz, 1H, 3a), 4 ,78 (dd largo, J= 14 , 5 e 8 Hz, 1H: 5 ει ), 4, ,86 (mt, , 1H: 2a), 4, 89 (d largo, J= 10 Hz , 1H: la), 5,33 (d largo, J= 6 Hz, 1H: 5 a), 5,42 (dd, J= 13,5 e 6 Hz, 1H: 4 a), 5,92 (d (J= 9,5 Hz) e mt, 1H cada um: respectivamente 6 α e 1β), 6,52 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 2), de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,28 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), 7,43 (dd, J= 9 e 1,5 Hz, 1H: 1' H4), 7,47 (dd, J= 9 e 5 Hz, 1H: 1' H5), 7,66 (d, J = 5 e 1,5 Hz, 1H: 1' H6), 7,98 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε), 8,38 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,76 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,70 (s, 1H: OH). EXEMPLO 9: Preparação da Λζ-οΙοΓο-άθβ ^-dimetilamino) pristinamicina IA.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-clorofenilalanina (R, S) a 10 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio 63 de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. 0 sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. 0 extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina lA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 3 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 60% e acetonitrilo a 40%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtém-se 1 mg de 4ζ-cloro-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina lA.
Espectro de R. M . N. de 'h ( 400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : : 0,93 (t, J '= 7,5 Hz, 3Η : CH3 2 Υ) , . 0, 95 (dd, J= 16 e 5 Hz, 1H, 5 β2), 1,09 (mt , 1H : 3 β2) , de 1, 20 a 1, ,40 (mt, 1H: 3 y2) ,1,35 (d, J= = 7,5 Hz, : 3 Η: : CH3 1 Υ), de 1,50 a 1, 85 (mt, 3H: 3 Yi e CH2 2 β), 2, 02 (mt, 1Η, 3 β! .), 2, 17 (mt, 1H, 5 δ2) , 2,43 (d largo, J= 16 Hz, 1H: 5 õii ), 2,59 (d, J=16 Hz , 1H , 5 βι), 2,90 (dt, J= 13,5 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 3,04 (dd, J= 13 e ' 6 Hz, 1H: 4 β2) , 3,21 (s, : 3H: 4 nch3) ', 3,36 (t, J=13 Hz, 1H: 4 βι ), 3, 39 e 3,59 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 δ), 4,53 ! (t , J= 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4, 76 (dd largo, J= 13 , 5 e 8 Hz, 1Η: 5 £i) , 4, 86 (mt, 1H: 2 a), Γ ΟΟ (d largo, J= 10 Hz, 1H Ια), 5,38 (mt, 2H: : 5 α e 4 a), 5,93 (mt, 2H: 6 α e 1β), 6,52 (d, J = 10 : Hz, 1H: NH 2), 7,12 (d, 64 J = 8 Hz, 2H: 4δ), de 7,15 a 7,35 (mt, 7H: H Aromáticos 6 e 4ε), 7,38 (dd, J= 9 e 4,5 Hz, 1H:1' H5) , 7,43 (d largo, J= 9 Hz, 1H:1' H4), 7,68 (dd, J = 4,5 e 1 Hz, 1H: 1' H6), 8,36 (d, J=10 Hz, 1H: NH 1), 8,75 (d, J= 9 Hz,1H: NH 6), 11,65 (s, 1H: OH). EXEMPLO 10: Preparação da 4ζ-]3Γθΐηο-άθ3^-dimetilamino) pristinamicina IA e da 4ζ-1>ι:οπιο-άθ3(4ζ-dimetilamino) pristinamicina IH.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-bromofenilalanina (R, S) a 10 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 6 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado em 2 vezes numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 60% e acetonitrilo a 40%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre 65 sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 6 mg de 4ζ-όΓοηιο-des (4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N . de 1 H (400 MHz, CDC13, δ em ppm / ref. TMS) : 0,93 (t, J= 7, 5 Hz , 3H: ch3 2 Y), 0, 95 (dd, J= 16 e 5 Hz, 1H, 5 β2), 1,10 (mt, 1H: 3 β2), 1,35 (d, J= = 7 , 5 Hz , 3H: ch3 1 Y) , 1,36 (mt, 1H: 3 γ2), . de 1,50 a 1, 85 (mt, 3H: 3 Yi e ch2 2 β), 2, 02 (mt, 1H , 3 β, 2,18 (mt, 1H, 5 δ2 ), 2 ,43 (d largo, J= 16 Hz, 1H: 5 δι), 2,59 (d, J '=16 Hz, 1H, 5 βι), 2,90 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H : 5 ε2) , 3 ,02 (dd, J= = 13 e 5,5 Hz, 1H: 4 β2) , 3, 21 (s, 3H: 4 NCH3), 3 ,33 (dd, J = 13 - 11 Hz, 1H: 4 βι), 3,39 e 3 ,59 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 δ) , 4,53 (t, J= 7,5 Hz, , 1H, 3 a) , 4, 76 (dd largo , J= 13 e 7 Hz, 1H: 5 ει), 4,86 (mt, 1H: 2a), 4,89 (d largo, J= 10 Hz, 1H: la), 5,37 (d largo, J= 5 Hz f 1H: í > a), 5,39 (dd, J= 11 e 5 ,5 Hz, 1H: 4 a), 5,' 92 (mt, 2H: 6 a e 1β), 6,! 56 (d, J= 9, 5 Hz, 1H: NH 2) , 7,08 (d, J = 8 Hz, 2H: 4δ), de 7 ,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7, 40 (mt, 4H: 1' h4 - 1' H5 e 4ε) f 7, 70 (d largo, J = 5 Hz, 1H: 1' h6 ), 8 ,40 (d, J= = ίο : Hz, 1H: NH D, CO (d, J: = 9 Hz, 1H : NH 6), 11 ,68 (s, 1H: OH ). São isoladas 3 mg de 4ζ-bromo-des(4ζ-dimetilamino) pristinamicina lH (espectrometria de massa: M + H+ = 874), a partir das fracções provenientes da coluna de silica descrita acima, contendo o novo derivado da pristinamicina IH, realizando a cromatografia em coluna semi-preparativa como descrito acima. 66 EXEMPLO 11: Preparação da 4ζ-ϊοάο-άθ3^-dimetilamino) pristinamicina IA e da 4ζ-ϊοάο-άθ3 ^-dimetilamino) pristinamicina lH.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-iodofenilalanina (R, S) a 10 g/L em hidróxido de sódio. No
final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 6 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado em 2 vezes numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 60% e acetonitrilo a 40%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 12 mg de 4ζ-iodo-des(4ζ- dimetilamino)pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. de ΧΗ (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS): 0,93 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 2 γ) , 0,95 (dd, J= 16 e 5,5 Hz, 1H, 5 β2), 1,10 (mt, 1H: 3 β2), 1,35 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ) , 67 1,38 (mt, 1H: 3 γ2), de 1,55 a 1,85 (mt, 3H: 3 γι e CH2 2 β), 02 (mt, IH, 3 βι), 2, 17 (mt, IH, 5 δ2) , 2 ,43 (d largo, 16 ,5 Hz, IH: 5 δι), 2, 60 (d, J=16 Hz, IH, 5 βι), 2, 89 (dt, 14 e 4,5 Hz, IH: 5 £2), 3,02 (dd, J= 13 e \ 5,5 Hz, IH : 4 β2), 21 (s, 3H : NCH 3 4), 3,31 (dd, J= 13 e 11 Hz, IH : 4 βι), 3,39 e 3,59 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 δ), 4,53 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4,75 (dd largo, J= 14 e 8 Hz, 1H: 5 ει), 4,83 (mt, 1H: 2a), 4,88 (d largo, J= 10 Hz, IH: la) , 5 ,37 (d largo, J= 5, 5 Hz, IH: 5 a), 5, 39 (dd, J= = 11 e 5,5 Hz, IH: 4 a), 5 ,92 (mt, 2H: 6 α e 1β), 6, 54 (d, J= 9,5 Hz, IH: NH 2), 6, 94 (d, J = 7,5 Hz, 2H: 4δ) , de 7, 15 a 7, . 50 (mt , 5H: H Aromáticos 6 ), 7,36 (dd, , J = 9 e 4 Hz, IH : 1' h5), 7, 43 (d largo, J= 9 Hz, IH: 1' H4), 7,62 (d, J= 7, 5 Hz , 2H: 4ε) , 7, 68 (d, J = 4 Hz , IH : 1' H6), 8,38 (d, J= 10 Hz, IH : NH 1) , 8, 76 (d, J= 9 Hz, IH: NH 6) , H,60 (s, IH: OH) . São isoladas 6 mg de 4ζ-ίοάο-άθ3 (4ζ-άίιι^ίΐ3ΐηίηο) pristinamicina lH (espectrometria de massa: M + H+ = 922), a partir das fracções provenientes da coluna de sílica descrita acima, contendo o novo derivado da pristinamicina IH, realizando a cromatografia em coluna semi-preparativa como descrito acima. EXEMPLO 12: Preparação da 4ζ-^ϊ£1ιιθΓθπΐθΐ;ϊ1-άθ3 (4ζ— dimetilamino) pristinamicina IA e da 4ζ-^ϊί1ιιθΓθπΐθ^1-(1θ3 (4ζ— dimetilamino) pristinamicina IH.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-trifluorometilfenilalanina (S) a 5 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros 68 de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de silica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina lA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 3 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 55% e acetonitrilo a 45%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 5 mg de 4ζ-trifluorometil-des(4ζ— dimetilamino) pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. de :H (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS): 0,86 (dd, J=16 e 5,5 Hz, 1H, 5 β2), 0,91 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1,13 (mt, 1H: 3 β2), 1,31 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ) , 1,42 (mt, 1H: 3 γ2), de 1,55 a 1,80 (mt, 3H: 3 γ3 e CH2 2 β), 2,02 (mt, 1H, 3 βι), 2,15 (mt, 1H, 5 δ2), 2,40 (d largo, J= 16,5 Hz, 1H: 5 δ3) . 2,55 (d, J=16 Hz, 1H, 5 βι), 2,88 (dt, J= 14 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 3,18 (s, 3H: NCH3 4), 3,20 e 3,31 (2 dd, respectivamente J=13 e 6 Hz e J= 13 e 10 Hz, 1H cada um: 4 β2 e 4 βι), 3,42 e 3,60 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 δ), 4,50 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4,73 (dd largo, J=14 e 7,5 Hz, 1H: 5 Si), 4,83 (mt, 1H: 2a), 4,91 (d largo, J= 10 Hz, 1H: la), 5,40 (d largo, J= 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5,55 (dd, J= 10 e 6 Hz, 1H: 4 a), 69 5,87 (d, J= 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,90 (q largo, J= 7,5 Hz, 1H:1β),
6,68 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), de 7,15 a 7,40 (mt, 9 H: 4 δ - H
Aromáticos 6 - 1' H5 e 1' H4), 7,52 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε), 7,68 (d, J = 4 e 1,5 Hz, 1H: 1' H6), 8,43 (d, J=10 Hz, 1H: NH 1), 8,76 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,70 (s, 1H: OH). São isoladas 4 mg de ζ-trifluorometil-des (4ζ-όίηιβΡίΐ3ΐηίηο) pristinamicina IH (espectrometria de massa: M + H+ = 864), a partir das fracções provenientes da coluna de sílica descrita acima, contendo o novo derivado da pristinamicina iH, realizando a cromatografia em coluna semi-preparativa como descrito acima. EXEMPLO 13: Preparação da 4ζ-ίθΓθ-1>ιΛϊ1-άθ3(4ζ- dimetilamino)-pristinamicina lA.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-terc-butilfenilalanina (R, S) a 5 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N, sintetizada como no exemplo 35-1. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de
diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O 70 resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado em 2 vezes numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 55% e acetonitrilo a 45%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 30 mg de 4ζ-£θΓθ-ό^11-άβ3 (4ζ — dimetilamino)pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. de 1h (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS, ref. TMS) : 0,21 (dd, J =16 e 5,5 Hz, 1H, 5 β2), 0,91 (t, J= 7 , 5 Hz , 3H: CH 3 2 y) , 1,17 (mt, 1H: 3 β2), del, 20 a 1,40 (mt, 1H: 3 y2), , 1,33 ( s, 9H: CH3 de terc -butilo), 1,35 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 1 Y), de 1,50 a 1, 85 (mt, 3H: 3 yi e CH2 2 β), 2,04 (mt, 1H, 3 βι) , 2,13 (mt, 1H, 5 δ2 ), 2,30 (mt, 2H: 5 δχ e 5 βι), 2,80 (dt, J= 13 e 4 Hz , 1H : 5 ε2), 3,00 (dd, j= 12 e 4 Hz, 1H: 4 β2), 3,29 (s, 3H: NCH3 4), 3, 31 e 3,59 (2 mt s, 1H cada um: CH2 3 δ), 3,40 (t, J=12 Hz, 1H: 4 βι), 4,57 i (t, J= 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4, 74 (dd largo ·, J= 13 e 7 Hz, , 1H: 5 εχ) , 4,85 (mt , 1H: : 2a) , 4,90 (d largo, J= =10 Hz, 1H: la) , 5, 21 (d largo, J= 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5,25 (dd, J= 12 e 4 Hz, • 1H: 4 a), 5,87(d, J= 9 Hz, 1H: 6 a), 5,92 (q largo, J= 7,5 Hz, , 1H: 1 1H: l'H6), 8,45 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1 ), 8, 74 (d, J= = 9 Hz, 1H: NH 6), 11,65 (s, 1H: OH). EXEMPLO 14: Preparação da 4ζ-ϊ3ορΓορϊ1-άθ3 ^-dimetilamino) pristinamicina IA. e da 4ζ-ϊ3ορΓορϊ1-άθ3 ^-dimetilamino) pristinamicina lE.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 71 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-isopropilfenilalanina (R, S) a 10 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N, sintetizada como no exemplo 36-1. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina lA são reunidas e evaporadas. Obtêm-se 61 mg de resíduo seco. Este é retomado com 9 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado em 3 vezes numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 55% e acetonitrilo a 45%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 51 mg de ίζ-ίθορ^ρϋ-όθΞ (4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. de ΧΗ (250 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS, ref. TMS) : 0,31 (dd, J=16 e 5,5 Hz, 1H, 5 β2), 0,91 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 2 y), de 1,00 a 1,45 (mt, 2H: 3 β2 e 3 y2), 1,25 (d, J= 7,5 Hz, 6H: CH3 do isopropilo), 1,35 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 γ3 e CH2 2 β), de 1,95 a 2,20 (mt, 2H, 3 βι e 5 δ2), 2,30 (mt, 2H: 5 δι e 5 βι), 2,80 (dt, J= 13 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 2,88 (mt, 1H: CH do isopropilo), 2,98 (dd, J=12 e 4 Hz, 1H: 4 β2), 3,30 (s, 3H: NCH3 4), 3,32 e 3,55 (2 72 mts, 1H cada um : CH2 3 5), 3,38 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 βι), 4,55 (t, c-l II 5 Hz, 1H, 3 a), 4, 72 (dd largo, J= 13 e 7 Hz, 1H: 5 ει), 4, 85 (mt, 1H: 2a), 4, 88 (d largo, J= = 10 Hz, 1H : la), 5,21 (d largo, J= 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5,25 (dd, J= 12 e 4 Hz, 1H: 4 a), 5,87(d, J= 9 Hz, 1H: 6 a), 5,90 (q largo, J= 7,5 Hz, 1H: 1β), 6,50 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), de 7,05 a 7,35 (mt, 9H: H Aromáticos 6 - 4ε e 45), 7, 50 (mt, 2H: 1' H5 e 1' H4), 7,86 (dd, J = 4 e 1,5 Hz, 1H: 1' H6) . 8,40 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,72 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 6), 11,60 (s, 1H: OH). São isoladas 5 mg de ζ-isopropil-des(4ζ-dimetilamino) pristinamicina IE a partir das mesmas fracções provenientes da coluna de sílica descrita acima, contendo igualmente o novo derivado da pristinamicina iE, realizando a cromatografia em coluna semi-preparativa como descrito acima.
Espectro de R. Μ. N. de ΧΗ (400 MHz, CDC1; 3, 5 em ppm, ref. TMS) : 0, 20 (mt, 1H, 5 β2), 0,92 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 2 γ) , de 1,15 a 1 ,40 (mt, 2H: 3 β2 e 3 y2) , 1,. 24 (d, J= 7 ,5 Hz, 6H: CH3 do isopropilo), . 1,34 (d, J= 7,5 Hz, 3H: ch3 1 Y) , de 1, 35 a 2, 05 (mt, 9H: 3 Yi - 3 βι - ch2 : 2 β - ch2 5 5- ch2 5γ e 5 βι), 2, 45 (dt, J= 13 e l,í i Hz, 1H: 5 ε2), 2,89 (mt, 1H: ArCH), 3,09 (dd, J= 14 e 7 Hz, 1H: 4 β2), 3,17 (s , 3H : NCH3 4), 3,25 (dd, J= 14 e 9 Hz , 1H : 4 βι), 3,32 e 3, 52 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 5), 4,55 (mt, 2H: 3 a e 5 Sl) , 4, 80 (mt, 1H: 2a), 4,89 (dd, J=10 e 1,5 Hz, 1H: la), 4, 90 (mt, 1H: 5 a), 5,: 35 (dd, J= = 9 e 7 Hz, 1H: 4 : a), 5, 60 (d, J= 8 Hz , 1H : 6 a) , 5,89 (dq, J= 7 , 5 e 1,5 Hz , 1H: Ιβ), 6,65 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 2), 7 ',08 (d, J = 8 Hz, 2H: 45), 7,14 (d, J= 8 Hz , 2H: 4ε) , de 7,20 a 7, 40 (mt, 7H: H Aromáticos 6 - 1' H4 e 1' HS) , 7,77 (d largo, J=4 Hz, 1H: 1' H6), 8,46 (d, J= 10 Hz, , 1H: NH D, 8,48 (d, J= = 8 Hz, 1H : NH 6),11,- 70 (s, 1H: OH) . 73 EXEMPLO 15: Preparação da 4s-metilamino-des(4 ζ— dimetilamino)pristinamicina IA.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 3-metilaminofenilalanina (R, S) a 10 g/L em água, sintetizada como no exemplo 35-3. No final de 40 h de cultura, são extraídos 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. Obtêm-se 19 mg de resíduo seco. Este é retomado com 3 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 55% e acetonitrilo a 45%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 8 mg de 4s-metilamino-des(4s-dimetilamino)pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. 1h (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0,93 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1,00 (dd, J= 16 e 6 Hz, 1H, 5 β2), 1,17 (mt, 1H: 3 β2), de 1,25 a 1,40 (mt, 2H: 3 γ2), 74 1, 35 ( d, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ), de 1,55 a 1,80 (mt, 3H: 3 Yi e CH 2 2 β) , 2,03 (mt, 1H, 3 βι), 2,23 (mt, 1H, 5 δ2) , 2,39 ) (d largo, J '= 16 Hz, 1H: 5 δι), 2,52 (d, J= 16 Hz, 1H: 5 βι), 2,78 (s , 3H: ArNCH3 4), 2 ,85 (dt, J= 13 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 2,99 (dd, J= 13 e 4,5 Hz, 1H : 4 β2), 3,23 (s, 3H: NCH3 4), 3,25 (t, J= 13 HZ , 1H: 4 βι), 3,38 e 3,58 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 δ), 4,05 (mf, 1H: ArNH) , 4,58 (dd, J= 6,5 e 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4,76 (dd largo, J=13 e 8 Hz, 1H: 5 Ei), 4,85 (mt, 1H: 2a) , 4, 87 (d largo, J= 10 Hz, 1H: la) , 5,35 (dd, J= 13 e 4,5 Hz, 1H: 4 a), 5,38 (d largo, J= 6 Hz, 1H: 5a), 5,90 (d, J=9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,91 (mt, 1H: 1β), 6,36 (s largo, 1H: H 2 de 1' aromático em 4), de 6,45 a 6, 55 (mt, 2H: H 4 e H 6 de 1 ' aromático em 4) , 6 ,53 (d, J= 10 Hz , 1H: NH 2) , 7, 12 (t, J= 8 Hz, 1H: H 5 de 1' aromático em 4), de 7,15 a 7, 45 (mt, 5H : H Aromáticos 6) , 7 ,35 (mt , 2H: ] L' H4 e 1' Hs), 7, 75 (t, J = 3 Hz, 1H: l'H6), 8, 40 (d, J= 10 Hz, 1H : NH 1) , 8,78 (d, J= = 9,5 Hz , 1H: NH 6), 11, 60 (s, 1H: OH). EXEMPLO 16: Preparação da 4£-metoxi-dcs ^-dimetilamino) pristinamicina I A e da 4s-metoxi-des (4ζ-(1ϊπΐθ^ΐ3ΐηϊηο) pristinamicina I H.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 3-metoxifenilalanina (S) a 5 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são 75 lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. 0 extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de silica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina iA são reunidas e evaporadas. Obtêm-se 41 mg de resíduo seco. Este é retomado com 6 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado em 2 vezes numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 55% e acetonitrilo a 45%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 28 mg de 4ε-metoxi-des (4ζ-άίιηβ^ΐ3ΐηϊηο)ρΓΪ5^η3πιϊσϊη3 I A.
Espectro de R. Μ. N. de ΧΗ (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0, 52 (dd , J=16 e 5,5 Hz , 1H, 5 β2), 0,90 (t, J= 7 ,5 Hz, 3H: CH3 2 Y) / de 1,10 a 1,34 (mt, 2H: 3 β2 e 3 Y2) , 1,34 (d, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 1γ) , de 1 ,50 a 1,80 (mt 3H: 3 Yi e CH2 β), 2, 04 (mt, 1H 3 βχ), 2,20 (mt, 1H, 5 δ 2 ) r 2 ,35 (d largo, J= 16 Hz, 1H: 5 δι), 2, 38 (d, J=16 Hz, 1H : 5 βΐ ), 2, 83 (dt, J = 13 e 4 H2 , 1H: 5 ε2), 2,9 7 (dd, J= 12 e 4 lz, 1H: 4 β2), 3,28 (s, 3H: NCH3 4 ), 3 ,28 e 3, 56 (2 mts, 1H cada um : ch2 3 δ) 3,40 (t, J= 12 Hz, 1H: 4 βι), 3, 80 (s, 3H: OCH3), 4,58 (t, J= 7 ,5 Hz, 1H, 3 a), 4, 76 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: 5 Sl) r 4,85 (mt , 1H: 2a), 4, 90 d largo, J= 10 Hz, 1H: la), 5,27 (dd r J= 12 e 4 Hz, 1H: 4 a), 5, 30 (d largo, J= = 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5, 89 (d / J= 9,5Hz, 1H: 6 a), 5, 91 (q largo, J = 7,5 Hz, 1H : 1β), 6, 51 (d , J= 10 Hz, 1H: NH 2), de 6, 8C a 6,90 (mt, 3H: H 2 - H 4 e H 6 de 1' aromático em 4), de 7,15 a 7,40 (mt, 6 Η: H 5 de 1' aromático em 4 e H Aromáticos 6), 7,45 (d largo, J= 9 Hz, 1H : 1 h4), 7,50 (dd, J= 9 76 e 4 Hz, 1H: 1' H5), 7,80 (d largo, J = 4 Hz, 1H: 1' H6) , 8,40 (d, J= 10 Hz, 1H: NH 1), 8,73 (d, J= 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,62 (s, 1H: OH). São isoladas 7 mg de 4s-metoxi-des (4ζ-άίιηθ1:ίΐ3πύηο) pristinamicina I H (espectrometria de massa: M + H+ = 826), a partir das fracções provenientes da coluna de sílica descrita acima, contendo o novo derivado da pristinamicina I h, realizando a cromatografia em coluna semi-preparativa como descrito acima. EXEMPLO 17: Preparação de 4s-fluoro 4ζ-ιηβ^1-άβ8(4ζ-dimetilamino)pristinamicina I Ά.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 3-fluoro 4-metilfenilalanina (R, S) a 10 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N, sintetizada como no exemplo 34-5. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. Obtêm-se 15 mg de resíduo seco. Este é retomado com 3 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna 77 semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 55% e acetonitrilo a 45%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 9 mg de 4s-fluoro 4ζ-ηΐθίί1-άθ3(4ζ-dimetilamino)pristinamicina I A.
Espectro de R. Μ. N. de ΧΗ (400 MHz, CDC13, δ em PP m, ref. TMS) : 0,60 (dd, J= 16 e ! 5,5 Hz, 1H, 5 β2), 0, 91 (t, J= 7,5 Hz, 3H: CH3 2 Y) f 1,12 (mt, . 1H : 3 β2), de 1,25 a 1, 35 (mt, 1H: 3 Y2) , 1,33 (d, J= 7 ,5 Hz, 3H : CH3 1 y), de 1,50 a 1, 85 (mt, 3H: 3 Yi e CH2 2 β), 2,02 (mt, 1H , 3 βι), 2,13 (mt, 1H, 5 δ2 ), 2, 27 (s, 3H: ArCH3 >, 2 ,36 (d largo, J= = 16 Hz, 1H: : 5 δι) , 2,45 (d, J= : 16 Hz, 1H: 5 βι), . 2,85 (dt, J= = 13 e 4,5 Hz, 1H: 5 ε2 ), 2, 97 (dd, J= 12,5 e 4,5 Hz, 1H: 4 β2), 3, 23 (s, 3H: NCH: 3 4), 3, 30 e 3, 56 (2 mts , 1H cada um: ch2 3 δ), 3 ,37 (t, J= 12, 5 Hz, 1H: i. 1 βι), 4, 55 (t, J= v, 5 Hz , 1H , 3 α) r 4, 75 i (dd largo , J= 13 e 8 Hz, 1H: 5 Si), 4,83 (mt, 1H: 2α), 4,! 39 (d largo, J= = 10 Hz, 1H: la), 5, 29 (dd, J= 12 , 5 e 4,5 Hz, 1Η: 4 α ), 5,32 (d largo, J= 5, 5 Hz, 1H : 5 a), 5,89 (d, J= 9,5 Ηζ r 1H: 6 a), 5,92 (mt, 1H: 1β), 6/ 49 (d, J= 10 Hz, 1H: ΝΗ 2) , 6 ,90 (mt, 2H: H 2 e H 6 do aromático em 4), 7,11 (t, j= ε ! Hz, 1Η: H 5 do aromático em 4), de 7, ,10 a 7,30 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,43 (dd, J= 8,5 e 1 Hz, 1H: 1' h4), 7, 49 (dd, J= 8,5 e 4,5 i Hz , 1H: 1' H5 ), 7,75 (dd, J = 4,5 e 1Hz, 1H: 1 ' h6; l, 8, 48 (d, J= = 10 Hz, 1H: NH D, 8,70 (d, J= 5 >,5 Hz, 1H: NH 6) / 11 , 60 (s, 1Η: OH) . 78
EXEMPLO 18: Preparação da 4ζ-etilamino-des (4ζ-dimetilamino) pristinamicina IA
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 50 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de de dicloridrato de 4-etilaminofenilalanina (R, S) sintetizada como no exemplo 33, 20 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,5 litros de meio de fermentação provenientes dos 50 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ζ-etilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 65% e acetonitrilo a 35% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 60% e acetonitrilo a 40%. As fracções contendo a 4ζ-etilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina lA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 10 mg de 4ζ-etilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. de (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0,72 (dd, J = 16 e 6 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 β); 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 em 2 γ); 1,15 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 β) ; de 79 1,20 a 1,40 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 γ) ; 1,27 (t, J = 7,5 Hz, 3h:CH3 do etilo); 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H:CH3 em 1 γ) ; de 1,50 a 1,65 (mt, 1H:o outro H do CH2 em 3 γ) ; 1,60 e 1,74 (2 mts, 1H cada um:CH2 em 2 β) ; 2,02 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 β); 2,21 e 2,33 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um:CH2 em 5 5); 2,40 (d, J = 16 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 (3); 2,82 (dt, J = 13 e 4,5 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 ε); 2,89 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 4 β); 3,10 (mt, 2H:NCH2 do etilo); de 3,20 a 3,35 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 5); 3,26 (s, 3H:NCH3); 3,31 (t, J = 12 Hz, lH:o outro H do CH2 em 4 β); 3,54 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 5); 3,67 (mf, 1H:NH); 4,56 (dd, J = 6,5 e 7 Hz, 1H:3 a); 4,75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 ε); 4,84 (mt, 1H:2 a); 4,90 (d largo, J = 10 Hz, 1H:1 a); 5,24 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:4 a); 5,32 (d largo, J = 6 Hz, 1H:5 a); 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a); 5,90 (mt, 1H:1 β); 6,52 (d, J = 8 Hz,
3H:NH em 2 e H Aromáticos em 4 ε); 7,00 (d, J = 8 Hz, 2H:H
Aromáticos em 4 5); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H:H Aromáticos em 6); 7,46 (AB limite, 2H: 1' H4 e 1' Hs); 7,84 (dd, J = 4 e 1 Hz, 1H:1' He); 8,45 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 1); 8,77 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 6); 11,65 (s, 1H:0H). EXEMPLO 19: Preparação da 4ζ-άϊθ^ΐ3ΐηϊηο-άθ8(4ζ-
dimetilamino)-pristinamicina IA
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 50 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de dicloridrato de 4-dietilaminofenilalanina (R, S) a 20 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N, sintetizada como no exemplo 33. No final de 40 h de cultura, 1,5 litros de meio de fermentação provenientes dos 50 erlenmeyers são extraídos com 2 volumes de uma mistura de 80 tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ζ-dietilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado duas vezes numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 68% e acetonitrilo a 32%. As fracções contendo a 4ζ-dietilamino-des (4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 50 mg de 4ζ-dietilamino-des(4ζ-dimetilamino) pristinamicina Ia.
Espectro de R. Μ. N. de ΧΗ (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0,65 (dd, J = 16 e 6 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 β); 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 em 2 γ) ; 1,14 (t, J = 7 Hz, 6H:CH3 do etilo); 1,15 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 β) ; 1,26 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 γ) ; 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H:CH3 em 1 γ) ; 1,55 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 γ) ; 1,63 e 1,75 (2 mts, 1H cada um:CH2 em 2 β); 2,02 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 β); 2,22 e 2,31 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um:CH2 em 5 δ); 2,37 (d, J = 16 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 β); 2,80 (dt, J = 13 e 4,5 Hz, 1H: 1H de CH2 em 5 e) ; 2, 89 (dd, J = 12,5 e 4 Hz, 1H : 1H de ch2 em 4 β); ' de 3,20 a 3, 40 (mt , 6H:NCH2 do etilo - 1H de CH2 em 3 δ e o outro H do CH2 em 4 β); 3,27 (s, 3H: :NCH3) ; 3, 55 (mt , 1H: o 81 outro H do CH2 em 3 5); 4,58 (dd, J = 8 e 6 Hz, 1H:3 a); 4,76 (dd largo, J = 13 e 7,5 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 ε); 4,84 (mt, 1H:2 a); 4,89 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H:1 a); 5,21 (dd, J = 12,5 e 4 Hz, 1H:4 a); 5,28 (d largo, J = 6 Hz, 1H:5 a); 5,87 (d, J = 9,5 Hz, 1H:6 a); 5,90 (mt, 1H:1 β); 6,52 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 2); 6,60 (d, J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em 4 ε); 7,02 (d, J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em 4 5); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H:H Aromáticos em 6); 7,46 (AB limite, 2H:1' H4 e 1' H5) ; 7,88 (dd, J = 4,5 e 2,5 Hz, 1H:1' H6) ; 8,43 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 1); 8,76 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 6); 11,62 (s, 1H:0H).
EXEMPLO 20: Preparação da 4ζ-άΐβ1ϊΐ3ΐηΐηο-άθ3 (4ζ-dimetilamino)-pristinamicina lA
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 94 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de de dicloridrato de 4-dialilaminof enilalanina (R, S) a 20 g/L em água, sintetizada como no exemplo 38-1. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 2,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 94 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ζ-dialilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura 82 de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 52% e acetonitrilo 48%. As fracções contendo a 4ζ-άΐ3ΐίΐ3ΐηίηο-άβ3(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 15 mg de 4ζ-άί3ΐίΐ3ΐηίηο-άθ3 (4 ζ-dimetilamino) prisrinamicina lA.
Espectro de R. Μ. N. de XH (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0, 55 (dd , J = 16 e 6 Hz, 1H: 1H de CH2 em 5 β) r 0,93 (t, J = 7 ,5 Hz, 3H: CH3 em 2 Y) i : 1,18 (mt , 1H: 1H de CH2 em 3 β); 1,25 (mt, 1H: 1H de CH2 em 3 y) ; 1,34 (d, J = 6,5 Hz, 3H:CH3 em 1 y) ; 1,59 (mt ·, : lH:o outro H do CH2 em 3 y) ; 1,68 e 1,78 (2 mts , 1H cada um: CH2 em 2 β); 2, 04 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 β); 2,25 e 2,34 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um:CH2 em 5 5); 2,40 (d, J = 16 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 β); 2,83 (dt, J = 13 e 4,5 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 s); 2,92 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 4 β) ; de 3,20 a 3,30 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 5); 3,29 (s, 3H:NCH3); 3,33 (t, J = 12 Hz, lH:o outro H do CH2 em 4 β); 3,57 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 5); 3,93 (AB limite, 4H:NCH2 do alilo) ; 4,60 (dd, J = 8 e 6,5Hz, 1H:3 a); 4,78 (dd largo, J = 13 e 7,5 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 e) ; 4,87 (mt, 1H: 2 a); 4,92 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H:1 a); de 5,10 a 5,25 (mt, 5H:4 α e =CH2 do alilo); 5,28 (d largo, J = 6 Hz, 1H:5 a); 5,85 (mt, 2H:CH= do alilo); 5,92 (d, J = 9,5 Hz, 1H:6 a); 5,94 (mt, 1H: 1 β); 6,54 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 2); 6,65 (d, J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em 4 ε); 7,05 (d, J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em
4 5); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H:H Aromáticos em 6); 7,51 (AB limite, 2H: 1' H4 e 1' H5) ; 7,88 (dd, J = 4 e 2 Hz, 1H:1' H6) ; 8,43 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 1); 8,77 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 6) ; 11,65 (s, 1H:0H). 83
EXEMPLO 21: Preparação da 4ζ-aliletilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 26 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de dicloridrato de 4-aliletilaminof enilalanina (R, S) a 20 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N, sintetizada como no exemplo 39-4. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 0,78 litros de meio de fermentação provenientes dos 26 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de dicloroméhane e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ζ-aliletilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 52% e acetonitrilo 48%. As fracções contendo a 4ζ-aliletilamino-des ( 4 ζ-dimetilamino) pristinamicina IA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 20 mg de 4ζ-aliletilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina Ia- 84
Espectro de R. Μ. N. de 1H (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0,58 (dd, j = 16 e 6 Hz, 1H: 1H de ch2 em 5 β) ; 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 em . 2 y) ; 1,16 (t, J = 7 Hz, 3H: CH3 do etilo); 1, 16 (mt, 1H: 1H de CH2 em 3 β); 1, 25 (mt, 1H: 1H de CH2 em 3 y) ; 1,32 (d, J = 6, 5 Hz, 3H:CH3 em 1 y) ; 1,54 (mt , 1H: o outro H do ch2 em 3 γ) ; i, 63 e 1, 75 ( 2 mts , 1H cada um :CH2 em 2 β); 2 ,02 (mt, 1H:o outro H do CH: 2 em 3 β); 2, 23 e 2, 31 ( respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um:CH2 em 5 5); 2,37 (d, J = 16 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 β) ; 2,80 (dt, J = 13 e 4,5 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 ε); 2,87 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 4 β); de 3,15 a 3,30 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 5); 3,26 (s, 3H:NCH3); 3,30 (t, J = 12 Hz, lH:o outro H do CH2 em 4 β); 3,36 (mt, 2H:NCH2 do etilo) ; 3,54 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 5); 3, 90 (AB limite, 2H:NCH2 do alilo) f 4,57 (dd, J = = 8 e 6 Hz, 1H : 3 oí) ; 4,76 (dd largo, J = 13 e 7, 5 Hz, lH:o outro H do ch2 em 5 ε) ; 4,: 84 (mt, 1H: : 2 a) ; 4,89 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H: 1 a); de 5, 05 a 5,20 (mt, 3H: 4 a e =CH2 do alilo); 5,27 (d largo, J = 6 Hz, 1H:5 a); 5, 83 (mt, 1H :CH= do alilo); 5,88 (d, J = 9 ,5 Hz, 1H:6 a) ; 5,91 (mt, 1H : 1 β); 6,50 (d, J = 10 Hz, 1H : NH em 2) ; 6,60 (d, J = = 8 Hz, 2H : H Aromáticos em 4 ε) ; 7 , 02 (d, J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em 4 5); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H:H Aromáticos em 6); 7,47 (AB limite, 2H:1' H4 e 1' H5); 7,88 (dd, J = 4 e 2 Hz, 1H: 1' H6) ; 8,41 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 1); 8,75 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 6); 11,62 (s, 1H:0H). 85
EXEMPLO 22: Preparação da 4ζ-θίϊ1 propilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de dicloridrato de 4-etilpropilaminofenilalanina (R, S) a 20 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N, sintetizada como no exemplo 39-6. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ζ-βϋ1 propilamino-des (4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de 63% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 37% de acetonitrilo. As fracções contendo a 4ζ-etilpropilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 16 mg de 4ζ-etil propilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA. 86
Espectro de R. Μ. N. de XH (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0,67 (dd, J = 16 e 6 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 β); 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 em 2 y) ; 0,95 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 de propilo); 1,14 (t, J = 7 Hz, 3H:CH3 do etilo); 1,15 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 β); 1,25 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 y) ; 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H:CH3 em 1 y); de 1,45 a 1,65 (mt, 3H:o outro H do CH2 em 3 y e CH2 propilo); 1,63 e 1,75 (2 mts, 1H cada um:CH2 em 2 β); 2,02 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 β); 2,23 e 2,33 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um: :CH2 em 5 δ); 2,37 (d, J = = 16 Hz, 1H : 0 outro H do CH2 em 5 β); 2, 80 (dt, J = 13 e 5 Hz, 1H : 1H de CH2 em 5 ε) ; 2, 89 (dd, J = = 12 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 4 β); de 3,10 a 3,25 (mt, 3H:1H de CH2 em 3 δ e NCH2 de propilo); 3,26 (s, 3H:NCH3); de 3,25 a 3,40 (mt, 2H:NCH2 do etilo); 3,34 (t, J = 12 Hz, lH:o outro H do CH2 em 4 β); 3,54 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 δ); 4,57 (dd, J = 7,5 e 6 Hz, 1H:3 a); 4,76 (dd largo, J = 13 e 7,5 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 ε); 4,84 (mt, 1H: 2 a); 4,89 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H:1 a); 5,21 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:4 a); 5,28 (d largo, J = 6 Hz, 1H:5 a); 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H:6 a); 5,91 (mt, 1H:1 β); 6,48 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 2); 6,60 (d, J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em 4 ε); 7,03
(d, J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em 4 δ); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H:H
Aromáticos em 6); 7,47 (AB limite, 2H:1' H4 e 1' H5); 7,89 (mt, 1H: 1' H6); 8,42 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 1); 8,76 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 6); 11,62 (s, 1H:0H).
EXEMPLO 23: Preparação da 4ζ-ί:Γϊί1ιιθΓθπΐθί:οχϊ-άθ3 (4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de cloridrato de 87 4-0-trifluorometiltirosina (R, S) a 20 g/L em água, sintetizada como no exemplo 34-8. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com volumes de de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ζ-trifluorometoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado duas vezes numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 60% e acetonitrilo a 40%. As fracções contendo a 4ζ-trifluorometoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 46,5 mg de 4ζ-trifluorometoxi-des (4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. de :H (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS): 0,77 (dd, J = 16 e 5,5 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 β); 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 em 2 y) ; 1,08 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 β); de 1,30 a 1,40 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 y); 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H:CH3 em 1 y); de 1,55 a 1,70 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 y) ; 1,65 e 1,76 (2 mts, 1H cada um:CH2 em 2 β) ; 2,02 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 (3); 2,11 e 2,40 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um:CH2 em 5 δ); 2,54 (d, J = 16 Hz, lH:o 88 outro H do CH2 em 5 β); 2,88 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 e); 3,08 (dd, J = 12 e 5 Hz, 1H:1H de CH2 em 4 β) ; 3,22 (s, 3H:NCH3); de 3,30 a 3,45 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 5); 3,39 (t, J = 12 Hz, 1H:o outro H do CH2 em 4 β) ; 3,59 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 5); 4,53 (t, J = 7,5 Hz, 1H:3 a); 4,75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H:o outro H do CH2 em 5 e); 4,85 (mt, 1H:2 a); 4,89 (dd, J = 10 e 1,5 Hz, 1H:1 a); 5,35 (d largo, J = 5,5 Hz, 1H:5 a);
5,41 (dd, J = 12 e 5 Hz, 1H:4 a); 5,92 (d, J = 10 Hz, 1H: 6 a); 5,93 (mt, 1H:1 β); 6,53 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 2); de 7,15 a 7,35 (mt, 5H:H Aromáticos em 6); 7,16 (d, J = 8 Hz, 2H:H
Aromáticos em 4 ε); 7,26 (d, J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em 4 δ); 7,37 (dd, J = 8,5 e 4 Hz, 1H:1' H5) ; 7,42 (dd, J = 8,5 e 1,5 Hz, 1H: 1' H4) ; 7,70 (dd, J = 4 e 1,5 Hz, 1H:1' H6) ; 8,37 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 1); 8,75 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 6); 11,66 (s, 1H:0H). EXEMPLO 24: Preparação da 4ζ-8ΐϊ1οχϊ-οΙθ8 ^-dimetilamino) pristinamicina Ia
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 90 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de cloridrato de 4-O-aliltirosina (S) a 20 g/L em ácido clorídrico 0,1 N, sintetizada como no exemplo 33. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 2,7 litros de meio de fermentação provenientes dos 90 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de 89 diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ζ-aliloxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 52% e acetonitrilo 48%. As fracções contendo a 4ζ-aliloxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina lA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 29 mg de 4ζ-aliloxi-des(4ζ-dimetilamino) pristinamicina lA.
Espectro de R. Μ. N. de ΧΗ (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0,63 (dd, J = 16 e 6 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 β); 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 em 2 γ) ; 1,13 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 β); 1,29 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 γ) ; 1,33 (d, J = 6,5 Hz, 3H:CH3 em 1 γ) ; 1,57 (mt, 1H: o outro H do CH2 em 3 γ) ; 1,65 e 1,74 (2 mts, 1H cada um:CH2, em 2 β) ; 2,02 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 β) ; 2,14 e 2,34 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um:CH2 em 5 δ); 2,43 (d, J = 16 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 β); 2,85 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 1H de CH2 em 5 ε); 2,95 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 4 β); 3,25 (s, 3H:NCH3); 3,33 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 δ); 3,36 (t, J = 12 Hz, lH:o outro H do CH2 em 4 β) ; 3,56 (mt, 1H:o outro H do CH2 em 3 δ); 4,51 (AB limite, 2H:OCH2 do alilo); 4,56 (t, J = 7,5 Hz, 1H:3 a); 4,75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 5 e) co (mt, 1H:2 a); 4,88 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H:1 a); 5,27 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:4 a); 5,32 (d largo, J = 6 Hz, 1H: 5 a); 5,30 e 5,40 (respectivamente mt e dd, J = 17 e 1,5 Hz, 1H cada um:=CH2 do alilo); 5,89 (d, J = 9,5 Hz, 1H:6 a); 5,91 (mt, 1H:1 β) ; 6,02 90 (mt, 1H:CH= do alilo) ; 6,50 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 2); 6,85 (d,
J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em 4 ε); 7,12 (d, J = 8 Hz, 2H:H
Aromáticos em 4 5); de 7,10 a 7,35 (mt, 5H:H Aromáticos em 6); 7,45 (dd, J = 8,5 e 1,5 Hz, 1H:1' H4) ; 7,57 (dd, J = 8,5 e 4 Hz, 1H: 1' Hs); 7,77 (dd, J = 4 e 1,5 Hz, 1H:1' H6) ; 8,41 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 1); 8,74 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 6); 11,63 (s, 1H:OH) .
EXEMPLO 25: Preparação da Λζ-θίιοχΐ-άθβ(4ζ-(ϋπΐθ^ΐ3ΐηϊηο) pristinamicina IA
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 90 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de cloridrato de 4-O-etiltirosina (S) a 20 g/L em ácido clorídrico 0,1 N, sintetizada como no exemplo 33. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 2,7 litros de meio de fermentação provenientes dos 90 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ζ-etoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 52% e 91 acetonitrilo 48%. As fracções contendo a 4ζ-etoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 29 mg de 4ζ-etoxi-des (4ζ-άίιηβίϊΐ3ΐηϊηο)ρΓΪ3ϋηβιηϊοϊηβ IA.
Espectro de R. Μ. N. de 1H (400 MHz, CDCI3, δ em ppm, ref. TMS) : 0 , 6 4 (dd, J = 16 e 5 ,5 Hz, 1H: 1H de ch2 em 5 β); 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H: ch3 em 2 γ); 1 ,12 (mt, 1H: 1H de CH2 em 3 β); 1 ,25 (mt, 1H : 1H de ch2 em 3 γ) r 1,33 (d, J = 7 Hz , 3H: CH3 em 1 y) ; 1, 42 (t , J = 7 Hz, , 3H: CH3 do eti lo); 1, 57 (mt , lH:o outro H do ch2 em 3 Y) ; 1, , 63 e 1, 74 (2 mts , 1H cada um: CH2 em 2 β); 2 , 02 (mt, 1H :o outro H do CH2 em 3 β); 2, 16 e 2, 35 ( respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um:CH2 em 5 5); 2,43 (d, J = 16 Hz, 1H:o outro H do CH2 em 5 β); 2,83 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 1H de CH2 em 5 ε); 2, 93 (dd, J = = 12 e 4 Hz, 1H:1H de ch2 em 4 β) ; de > 3,15 a 3,30 (mt, 1H : 1H de ch2 em 3 5); 3,: 24 (s, 3H: NCH3) ; 3,35 (t, J = 12 ! Hz , 1H : 0 outro H do CH2 em 4 β) ; 3 , 55 (mt, 1H: 0 outro H do CH: 2 em 3 δ); 3,95 (AB limite, 2H:OCH2 do etilo); 4,56 (dd, J = 7 ',5 e 6 Hz , 1H:3 a); 4, 75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: 0 outro H do ch2 em 5 ε) ; 4,84 (mt , 1H: 2 a) ; CG (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H: 1 oí) , ? 5, 26 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 4 oí) ; 5,32 (d largo, J = 5,5 Hz, 1H:! 5 a); 5,88 (d, J = 10 Hz, 1H: 6 a); 5,92 (mt, 1H: 1 β); 6,48 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 2); 6,83 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos em 4 ε) ; 7,10 (d, J = = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em 4 δ); de 7,10 cL 7,35 > (mt ., 5H:H Aromáticos em 6); 7, 44 (dd, J = 8,5 e 1,5 Hz, 1H : 1' h4) ; 7,57 (dd, J = = 8, 5 e LO Hz, 1H: 1' h5) ; 7, 77 (dd, , J = - 4 / , 5 e 1,5 Hz, 1H:1' Hg) ; 8 ,38 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em D; : 8,- 75 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 6); 11,60 (s, 1H:OH). 92
EXEMPLO 26: Preparação da 4ζ-(2-cloroetoxi)-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de cloridrato de 4-0(2-cloroetil) tirosina (S) a 20 g/L em água, sintetizada como no exemplo 42-1. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ζ-(2-cloroetoxi) -des (4ζ-άίιηβ^ΐ3ΐηίηο)ρ^5^η3ΐηίοίη3 IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 60% e acetonitrilo a 40%. As fracções contendo a 4ζ-(2-cloroetoxi) -des (4ζ-όίιηθ0ί1οιηίηο)ρ^3^η3ΐηίοίη3 IA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 3,2 mg de 4ζ-(2-cloroetoxi)-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. de 1ti (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS): 0,66 (dd, J = 16 e 5,5 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 β); 0,91 (t, 93 J = 7,5 Hz, 3H:CH3 em 2 γ) ; 1,13 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 β); 1,28 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 γ) ; 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H:CH3 em 1 γ) ; 1,57 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 γ) ; 1,66 e 1,76 (2 mts, 1H cada um:CH2 em 2 β); 2,02 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 β) ; 2,16 e 2,37 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um:CH2 em 5 5); 2,47 (d, J = 16 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 β); 2,86 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 ε) ; 2,95 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 4 β) ; 3,23 (s, 3H:NCH3); 3,32 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 5); 3,37 (t, J = 12 Hz, lH:o outro H do CH2 em 4 β) ;
3,57 (mt, 1H: o outro H do CH2 em 3 δ) ; 3,82 (t, J = 6 Hz, 2H: CH2C1) ; 4,19 (AB limite, 2H:OCH2 do etilo); 4,55 (dd, J = 7,5 e 7 Hz, 1H:3 a); 4,75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 5ε); 4,84 (mt, 1H: 2 a); 4,87 (d largo, J = 10 Hz, 1H: 1 a) ; 5,28 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:4 a) ; 5, 32 (d largo, J = 5,5 Hz, 1H:5 oí); 5,88 (d, J = 10 Hz, 1H:6 a); 5,90 (mt, 1H:1 β); 6,50 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 2); 6,86 (d, J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em 4ε); 7,13 (d, J = 8 Hz, 2H:H
Aromáticos em 4 δ); de 7, 10 a 7, 35 (mt, 5H : H Aromáticos em 6) ; 7, 45 (AB limite, 2H : 1' H4 e 1' LO nu 75 (dd, J = 4 e 2 Hz, 1H : 1' h6) ; OO 00 OO 1 (d, J = 10 Hz, 1H : NH em 1) ; 8 ,74 (d , J = 10 Hz, 1H : NH em 6) • 11 62 (s, 1H: OH) . 94
EXEMPLO 27: Preparação da 4ζ-8θθί;ϊ1-<1θ8 4ζ-dimetilamino) pristinamicina IA
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-acetil-fenilalanina (S) a 20 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N, sintetizada como no exemplo 33. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ζ-3θβ^1) -des (4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 60% e acetonitrilo a 40%. As fracções contendo a 4ζ-acetil-des(4ζ- dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 4,2 mg de 4ζ-acetil-des(4ζ-dimetilamino) pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. de ΧΗ (400 MHz, CDCI3, δ em ppm, ref. TMS) : 0,73 (dd, J = 16 e 6 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 β); 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 em 2 γ) ; 1,12 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 β); de 95 1,25 a 1,45 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 γ) ; 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H:CH3 em 1 γ) ; 1,62 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 γ); de 1,60 a 1,85 (mt, 2H CH2 em 2 β); 2,02 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 (3); 2,20 e 2,42 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um:CH2 em 5 δ) ; 2,52 (d, J = 16 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 β) ; 2,60 (s, 3H:ArCOCH3) ; 2,88 (dt, J = 13 e 4,5 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 ε);
3,13 (dd, J = 13,5 e 5,5 Hz, 1H:1H de CH2 em 4 β) ; 3,21 (s, 3H:NCH3); de 3,30 a 3,50 (mt, lH:o outro H do CH2 em 4 β) ; de 3,30 a 3,50 e 3,63 (2 mts, 1H cada um:CH2 em 3 5); 4,53 (t, J = 7,5 Hz, 1H:3 a); 4,75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 ε ); 4,84 (mt, 1H:2 a); 4,88 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H : 1 a); 5 ,35 (d largo, J = 6 Hz, 1H : 5 a) ; 5,43 (dd, J L0, 5 e 4 Hz, 1H: 4 α); 5, 90 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a); 5,' 92 (mt, 1H : 1 β); 6, 56 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 2) ; de 7,10 a 7, 35 (mt, 5H:H Aromáticos em 6); : 7,28 (d, J = 8 Hz , 2H :H Aromáticos em 4 δ); 7, 38 (dd, J = 8,5 e 2 Hz, 1H : 1' H4); 7, 42 (dd, J - 8,5 e 4 t 5 Hz, 1H : 1' h5) ; : 7, 66 (dd, J = 4,5 e 2 Hz, 1H: 1' Hi o); 7, 88 (d, J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em 4 ε); 8 ,38 1 ;d, j = 10 Hz, 1H :NH em 1); 8,74 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 6); 11,65 (s, 1H:0H). exemplo 28: Preparação da 48-dimetilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de dicloridrato de 3-dimetilaminofenilalanina (R, S) a 20 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N, sintetizada como no exemplo 35-10. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois 96 são centrifugados. 0 sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4e-dimetilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 3 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 57% e acetonitrilo a 43%. As fracções contendo a 4s-dimetilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 1,1 mg de 4s-dimetilamino-des(4ζ— dimetilamino)pristinamicina iA.
Espectro de R. Μ. N. de (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. IMS): 0,63 (dd, J = 16 e 5 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 β); 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 em 2 y) ; 1,13 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 β); de 1,20 a 1,35 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 γ); 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H:CH3 em 1 γ) ; 1,57 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 γ) ; 1,63 e 1,76 (2 mts, 1H cada um:CH2 em 2 β) ; 2,02 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 β); 2,08 e 2,31 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um:CH2 em 5 δ); 2,35 (d, J = 16 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 β); 2,81 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 ε); 2,90 (s, 6H:N(CH3)2); 2,97 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 4 β); de 3,20 a 3,30 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 δ); 3,28 (s, 3H:NCH3); 3,37 (t, J = 12 Hz, lH:o outro H do CH2 em 4 β); 3,57 (mt, 1H:o outro H do CH2 em 3 5); 4,58 (t, J = 7,5 Hz, 1H:3 a); 97 4,74 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 ε); 4,86 (mt, 1H:2 a); 4,89 (d largo, J = 10 Hz, 1H:1 a); 5,27 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:4 a); 5,29 (d largo, J = 5 Hz, 1H:5 a); 5,89 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a); 5,90 (mt, 1H:1 β) ; 6,50 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 2); de 6,50 a 6,70 (mt, 3H:H Aromáticos em orto e em para dimetilamino); de 7,15 a 7,35 (mt, 5H:H Aromáticos em 6); 7,20 (t, J = mL de uma solução de cloridrato de 3-metiltiofenilalanina (R, S) a 20 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N, sintetizada como no exemplo 34-11. No final de 40 h de cultura, são extraídos os 1,68 litros de meio de fermentação provenientes dos 56 erlenmeyers com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. O resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 54% e acetonitrilo a 46% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 55% e acetonitrilo a 45%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 20 mg de 4s-metiltio-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina lA.
Espectro de R. Μ. N. de 1H (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0,56 (dd, J = 16 e 5,5 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 β); 0,90 (t, 98 J = 7 ,5 Hz, 3H: :CH3 em 2 y) ; : 1, 13 (mt , 1H: 1H de CH2 em 3 β); 1,28 (mt, 1H: : 1H de CH2 em 3 y) ; 1, 32 (d, J = 6,5 Hz , 3H:CH 3 em 1 γ) ; 1,58 (mt, 1H: o outro H do CH: 2 em 3 y) ; 1,62 e 1, 74 (2 mts , 1H cada um: : CH2 em 2 β); 2, 02 (mt, 1H : o outro H do CH2 em 3 β); 2,25 e 2,35 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um:CH2 em 5 5); 2,39 (d, J = 16 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 β); 2,43 (s, 3H:SCH3) ; 2,82 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 ε); 2,98 (dd, J = 12 e 4,5 Hz, 1H:1H de CH2 em 4 β) ; 3,26 (s, 3H:NCH3); 3,30 (t, J = 12 Hz 1H:1H de CH2 em 3 5); 3,38 (mt, lH:o outro H do CH2 em 4 β); 3,57 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 5); 4,56 (t, J = 7,5 Hz, 1H:3 a); 4,74 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 ε); 4,84 (mt, 1H:2 a); 4,89 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H:1 a); 5,29 (dd, J = 12 e 4,5 Hz, 1H:4 a); 5,32 (d largo, J = 5,5 Hz, 1H:5 a); 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H:6 a); 5,90 (mt, 1H:1 β); 6,51 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 2); 6,99 (d largo, J = 8 Hz, 1H: H Aromático em para do metiltio); 7, 10 e 7, 15 (respectivamente s largo e d largo, J = 8 Hz, 1H cada um : H Aromáticos em orto do metiltio); de 7,15 a 7,35 (mt, 6H : H Aromáticos em 6 e H Aromáticos em meta do metiltio ); 7, 43 (d largo, J = 8 Hz, 1H: 1' H4); 7,52 (dd, J = 8 e 4 Hz, 1H: 11 ' h5 ); 7,79 (d largo, J = 4 Hz, 1H:1' H6) ; 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 1); 8,73 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 6); 11,62 (s, 1H:0H). EXEMPLO 30: Preparação da 4 ε-etoxi-des (4ζ-άϊπΐθί:ΐΐ3πιϊηο) pristinamicina lA.
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de cloridrato de 3-O-etiltirosina (S) a 20 g/L em hidróxido de sódio 0,2 N, sintetizada como no exemplo 37-1. No final de 40 h de cultura, 99 os 1,8 litros de meio de fermentação provenientes dos 60 erlenmeyers são extraídos com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. 0 sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado da pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. Obtêm-se 19 mg de resíduo seco. Este é retomado com 3 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 60% e acetonitrilo a 40%. As fracções contendo a nova pristinamicina são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 15,8 mg de 4s-0-etoxi-des (4ζ — dimetilamino)pristinamicina IA.
Espectro de R. Μ. N. de ΧΗ (400 MHz, CDC13, δ em ppm, ref. TMS) : 0,55 (dd, J = 16 e 5,5 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 β); 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 em 2 γ) ; 1,12 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 β); 1,20 (mt, 1H: 1H de CH2 em 3 γ); 1,31 (d, J = 6,5 Hz, 3H:CH3 em 1 γ) ; 1,49 (t, J = 7 Hz, 3H:CH3 do etilo); 1,54 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 γ) ; 1,63 e 1,73 (2 mts, 1H cada um:CH2 em 2 β); 2,02 (mt, 1Η:ο outro H do CH2 em 3 β); 2, 22 e 2,33 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um :CH2 em 5 5); 2,46 (d, J = 16 Hz, 1H:o outro H do CH2 em 5 β); 2, 83 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 1H de CH2 em 5 ε); 2, 95 (dd, J = = 12 e 4 Hz, 1H: 1H de CH2 em 4 β); 3,22 (mt, 1H: 1H de CH 2 em 3 δ) ; 3, 27 (s , 3H:NCH3); 3,39 (t, 100 J = 12 Hz, lH:o outro H do CH2 em 4 β); 3,53 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 5); 3,93 e 4,03 (2 mts, 1H cada um:OCH2 do etilo) ; 4,56 (dd, J = 7 e 5,5 Hz, 1H:3 a); 4,75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 ε) ; 4,82 (mt, 1H: 2 a) ; 4,88 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H:1 a); 5,23 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:4 a); 5,23 (d largo, J = 5, 5 Hz, 1H:5 a); 5,87 (d, J = 9,5 Hz, 1H:6 a) ; 5,92 (mt, 1H:1 β); 6,47 (d, J = 10 Hz , 1H:NH em 2 ) ; 6,80 (mt, 3H:H Aromáticos em orto e em para do etoxilo) ; de 7,10 a 7,35 (mt, 6H:H Aromáticos em 6 e H Aromáticos em meta do etoxilo) ; 7,43 (dd, J = 8 e 1 Hz, 1H: 1' h4) ; 7,50 (dd, J = 8 e 4 Hz, 1H:1' Hs) ; 7,77 (dd, J = 4 e 1 Hz, 1H:1' H6) ; 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 1); 8,70 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 6); 11,60 (s, 1H:0H).
EXEMPLO 31: Preparação da 4ζ-θ^]^ϊο-άθ8 ^-dimetilamino) pristinamicina IA
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92: :pVRC508 em meio de produção numa escala de 2 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de cloridrato de 4-etiltiofenilalanina (S) a 20 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N, sintetizada como no exemplo 33. No final de 40 h de cultura, os 60 mL de meio de fermentação provenientes dos 2 erlenmeyers são extraídos com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 101 4ζ-etiltio-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. 0 resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 60% e acetonitrilo a 40% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 52% e acetonitrilo 48%. As fracções contendo a 4ζ-β^1^ο-όβ3 (4ζ— dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se ? mg de 4ζ-etiltio-des(4ζ-dimetilamino) pristinamicina lA.
Espectro de R. Μ. N. de 1H (400 MHz, CDC13, δ em ppm) : 0,68 (dd, J = 16 e 6 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 β); 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 em 2 γ); de 1,10 a 1,40 (mt, 5H:lH de CH2 em 3 β e 1H de CH2 em 3 γ e CH3 do etilo); 1,32 (d, J = 7 Hz, 3H:CH3 em 1 y); de 1,45 a 1,85 (mt, 3H:o outro H do CH2 em 3 γ e CH2 em 2 β); 2,02 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 (3); 2,18 e 2,37 (respectivamente mt e d largo, j = 16,5 Hz, 1H cada um:CH2 em 5 δ); 2,45 (d largo, J = 16 Hz, 1H:o outro H do CH2 em 5 β); 2,85 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 1H de CH2 em 5 ε); 2,90 (mt, 2H:ArSCH2 etile) ; 2,98 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 4 β); 3,25 (s, 3H:NCH3); 3,35 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 δ); 3,39 (t, J = 12 Hz, lH:o outro H do CH2 em 4 β); 3,57 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 δ); 4,55 (t, J = 7,5 Hz, 1H:3 a); 4,75 (dd largo, J = 13 e 7,5 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 ε); 4,85 (mt, 1H:2 a); 4,89 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H:1 a); de 5,25 a 5,40 (mt, 2H:5 α e 4 a); 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H:6 a); 5,91 (mt, 1H: 1 β) ; 6,55 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH em 2); 7,10 (d, J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em 4 δ); de 7,10 a 7,35 (mt, 7H:H Aromáticos em 6 e 4 ε); 7,44 (AB limite, 2H: 1' H4 e 1' h5) ; 7, 74 (mt, 1H:1' h6) ; 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 1); 8,75 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH em 6); 11,62 (s, 1H:0H). 102
EXEMPLO 32: Preparação da 4ζ-etil-des (4ζ-άϊπΐθ^ΐ3Πΐΐηο) pristinamicina IA
Realiza-se uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção numa escala de 2 erlenmeyers, como descrito no exemplo 3, com adição às 16 h de 1 mL de uma solução de 4-etilfenilalanina (R, S) a 20 g/L em hidróxido de sódio 0,1 N, sintetizada como no exemplo 33. No final de 40 h de cultura, os 60 mL de meio de fermentação provenientes dos 2 erlenmeyers são extraídos com 2 volumes de uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 66% e acetonitrilo a 34%, depois são centrifugados. O sobrenadante é extraído 2 vezes com volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois são combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado com 20 mL de diclorometano e é injectado numa coluna de sílica (30 g) preparada em diclorometano e eluida sucessivamente por etapas de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ζ-β^1-άβε (4ζ— dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e evaporadas. 0 resíduo seco é retomado com 7 mL de uma mistura de água a 52% e acetonitrilo a 48% e é injectado numa coluna semi-preparativa Nucleosil 7 μ C8 10 x 250 mm (Macherey Nagel), eluida com uma mistura de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 a 52% e acetonitrilo 48%. As fracções contendo a 4ζ-etil-des(4ζ- dimetilamino)pristinamicina IA são reunidas e extraídas com um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, é seca sobre sulfato de sódio, depois é evaporada. Obtêm-se 0,50 mg de 4ζ-etil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina lA.
Espectro de R. Μ. N. de (400 MHz, CDCI3, δ em ppm, ref. TMS): 0,42 (dd, J = 16 e 5,5 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 β); 0,92 (t, 103 J = 7,5 Hz, 3H:CH3 em 2 γ) ; de 1,10 a 1,40 (mt, 2H:1H de CH2 em 3 β e 1H de CH2 em 3 γ) ; 1,23 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 do etilo); I, 35 (d, J = 7 Hz, 3H:CH3 em 1 γ) ; de 1,45 a 1,85 (mt, 3H:o outro H do CH2 em 3 γ e CH2 em 2 β); 2,02 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 β); 2,15 e de 2,25 a 2,40 (2 mts, 1H cada um:CH2 em 5 5); de 2.25 a 2,40 (mt, lH:o outro H do CH2 em 5 β); 2,60 (q, J = 7,5 Hz, 2H:ArCH2 do etilo); 2,83 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 e); 2,98 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 4 β); de 3.25 a 3,35 (mt, 1H:1H de CH2 em 3 δ); 3,27 (s, 3H:NCH3); 3,39 (t, J = 12 Hz, lH:o outro H do CH2 em 4 β); 3,59 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 5); 4,58 (dd, J = 7 e 6,5 Hz, 1H:3 a); 4,75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 e); 4,87 (mt, 1H:2 a); 4,89 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H:1 a); 5,24 (d largo, j = 5,5 Hz, 1H:5 a); 5,29 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H:4 a); 5,88 (d, J = 10 Hz, 1H:6 a); 5,92 (mt, 1H:1 β); 6,73 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 2); de 7,10 a 7,35 (mt, 9H:H Aromáticos em 6 - 4 ε e 4 5); 7.4 4 (dd, J = 8,5 e 1,5 Hz, 1H:1' H4) ; 7,50 (dd, J = 8,5 e 4.5 Hz, IH: 1' Hs) ; 7,80 (dd, J = 4,5 e 1,5 Hz, 1H:1' H6); 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 1); 8,75 (d, J = 10 Hz, 1H:NH em 6); II, 66 (s, 1H:OH). São isoladas 0,3 mg de ζ-etil-des ^-dimetilamino) pristinamicina IH a partir das mesmas fracções provenientes da coluna de sílica descrita acima, contendo igualmente o novo derivado da pristinamicina IH, realizando a cromatografia em coluna semi-preparativa como descrito acima.
Espectro de R. Μ. N. de XH (400 MHz, CDC13, δ em ppm) ::0,04 (mt, IH:IH de CH2 em 5 β); 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 em 2 γ) ; de 1,10 a 1,40 (mt, 2H:1H de CH2 em 5 δ e IH de CH2 em 5 γ); 1,18 (t, J = 7,5 Hz, 3H:CH3 do etilo); 1,30 (d, J = 6,5 Hz, 3H:CH3 em 1 γ); de 1,45 a 1,85 (mt, 7H:o outro H do CH2 em 5 γ - o outro H 104 do CH2 em 5 δ - 1H de CH2 em 3 β - CH2 em 3 γ e CH2 em 2 β); 1,81 (d largo, J = 13 Hz, lH:o outro H do CH2 em 5 β); 2,02 (mt, lH:o outro H do CH2 em 3 β); 2,40 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H:1H de CH2 em 5 e); 2,65 (q, J = 7,5 Hz, 2H: Ar CH2 do etilo) ; 2,97 e 3,09 (respectivamente dd e t, J = 12 um:CH2 em 4 β); 3,50 e 3,60 (2 mt (dd, J = 8 e 5 Hz, 1H:3 a); 4,49 H do CH2 em 5 e); 4,70 (mt, 2H:í 4,83 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H:1 a; 5,74 (mt, 1H:1 β); 6,09 (d, J = 1H:NH em 2); 7,07 (d, J = 8 Hz, (d, J = 8 Hz, 2H:H Aromáticos em Aromáticos em 6); 7,40 (dd, J = J = 8 e 4 Hz, 1H:1' H5) ; 7,92 (dd (mf, 1H:NH em 6); 8,50 (d, J = 1H:OH). e 5 Hz e J = 12 Hz, 1H cada s, 1H cada um:CH2 em 3 5); 4,13 (d largo, J = 13 Hz, lH:o outro j α e 4 a); 4,77 (mt, 1H:2 a); ; 5,50 (d, J = 7 Hz, 1H:6 a) ; 4 Hz, 1H:NH em 4); 6,72 (mf, 2H:H Aromáticos em 4 e) ; 7,15 4 5); de 7,15 a 7,35 (mt, 5H:H 8 e 1 Hz, 1H: 1' h4); 7,45 (dd, r J = 4 e 1 Hz, 1H:1' He) ; 8,40 10 Hz, 1H:NH em 1); 11,72 (s, EXEMPLO 33: Preparação dos derivados de fenilalanina e de ácido fenilpirúvico já descritos. A fenilalanina e os derivados 4-metoxifenilalanina, 4-bromofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-iodofenilalanina, 4-trifluorometilfenilalanina, 4-aminofenilalanina, 3-metoxifenilalanina utilizados, são comerciais.
Os seguintes derivados fenilalanina podem ser preparados de acordo com os métodos descritos na literatura. 105 4-Dimetilaminofenilalanina (RS) D. F. Elliott, A. T. Fuller, C. R. Harrington, J. Chem. Soc., 1948, 85-89. 4-Dietilaminofenilalanina (RS)
Moldaver B. L., Pushkareva Z. V., Zhur. Obshchei Khim. 31, 1560-1569 (1961); C.A. 1961, 22226f.; J. A Stock, J. Chem. Soc, 1959, 90-97 4-Etilaminofenilalanina (RS) F. Bergel, J.A. Stock, J. Chem. Soc, 1959, 90-97. 4-Fenilfenilalanina (RS) J. V. Braun, J. Nelles, Berichte, 66B, 193, 1464-1470. 4-Metilfenilalanina (RS) R. R., Herr, T. Enjoki, J. P. Dailey, J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4229-4231. 106 4-Metiltiofenilalanina (RS) e 4-Etiltiofenilalanina (R, S) R. L. Colescott, R. R. Herr, J. P. Dailey J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4232-4235. 4-Metoxicarbonilfenilalanina (RS) H. Cleland, J. Org.Chem., 1969, 34, 747. 2.4 Dimetilfenilalanina (RS) R. R., Herr, T. Enjoki, J. P. Dailey, J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4229-4231. 3.4 Dimetilfenilalanina (RS) RR., Herr, T. Enjoki, J.P. Dailey, J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4229-4231. 3- Trifluorometilfenilalanina (RS), cloridrato R. Filler e H. Novar, J. Org. Chem, 1960, 25, 733-736. 4- Aminometil fenilalanina (S) G. E. Stokker, W. F. Hoffman e C. F. Homnick, J. Org.Chem., 1993, 58, 5015-5017. 107 3- Metilfenilalanina (R,S) J. H Burckhalter, V. Stephens, J. A. C. S. 1951, 73, 56-58. 4-acetil-fenilalanina (R,S) J.I. Degaw et al., J. Med. Che., 1969, 11, 225-227 4-0-Alil tirosina (S) A. Loffet, H. Zang, Int. J. Pept. Protein Res. ,1993, 42, 346 4-0-Etil tirosina (S) Y. Sasaki et al., Chem. Pharm, Buli., 1982, 30, 4435 4-Etil fenilalanina (RS) A. Zhuze et al., Coll., Czech. Chem. Commmm., 1965, 62, 2648 O ácido 4-terc-butilfenilpirúvico pode ser preparado de acordo com R. Breslow, J. W. Canary, M. Varney, S. T. Waddell e D. Yang, J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 5212-5219. 108
Os outros derivados de fenilalanina foram preparados de acordo com os exemplos 34 a 42 indicados abaixo. Nestes exemplos, são realizadas cromatografias flash sob uma pressão de azoto média de 50 kPa, utilizando uma silica com granulometria 40-53 pm, de acordo com Still et al., J. Org. Chem., 43, 2923, (1978). EXEMPLO 34: Preparação de derivados de fenilalanina e de um derivado do ácido fenilpirúvico pelo método A.
34-1: 4-Metilaminofenilalanina (RS), dicloridrato
Adicionam-se 37 mL de ácido clorídrico 12 N a 3,70 g de N-acetil 4-metilaminofenilalaninato de metilo e a mistura é aquecida sob refluxo, sob agitação, durante 8 h. Após uma noite à temperatura ambiente, o meio de reacção é concentrado até à secura sob pressão reduzida (50 kPa), é retomado com uma mistura de 50 mL de tolueno e 50 mL de etanol, depois é novamente concentrado. Após secagem num excicador sob pressão reduzida (2,6 kPa), obtêm-se 4,18 g (100%) de dicloridrato de 109 4-metilaminofenilalanina (RS), sob a forma de um sólido bege claro higroscópico fundindo a 158 °C. 34-2: N-Acetil 4-metllamlnofenilalaninato de metilo (RS)
Adicionam-se 0,4 g de paládio em carvão a 10%, depois 50 mL de etanol absoluto a 4 g de 4-metilamino-2-acetamido-cinamato de metilo colocado sob atmosfera de azoto num autoclave. A mistura é colocada sob uma pressão de 5,5 bar de hidrogénio e é aquecida durnate 15 h a 50 °C sob agitação. Após estabilização da temperatura a 26 °C e retorno à pressão atmosférica, o meio de reacção é filtrado em Clareei®, é lavado com etanol, depois é concentrado até à secura sob pressão reduzida (2,6 kPa) . Obtêm-se deste modo 3,73 g de N-acetil 4-metilaminofenilalaninato de metilo, sob a forma de cristais brancos, fundindo a 118 °C. 34-3: 4-metilamino-2-acetamido-cinamato de metilo
Adicionam-se 5,75 g de 2-acetamido-acrilato de metilo, 0,185 g de acetato de paládio, 8,1 g de cloreto de tetrabutil amónio e 6,03 g de hidrogenocarbonato de sódio a um frasco de três entradas colocado sob azoto, depois adicionam-se a esta mistura 6,5 g de 4-iodo-N-metilanilina em solução em 200 mL de DMF. A mistura é aquecida durante 16 h 30 min a 82 °C, depois após arrefecimento é vertida em 1000 mL de água destilada. O meio é retomado com 250 mL de CH2C12, a fase orgânica é decantada e a fase aquosa é lavada 2 vezes com 250 mL de CH2C12. As fases orgânicas são reunidas, secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas sob pressão reduzida (50 kPa) a 70 °C para 110 originar um óleo castanho que é purificado por cromatografias flash (eluente AcOEt/ciclo-hexano, depois AcOEt puro).
Obtêm-se, deste modo, 4 g de 4-metilamino-2-acetamido-cinamato de metilo, sob a forma de um sólido amarelo (Sílica Merck 5719, Rf = 0,48) que é utilizado como tal. A N-metil-p-iodoanilina pode ser preparada de acordo com: S. Krishnamurthy, Tetrahedron Letters, 33, 3315-3318, 1982. 34-4: Ácido 4-metilamino-fenilpirúvico
Colocam-se 2,4 g de 4-metilamino-2-acetamido-cinamato de metilo e 32 mL de ácido clorídrico 12 N num balão. A mistura é aquecida, sob refluxo, durante 3 h, depois é arrefecida e é lavada 2 vezes com 20 mL de éter dietílico. A fase aquosa é arrefecida a -10 °C e o precipitado obtido é filtrado, depois é lavado com um mínimo de ácido clorídrico frio. O sólido obtido é seco num excicador sob pressão reduzida para originar 1,1 g de ácido 4-metilamino-fenilpirúvico sob a forma de um sólido bege claro fundindo a 210 °C. 34-5: 3-Fluoro-4-metilfenilalanina (R, S), cloridrato
Procedendo como no exemplo 34-1, mas a partir de 1,6 g de N-Acetil-(3—fluoro-4-metil)-fenilalaninato de metilo, obtêm-se 0,6 g de cloridrato de 3-fluoro-4-metilfenilalanina (R, S), sob a forma de cristais ), sob a a uma temperatura superior a 260 °C. 111 34-6: N-Acetil-(3-fluoro-4-metil)fenilalaninato de metilo (R,S)
Procedendo como no exemplo 34-2, mas a partir de 1,9 g de (4-metil-3-fluoro)-2-acetamido-cinamato de metilo, de 0,2 g de paládio em carvão a 10% em 230 mL de etanol, obtêm-se 1,6 g de N-acetil-(3-fluoro-4-metil)-fenilalaninato de metilo, sob a forma de um óleo incolor (Silica Merck 5719, Rf = 0,46; eluente CH2C12/AcOEt 50/50). 34-7: (3-fluoro-4-metil)-2-acetamido-cinamato de metilo
Procedendo como no exemplo 34-3, mas a partir de 3,6 g de 2-acetamido-acrilato de metilo, 0,12 g de acetato de paládio, 5,2 g de cloreto de tetrabutil amónio, 3,8 g de hidrogenocarbonato de sódio e 4 g 2-fluoro 4-bromo tolueno em solução em 120 mL de DMF anidro, obtêm-se 2,6 g de (3-fluoro-4-metil)-2-acetamido-cinamato de metilo, sob a forma de um sólido branco fundindo a 163 °C. 34-8: 4-Trifluorometoxifenilalanina (R, S), cloridrato ou O-trifluorometil tirosina, cloridrato (R, S)
Procedendo como no exemplo 34-1, mas a partir de 3 g de N-acetil-(4-trifluorometoxi)-fenilalaninato de metilo e 30 mL de ácido clorídrico 12 N, obtêm-se 1,5 g de cloridrato de 4-trifluorometoxi-fenilalanina (RS), sob a forma de cristais ), sob a a 260 °C. 112 34-9: N-Acetil-(4-trifluorometoxi)fenilalaninato de metilo (R, S)
Procedendo como no exemplo 34-2, mas a partir de 3,1 g de (4-trifluorometoxi)-2-acetamido-cinamato de metilo, de 0,3 g de paládio em carvão a 10% em 50 mL de etanol, obtêm-se 3 g de N-acetil-(4-trifluorometoxi)-fenilalaninato de metilo, sob a forma de um sólido branco fundindo a 80 °C. 34-10: 4-Trifluorometoxi 2-acetamido-cinamato de metilo
Procedendo como no exemplo 34-3, mas a partir de 4,3 g de 2-acetamido-acrilato de metilo, 0,14 g de acetato de paládio, 6,1 g de cloreto de tetrabutil amónio, 4,6 g de hidrogenocarbonato de sódio e 5 g de 4-trifluorometoxi-bromo-benzeno em solução em 150 mL de DMF anidro.
Obtêm-se 3,1 g de (4-trifluorometoxi) 2-acetamido-cinamato de metilo, sob a forma de um sólido branco fundindo a 135 °C. 34-11: 3-Metiltiofenilalanina (RS), cloridrato
Procedendo como no exemplo 34-1, mas a partir de 3,3 g de N-acetil-3-metiltio-fenilalaninato de metilo e 40 mL de ácido clorídrico 12 N, obtêm-se 1,38 g de cloridrato de 3-metiltio-fenilalanina (RS), sob a forma de cristais ), sob a a 190 °C. 113 34-12: N-Acetil-3-metiltio-fenilalaninato de metilo (RS)
Colocam-se 3,72 g de 3- -metiltio-2-acetamido- cinamato de metilo em solução em 100 mL de metanol e 30 mL de tetra-hidrofurano num balão, depois adicionam-se 1,4 g de magnésio. Após 20 min de reacção arrefece-se o meio com um banho de gelo, depois adicionam-se novamente 1,4 g de magnésio. A mistura é agitada à temperatura ambiente durante 18 h, é vertida em 1,4 1 de água destilada e 300 mL de CH2C12, depois é filtrada sobre Carcel®. A fase aquosa é ajustada para pH 6 por adição de ácido clorídrico 12 N, depois é decantada e é lavada com 100 mL de CH2C12. As fases orgânicas são reunidas, secas sobre sulfato de magnésio, são filtradas, depois são concentradas até à secura sob pressão reduzida para originar 3,42 g de N-acetil 3-metiltio-fenilalaninato de metilo, sob a forma de um óleo incolor (Sílica Merck 5719, Rf = 0,5; AcOEt). 34-13: 3-Metiltio-2-acetamido-cinamato de metilo
Procedendo como no exemplo 34-3, mas a partir de 5,6 g de 2-acetamido-acrilato de metilo, 0,18 g de acetato de paládio, 8,2 g de cloreto de tetrabutilamónio, 5,86 g de hidrogenocarbonato de sódio e 6,5 g de 3-iodo 1-metiltiobenzeno em solução em 160 mL de DMF anidro, obtêm-se 4,8 g de (3-metiltio)-2-acetamido-cinamato de metilo, sob a forma de um sólido branco fundindo a 139 °C. 114 34-14: 3-Iodometiltiobenzeno
Colocam-se sob agitação, num frasco de três entradas 20 mL de água destilada e 20 mL de ácido clorídrico 12 N, depois adicionam-se 10 mL de 3-metiltio-anilina através de uma ampola de adição. A mistura é aquecida para assegurar a dissolução, depois é arrefecida a 5 °C. Adicionam-se, em seguida, lentamente através de uma ampola de adição 5,86 g de nitrito de sódio em solução em 15 mL de água mantendo a temperatura entre 5 e 8 °C. São adicionada 13,57 g de iodeto de potássio em solução em 15 mL de água durante 10 min, 20 min após o final da adição, depois a mistura é agitada durante 15 h à temperatura ambiente. O óleo formado é separado da fase aquosa por decantação, depois é adicionado de uma solução aquosa de tiosulfato de sódio. A fase aquosa é decantada e o produto é extraído com 100 mL de diclorometano. A fase orgânica é lavada com 100 mL de água, a fase aquosa ajustada para pH 9 com hidróxido de sódio concentrado, depois é decantada. A fase orgânica é lavada 2 vezes com 100 mL de água, é decantada, seca sobre sulfato de magnésio, filtrada, depois é concentrada até à secura sob pressão reduzida (50 kPa) a 40 °C. O produto resultante é purificado por cromatografia flash (eluente ciclo-hexano) para originar 13 g de 3-iodo-l-metiltiobenzeno, sob a forma de um líquido amarelo (Sílica Merck 5719, Rf = 0,8/ciclo-hexano). 115 EXEMPLO 35: Preparação de derivados de fenilalanina pelo método B.
35-1: 4-terc-Butilfenilalanina (RS) São adicionadas 25 g de 4-(terc-butil) benzil-acetamidomalonato de dietilo e 250 mL de ácido clorídrico a 37% a um frasco de três entradas equipado com um sistema refrigerador. A mistura é agitada e é aquecida, sob refluxo, até deixar de haver emissão gasosa. Após o arrefecimento do meio de reacção o precipitado obtido é filtrado, depois é recristalizado em acetonitrilo para originar 25,6 g de cloridrato de 4-terc-butilfenilalanina (R, S), sob a forma de um sólido branco fundindo a 234 °C. (ver igualmente Journal of the Takeda
Research Laboratories Vol. 43; N°3/4, Dez 1984 p53-76). 116 35-2: 4-(terc butil) benzil-acetamidomalonato de dietilo São adicionadas sob atmosfera de azoto, 25 g de brometo de 4-terc-butil-benzilo, 50 mL de tolueno anidro e 3,1 g de hidreto de sódio em suspensão em óleo a 80%, depois 21,8 g de acetamido-malonato de dietilo, a um frasco de três entradas equipado com um sistema refrigerador. A mistura é aquecida a 110 °C durante 17 h. Após arrefecimento adicionam-se lentamente utilizando um ampola de adição, 15 mL de etanol absoluto, depois 15 mL de etanol a 5 0%, depois 50 mL de água. A fase orgânica é decantada e a fase aquosa é lavada 3 vezes com 50 mL de éter dietilico. As fases orgânicas são reunidas, são lavadas com água, depois são secas sobre sulfato de sódio. Após filtração e concentração sob pressão reduzida, o produto é cristalizado em éter de petróleo para originar 25 g de 4-(terc-butil)-benzil-acetamidomalonato de dietilo sob a forma de um sólido branco fundindo a 80 °C. 35-3: 3-Metilaminofenilalanina (R, S), dicloridrato
Procedendo como no exemplo 35-1, mas a partir de 1,17 g de 3-metilamino benzil-acetamidomalonato de dietilo e de 20 mL de ácido cloridrico 12 N, obtêm-se 1,03 g de um sólido amarelo bege. Este é dissolvido em 20 mL de etanol absoluto e é adicionado de 0,4 g de carvão animal. A solução é filtrada sobre Carcel®, depois é filtrada e é concentrada sob pressão reduzida (50 kPa). A mesma operação é reiniciada com 1 g de carvão animal e o sólido obtido é triturado em 20 mL de éter. Após filtração e secagem sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 50 °C, obtêm-se 0,65 g de dicloridrato de 3-metilaminofenilalanina (R, S), sob a forma de um pó branco fundindo próximo de 135 °C (decomposição). 117 35-4: 3-Metilamino benzil-acetamidomalonato de dietilo
Colocam-se 3,11 mL de anidrido acético num frasco de três entradas, mantido sob atmosfera de azoto. Adicionam-se, em seguida, durante 3 min a 0 °C, 1,51 mL de ácido de ácido fórmico, depois aquece-se a 50 °C durante 2 horas. Deixa-se a mistura regressar à temperatura ambiente agitando durante 3 h 20 e adicionam-se 4 mL de THF anidro sob azoto e arrefece-se a -20 °C. Adiciona-se durante 10 min, uma solução de 4 g de 3-aminobenzil-acetamidomalonato de dietilo numa mistura de 15 mL de THF anidro e de 15 mL de diclorometano anidro. A agitação é mantida durante 1 h e 10 min a -20 °C, depois a 20 °C durante 16 h. A mistura de reacção é concentrada até à secura sob pressão reduzida (50 kPa) a 30 °C, depois é coevaporada com 30 mL de tolueno anidro para originar um sólido branco que é dissolvido numa mistura de 10 mL de THF anidro e de 20 mL de dicloro 1,2 etano anidro, depois é colocado num frasco de três entradas sob azoto. O meio é arrefecido a -5 °C, depois são adicionados 1,55 mL de complexo borano-dimetilsulfureto (solução 2 M em THF) durante 10 min. Deixa-se o meio regressar à temperatura ambiente e a solução é aquecida durante 3 h, sob refluxo, depois é agitada durante 15 h à temperatura ambiente. O meio de reacção é arrefecido a 0 °C, depois adicionam-se 10 mL de MeOH, durante 25 min. Agita-se durante 45 min a 0 °C, depois durante 30 min à temperatura ambiente. Arrefece-se a 0 °C, depois faz-se
borbulhar HC1 gasoso até pH 2. Aquece-se durante 1 h sob refluxo, depois a mistura é concentrada até à secura sob pressão reduzida a 30 °C para originar 5 g de um produto que é retomado com 30 mL de uma solução aquosa de NaHC03 e 30 mL de CH2C12. A 118 fase orgânica é decantada e a fase aquosa é lavada com 20 mL de água. As fases orgânicas são reunidas, secas sobre sulfato de magnésio, são filtradas, depois são concentradas até à secura sob pressão reduzida (2,6 kPa) para originar 3,43 g de um óleo amarelo que é purificado por cromatografia flash (eluente AcOEt-ciclo-hexano 50/50). Obtêm-se deste modo após secagem sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 20 °C, 1,18 g de 3-metilamino- benzil-acetamidomalonato de dietilo sob a forma de um sólido bege claro fundindo a 122 °C. 35-5: 3-Aminobenzil-acetamidomalonato de dietilo O 3-amino-benzil-acetamidomalonato de dietilo pode ser preparado como descrito em: T. S. Osdene, D. N. Ward, W. H. Chapman e H. Rakoff, J. Am. Chem. Soc., 81, 1959, 3100-3102. 35-6: 3-Etilaminofenilalanina (R, S), dicloridrato
Procedendo como no exemplo 34-1, mas a partir de 2 g de N-acetil-3-etilamino-fenilalaninato de etilo (R, S) e 30 mL de ácido clorídrico 12 N, obtêm-se 1,7 g de dicloridrato de 3-etilamino fenilalanina (R, S), sob a forma de um sólido bege claro higroscópico contendo dicloridrato de 3-dietilamino-fenilalanina (R, S) 10% molar. 119 35-7: N-Acetil-3-etilamino-fenilalaninato de etilo (RS)
Colocam-se num balão sob atmosfera de azoto, 3 g de N-acetil-3-amino-fenilalaninato de etilo (R, S), 40 mL de etanol e 14 g de níquel de Raney lavado previamente com água destilada e etanol. A mistura é aquecida, sob refluxo, durante 19 h, é arrefecida, é filtrada sobre Carcel®, depois é concentrada até à secura sob pressão reduzida (50 kPa) para originar 3,07 g de um óleo incolor que é purificado por cromatografia flash (eluente AcOEt) para originar 2,1 g de N-acetil-3-etilamino-fenilalaninato de etilo (R, S), sob a forma de um óleo incolor (Sílica Merck 5719, Rf = 0,6: AcOEt) contendo N-acetil-3-dietilamino-fenilalaninato de etilo (R, S) a 10%. 35-8: N-acetil-3-amino-fenilalaninato de etilo (R.S) São colocadas 25 g de uma mistura de N-acetil-3-nitro-fenilalaninato de etilo (R, S) (75% mol./mol.) e de 3-nitro-benzil-acetamidomalonato de dietilo (25% mol./mol.) sob azoto num autoclave. Adicionam-se 2,5 g de paládio em carvão a 10%, depois 200 mL de diclorometano. A mistura é colocada sob uma pressão de 9 bar de hidrogénio, depois é agitada a 18 °C durante 4 h. Após o regresso à pressão atmosférica, o meio de reacção é filtrado em Clareei®, é lavado com diclorometano, depois é concentrado a seco sob pressão reduzida (50 kPa) para originar um sólido que é recristalizado em 450 mL de água destilada sob refluxo na presença de 4 g de carvão animal 3S. Após filtração a quente em Claroel® cristalização é deixada a 4 °C, os cristais são filtrados, depois são secos para originar 9,9 g de N-acetil-3-amino-fenilalaninato de etilo (R, S), sob a forma de um sólido 120 bege claro fundindo a 106 °C e contendo 3-amino benzil-acetamido-malonato de dietilo a 5%. 35-9: N-acetil-3-nitro-fenilalaninato de etilo (R, S) e 3-nitro-benzol-acetamidomalonato de dietilo. São colocados num frasco de três entradas equipado com um sistema refrigerador sob atmosfera de azoto, 600 mL de etanol absoluto, depois 7,9 g de sódio. Após dissolução total, adicionam-se 74,5 g de acetamido-malonato de dietilo, depois 60 g de cloreto de 4-nitro-benzilo em 200 mL de etanol anidro. A mistura é aquecida, sob refluxo, durante 16 h 30 min. Após arrefecimento o meio de reacção é concentrado sob pressão reduzida (50 kPa), depois é retomado com uma mistura de 500 mL de CH2C12 e 500 mL de água. O pH é ajustado para 7 por adição de ácido sulfúrico 0,5 N, depois a fase orgânica é decantada e a fase aquosa é lavada 2 vezes com 200 mL de CH2C12. As fases orgânicas são reunidas, lavadas com 200 mL de água saturada com bicarbonato de sódio, decantadas, depois são secas sobre sulfato de magnésio. Após filtração e concentração sob pressão reduzida (50 kPa), o produto é recristalizado em 600 mL de etanol sob refluxo para originar após cristalização à temperatura ambiente, filtração e secagem, 70,4 g de 3-nitro-benzil-acetamidomalonato de dietilo sob a forma de cristais ), sob a a 156 °C. As águas-mãe são concentradas, depois são purificadas por cromatografia flash (eluente AcOEt) para originar 25,6 g de uma mistura de N-acetil-3-nitro-fenilalaninato de etilo (75% mol/mol) e 3-nitro-benzil-acetamidomalonato de dietilo (25% mol/mol), sob a forma de um sólido bege claro utilizado como tal na etapa seguinte. 121 35-10: 3-Dimetilamino fenilalanina (R, S), dicloridrato
Procedendo como no exemplo 35-1, mas a partir de 0,72 g de N-acetil-3-dimetilamino-fenilalaninato de etilo (RS) e de 8,6 mL de ácido clorídrico 10 N, obtém-se após evaporação um sólido que é triturado em 50 mL de acetona, filtrado, depois é seco sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 40 °C. Obtêm-se 0,68 g (93%) de dicloridrato de 3-dimetilamino-fenilalanina (RS), sob a forma de um sólido branco fundindo próximo de 120 °C (decomposição). 35-11: N-acetil-3-dimetilamino-fenilalaninato de etilo (RS)
Colocam-se num frasco de três entradas sob atmosfera de azoto, 4 g de N-acetil-3-amino-fenilalaninato de etilo (RS), preparado como descrito no exemplo 35-8 em 15 mL de DMF e adicionam-se 5,5 mL de trietilamina, depois 2,5 mL de iodeto de metilo e 4 mL de diclorometano mantendo a temperatura próxima de 30 °C utilizando um banho de gelo. A mistura é, em seguida, aquecida durante 18 h a 35 °C. Adicionam-se então lentamente 1 mL de iodeto de metilo em solução em 1 mL de DMF mantendo a temperatura próxima de 30 °C, depois 2,2 mL de trietilamina, depois a mistura é aquecida durante mais 5 h a 35 °C. A mistura é levada novamente à temperatura ambiente, depois é extraída com 100 mL de acetato de etilo e 1501 de água destilada. A fase aquosa é decantada, depois é lavada novamente 2 vezes com 70 mL de acetato de etilo. As fases orgânicas são reunidas, são lavadas 2 vezes com 80 mL de água destilada, depois com 50 mL de água destilada saturada com NaCl. A fase orgânica é decantada, seca sobre sulfato de magnésio, é filtrada, depois é concentrada até à secura sob pressão reduzida para originar 2,4 g de um produto que é purificado por cromatografia flash (diclorometano, 122
MeOH 90/10). Obtêm-se deste modo 0,72 g (16%) de 3-N-acetil-3-dimetilamino-fenilalaninato de etilo (RS), sob a forma de cristais amarelos. EXEMPLO 36: Preparação de derivados de fenilalanina pelo método C.
36-1: 4-Isopropilfenilalanina (R, S)
Colocam-se num frasco de três entradas 7 g de fósforo vermelho e 8 g de 4-(isopropil-benzilideno)-2-metil 5-oxazolona em 45 mL de anidrido acético, depois adicionam-se 35 mL de ácido iodridico a 57% lentamente sob agitação utilizando uma ampola de adição. No final da adição a mistura é aquecida durante
3 h 30 min sob refluxo, depois é deixada durante 3 dias à temperatura ambiente. O meio de reacção é filtrado, o sólido obtido é lavado 2 vezes com 10 mL de ácido acético, depois o filtrado é concentrado até à secura sob pressão reduzida. O resíduo obtido é retomado com 100 mL de água destilada, é concentrado até à secura sob pressão reduzida para originar um sólido que é retomado em 50 mL de água destilada, depois é extraído 3 vezes com 50 mL de éter dietílico após a adição de 0,5 g de sulfito de sódio. O éter é decantado e a fase aquosa é colocada sob pressão reduzida para eliminar os vestígios de éter 123 dietílico. Adicionam-se 2 g de carvão animal à fase aquosa, aquece-se a 40-50 °C, filtra-se em Clareei®, depois lava-se com um minimo de água. O pH é ajustado para 5 por adição, a 4 °C, de amónia a 32%. O precipitado obtido é filtrado a frio, é lavado 2 vezes com 10 mL de água, 10 mL de etanol, depois 2 vezes com 10 mL de éter para originar após secagem sob pressão reduzida a 20 °C, 3,97 g de 4-isopropilfenilalanina (R, S), sob a forma de um sólido branco fundindo a uma temperatura superior a 260 °C. (ver igualmente Journal of the Takeda Research Laboratories Vol. 43; N°3/4, Dez 1984 p53-76). 36-2: 4-(isopropil-benzilideno)-2-metil 5-oxazolona
Colocam-se num balão munido de um sistema refrigerador, 18,52 g de N-acetilglicina, 10,6 g de acetato de sódio, 20 mL de 4-isopropilbenzaldeido e 57 mL de anidrido acético. Agita-se durante 30 min, depois a mistura é agitada durante lha 110 °C, depois durante 15 h à temperatura ambiente. O meio de reacção é vertido em 600 mL de água e 400 mL de éter de petróleo aquecido previamente a 50 °C. A fase orgânica é decantada e a fase aquosa é lavada 2 vezes com 150 mL de éter de petróleo.
As fases orgânicas são reunidas, secas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas sob pressão reduzida até 100 mL e à obtenção de um precipitado. Este é filtrado, é lavado 2 vezes com 50 mL de pentano para originar 8,2 g de 4-(isopropil-benzilideno)-2-metil-5-oxazolona sob a forma de um sólido amarelo fundindo a 77 °c. 124 36-3: 4-butilfenilalanina (R, S)
Procedendo como no exemplo 36-1, mas a partir de 1,49 g de fósforo vermelho, de 1,8 g 4-(butil-benzilideno)-2-metil-5-oxazolona em 9,23 mL de anidrido acético e 7,39 mL de ácido iodridico com 57%, obtêm-se 0,35 g de 4-butilf enilalanina (R, S), sob a forma de um sólido bege claro fundindo a uma temperatura superior a 260 °C. 36-4: 4-(bulil-benzilideno)-2-metil 5-oxazolona
Procedendo como no exemplo 36-2, mas a partir de 8,43 g de N-acetilglicina, 4,92 g de acetato de sódio, 9,8 g de 4-butilbenzaldeído e 26 mL de anidrido acético, obtêm-se 1,89 g de 4-(butil-benzilideno)-2-metil 5-oxazolona, sob a forma de um sólido amarelo fundindo a 74 °C. EXEMPLO 37: Preparação de um derivado de fenilalanina pelo método D. 37-1: 3-Etoxi fenilalanina (R, S), cloridrato (ou 3-0-
Etiltirosina (R, S), cloridrato)
Coloca-se num balão 1 g de N-terc-butoxi carbonil 3-etoxi fenilalanina (R, S) em solução em 3,6 mL de dioxano clorídrico, depois a mistura é agitada durante 5 h à temperatura ambiente. 0 precipitado formado é filtrado, lavado com dioxano, depois com éter, depois é seco sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 40 °C para originar 0,65 g de 3-etoxi fenilalanina (R, S), cloridrato sob a forma de um sólido branco fundindo a 200 °C. 125 37-2: N-terc Butoxi carbonil 3-etoxi fenilalanina (R, S)
Colocam-se num balão 1,33 g de N-terc-butoxí-carbonil 3-etoxi-fenilalaninato de etilo (R, S) em solução em 8 mL de metanol, depois adicionam-se 8 mL de hidróxido de sódio 1 N. Após 18 h de agitação à temperatura ambiente, a mistura é evaporada sob pressão reduzida, depois é acidificada com 8,56 mL de ácido clorídrico 1 N. 0 produto é extraído 2 vezes com 10 mL de acetato de etilo, as fases orgânicas são reunidas, são lavadas 2 vezes com 10 mL de água, são secas por filtração, depois são concentradas até à secura sob pressão reduzida para originar 1 g de N-terc-butoxi-carbonil 3-etoxi fenilalanina (R, S), sob a forma de um óleo amarelo (Sílica Merck 5719, Rf = 0,7, eluente: tolueno 80/MeOH 10/dietilamina 10). 37-3: N-terc-Butoxi carbonil 3-etoxi-fenilalaninato de etilo (R, S)
Colocam-se num frasco de três entradas sob atmosfera de azoto, 1,5 g de N-terc-butoxi-carbonil 3-tirosina (R, S) em solução em 7,5 mL de DMF seco, depois adicionam-se 0,508 g de hidreto de sódio a 50% em óleo. Após 2 h de agitação à temperatura ambiente adicionam-se 0,86 mL de iodoetano, depois a mistura é agitada durante 4 h à temperatura ambiente. O meio é filtrado, o sólido resultante é lavado 3 vezes com 10 mL de água, depois 2 vezes com 10 mL de éter de petróleo para originar após secagem sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 30 °C, 1,33 g de N-terc-butoxi-carbonil 3-etoxi-fenilalaninato de etilo (R, S), sob a forma de um sólido branco. 126 37-4: N-terc-Butoxi carbonil 3-tirosina (R.S)
Colocam-se sob agitação num frasco de três entradas, 18 g de 3-tirosina (R, S) em solução em 180 mL de dioxano, depois adicionam-se 99 mL de hidróxido de sódio 1 N, depois 26 g de di-terc butil dicarbonato em solução em 160 mL de dioxano. Após 36 h de agitação o meio é concentrado sob pressão reduzida a 30 °C, é retomado com 100 mL de água destilada, é acidificado com ácido clorídrico 1 N até pH 5, depois é extraído 2 vezes com 200 mL de acetato de etilo. A fase orgânica é seca sobre sulfato de magnésio, é filtrada, depois é concentrada até à secura sob pressão reduzida a 30 °C, para originar 30 g de N-terc-butoxi carbonil 3-tirosina (R, S), sob a forma de um sólido branco (Sílica Merck 5719, Rf = 0,25, eluente: tolueno 80, MeOH 10, dietilamina 10) . EXEMPLO 38: Preparação de derivados de fenilalanina pelo método E. 38-1: 4-Dialilaminofenilalanina (RS), dicloridrato
Procedendo como no exemplo 35-1, mas a partir de 5,8 g de 4-dialilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo e de 48 mL de ácido clorídrico 10 N, obtém-se após evaporação um sólido que é triturado em 50 mL de acetona, filtrado, depois é triturado em 10 mL de diclorometano, filtrado, depois é lavado 3 vezes com 10 mL de éter de etilo. Após secagem sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 40 °C, obtêm-se 4,41 g de dicloridrato de 4-dialilaminofenilalanina (RS), sob a forma de um sólido esbranquiçado fundindo próximo de 135 °C (decomposição). 127 38-2: 4-Alilaminofenilalanina (RS), dicloridrato
Procedendo como no exemplo 35-1, mas a partir de 3,27 g de 4-alilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo e 30 mL de ácido clorídrico 10 N, obtém-se após evaporação um sólido que é triturado em 50 mL de acetona, é filtrado, depois é seco sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 40 °C. Obtêm-se 2,3 g de dicloridrato de 4-alilaminofenilalanina (RS), sob a forma de um sólido branco fundindo próximo de 134 °C (decomposição). 38-3: 4-Dialilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo e 4-Alilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo
Colocam-se num frasco de três entradas equipado com um ampola de adição e mantido sob atmosfera de azoto 10 g de 4-aminobenzilacetamidomalonato de dietilo em solução em 150 mL de DMF. Adicionam-se lentamente à temperatura ambiente, 6,57 mL de brometo de alilo, depois 10,76 mL de trietilamina sob agitação. Após 19 h sob agitação adicionam-se novamente, 1,31 mL de brometo de alilo e 2,15 mL de trietilamina e esta mistura é agitada durante 26 h. O meio de reacção é vertido em 1,51 de água destilada e é extraído com 11 de acetato de etilo. A fase aquosa é decantada, é lavada 2 vezes com 500 mL de acetato de etilo. As fases orgânicas são reunidas, são lavadas com 500 mL de água destilada, depois com 500 mL de água saturada com cloreto de sódio, são decantadas, secas sobre sulfato de magnésio, filtradas, depois são concentradas até à secura originar um óleo castanho que é purificado por cromatografia flash (eluente CH2CI2 90/AcOEt 10) para originar 6,66 g de 4-dialilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo sob a forma de uma bege fundindo sólida a 94-96 °C (Rf =0,6 AcOEt 128 50/ciclo-hexano 50) e 3,49 g de 4-alilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo sob a forma de um sólido bege fundindo a 104-106 °C (Rf = 0,45 AcOEt 50/ciclo-hexano 50) O 4-aminobenzil-acetamido-malonato de dietilo pode ser preparado como descrito em j. b. Burckhalter, VC Stephens, J. Am. Chem. Soc., 56, 1951, 73.
EXEMPLO 39: Preparação de derivados de fenilalanina pelo método F
R 129 39-1: 4-Etilisopropil fenilalanina (RS), dicloridrato
Procedendo como no exemplo 35-1, mas a partir de 2,9 g de 4-etilisopropilbenzil-acetamido-malonato de dietilo e 24,6 mL de ácido clorídrico 10 N, obtém-se após evaporação um sólido que é triturado em 20 mL de acetona, filtrado, depois é seco sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 40 °C. Obtêm-se 2 g de dicloridrato de 4-etilisopropilaminofenilalanina (RS), sob a forma de um sólido branco fundindo próximo de 147 °C (decomposição). 39-2: 4-Etilisopropil-aminobenzil-acetamido-malonato de dietilo
Colocam-se num frasco de três entradas, mantido sob atmosfera de azoto, 15 g de 4-etil-aminobenzilacetamido-malonato de dietilo em 70 mL de THF, adicionam-se 6,4 mL de 2-iodopropano, depois 8,4 mL de 1,5-diazabiciclo[4-3-0]non-5-eno, depois a mistura é aquecida durante 24 h a 60 °C. Adicionam-se então 2,13 mL de 2-iodopropano, depois 8,4 mL de 1,5-diazabiciclo[4-3-0]non-5-eno, depois a mistura é aquecida durante mais 24 h a 60 °C. A mistura é levada novamente à temperatura ambiente, depois é extraída com 50 mL de diclorometano e 50 mL de água destilada. A fase aquosa é decantada, depois é lavada novamente 2 vezes com 30 mL de diclorometano. As fases orgânicas são reunidas, são lavadas com 60 mL de água destilada, depois com 50 mL de água destilada saturada com NaCl. A fase orgânica é decantada, seca sobre sulfato de magnésio, é filtrada, depois concentrada até à secura sob pressão reduzida para originar 16,2 g de um produto que é purificado por cromatografia flash (diclorometano, MeOH 90/10). Obtêm-se deste modo 4,59 g de um produto que é 130 recristalizado em 45 mL de ciclo-hexano para originar 3,44 g de 4-etilisopropil-aminobenzil-acetamido-malonato de dietilo sob a forma de cristais ), sob a a 80 °C. 39-3: 4-Etilaminobenzilacetamido-malonato de dietilo O 4-etil-aminobenzilacetamido-malonato de dietilo pode ser preparado procedendo como no exemplo 35-7, mas a partir de 22 g de 4-aminobenzil-acetamidomalonato de dietilo, 500 mL de etanol e 70 g de niquel de raney. Obtêm-se deste modo, 23,8 g de 4-etilamino benzilacetamido-malonato de dietilo, sob a forma de um sólido esbranquiçado fundindo a 136 °C. 39-4: 4-Alil-etilaminofenilalanina (R, S), dicloridrato
Procedendo como no exemplo 35-1, mas a partir de 4,54 g de etilbenzil-4-alil-acetamido-malonato de dietilo e 37,9 mL de ácido clorídrico 10 N, obtém-se após evaporação um sólido que é seco sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 40 °C. Obtêm-se 3,67 g de dicloridrato de 4-alil-etilaminofenilalanina (RS), sob a forma de um sólido castanho fundindo próximo de 130 °C (decomposição). 39-5: 4-Alil-etilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo
Procedendo como no exemplo 39-2, mas a partir de 8 g de 4-etilaminobenzilacetamido-malonato de dietilo, 4 mL de brometo de alilo, 5,82 mL de 1,5-diazabiciclo [4-3-0] non-5-eno, em 50 mL de THF, obtêm-se após purificação por cromatografia flash (eluente CH2Cl2/AcOEt 90-10 em volume) 5,6 g de um sólido que é 131 recristalizado em 35 mL de ciclo-hexano. Obtêm-se deste modo 5,43 g de 4-alil-etilaminobenzilo-acetamido-malonato de dietilo sob a forma de um sólido branco fundindo a 86 °C. 39-6: 4-etilo propilaminofenilalanina (RS), dicloridrato
Procedendo como no exemplo 35-1, mas a partir de 2,5 g de 4-etil pcopilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo e 21 mL de ácido clorídrico 10 N, obtém-se após evaporação um sólido que é seco sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 40 °C. Obtêm-se 2 g (97%) de dicloridrato de 4-etil propilaminofenilalanina (RS), sob a forma de um sólido branco fundindo próximo de 147 °C (decomposição). 39-7: 4-Etil propilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo
Procedendo como no exemplo 39-2, mas a partir de 10 g de 4-etilaminobenzilacetamido-malonato de dietilo, 5,6 mL de 1-iodo propano, 7,2 mL de 1,5-diazabiciclo[4-3-0]non-5-eno, em 70 mL de THF, obtêm-se após 36 horas de reacção após purificação por cromatografia flash (eluente CH2Cl2/MeOH 97-3 em volume), 2,8 g de um sólido que é recristalizado em 26 mL de ciclo-hexano. Obtêm-se deste modo 2,9 g de 4-etil-propilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo sob a forma de um sólido branco fundindo a 84-86 °C. 132 39-8: 4-etil metilciclopropilaminofenilalanina (RS) dicloridrato
Procedendo como no exemplo 35-1, mas a partir de 3 g de 4-etil metilciclopropilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo e 25 mL de ácido clorídrico 10 N, obtêm-se após 3 dias de reacção, após evaporação um sólido que é triturado em 40 mL de acetona, é filtrado, depois é seco sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 40 °C. Obtêm-se 2,24 g de dicloridrato de 4-etil metilciclopropilaminofenilalanina (RS), sob a forma de um sólido branco fundindo próximo de 140 °C (decomposição). 39-9: 4-etil metilciclopropilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo
Procedendo como no exemplo 39-2, mas a partir de 8 g de 4-etilaminobenzilacetamido-malonato de dietilo, 2,6 mL de bromometilciclopropano, 2,97 mL de 1,5-diazabiciclo[4-3-0]non-5-eno, em 50 mL de THF, obtêm-se após 3 dias de reacção após purificação por cromatografia flash (eluente CH2Cl2/AcOEt 90-10 em volume), 3,3 g de 4-etil-metilciclopropilaminobenzil-acetamido-malonato de dietilo sob a forma de um sólido branco fundindo a 112-114 °C. 133
EXEMPLO 40: Preparação de derivados de fenilalanina pelo método G o o.
40-1: 4-(1-pirrolidinil) fenilalanina (RS) dicloridrato
Procedendo como no exemplo 35-1, mas a partir de 1,5 g de 4-(1-pirrolidinil)-benzil-acetamidomalonato de dietilo e 40 mL de ácido clorídrico 5 N, obtém-se após evaporação um sólido que é triturado em 15 mL de acetona, filtrado, depois é seco sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 40 °C. Obtêm-se 0,6 g de dicloridrato de 4-(1-pirrolidinil) fenilalanina (RS), sob a forma de um sólido esbranquiçado. 40-2: 4-(1-pirrolidinil)-benzil-acetamidomalonato de dietilo
Colocam-se num autoclave 4 g de 4-(1-pirrolil)-benzil-acetamidomalonato de dietilo em solução em 100 mL de MeOH e 1 g 134 de paládio em carvão a 10%. Após se ter purgado 3 vezes com azoto, o produto é hidrogenado sob uma pressão de 14 bar de hidrogénio a 19 °C. Após 25 horas da agitação, a hidrogenação é inactivada, o produto é filtrado em Clareei®, é lavado com diclorometano, depois a solução é concentrada sob pressão reduzida para originar 3,85 g de um sólido que é triturado numa mistura de 50 mL de heptano e 10 mL de éter etilico. O sólido obtido é filtrado, seco, depois é purificado por cromatografia flash (eluente CH2Cl2/acetona 90/10 em volume) para originar 1,6 g de 4-(1-pirrolidinil)-benzil-acetamidomalonato de dietilo sob a forma de um sólido branco fundindo a 132 °C. 40-3: 4-(1-pirrolil) benzil-acetamidomalonato de dietilo
Colocam-se num frasco de três entradas, mantido sob azoto, 4,6 g de 4-aminobenzil-acetamidomalonato de dietilo em 104 mL de ácido acético. Adicionam-se 7,02 g de acetato de sódio, depois 1,87 mL de 2,5-dimetoxitetra-hidrofurano. A mistura é aquecida a 65 °C durante 1 h 15 min, arrefecida, depois é extraída com 100 mL de diclorometano e 100 mL de água destilada. A fase aquosa é decantada, depois é lavada 3 vezes com 100 mL de diclorometano. As fases orgânicas são reunidas, são lavadas com 100 mL de água, depois com 100 mL de uma solução saturada com NaCl, são decantadas, depois são secas sobre sulfato de magnésio, filtradas, depois são evaporadas até à secura sob pressão reduzida (50 K Pa) para originar 6,2 g de um sólido que é purificado por cromatografia flash (eluente CH2Cl2/acetona 75/25 em volume). Obtêm-se deste modo 3,57 g de 4-(1-pirrolil)-benzil-acetamidomalonato de dietilo sob a forma de um sólido bege fundindo a 110 °C. 135
EXEMPLO 41: Preparação de derivados de fenilalanina pelo método H 41-1: 4-Etiltiometil fenilalanina (RS)
Colocam-se num frasco de três entradas, mantido sob azoto, 300 mL de metanol anidro, depois adicionam-se sob agitação 1,72 g de metilato de sódio, depois 5,55 mL de etil mercaptano. O solvente é concentrado sob pressão reduzida a 40 °C para originar 8,5 g de sal de sódio de etilmercaptano que são colocadas em solução em 100 mL de THF anidro. Adicionam-se à temperatura ambiente 3,6 g de 4-clorometil-fenilalanina (RS), depois a mistura é aquecida, sob refluxo, durante 18 h. O solvente é evaporado sob pressão reduzida a 40 °C e o residuo é retomado com 100 mL de água destilada. A solução turva obtida é acidificada com 5 mL de ácido acético. O precipitado obtido é filtrado, é lavado com água destilada, depois é seco a 60 °C) C sob pressão reduzida para originar 3,6 g de um sólido que é purificado por cromatografia flash (eluente AcOEt 60, AcOH 12, água 10) . Obtêm-se deste modo 256 mg de 4-etiltiometil-fenilalanina (RS), sob a forma de um sólido branco fundindo a 251 °C. A 4-clorometil fenilalanina (RS) pode ser obtida por analogia com a 4-clorometil-fenilalanina (S) descrita em:RGonzalez-Muniz, F. Cornille, F. Bergemn, D. Ficheux, J. Pothier, C. Durieux e B. Roques, Int. J. Pept. Protein. Res., 1991, 37 (41), 331-340. 136
EXEMPLO 42: Preparação de derivados de fenilalanina pelo método I 42-1: 4-0- tirosina (2-Cloroetil) (S), cloridrato
Colocam-se num balão, 5 g de N-terc-butoxi carbonil-4-0-(2-cloroetil) tirosina (S) em solução em 50 mL de dioxano clorídrico. Após 28 h, sob agitação, a mistura é concentrada até à secura sob pressão reduzida. 0 resíduo obtido é retomado com 50 mL de éter, é agitado, depois é filtrado. 0 sólido obtido é lavado 2 vezes com 25 mL de éter, é seco sob pressão reduzida para originar 1,58 g de cloridrato de 4-0-(2-cloroetil)tirosina (S), sob a forma de um sólido branco fundindo a 260 °C. 42-2: N-terc-butoxi carbonil-4-Ο-(2-cloroetil) tirosina (S)
Colocam-se num frasco de três entradas sob atmosfera de azoto, 14 g de N-terc-butoxicarbonil tirosina (S), em solução em 140 mL de DMF. Adicionam-se lentamente 4,8 g de hidreto de sódio a 50% em óleo com uma espátula. Após 2 h, sob agitação, à temperatura ambiente, adicionam-se 16,87 g de 1-tosil 2-cloroetanol. Após 2 dias de agitação adicionam-se 2,4 g hidreto de sódio a 50% em óleo e mais 8,4 mL de 1-tosil 2-cloroetanol. A mesma operação é realizada após 24 h e a agitação é mantida durante mais 24 h. A reacção é inactivada por adição de 100 mL de água destilada e a mistura de reacção é concentrada até à secura sob pressão reduzida. O resíduo obtido é retomado com 100 mL de água destilada, depois é extraído 3 vezes com 100 mL de acetato de etilo. A fase aquosa é decantada, é acidificada com 50 mL de HC1 1 N a pH3 e o produto é extraído 3 vezes com 100 mL de acetato de etilo. As fases 137 orgânicas são reunidas, são lavadas 2 vezes com 50 mL de água, são decantadas, são secas sobre sulfato de magnésio, são filtradas, depois são concentradas até à secura sob pressão reduzida para originar 13,51 g de N-terc-butoxi carbonil-4-Ο-(2-cloroetil)tirosina (S), sob a forma de um óleo castanho (Rf 0,5, tolueno 70%/metanol a 20%/dietilamina a 10%/) utilizado como tal na etapa seguinte.
TABELA V
MICRORGANISMOS
ANTIBIÓTICOS FUNGOS Micromonospora sp. S TREP TOMYCES S. alborectus S. conganensis (ATCC13528) S. diastaticus S. graminofascians S. griseus (NRRL2426) S. griseoviridus S. griseoviridus (FERMP3562) S. lavendulae S. loidensis (ATCC11415) S. mitakaensis (ATCC15297) S. olivaceus (ATCC12019) S. ostreogriseus (ATCC27455) S. pristinaespiralis (ATCC25486) S. virginiae (ATCC13161)
Vernamicinas
Virginiamicinas F1370 A, B Plauracinas, Estreptograrninas Estreptograminas Viridogriseína (Etamicina) Griseoviridina Neoviridogriseínas Etamicinas Vernamicinas Micamicinas Sinergistinas (PA114 A, B) Ostreogricinas Pristinamicinas Virginiamicinas (Estafilomicinas) 138 (continuação) MICRORGANISMOS ANTIBIÓTICOS ACTINOMYCETES A. auranticolor (ATCC31011) Plauracinas A. azureus (ATCC31157) Plauracinas A. daghestanicus Etamicina A. philippinensis A-2315 A, B, C Actinoplanes sp. (ATCC33002) A15104 Actinoplanes sp. AI7002 A, B, C, F Actinomaduraflava Madumicinas
Abreviaturas utilizadas:
AcOEt acetato de etilo ADN: ácido desoxirribonucleico AMP: 5'-monofosfato de adenosina CH2CI2: diclorometano CLHP: cromatografia liquida de elevado desempenho dCTP 5'trifosfato desoxi-citosina DMF dimetilformamida DMPAPA 4-dimetilamino-L-fenilalanina HC1 ácido clorídrico HT7 meio sólido de Hickey Tresner 3-HPA ácido 3-hidroxipicolínico IPTG isopropil β-D-tiogalactopiranósido kb: quilobase LB: Meio de Luria (meio de crescimento rico para E. coli)
MeOH metanol 139 MMPAPA 4-metilamino-L-fenilalanina NaOH hidróxido de sódio PAPA 4-amino-L-fenilalanina PEG Polietilenoglicol P I Pristinamicina I P II Pristinamicina II pb: par de bases SAM: S-adenosilmetionina TE: tampão Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5 THF tetra-hidrofurano Tris: amino-2-hidroxilmetil-2-propanodiol-l,3 U.V. : raios ultravioleta x-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indoil-p-D-galactósido YEME : meio de extracto de levedura - extracto de malte (meio de crescimento rico para Streptomyces)
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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: RHÔNE-POULENC RORER S.A. (B) RUA: Avenida Raymond ARON, 20
(C) CIDADE: ANTONY
(E) PAÍS: FRANCE (F) CÓDIGO POSTAL: 92165 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: NOVAS ESTREPTOGRAMINAS E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE ESTREPTOGRAMINAS POR MUTASSÍNTESE. (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 8 142 (iv) FORMA DE LEITURA POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Fita (B) COMPUTADOR: IBM PC Compatível
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS- DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1.0 # 1.0, Versão #1.25 (OEB) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2888 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 143 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 1: 10 20 30 40 50 60
CTGCAGTTCC CCGGGGCCAC CGTGCTCAGC TCCTCACCCG AACGGTTCCT GCGCATCGGC 70 80 90 100 110 120
GCGGACGGCT GGGCGGAGTC CAAACCCATC AAGGGCACCC GCCCCCGCGG CGCCGGCCCC 130 140 150 160 170 180
GCCCAGGACG CCGCCGTCAA GGCCTCCCTC GCCGCGGCCG AGAAGGACCG CAGCGAGAAC 190 200 210 220 230 240
CTGATGATCG TCGACCTGGT CCGCAACGAC CTCGGCCAGG TCTGCGACAT CGGCTCCGTC 250 260 270 280 290 300
CACGTACCGG GCCTGTTCGA GGTGGAGACC TACGCCACCG TCCACCAGCT CGTCAGCACG 310 320 330 340 350 360
GTCCGCGGCC GCCTGGCGGC CGACGTCTCC CGCCCCCGCG CGGTACGGGC CGCCTTCCCC 370 380 390 400 410 420
GGCGGGTCGA TGACCGGCGC GCCCAAGGTC CGCACCATGC AGTTCATCGA CCGGCTCGAG 430 440 450 460 470 480
AAGGGCCCGC GCGGCGTGTA CTCGGGCGCG CTGGGCTACT TCGCCCTCAG CGGCGCGGCC 490 500 510 520 530 540
GACCTCAGCA TCGTCATCCG CACCATCGTC GCCACCGAGG AGGCCGCCAC CATCGGCGTG 550 560 570 580 590 600
GGCGGCGCCG TCGTCGCCCT GTCCGACCCC GACGACGAGG TCCGCGAAAT GCTCCTCAAG 610 620 630 640 650 660
GCGCAGACCA CCCTCGCCGC CCTGCGCCAG GCACACGCGG GCGCCACCGC CTCGGACCGT 670 680 690 700 710 720
GAACTCCTGG CCGGCAGCCT GCGGTGACCC ACCCACCGCC CCACCCCGGC CACCGCAACC 730 740 750 760 770 780
CCGGCTCACC CCCGGGGCGG CCGCGCGCGG TGCCGCCCGG CGGCCGACCC GGCGACGGGT 790 800 810 820 830 840
CCGCTCGCGG ACCGGGTGAC GGACCCGGCG GCGGGGCCGG CGGCGGGCCG GGACGTGGGC 850 860 870 880 890 900
CGGGACGTGG GCCCGGCGTC CCCGGCGACC GGCACGGCGG CGGGCCCGGA CGTGGGCCCG 910 920 930 940 950 960
GCGTGCCCGG CGACCGGCAC GGTGGCGGGG CGGGGCGGGG GACGGTCAGT GCAGGGCGGT 970 980 990 1000 1010 1020
GAACATCCGC GCGCACAGCC GTTCCAGCTC CGCGCCGTGC TCGCCCAGCA CACCGCGCAG 1030 1040 1050 1060 1070 1080
TTCGGCGAAC AGGGCGGCGA ACGTCTCCTC GTCGCCCCTC TCGACGGCCT GCCCCAGCCG 1090 1100 1110 1120 1130 1140
CACCAGGCCG CGGCCCAGCG CCTGCCGCGC GGCCGGCGCG CCGGGGTTGG CGGCCTGGAT 1150 1160 1170 1180 1190 1200
GTCGAAATAC ACCTCCGGCG TCCCGCCGGC GATCCGGGCC AGCAGCGCCA GCATCGCCAG 1210 1220 1230 1240 1250 1260
ATGCGGCGGC GGGGCACTGT CCCGCAGCGC CCCCACGTCC ACCGACAGCT CACCCAGGCC 1270 1280 1290 1300 1310 1320
CAGCCCGAAG GCCAGCACCG CGGCATGCGT GGCGGCCTGC TGCGCGGCGG TCAGCTCGTC 144
1330 1340 1350 1360 1370 1380 GTGCCGCCGC GCCGGCATCT CCACCACCCG GGCCCCCCAC CCGGCCACCA GCTCCACCAG 1390 1400 1410 1420 1430 1440 GGCCCGCACA CCGGGCCCGT CGGTGACCAC CACCGCCGCC ACCGGCCGCC CCTGAAGACC 1450 1460 1470 1480 1490 1500 CAGCGAGCGG GCGAACATCG GGTTCAGCCC CACCGCCTGC AGCCCCGGCG CCGCCTCACG 1510 1520 1530 1540 1550 1560 CAGCCGCCCG GCGATCCGGC TCTTGACCGA CAAGGTGTCC GCGAGCACCG CACCGGGCCG 1570 1580 1590 1600 1610 1620 CATCACCCCC GCCAGCACCT CCACCGCCTC CCACGCCACC GGCTCCGGCA CCGCCAGCAC 1630 1640 1650 1660 1670 1680 CACCACGTCC GCCGCCGCCA GCGCCGCGAC CGCCTCCGGC CCCGGCCGCC GCACATCACC 1690 1700 1710 1720 1730 1740 GGCCACCACC CGCACCCCGT CCGCCGCACC GGCCCCGGCC ACGTCCAGCC AGGTCACCGC 1750 1760 1770 1780 1790 1800 CACCCCCGAA CGCACCAGCC AGTGGCTGAA CATGCGGCCC ACCGCACCGG CCCCGCCCAC 1810 1820 1830 1840 1850 1860 CACCACACAA CGCCCGAACA CCGAACCACC CCTCATCCGC GTTCCCGATC CCCCCGGTAC 1870 1880 1890 1900 1910 1920 GGAGGAAGAA CCATGACCCC GCCCGCCATC CCCGCCGCCC CGCCCGCCAC CGGGCCCGCC 1930 1940 1950 1960 1970 1980 CCCGCCACCG ACCCCCTCGA CGCGCTGCGC GCCCGCCTGG ACGCCGCGGA CGCCGCCCTG 1990 2000 2010 2020 2030 2040 CTGGACGCCG TCCGCACACG CCTGGACATC TGCCTGCGCA TCGGCGAGTA CAAGCGCCTC 2050 2060 2070 2080 2090 2100 GACCAGGTGC CGATGATGCA GCCCCACCGG ATCGCCCAGG TCCACGCCAA CGCCGCCCGC 2110 2120 2130 2140 2150 2160 TACGCCGCCG ACCACGGCAT CGACCCCGCC TTCCTGCGCA CCCTGTACGA CACGATCATC 2170 2180 2190 2200 2210 2220 ACCGAGACCT GCCGCCTCGA GGACGAGTGG ATCGCCTCCG GCGGCGCCCC CGTCCCCACG 2230 2240 2250 2260 2270 2280 CCCGTGCACG CGTCCGCGTC CGCGCGGGGG GCCGTGTCGT GACCGCCGCC GCACCCACCC 2290 2300 2310 2320 2330 2340 TCGCCCAGGC GCTGGACGAG GCCACCGGGC AGCTGACCGG CGCCGGGATC ACCGCCGACG 2350 2360 2370 2380 2390 2400 CCGCCCGGGC CGACACCCGG CTGCTGGCCG CCCACGCCTG CCAGGTCGCC CCGGGGGACC 2410 2420 2430 2440 2450 2460 TCGACACCTG CCTGGCCGGC CCGGTGCCGC CCCGGTTCTG GCACTACGTC CGGCGCCGTC 2470 2480 2490 2500 2510 2520 TGACCCGCGA ACCCGCCGAA CGCATCGTCG GCCACGCCTA CTTCATGGGC CACCGCTTCG 2530 2540 2550 2560 2570 2580 ACCTGGCCCC CGGCGTCTTC GTCCCCAAAC CCGAGACCGA GGAGATCACC CGGGACGCCA 2590 2600 2610 2620 2630 2640 TCGCCCGCCT GGAGGCCCTC GTCCGCCGCG GCACCACCGC ACCCCTGGTC GTCGACCTGT 145
2650 2660 2670 2680 2690 2700 GCGCCGGACC GGGCACCATG GCCGTCACCC TGGCCCGCCA CGTACCGGCC GCCCGCGTCC 2710 2720 2730 2740 2750 2760 TGGGCATCGA ACTCTCCCAG GCCGCCGCCC GCGCCGCCCG GCGCAACGCC CGCGGCACCG 2770 2780 2790 2600 2810 2820 GCGCCCGCAT CGTGCAGGGC GACGCCCGCG ACGCCTTCCC CGAACTGAGC GGCACCGTCG 2830 2840 2850 2860 2870 2880 ACCTCGTCGT CACCAACCCG CCCTACATCC CCATCGGACT GCGCACCTCC GCACCCGAAG
TGCTCGAG (3) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 2: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 888 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 2
ATG AGG GGT GGT TCG GTG TTC GGG CGT TGT GTG GTG GTG GGC GGG GCC GGT GCG
Met Arg Gly Gly Ser Vai Phe Gly Arg Cys Vai Vai Vai Gly Gly Ala Gly Ala
GTG GGC CGC ATG TTC AGC CAC TGG CTG GTG CGT TCG GGG GTG GCG GTG ACC TGG
Vai Gly Arg Met Phe Ser His Trp Leu Vai Arg Ser Gly Vai Ala Vai Thr Trp
CTG GAC GTG GCC GGG GCC GGT GCG GCG GAC GGG GTG CGG GTG GTG GCC GGT GAT
Leu Asp Vai Ala Gly Ala Gly Ala Ala Asp Gly Vai Arg Vai Vai Ala Gly Asp 54 18 108 36 162 54 146 GTG CGG CGG CCG GGG CCG GAG GCG GTC GCG GCG CTG GCG GCG GCG GAC GTG GTG 216 Vai Arg Arg Pro Gly Pro Glu Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asp val val 72 GTG O o GCG GTG CCG GAG CCG GTG GCG TGG GAG GCG GTG GAG GTG CTG GCG GGG 270 Vai Leu Ala Val Pro Glu Pro Val Ala Trp Glu Ala val Glu Val Leu Ala Gly 90 GTG ATG CGG CCC GGT GCG GTG CTC GCG GAC ACC TTG TCG GTC AAG AGC CGG ATC 324 Vai Met Arg Pro Gly Ala Val Leu Ala Asp Thr Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile 108 GCC GGG CGG CTG CGT GAG GCG GCG CCG GCG CTG CAG GCG GTG GGG CTG AAC CCG 378 Ala Gly Arg Leu Arg Glu Ala Ala Pro Gly Leu Gin Ala Val Gly Leu Asn Pro 126 ATG TTC GCC CCC TCG CTG GGT CTT CAG GGG CGG CCG GTG GCG GCG GTG GTG GTC 432 Met Phe Ala Pro Ser Leu Gly Leu Gin Gly Arg Pro val Ala Ala Val val val 144 ACC GAC GGG CCC GGT GTG CGG GCC CTG GTG GAG CTG GTG GCC GGG TGG GGG GCC 486 Thr Asp Gly Pro Gly Val Arg Ala Leu Val Glu Leu Val Ala Gly Trp Gly Ala 162 CGG GTG GTG GAG ATG CCG GCG CGG CGG CAC GAC GAG CTG ACC GCC GCG CAG CAG 540 Arg Vai val Glu Met Pro Ala Arg Arg His Asp Glu Leu Thr Ala Ala Gin Gin 180 GCC GCC ACG CAT GCC GCG GTG CTG GCC TTC GGG CTG GGC CTG GGT GAG CTG TCG 594 Ala Ala Thr His Ala Ala Val Leu Ala Phe Gly Leu Gly Leu Gly Glu Leu Ser 198 GTG GAC GTG GGG GCG CTG CGG GAC AGT GCC CCG CCG CCG CAT 1 CTG i GCG ; ATG CTG 648 Vai ASp val Gly Ala Leu Arg Asp Ser Ala Pro Pro Pro HiS Leu . Ala . Met Leu 216 GCG CTG CTG GCC CGG ATC GCC GGC GGG ACG CCG GAG GTG TAT ’ TTC : GAC 1 ATC CAG 702 Ala Leu Leu Ala Arg Ile Ala Gly Gly Thr Pro Glu Val Tyr Phe ! Asp i Ile Gin 234 GCC GCC AAC CCC GGC GCG CCG GCC GCG CGG CAG GCG CTG GGC CGC : GGC ! CTG GTG 756 Ala Ala Asn Pro Gly Ala Pro Ala Ala Arg Gin Ala Leu Gly Arg t Gly Leu val 252 CGG CTG GGG CAG GCC GTC GAG AGG GGC GAC GAG GAG ACG TTC GCC : gcc : ctg ttc 810 Arg Leu Gly Gin Ala Val Glu Arg Gly Asp Glu Glu Thr Phe Ala i Ala . Leu Phe 270 GCC GAA CTG CGC GGT GTG CTG GGC GAG CAC GGC GCG GAG CTG GAA . CGG ! CTG TGC 864 Ala Glu Leu Arg Gly Val Leu Gly Glu HiS Gly Ala Glu Leu . Glu l Arg i Leu Cys 2B8 GCG CGG ATG TTC ACC GCC CTG CAC 888 Ala Arg Met Phe Thr Ala Leu His 296 (4) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 387 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 147 (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 3 ATG ACC CCG CCC GCC ATC CCC GCC GCC CCG CCC GCC ACC GGG CCC GCC CCC GCC 54
Met Thr Pro Pro Ala Ile Pro Ala Ala Pro Pro Ala Thr Gly Pro Ala Ala Ala 18 ACC GAC CCC CTC GAC GCG CTG CGC GCC CGC CTG GAC GCC GCG GAC GCC GCC CTG 108
Thr Asp Pro Leu Asp Ala Leu Arg Ala Arg Leu Asp Ala Ala Asp Ala Ala Leu 36 CTG GAC GCC GTC CGC ACA CGC CTG GAC ATC TGC CTG CGC ATC GGC GAG TAC AAG 162
Leu Asp Ala vai Arg Thr Arg Leu Asp Ile Cys Leu Arg Ile Gly Glu Tyr Lys 54 CGC CTC CAC CAG GTG CCG ATG ATG CAG CCC CAC CGG ATC GCC CAG GTC CAC GCC 216
Arg Leu His Gin Vai Pro Met Met Gin Pro His Arg Ile Ala Gin Vai His Ala 72 AAC GCC GCC CGC TAC GCC GCC GAC CAC GGC ATC GAC CCC GCC TTC CTG CGC ACC 270
Asn Ala Ala Arg Tyr Ala Ala Asp His Gly Ile Asp Pro Ala Phe Leu Arg Thr 90 CTG TAC GAC ACG ATC ATC ACC GAG ACC TGC CGC CTC GAG GAC GAG TGG ATC GCC 324
Leu Tyr Asp Thr Ile Ile Thr Glu Thr Cys Arg Leu Glu Asp Glu Trp Ile Ala 108 TCC GGC GGC GCC CCC GTC CCC ACG CCC GTG CAC GCG TCC GCG TCC GCG CGG GGG 378
Ser Gly Gly Ala Pro Vai Pro Thr Pro Vai His Ala Ser Ala Ser Ala Arg Gly 126 GCC GTG TCG 387
Ala Vai Ser 129 (5) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4496 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 148 (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N°: 4 10 20 30 40 50 60
CTCGAGCAGG TGCCCCACCT CGGCGGCACG GTGCGCGCGC AGCGCGAACA CCGCCAGCGC 70 80 90 100 110 120
GCCCAGACGG AACAGCGCGA AGCACACCGC GACGAACTCG GGCGTGTTCG GCAGCTGCAC 130 140 150 160 170 180
CAGCACCCGC TCGCCGGCGC CGATCCCGCG CGCCGCGAAC CCCGCCGCCA GCCGGTCGCA 190 200 210 220 230 240
CCAGCGGTCC AGGGCACGGT AGGTGACACG GGAGCACCCG TCCGCGCCGA CCAGCGCCTC 250 260 270 280 290 300
CCGCTCGCCG TACTGCTCCG CCCAGCGGCC CAGCAGCATG CCCAGCGGCT CGCCCCGCCA 310 320 330 340 350 360
GTAGCCGGCC GCCCGGTACT TCGCGGCCAC ATCCTCGGGC CAGGGAACGC ATCCGTCCAG 370 380 390 400 410 420
CATCGTTGGT CCTTTCCGGC TTCGTCCTCG CGTCGCGCCC AGTGTCGGCA GCGCCGTTGA 430 440 450 460 470 480
CACGCCGCTG ATGCGCCGCG CCCGCGCGCC GCCGCTCCGT CAGGAGCCGA TCAGGGCGGC 490 500 510 520 530 540
GTCAGCCGGG CCGGACAGGA TGCCGCCCAC GGGGCCCGGC ACACCGGGCC GCGGCGACAG 550 560 570 580 590 600
CGGGCCGGCG ACCGGCAGGC CGACACCACG CACGGACGAG AAGAAACAAC ACAAGGGGAG 610 620 630 640 650 660
CACCCGATGG AGACCTGGGT CCTGGGCCGG CGCGACGTCG CCGAGGTGGT GGCCGCCGTC 670 680 690 700 710 720
GGCCGCGACG AACTCATGCG CCGCATÇATC GACCGCCTCA CCGGCGGACT GGCCGAGATC 730 740 750 760 770 780 GGCCGCGGCG AGCGGCACCT gtccccgctg CGCGGGGGAC TGGAACGCAG cgaacccgtg 149
790 800 810 820 830 840 CCCGGCATCT GGGAATGGAT GCCGCACCGC GAACCCGGCG ACCACATCAC CCTCAAGACC 850 860 870 880 890 900 GTCGGCTACA GCCCCGCCAA CCCCGGCCGC TTCGGCCTGC CGACCATCCT GGGCACCGTC 910 920 930 940 950 960 GCCCGCTACG ACGACACCAC CGGCGCCCTG ACCGCCCTGA TGGACGGCGT GCTGCTCACC 970 980 990 1000 1010 1020 GCCCTGCGCA CCGGCGCCGC CTCCGCCGTC GCCTCCCGCC TGCTGGCCCG CCCCGACAGC 1030 1040 1050 1060 1070 1080 CACACCCTGG GACTGATCGG CACCGGCGCC CAGGCCGTCA CCCAACTGCA CGCCCTGTCC 1090 1100 1110 1120 1130 1140 CTGGTACTGC CCCTGCAACG GGCCCTGGTG TGGGACACCG ACCCCGCCCA CCGGGAAAGC 1150 1160 1170 1180 1190 1200 TTCGCCCGGC GCGCCGCGTT CACCGGCGTC AGCGTCGAGA TCGCCGAGCC CGCCCGGATC 1210 1220 1230 1240 1250 1260 GCCGCCGAGG CCGACGTCAT CTCCACCGCC ACCTCGGTAG CCGTCGGCCA GGGCCCGGTC 1270 1280 1290 1300 1310 1320 CTGCCCGACA CCGGCGTCCG CGAGCACCTG CACATCAACG CCGTCGGCGC GGACCTCGTC 1330 1340 1350 1360 1370 1380 GGCAAGACGG AACTGCCGCT CGGCCTGCTC GAGCGGGCGT TCGTCACCGC CGACCACCCC 1390 1400 1410 1420 1430 1440 GAGCAGGCGC TGCGCGAGGG CGAGTGCCAG CAACTCTCCG CCGACCGGCT CGGCCCGCAG 1450 1460 1470 1480 1490 1500 CTGGCCCACC TGTGCGCCGA CCCGGCGGCC GCCGCCGGCC GGCAGGACAC CCTGAGCGTC 1510 1520 1530 1540 1550 1560 TTCGACTCCA CCGGCTTCGC CTTCGAGGAC GCCCTGGCGA TGGAAGTGTT CCTCGAGGCC 1570 1580 1590 1600 1610 1620 GCCGCCGAAC Gggacctggg CATCCGGGTG GGCATCGAAC ACCACCCCGG CGACGCCCTG 1630 1640 1650 1660 1670 1680 GACCCCTACG CCCTCCAGCC CCTGCCCCTG CCCCTGGCCG CCCCCGCCCA CTGACCCCCC 1690 1700 1710 1720 1730 1740 CCTTTTTTCG GGACCCCCGC TCTTTTTCGA GACCCCCGCC CGGCCGGCCC GGCCCTCCTC 1750 1760 1770 1780 1790 1800 CCGCCGGCCC CCATGCCCGC CCGGGCCGGG GCACCCACGA CGCCCTCGCG AGGAGAGAGA 1810 1820 1830 1840 1850 1860 TGCCCCCCAC CCCCCGGCCC ACCACCGACG ACGGCGGCCG TGAACTGCTC GCCTGGCTGC 1870 1880 1890 1900 1910 1920 GCGAGATGCG CCACCACCAC CCCGTCCACG AGGACGAATA CGGTGCCTTC ÇACGTCTTCC 1930 1940 1950 1960 1970 1980 GGCACGCCGA CGTCCTCACC GTCGCCTCCG ACCCCGGCGT CTACTCCTCC CAGCTCAGCC 1990 2000 2010 2020 2030 2040 GGCTACGGCC CGGCTCCCAG GCGTTGAGCG AACAGATCCT GTCGGTCATC GACCCGCCGA 2050 2060 2070 2080 2090 2100 TGCACCGCAC CCTGCGCCGC CTGGTCAGCC AGGCCTTCAC CCCCCGCACC GTCGCCGACC 150
2110 2120 2130 2140 2150 2160 TCGAACCACG CGTCACCGAA CTGGCCGGGC AACTGCTCGA CGCCGTCGAC GGCGACACGT 2170 2180 2190 2200 2210 2220 TCGACCTCGT CGCCGACTTC GCCTACCCGC TGCCCGTGAT CGTGATCGCC GAACTCCTCG 2230 2240 2250 2260 2270 2280 GCGTGCCGCC CGCCGACCGC ACCCTGTTCC GCTCCTGGTC CGACCGGATG CTGCAGATCC 2290 2300 2310 2320 2330 2340 AGGTCGCCGA CCCGGCGGAC ATGCAGTTCG GCGACGACGC CGACGAGGAC TACCAACGCC 2350 2360 2370 2380 2390 2400 TCGTCAAAGA ACCCATGCGC GCCATGCACG CCTACCTCCA CGACCACGTC ACCGACCGCC 2410 2420 2430 2440 2450 2460 GCGCCCGCCC CGCGAACGAC CTGATCTCCG CACTCGTCGC CGCCCGCGTG GAGGGCGAAC 2470 2480 2490 2500 2510 2520 GACTCACCGA CGAGCAGATC GTCGAATTCG GGGCGCTGCT GCTGATGGCC GGCCACGTCT 2530 2540 2550 2560 2570 2580 CCACCTCCAT GCTGCTCGGC AACACCGTGC TGTGCCTGAA GGACCACCCC CGGGCCGAGG 2590 2600 2610 2620 2630 2640 CCGCCGCCCG CGCCGACCGG TCCCTGATCC CCGCCCTGAT CGAAGAAGTA CTGCGGCTGC 2650 2660 2670 2680 2690 2700 GGCCGCCGAT CACCGTCATG GCCCGCGTCA CCACCAAGGA CACCGTCCTC GCCGGCACCA 2710 2720 2730 2740 2750 2760 CCATCCCCGC CGGACGCATG GTCGTGCCCT CCCTGCTGTC CGCCAACCAC GACGAACAGG 2770 2780 2790 2800 2810 2820 TCTTCACCGA CCCCGACCAC CTCGACCTCG CCCGCGAAGG CCGCCAGATC GCCTTCGGCC 2830 2840 2850 2860 2870 2880 ACGGCATCCA CTACTGCCTG GGCGCCCCGC TCGCCCGCCT GGAGGGCCGC ATCGCCCTGG 2890 2900 2910 2920 2930 2940 AAGCCCTCTT CGACCGATTC CCCGACTTCT CGCCCACCGA CGGCGCAAAA CTGCGCTACC 2950 2960 2970 2980 2990 3000 accgcgacgg ACTGTTCGGC GTCAAGAACC TGCCGCTGAC CGTACGGCGC GGCTGACACA 3010 3020 3030 3040 3050 3060 GACAAGGGGG CCACCTGGTG CGCACCGTGC GAACCCTGCT GATCGACAAC TACGACTCGT 3070 3080 3090 3100 3110 3120 TCACCTACAA CCTCTTCCAG ATGCTGGCCG AGGTGAACGG CGCCGCTCCG CTCGTCGTCC 3130 3140 3150 3160 3170 3180 GCAACGACGA CACCCGCACC TGGCAGGCCC TGGCGCCGGG CGACTTCGAC AACGTCGTCG 3190 3200 3210 3220 3230 3240 TCTCACCCGG CCCCGGCCAC CCCGCCACCG ACACCGACCT GGGCCTCAGC CGCCGGGTGA 3250 3260 3270 3280 3290 3300 TCACCGAATG GGACCTGCCG CTGCTCGGGG TGTGCCTGGG CCACCAGCCC CTGTGCCTGC 3310 3320 3330 3340 3350 3360 TCGCCGGCGC CGCCGTCGTC CACGCACCCG AACCCTTTCA CGGCCGCACC AGCGACATCC 3370 3380 3390 3400 3410 3420 GCCACGACGG GCAGGGCCTG TTCGCGAACA TCCCCTCCCC GCTGACCGTG GTCCGCTACC 151
3430 3440 3450 3460 3470 3480 ACTCGCTGAC CGTCCGGCAA CTGCCCGCCG ACCTGCGCGC CACCGCCCAC ACCGCCGACG 3490 3500 3510 3520 3530 3540 GGCAGCTGAT GGCCGTCGCC CACCGCCACC TGCCCCGCTT CGGCGTGCAG TTCCACCCCG 3550 3560 3570 3580 3590 3600 AATCGATCAG CAGCGAACAC GGCCACCGGA TGCTCGCCAA CTTCCGCGAC CTGTCCCTGC 3610 3620 3630 3640 3650 3660 GCGCGGCCGG CCACCGCCCC CCGCACACCG AACGCATACC CGCACCCGCA CCCGCCCCCG 3670 3680 3690 3700 3710 3720 CCCCCGCCCC CGCACCGGCA CCGCCCGCGT CCGCGCCGGT GGGGGAGTAC CGGCTGCATG 3730 3740 3750 3760 3770 3780 TGCGCGAGGT CGCCTGCGTG CCCGACGCGG ACGCCGCGTT CACCGCCCTG TTCGCCGACG 3790 3800 3810 3820 3830 3840 CCCCGGCCCG GTTCTGGCTC GACAGCAGCC GCGTCGAGCC GGGCCTCGCC CGCTTCACCT 3850 3860 3870 3880 3890 3900 TCCTCGGCGC CCCCGCCGGC CCGCTCGGCG AACAGATCAC CTACGACGTC GCCGACCGGG 3910 3920 3930 3940 3950 3960 CCGTGCGCGT CAAGGACGGT TCAGGCGGCG AGACCCGCCG GCCCGGCACC CtcttCGACC 3970 3980 3990 4000 4010 4020 ACCTGGAACA CGAACTGGCC GCCCGCGCCC TGCCCGCCAC CGGCCTGCCC TTCGAGTTCA 4030 4040 4050 4060 4070 4080 ACCTCGGCTA CGTCGGCTAC CTCGGCTACG AGACCAAGGC CGACAGCGGC GGCGAGGACG 4090 4100 4110 4120 4130 4140 CCCACCGCGG CGAACTGCCC GACGGCGCCT TCATGTTCGC CGACCGGATG CTCGCCCTCG 4150 4160 4170 4180 4190 4200 ACCACGAACA GGGGCGGGCC TGGCTCCTGG CACTGAGCAG CACCCGACGG CCCGCCACCG 4210 4220 4230 4240 4250 4260 CACCCGCCGC CGAACGCTGG CTCACCGACG CCGCCCGGAC CCTCGCCACC ACCGCCCCCC 4270 4280 4290 4300 4310 4320 GCCCGCCCTT CACCCTGCTG CCCGACGACC AACTGCCCGC CCTGGACGTC CACTACCGCC 4330 4340 4350 4360 4370 4380 ACAGCCTGCC CCGCTACCGG GAACTGGTCG AGGAATGCCG CCGCCTGATC ACCGACGGCG 4390 4400 4410 4420 4430 4440 AGACCTACGA GGTGTGCCTG ACGAACATGC TCCGGGTGCC CGGCCGGATC GACCCGCTCA 4450 4460 4470 4480 4490 CCGCCTACCG CGCCCTGCGC ACCGTCAGCC CCGCCCCCTA CGCCGCCTAC CTGCAG (6) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 5: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 1065 pares de bases 152 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 5 ATG GAG ACC TGG GTC CTG GGC CGG CGC GAC GTC GCC GAG GTG GTG GCC GCC GTC 54 Met Glu Thr Trp Vai Leu Gly Arg Arg ASP Val Ala Glu Val Val Ala Ala Val 18 GGC CGC GAC GAA CTC ATG CGC CGC ATC ATC GAC CGC CTC ACC GGC GGA CTG GCC 108 Gly Arg ASp Glu Leu Met Arg Arg ile Ile Asp Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala 36 GAG ATC GGC CGC GGC GAG CGG CAC CTG TCC CCG CTG CGC GGC GGA CTG GAA CGC 162 Glu Ile Gly Arg Gly Glu Arg His Leu Ser Pro Leu Arg Gly Gly Leu Glu Arg 54 AGC GAA CCC GTG CCC GGC ATC TGG GAA TGG ATG CCG CAC CGC GAA CCC GGC GAC 216 Ser Glu Pro Vai Pro Gly Ile Trp Glu Trp Met Pro His Arg Glu Pro Gly Asp 72 CAC ATC ACC CTC AAG ACC GTC GGC TAC AGC CCC GCC AAC CCC GGC CGC TTC GGC 270 His Ile Thr Leu Lys Thr Vai Gly Tyr Ser Pro Ala Asn Pro Gly Arg Phe Gly 90 CTG CCG ACC ATC CTG GGC ACC GTC GCC CGC TAC GAC GAC ACC ACC GGC GCC CTG 324 Leu Pro Thr Ile Leu Gly Thr Vai Ala Arg Tyr Asp Asp Thr Thr Gly Ala Leu 108 ACC GCC CTG ATG GAC GGC GTG CTG CTC ACC GCC CTG CGC ACC GGC GCC GCC TCC 378 Thr Ala Leu Met Αερ Gly Vai Leu Leu Thr Ala Leu Arg Thr Gly Ala Ala Ser 126 GCC GTC GCC TCC CGC CTG CTG GCC CGC CCC GAC AGC CAC ACC CTG GGA CTG ATC 432 Ala Vai Ala Ser Arg Leu Leu Ala Arg Pro Asp Ser His Thr Leu Gly Leu Ile 144 GGC ACC GGC GCC CAG GCC GTC ACC CAA CTG CAC GCC CTG TCC CTG GTA CTG CCC 486 Gly Thr Gly Ala Gin Ala Vai Thr Gin Leu HiS Ala Leu Ser Leu Val Leu Pro 162 CTG CAA CGG GCC CTG GTG TGG GAC ACC GAC CCC GCC CAC CGG GAA AGC TTC GCC 540 Leu Gin Arg Ala Leu Vai Trp Asp Thr Asp Pro Ala His Arg Glu Ser Phe Ala 180 CGG CGC GCC GCG TTC ACC GGC GTC AGC GTC GAG ATC GCC GAG CCC GCC CGG ATC 594 Arg Arg Ala Ala Phe Thr Gly val Ser Val Glu ile Ala Glu Pro Ala Arg Ile 198 GCC GCC GAG GCC GAC GTC ATC TCC ACC GCC ACC TCG GTA GCC GTC GGC CAG GGC 648 Ala Ala Glu Ala Asp Vai Ile Ser Thr Ala Thr Ser Val Ala Val Gly Gin Gly 216 153 CCG GTC CTG CCC GAC ACC GGC GTC CGC GAG CAC CTG CAC ATC AAC GCC GTC GGC 702 Pro Vai Leu Pro Asp Thr Gly Vai Arg Glu His Leu His Ile Asn Ala Val Gly 234 GCG GAC CTC GTC GGC AAG ACG GAA CTG CCG CTC GGC CTG CTC GAG CGG GCG TTC 756 Ala Asp Leu Vai Gly LyS Thr Glu Leu Pro Leu Gly Leu Leu Glu Arg Ala Phe 252 GTC ACC GCC GAC CAC CCC GAG CAG GCG CTG CGC GAG GGC GAG TGC CAG CAA CTC 810 Vai Thr Ala Asp Hls Pro Glu Gin Ala Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gin Gin Leu 270 TCC GCC GAC CGG CTC GGC CCG CAG CTG GCC CAC CTG TGC GCC GAC CCG GCG GCC 864 Ser Ala ASP Arg Leu Gly Pro Gin Leu Ala His Leu Cys Ala Asp Pro Ala Ala 286 GCC GCC GGC CGG CAG GAC ACC CTG AGC GTC TTC GAC TCC ACC GGC TTC GCC TTC 918 Ala Ala Gly Arg Gin Asp Thr Leu Ser Val Phe Asp Ser Thr Gly Phe Ala Phe 306 GAG GAC GCC CTG GCG ATG GAA GTG TTC CTC GAG GCC GCC GCC GAA CGG GAC CTG 972 Glu ASp Ala Leu Ala Met Glu val Phe Leu Glu Ala Ala Ala Glu Arg Asp Leu 324 GGC ATC CGG GTG GGC ATC GAA CAC CAC CCC GGC GAC GCC CTG GAC CCC TAC GCC 1026 Gly Ile Arg Vai Gly Ile Glu His Hls Pro Gly Asp Ala Leu Asp Pro Tyr Ala 342 CTC CAG CCC CTG CCC CTG CCC CTG GCC GCC CCC GCC CAC 1065 Leu Gin Pro Leu Pro Leu Pro Leu Ala Ala Pro Ala His 355 (7) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1194 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 154 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 6 ATG CCC CCC ACC CCC CGG CCC ACC ACC GAC GAC GGC GGC CGT GAA CTG CTC GCC 54 Met Pro Pro Thr Pro Arg Pro Thr Thr Asp Asp Gly Gly Arg Glu Leu Leu Ala 18 TGG CTG CGC GAG ATG CGC CAC CAC CAC CCC GTC CAC GAG GAC GAA TAC GGT GCC 108 Trp Leu Arg Glu Met Arg HiS His His Pro val His Glu Asp Glu Tyr Gly Ala 36 TTC CAC GTC TTC CGG CAC GCC GAC GTC CTC ACC GTC GCC TCC GAC CCC GGC GTC 162 Phe Hls Vai Phe Arg His Ala Asp Vai Leu Thr Val Ala Ser Asp Pro Gly Val 54 TAC TCC TCC CAG CTC AGC CGG CTA CGG CCC GGC TCC CAG GCG TTG AGC GAA CAG 216 Tyr Ser Ser Gin Leu Ser Arg Leu Arg Pro Gly Ser Gin Ala Leu Ser Glu Gin 72 ATC CTG TCG GTC ATC GAC CCG CCG ATG CAC CGC ACC CTG CGC CGC CTG GTC AGC 270 Ile Leu Ser Vai Ile Asp Pro Pro Met His Arg Thr Leu Arg Arg Leu Val Ser 90 CAG GCC TTC ACC CCC CGC ACC GTC GCC GAC CTC GAA CCA CGC GTC ACC GAA CTG 324 Gin Ala Phe Thr Pro Arg Thr Vai Ala Asp Leu Glu Pro Arg Val Thr Glu Leu 108 GCC GGG CAA CTG CTC GAC GCC GTC GAC GGC GAC ACG TTC GAC CTC GTC GCC GAC 378 Ala Gly Gin Leu Leu Asp Ala Vai Asp Gly Asp Thr Phe Asp Leu Val Ala Asp 126 TTC GCC TAC CCG CTG CCC GTG ATC GTG ATC GCC GAA CTC CTC GGC GTG CCG CCC 432 Phe Ala Tyr Pro Leu Pro Vai Ile Vai Ile Ala Glu Leu Leu Gly Val Pro Pro 144 GCC GAC CGC ACC CTG TTC CGC TCC TGG TCC GAC CGG ATG CTG CAG ATG CAG GTC 486 Ala Asp Arg Thr Leu Phe Arg Ser Trp Ser Asp Arg Met Leu Gin Met Gin Val 162 GCC GAC CCG GCG GAC ATG CAG TTC GGC GAC GAC GCC GAC GAG GAC TAC CAA CGC 540 Ala ASp Pro Ala Asp Met Gin Phe Gly Asp Asp Ala ASp Glu Asp Tyr Gin Arg 180 CTC GTC AAA GAA CCC ATG CGC GCC ATG CAC GCC TAC CTC CAC GAC CAC GTC ACC 594 Leu Vai Lys Glu Pro Met Arg Ala Met HiS Ala Tyr Leu His Asp His Val Thr 198 GAC CGC CGC GCC CGC CCC GCG AAC GAC CTG ATC TCC GCA CTC GTC GCC GCC CGC 648 ASp Arg Arg Ala Arg Pro Ala Asn Asp Leu Ile Ser Ala Leu val Ala Ala Arg 216 GTG GAG GGC GAA CGA CTC ACC GAC GAG CAG ATC GTC GAA TTC GGG GCG CTG CTG 702 Vai Glu Gly Glu Arg Leu Thr ASp Glu Gin Ile Val Glu Phe Gly Ala Leu Leu 234 CTG ATG GCC GGC CAC GTC TCC ACC TCC ATG CTG CTC GGC AAC ACC GTG CTG TGC 756 Leu Met Ala Gly His Vai Ser Thr Ser Met Leu Leu Gly Asn Thr val Leu Cys 252 CTG AAG GAC CAC CCC CGG GCC GAG GCC GCC GCC CGC GCC GAC CGG TCC CTG ATC 810 Leu Lys Asp His Pro Arg Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala Asp Arg Ser Leu Ile 270 CCC GCC CTG ATC GAA GAA GTA CTG CGG CTG CGG CCG CCG ATC ACC GTC ATG GCC 864 Pro Ala Leu He Glu Glu Vai Leu Arg Leu Arg Pro Pro ile Thr val Met Ala 288 155 CGC GTC ACC ACC AAG GAC ACC GTC CTC GCC GGC ACC ACC ATC CCC GCC GGA CGC 918
Arg Vai Thr Thr Lys Asp Thr Vai Leu Ala Gly Thr Thr Ile Pro Ala Gly Arg 306 ATG GTC GTG CCC TCC CTG CTG TCC GCC AAC CAC GAC GAA CAG GTC TTC ACC GAC 972
Met Vai Vai Pro Ser Leu Leu Ser Ala Asn Kís Asp Glu Gin Vai Phe Thr Asp 324 CCC GAC CAC CTC GAC CTC GCC CGC GAA GGC CGC CAG ATC GCC TTC GGC CAC GGC 1026
Pro Asp His Leu Asp Leu Ala Arg Glu Gly Arg Gin Ile Ala Phe Gly His Gly 342 ATC CAC TAC TGC CTG GGC GCC CCG CTC GCC CGC CTG GAG GGC CGC ATC GCC CTG 1080
Ile His Tyr Cys Leu Gly Ala Pro Leu Ala Arg Leu Glu Gly Arg Ile Ala Leu 360 GAA GCC CTC TTC GAC CGA TTC CCC GAC TTC TCG CCC ACC GAC GGC GCA AAA CTG 1134
Glu Ala Leu Phe Asp Arg Phe Pro Asp Phe Ser Pro Thr Asp Gly Ala Lys Leu 378 CGC TAC CAC CGC GAC GGA CTG TTC GGC GTC AAG AAC CTG CCG CTG ACC GTA CGG 1188
Arg Tyr His Arg Asp Gly Leu Phe Gly Vai Lys Asn Leu Pro Leu Thr Vai Arg 396 CGC GGC 1194
Arg Gly 398 (8) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1561 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) tipo de cadeia: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 156 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N°: 7
10 20 30 40 50 60 AAGCTTCCCG ACCGGGTGGA GG1CGTCGAC GCGTTCCCGC TGACCGGCCT CAACAAGGTC 70 80 90 100 110 120 GACAAGAAGG CCCTGGCGGC CGACATCGCC GCCAAGACCG CCCCCACCCG CCCCACCACC 130 140 150 160 170 180 GCCGGCCACG GCCCGACCAC GGACGGCGAT ACGGCCGGTG GGGGTGGGTC CGCGGGCGGG 190 200 210 220 230 240 GTGACGGCCG I CCGGTGGCGG GCGGGAGGAG GCGGCGTGAG CGGGCCCGGG CCCGAGGGCG 250 i 260 270 280 290 300 GCTACCGGGT GCCGTTCGCG CGACGCGGTT CGGTGGTGGG CGAGGCGGAC CTGGCGGCGC 310 320 330 340 350 360 TGGGCGAACT GGTCCGCTCG GGCCGGTCGC TGACGTCGGG GGTGTGGCGG GAGCGGTTCG 370 380 390 400 410 420 AGGAACAGTT CGCCCGCCTG ACCGGCGCCC GGCACGCGCT CAGTGTCACC AGCGGCACCG 430 440 450 460 470 480 TCGCGCTGGA ACTGGCGGTG CGGATGCTGG ACCTGGCGCC GGGCGACGAG GTGATCGCCA 490 500 510 520 530 540 CCCCGCAGAC GTTCCAGGCG ACGGTGCAGC CGCTGCTCGA CCACGACGTG CGGCTGCGGT 550 560 570 580 590 600 TCTGCGACAT CGACCCGGAC ACCCTCAACC TCGACCCGGC GGTGCTGGAG ACGCTGATCA 610 620 630 640 650 660 CCGACCGCAC CCGGGCGATC CTGCTCGTCC ACTACGGCGG CAACCCGGCC GACATGGACC 670 680 690 700 710 720 GCATCATGGC CCTGGCCCGC AAGCGCGGCA TCATCGTCGT CGAGGACAGC GCGCACGCGC 730 740 750 760 770 780 TGGGCGCCGT GTACCGGGGG CGGCGGCCGG GGGCACTGGC GGACATCGGC TGCTTCACTT 790 800 810 820 830 840 TCCACTCCAC GAAGAACATC ACCACCCTCG GCGAGGGCGG CATGATCACC CTGTCGCGTG 850 860 870 880 890 900 ACGAGTGGGC CCAGCGGGTG GGACGTATCC GCGACAACGA GGCCGACGGC GTGTACGCGG 910 920 930 940 950 960 CGCTGCCGGA CTCCGCGCGG GCGGGTGCTC CGGCGCTGCT gccgtggatg AAGTTCGCGG 970 980 990 1000 1010 1020 AGGGTGTGTA CGGTCACCGG GCGGTCGGGG TCCGCGGGGC GGGCACGAAC GCGACGATGT 1030 1040 1050 1060 1070 1080 CGGAGGCGGC GGCGGCGGTG GGCGTGGTGC AACTGGCGTC GCTGGAGCGG TTCGTGGCCC 1090 1100 1110 1120 1130 1140 GGCGCCGGAG CATCGCGCAG CGGCTGGACG AGGCCGTGGC CTCGGTGGCC GGCACCCGGC 1150 1160 1170 1180 1190 1200 TGCACCGGGC GGCGGCGGAC AGTCTGCACG CCTACCACCT GTACACGTTC TTCCTCACCG 157
1210 1220 1230 1240 1250 1260 GCGGCCGGCA GGTGCGGGAG CGGTTCGTGC GCGCCCTGGA CCGGCTGGGT GTGGAGGTCC 1270 1280 1290 1300 1310 1320 AGTTGCGGTA CTTCCCGCTC CATCTGTCGC CCGAGTGGCG GCTGCGCGGC CACGGGCCGG 1330 1340 1350 1360 1370 1380 GCGAGTGTCC GACGGCCGAA CGGGTCTGGT TCGAGGAGCA CATGAACCTG CCGTGCCATC 1390 1400 1410 1420 1430 1440 CCGGTCTGAG TGACGGCCAG GTCGACTACA TGGTCGAGGC GGTCACCCGC GCCCTGCACG 1450 1460 1470 1480 1490 1500 AGGCCCACGG CACGGGGACG CGGGTGGCGG CCGGGCACCT GTGACACCGT CCGCATCCGG 1510 1520 1530 1540 1550 1560 CCGGTGGTTT TCCAAGACCG AGGGAGAGGC AGGCGTATGC CGTTCATCGA AGTGAAGATC τ (9) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 8: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 1233 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis (xi) DESCRIÇÃO da SEQUENCIA: SEQ ID N°: 8 GTG CCG TTC GCG CGA CGC Vai Pro Phe Ala Arg Arg GGT TCG GTG GTG GGC GAG GCG Gly Ser Vai Vai Gly Glu Ala GAC CTG GCG GCG CTG 54 Asp Leu Ala Ala Leu 18 GGC GAA CTG GTC CGC TCG Gly Glu Leu Vai Arg Ser GGC CGG TCG CTG ACG TCG GGG Gly Arg Ser Leu Thr Ser Gly GTG TGG CGG GAG CGG 108 val Trp Arg Glu Arg 36 158 TTC GAG GAA CAG TTC GCC CGC CTG ACC GGC GCC CGG CAC GCG CTC AGT GTC ACC 162 Phe Glu Glu Gin Phe Ala Arg Leu Thr Gly Ala Arg His Ala Leu Ser Val Thr 54 AGC GGC ACC GTC GCG CTG GAA CTG GCG GTG CGG ATG CTG GAC CTG GCG CCG GGC 216 Ser Gly Thr Val Ala Leu Glu Leu Ala Val Arg Met Leu Asp Leu Ala Pro Gly 72 GAC GAG GTG ATC GCC ACC CCG CAG ACG TTC CAG GCG ACG GTG CAG CCG CTG CTC 270 Asp Glu Vai lie Ala Thr Pro Gin Thr Phe Gin Ala Thr val Gin Pro Leu Leu 90 GAC CAC GAC GTG CGG CTG CGG TTC TGC GAC ATC GAC CCG GAC ACC CTC AAC CTC 324 Asp His Asp Val Arg Leu Arg Phe Cys Asp Ile Asp Pro Asp Thr Leu Asn Leu 108 GAC CCG GCG GTG CTG GAG ACG CTG ATC ACC GAC CGC ACC CGG GCG ATC CTG CTC 378 Asp Pro Ala Val Leu Glu Thr Leu Ile Thr Asp Arg Thr Arg Ala Ile Leu Leu 126 GTC CAC TAC GGC GGC AAC CCG GCC GAC ATG GAC CGC ATC ATG GCC CTG GCC CGC 432 Vai His Tyr Gly Gly Asn Pro Ala Asp Met Asp Arg Ile Met Ala Leu Ala Arg 144 AAG CGC GGC ATC ATC GTC GTC GAG GAC AGC GCG CAC GCG CTG GGC GCC GTG TAC 486 Lys Arg Gly lie Ile Val Val Glu ASp ser Ala HiS Ala Leu Gly Ala val Tyr 162 CGG GGG CGG CGG CCG GGG GCA CTG GCG GAC ATC GGC TGC TTC ACT TTC CAC TCC 540 Arg Gly Axg Arg Pro Gly Ala Leu Ala Asp Ile Gly Cys Phe Thr Phe His Ser 180 ACG AAG AAC ATC ACC ACC CTC GGC GAG GGC GGC ATG ATC ACC CTG TCG CGT GAC 594 Thr Lys Asn Ile Thr Thr Leu Gly Glu Gly Gly Met Ile Thr Leu Ser Arg Asp 198 GAG TGG GCC CAG CGG GTG GGA CGT ATC CGC GAC AAC GAG GCC GAC GGC GTG TAC 648 Glu Trp Ala Gin Arg Val Gly Arg ile Arg Asp Asn Glu Ala Asp Gly Val Tyr 216 GCG GCG CTG CCG GAC TCC GCG CGG GCG GGT GCT CCG GCG CTG CTG CCG TGG ATG 702 Ala Ala Leu Pro Asp Ser Ala Arg Ala Gly Ala Pro Ala Leu Leu Pro Trp Met 234 AAG TTC GCG GAG GGT GTG TAC GGT CAC CGG GCG GTC GGG GTC CGC GGG GCG GGC 756 Lys Phe Ala Glu Gly val Tyr Gly His Arg Ala Val Gly Val Arg Gly Ala Gly 252 ACG AAC GCG ACG ATG TCG GAG GCG GCG GCG GCG GTG GGC GTG GTG CAA CTG GCG 810 Thr Asn Ala Thr Het Ser Glu Ala Ala Ala Ala Val Gly Val Val Gin Leu Ala 270 TCG CTG GAG CGG TTC GTG GCC CGG CGC CGG AGC ATC GCG CAG CGG CTG GAC GAG 864 Ser Leu Glu Arg Phe Val Ala Arg Arg Arg Ser Ile Ala Gin Arg Leu Asp Glu 288 GCC gtg GCC TCG GTG GCC GGC ACC CGG CTG CAC CGG GCG GCG GCG GAC AGT CTG 918 Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Thr Arg Leu His Arg Ala Ala Ala Asp Ser Leu 306 CAC GCC TAC CAC CTG TAC ACG TTC TTC CTC ACC GGC GGC CGG CAG GTG CGG GAG 972 His Ala Tyr His Leu Tyr Thr Phe Phe Leu Thr Gly Gly Arg Gin Val Arg Glu 324 CGG TTC GTG CGC GCC CTG GAC CGG CTG GGT GTG GAG GTC CAG TTG CGG TAC TTC 1026 Arg Phe Val Arg Ala Leu Asp Arg leu Gly Val Glu Val Gin Leu Arg Tyr Phe 342 CCG CTC CAT CTG TCG CCC GAG TGG CGG CTG CGC GGC CAC GGG CCG GGC GAG TGT 1080 Pro Leu His Leu Ser Pro Glu Trp Arg Leu Arg Gly His Gly Pro Gly Glu Cys 360 159 CCG ACG GCC GAA CGG GTC TGG TTC GAG GAG CAC ATG AAC CTG CCG TGC CAT CCC 1134 Pro Thr Ala Glu Arg val Trp Phe Glu Glu HiS Met Asn Leu Pro Cys His Pro 378 GGT CTG AGT GAC GGC CAG GTC GAC TAC ATG GTC GAG GCG GTC ACC CGC GCC CTG 1188 Gly Leu Ser Asp Gly Gin val Asp Tyr Met val Glu Ala Val Thr Arg Ala Leu 396 CAC GAG GCC CAC GGC ACG GGG ACG CGG GTG GCG GCC GGG CAC CTG 1233 HiS Glu Ala HiS Gly Thr Gly Thr Arg val Ala Ala Gly His Leu 411
Lisboa, 30 de Novembro de 2010 160

Claims (3)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto caracterizado por ser representado pela fórmula geral I
    I em que: - R.2 e R4 representam, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo, - R3 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxilo, - X representa um grupo CO, CHOH ou CH2 e - Ri representa: 1
    com - para os derivados meta: A, C, D e E representam um átomo de hidrogénio e podendo B representar: - um halogéneo e, de um modo preferido, um átomo de flúor, um grupo monoalquilamino ou dialquilamino com alquilo representando, de um modo preferido, um grupo metilo ou etilo, - um grupo éter. - um grupo tioéter, - um grupo alquilo em Ci a C3 ou um grupo tri-halogenometilo e, de um modo preferido, trifluorometilo. 2 - para os derivados para: A, B, D e E representam um átomo de hidrogénio e podendo C representar. - um halogéneo, um grupo NR5R6 com R5 e R6 representando independentemente um do outro, um grupo seleccionado de entre - hidrogénio, - um grupo alquilo em Ci a C4 linear ou ramificado com quando um dos substituintes R5 ou R6, representa um grupo metilo, o outro representa obrigatoriamente um grupo etilo, um grupo alquil-cicloalquilmetilo com cicloalquilo em C3 a C4 - um grupo cicloalquilo em C3 a C4 eventualmente substituído, um grupo alcenilo em Ci a C4 linear ou ramificado com quando um dos substituintes R5 ou R6, representa um grupo alcenilo, o outro é diferente de grupo metilo ou de grupo cicloalquilo em C3 a C6, - um grupo N-pirrolidinilo substituído ou não, 3 um grupo éter, - um grupo tioéter, - um grupo acilo ou alcoxicarbonilo, - um grupo alquilo em Ci a Ce, linear ou ramificado e seleccionado, de um modo preferido, de entre os grupos metilo, isopropilo e terc-butilo, - um grupo alquiltiometilo, - um grupo arilo e, de um modo preferido, um fenilo ou um grupo tri-halogenometilo e, de um modo preferido, trifluorometilo e - para os derivados dissubstituídos meta-para: A, D e E representam um átomo de hidrogénio e podendo B representar: - um halogéneo e, de um modo preferido, um átomo de flúor, um grupo monoalquilamino ou dialquilamino com alquilo representando, de um modo preferido, um grupo metilo ou etilo, 4 um grupo éter - um grupo tioéter, - um grupo alquilo em Ci a C3 e podendo C representar. - um halogéneo e, de um modo preferido, um átomo de flúor, - um grupo amino, monoalquilamino ou dialquilamino com alquilo representando, de um modo preferido, um grupo metilo na condição de que B seja diferente de um átomo de bromo ou de cloro ou de um grupo alilo substituído ou não, - um grupo éter, - um grupo tioéter, - um grupo alquilo em Ci a Ce ou um grupo tri-halogenometilo e, de um modo preferido, trifluorometilo e - para os derivados dissubstituídos orto-para: B, E e D representam um átomo de hidrogénio, e A e C, um grupo metilo. 5
  2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se tratar, de um modo preferido, de: 4ζ-metiltio-des (4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA, 4ζ-metiltio-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina lH, 5γ -hidroxi 4ζ-metiltio-des(4ζ-dimetilamino) pristinamicina IH, 4ζ-metil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina lA, 4ζ-metil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IH, 4ζ-metoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina lA, 4ζ-metoxicarbonil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA, 4ζ-cloro-des(4ζ-imetilamino)pristinamicina lA, 4ζ-bromo-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA, 4ζ-bromo-des (4ζ-άίιηβ^1ηιηίηο)ρΓί3^η3ΐηίοίη3 IH, 4ζ-iodo-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA, 4ζ-iodo-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IH, 4ζ-trifluorometil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA, 4ζ-trifluorometil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IH, 6 4ζ-terc-butil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA, 4ζ-isopropil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA, 4ζ-isopropil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IE, 4s-metilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA, 4s-metoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina I A, 4s-metoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina I H, 4s-fluoro 4ζ-metil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina I A 4ζ-amino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina I A 4ζ-etilamino-des (4ζ-άίιηβ1ίΐ3ΐηίηο)ρηί3ΐίη3ΐηίοίη3 IA 4ζ-dietilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-alilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-dialilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-alil-etilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-θ1ί1 propilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4 ζ-etilisoprcpilamino-des(4 ζ-dimetilamino)pristinamicina Ia 7 4ζ-Θΐ:ί1 metilciclopropilamino-des (4ζ-dimetilamino) pristinamicina IA 4ζ-(1-pirrolidinil)-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-trifluorometoxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-aliloxi-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-θ1οχί-άθ5(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-etiltio-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-metiltiometil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4 ζ-(2-cloroetoxi)-des(4 ζ-diraetilamino)pristinamicina IA 4ζ-acetil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-etil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4ζ-etil-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IH 4s-dimetilamino-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA 4s-metiltio-des(4ζ-dimetilamino)pristinamicina IA e 4s-etoxi-des (4ζ-άίιηθ1ίΐ3ΐηίηο)ρηί3ΐίη3ΐηίηίη3 IA. 8 3.
  3. 3. pelo 2 em Composição farmacêutica caracterizada por esta conter, menos, um composto de acordo com a reivindicação 1 ou associação ou não com uma estreptogramina do grupo A. Lisboa, 30 de Novembro de 2010 9
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