JPH08501696A - ストレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチド、これらポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はストレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、該配列を含有する組換え細胞、およびその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ストレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチド、これらポリペブチドをコ ードするヌクレオチド配列およびその使用 本発明はストレプトグラミン（streptogramines）の生合成に関与する新規ポ リペプチドに関し、同時にストレプトグラミンのＡおよびＢ成分の生合成に関す る遺伝子の単離および同定、目的物の生産レベルが増大したこれら遺伝子の発現 、ならびに新規抗生物質の合成またはストレプトグラミンからの誘導体を導くこ とができるブロックされた変異体の構築物に関する使用を含んで成る。 ストレプトグラミンは化学的に異なる２種類の分子型を組み合わせて構成され ている抗生物質の均一な群を形成している。一方はポリ不飽和マクロラクトン（ Ａ−群成分、それらの２つの構造例が第１図に表されている）、そして他方はデ プシペプチド（Ｂ−群、それらの３つの構造例が第２図に表されている）である 。この群は多くの抗生物質（表１および第３図を参照にされたい）を含んで成る ことができ、それらの起源により様々な名前で知られている、例えばプリスチナ マイシン（pristinamycines）、ミカマイシン（mikamycines）およびバージニア マイシン（virginiamycines）がある（概説としてCocito 1979、1983を参照にさ れたい）。 ＡおよびＢ成分は、別個の成分の１００倍にも達することができる相乗的な抗 バクテリア活性を有し、そしてこれは各成分と比較して殺バクテリア性である（ Cocito 1979）。この活性はブドウ球菌属および連鎖球菌属のようなグラム−陽 性バクテリアに対してより特別に効果的である（Cocito 1979、Videau 1982）。 このＡおよびＢ成分はリボゾームの ５０Ｓサブユニットに結合することによりタンパク質合成を阻害する（Cocito 1 979；概説にはDi Giambattistaら、1989を参照にされたい）。 ストレプトグラミンは表１に表すように多くのストレプトミセス属を含む放線 菌類により主として生産される。加えて、ストレプトグラミンはバーナマイシン を合成するミクロモノスポーラ（Micromonospora）のような真核生物でも合成さ れる。放線菌類はそれらが生産する大量の二次代謝産物（多くの抗生物質（ベー ターラクタム、テトラサイクリン、マクロリッド、アミノグリコシド、ポリ酢酸 等）、除草剤、抗ガン剤、抗菌剤、イムノモジュレーターおよび酵素阻害剤を含 む）ゆえに重要な微生物群を構成している。現在、放線菌に関しては種々雑多な 種類に属する抗生物質、ならびに染料（概説はChater 1990を参照にされたい） のような他の二次代謝産物に関連する生合成経路はすでに研究されている。この バクテリア群の重要な観点は同一の生合成経路に関与する遺伝子類、構造遺伝子 類、および耐性遺伝子（１つまたは複数）、ならびに制御遺伝子（１つまたは複 数）が天然に一緒に染色体上に群を成し、１００ｋｂ以上にもなることができる クラスターを構成している点である（Hopwoodら1986a、Hopwoodら1986b、Hallam ら1988、Anzaiら1987、Ohnukiら1985）。今日までこの考察に反対するものは見 いだされていない。このような構造的組織は、生合成遺伝子をクローニングする ための戦略を開発するのに大変興味深い。要するに、種々の手法によりすでにク ローン化された単一遺伝子から出発して、生合成、耐性または制御遺伝子を染色 体に沿って歩き、そして生合成クラスターの遺伝子の組をこのように単離するこ とが可能である。 ストレプトグラミンの各成分の生合成経路に関する我々の知識は未だ 完全ではないが、各分子の種々の部分の起源は放射線活性標識により同定された （kingstonら、1983）。したがってＡ−型成分は、酢酸塩と例えばセリンおよび グリシンのような数個のアミノ酸との縮合に由来する２つの領域から成る。Ｂ− 型成分に関しては、ペプチド鎖中に存在するすべてのアミノ酸が天然アミノ酸で あることが示された（HookおよびVining、1973）。しかしこれらの経路に関与す るペプチドは今日までその分子特性を決定するために十分な量で精製されてはお らず、生合成遺伝子も記載されていない。Ｂ−型成分の生合成段階は、２つの部 分に分けることができる： １）大環状の前駆体またはその類似体の合成：３−ヒドロキシピコリン酸、Ｌ −２−アミノ酪酸、ｐ−ジメルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−オキソ−Ｌ −ピペコリン酸、Ｌ−フェニルグリシン。 ２）上記の前駆体、Ｌ−トレオニンおよびＬ−プロリンまたはその類似体から 大環の形成、あるいはこれら前駆体の修飾またはペプチドＮ−メチル化。 現在まで可能なＢ−型成分の大環の前駆体の代謝起源が標識同位体を使用して 決定されているだけである（Reedら1986、Molineroら1989、Reedら1989）。 本発明はストレプトグラミンの生合成に参加するポリペプチドの精製の結果で あり、同様に生産物がストレプトグラミンの生合成に参加する遺伝子クローニン グの結果である。ストレプトグラミンの生合成という用語は、制御遺伝子および 生産微生物に耐性を付与する遺伝子を含んで成ると理解されている。したがって 、本発明はこれらの代謝物の生産レベルを組換えＤＮＡ法により増大させること も可能である。本発明の別 の利点は、この生合成の種々の段階でブロックされた変異体を構築することによ り、各々２つの成分のための合成中間体を生産する可能性にある。これらの中間 体は化学的、生化学的、酵素的または微生物的手段用にさらに修飾するための基 質を提供することができる。同様に生合成遺伝子を単離することは、生産株間に 遺伝子を移すことによって医薬的に有利な特性を持つハイブリッド抗生物質を製 造することを可能にする（Hopwoodら、1985a、Hopwoodら、1985b、Hutchinsonら 、1989）。本発明の別の利点はストレプトグラミン類として分類される代謝物の 生合成経路のより良い知識を提供するという事実にある。要するに本発明は、ス トレプトグラミンの生合成に参加する１つ以上のタンパク質が適当な発現信号の 制御の元に発現されるようにバクテリアまたは真菌株を構築できる。そのような 株は次に生物変換を行うために使用できる。これらの生物変換は細胞全体、ある いは該細胞の無細胞抽出物のいずれかを使用して行うことができる。これらの生 物変換はストレプトグラミンを生合成経路の酵素で誘導体に転換させることがで きる。例えばプリスチナマイシンIIＢはこのようにプリスチナマイシンIIＡに転 換できる。同様な理論を任意の生合成中間体に応用できる。 したがって本発明の第一の目的は、ストレプトグラミンの生合成に関与するポ リペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。 さらに詳細には、生産物がストレプトグラミンの生合成に参加する数個の遺伝 子がストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespir alis ）から単離された。この株から生産されたストレプトグラミンは通常、用語 プリスチナマイシンと呼ばれているので（表１）、以下のプリスチナマイシンの 生合成に関する遺伝子の場合には参 考になることもあるだろう。しかし、得られた結果はすべてのストレプトグラミ ン応用にできることは明らかである。プリスチナマイシンＩおよびIIはそれぞれ ストレプトグラミンのＢおよびＡ成分に対応する。したがってプリスチナマイシ ンII一族およびプリスチナマイシンＩ−族の分子は、以下ではそれぞれストレプ トグラミンのＡおよびＢ成分と呼ぶ。 本発明は特にｓｎａＡ、ｓｎａＢ、ｓｎａＣ、ｓｎａＤ、ｐａｐＡ、ＰａｐＭ 、ｓａｍＳ、ｓｎｂＡ、ｓｕｂＣ、ｓｎｂＤ、ｓｎｂＥおよびｓｎｂＲ遺伝子の 単離および特性決定に関する。これらの遺伝子はエス．プリスチナエスピラリス （S.pristinaespiralis）のゲノムＤＮＡライブラリーから単離された。このラ イブラリーはエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のゲノム ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分消化することにより得られた。平均４０−５ ０ｋｂの巨大ＤＮＡ断片を、コスミドｐＨＣ７９中にクローン化した（Hohn，B. ，およびCollins，J.F.，1980）。インビトロのキャプシド化後、E.Coli HB101 株（Boyerら、Roulland-Dussoix、1969）およびDH1株（Low，1968）をトランス フェクションした。エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）の ＤＮＡライブラリーはこのように異なる２つのE.Coli株から作成される。 ｓｎａＡ、ｓｎａＢおよびｓａｍＳ（初はＳｎａＣ遺伝子と呼ばれた）は、コ スミドｐＩＢＶ１（第４図）上に存在する。ポリペプチドＳｎａＡおよびＳｎａ Ｂに対応するｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子の生成物は、プリスチナマイシンの II成分の最終生合成段階に参加し（プリスチナマイシンIIＢのプリスチナマイシ ンIIＡへの転換）、Ｄ−プロリンの２，３−結合の酸化に対応する。これら２つ のポリペブチドはプリスチナマ イシンIIＡシンターゼの２つのサブユニットを構成し、その精製は本発明に記載 される。ｓａｍＳ遺伝子の生成物は、ＡＴＰとメチオニンからＳＡＭ（メチル基 供与体）の合成に参加すると考えられている。多くのストレプトグラミンのＡ成 分は、実質的にＣ−４でメチル化され（第１図）、そしてこのメチルはメチオニ ンのメチルに由来すると記載され（Kingstonら、1983）、ＳＡＭとのメチル化反 応を介しておそらく変化する。したがってｓａｍＳ遺伝子は、プリスチナマイシ ンの生合成経路に特異的であるＳＡＭシンターゼ（ＳａｍＳ；ＥＣ ２．５．１ ．６）をコードすると考えられる。 ｓｎｂＡ、ｓｎｂＲ、ｐａｐＡおよびｐａｐＭ遺伝子はコスミドｐＩＢＶ２（ 第５図）上に存在する（第５図）。ｓｎｂＡ遺伝子は実施例５に表すような生化 学的研究に基づき、プリスチナマイシンＩの生合成の第一段階に対応する。これ は鎖の第一の酸、３−ヒドロキシピコリン酸のアデニル化による活性化を含んで 成る。ｓｎｂＲはプリスチナマイシンＩ（またはおそらくプリスチナマイシII） 一族の分子を、合成後に細胞外に転移させることに参加し、これにより生産株の 成分に対して耐性を付与する。ｐａｐＡ遺伝子は配列分析（実施例８．８）、な らびにこの遺伝子により分断される変異体の研究（実施例９．３）に基づいて、 コリスメートからパラ−アミノフェニルアラニンの生合成に関する遺伝子に対応 する。パラ−アミノフェニルアラニンは次にｐａｐＭ遺伝子の生産物（本発明に より記載されるＮ−メチルトランスフェラーゼ）によりジメチル化され、パラ− ジメチルフェニルアラニンを形成し、これは次にプリスチナマイシンＩＡ中に取 り込まれる。したがってｐａｐＡおよびｐａｐＭ遺伝子はプリスチナマイシンＩ Ａの１つの前駆対の合成に 参加する。 ｓｎａＡ、ｓｎａＤ、ｓｎｂＣ、ｓｎｂＤおよびｓｎｂＥ遺伝子は、コスミド ｐＩＢＶ３（第６図）に存在し、したがってこれはｓｎａＡ遺伝子がすでに存在 するコスミドｐＩＢＶ１に隣接する。ｓｎａＤ遺伝子は配列分析（実施例８．９ ）、ならびにこの遺伝子により分断される変異体の研究（実施例９．５）に基づ いて、プリスチナマイシンIIの生合成に関与するペプチドシンターゼをコードす る。生産物が本発明に記載されているｓｎｂＣ遺伝子はプリスタマイシンＩＡの ペプチド鎖中にトレオニンおよびアミノ酪酸残基を取り込むことに参加する。ま た生産物が本発明に記載されているｓｎｂＤ遺伝子は、プリスチナマイシンＩＡ のペプチド鎖中へのプロリンおよびパラ−ジメチルアミノフェニルアラニン残基 の取り込みに関与する。これはまたこれら２つの残基間のペプチド結合のＮ−メ チル化をも支配する。また最後に生産物が本発明に記載されているｓｎｂＥ遺伝 子は、プリスチナマイシンＩＡの最後の２つの残基、すなわちフェニルグリシン および４−オキソピペコリン酸の取り込みに参加する。 ｓｎａＣ遺伝子はコスミドｐＩＢＶ４（第７図）に存在する。これは本発明中 に記載されたＦＭＮレダクターゼとも言うＦＭＮ：ＮＡＤＨ酸化還元酵素をコー トし、そしてＦＭＮおよびＮＡＤＨからＦＭＮＨ₂でプリスチナマイシンIIＡシ ンターゼを供給する。したがってｓｎａＣ遺伝子はプリスチナマイシンIIＡの生 合成の最終段階に参加する。 これらの種々の遺伝子はそれらのコスミド起源からサブクローン化され、それ らの核酸配列が決定された。ｓｎａＡ、ｓｎａＢおよびｓａｍＳ遺伝子は６−ｋ ｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片中にサブクローン化 され、その部分を配列決定した（配列番号１）。ｓｎｂＡ遺伝子は５．５ｋｂのＥｃｏ ＲＩ−ＢｇｌII断片中にサブクローン化され、その部分を配列決定した（ 配列番号５）。ｓｎｂＲ遺伝子は４．６ｋｂのＢｇｌII−ＢｇｌII断片中にサブ クローン化され、その部分を配列決定した（配列番号６）。ｐａｐＡ遺伝子部分 は３．４ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片中にサブクローン化され、その部分を配 列決定した（配列番号９）。ｐａｐＭ遺伝子は４．１ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ 断片中にサブクローン化され、その部分を配列決定した（配列番号１０）。ｓｎ ａＤ 遺伝子部分は１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片中にサブクローン化さ れ、その部分を配列決定した（配列番号８）。ｓｎｂＣ遺伝子部分は６．２ｋｂ のＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ断片中にサブクローン化され、その２つの領域を配列決定 した（配列番号１１および１２）。ｓｎｂＤ遺伝子部分は８．４ｋｂのＳｐｈＩ −ＳｐｈＩ断片中にサブクローン化され、その２つの領域を配列決定した（配列 番号１３および１４）。ｓｎｂＥ遺伝子部分は６．６ｋｂのＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ 断片中にサブクローン化され、その２つの領域を配列決定した（配列番号１５お よび１６）。ｓｎａＣ遺伝子は４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片中にサブク ローン化され、その領域を配列決定した（配列番号７）。 ｓｎａＡ、ｓｎａＢ、ｓｎａＤ、ｓａｍＳ、ｓｎｂＣ、ｓｎｂＤおよびｓｎｂ Ｅ 遺伝子の近接、一方同様にｓｎｂＡ、ｓｎｂＲ、ｐａｐＡおよびｐａｐＭの近 接は、ストレプトグラミンのＡおよびＢ成分の生合成に関する遺伝子のクラスタ ー局在性を付与する。さらに本発明で記載した４つのコスミドは、パルスフェー ルド電気泳動で大きさが２００ｋｂと推定される染色体の領域中一で緒に群を成 し、これはストレプトミセ ス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）の全ゲノムの ３％に等しい（７５００ｋｂ）（実施例１３）。したがって本発明で同定した遺 伝子（ｓｎａＡ、ｓｎａＢ、ｓｎａＤ、ｓａｍＳ、ｓｎｂＣ、ｓｎｂＤおよびｓ ｎｂＥ ；ｓｎｂＡ、ｓｎｂＲ、ｐａｐＡおよびｐａｐＭ；ｓｎａＣ）の周辺領域 は、プリスチナマイシン生合成クラスターの他の遺伝子を含み、そしてこれらの 遺伝子はストレプトグラミンの生合成用の他の遺伝子を局在させるために使用で きることが明らかである。 好ましくは本発明の主題は以下から選択されるヌクレオチド配列である： （ａ）ｓｎａＡ（配列番号２）、ｓｎａＢ（配列番号３）、ｓｎａＣ（配列番 号７）、ｓｎａＤ（配列番号８）、ｐａｐＡ（配列番号９）、ｐａｐＭ（配列番 号１０）、ｓａｍＳ（配列番号４）、ｓｎｂＡ（配列番号５）、ｓｎｂＣ（配列 番号１１および１２）、ｓｎｂＤ（配列番号１３および１４）、ｓｎｂＥ（配列 番号１５および１６）、ならびにｓｎｂＲ（配列番号６）遺伝子の全部または部 分、 （ｂ）生合成クラスターを構成し、そしてストレプトグラミンの生合成に関与 するポリペプチドをコートする遺伝子（ａ）に隣接する配列、 （ｃ）遺伝子（ａ）または（ｂ）の全部または部分とハイブリダイズし、かつ ストレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチドをコードする配列、ならび に （ｄ）配列（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に由来し、遺伝子コードの縮退を持 つ配列。 さらに好ましくは本発明の主題は、ｓｎａＡ（配列番号２）、ｓｎａ Ｂ （配列番号３）、ｓｎａＣ（配列番号７）、ｓｎａＤ（配列番号８）、ｐａｐ Ａ （配列番号９）、ｐａｐＭ（配列番号１０）、ｓａｍＳ（配列番号４）、ｓｎ ｂＡ （配列番号５）、ｓｎｂＣ（配列番号１１および１２）、ｓｎｂＤ（配列番 号１３および１４）、ｓｎｂＥ（配列番号１５および１６）、ならびにｓｎｂＲ （配列番号６）遺伝子により表されるヌクレオチド配列である。 本発明の別の主題はストレプトグラミンの生合成に関する遺伝子を含んで成る 任意の組換えＤＮＡ法に関する。さらに好ましくはこれは第４から７図に表され るコスミドｐＩＢＶ１、ｐＩＢＶ２、ｐＩＢＶ３またはｐＩＢＶ４の全部または 部分、あるいはコスミドｐＩＢＶ１からｐＩＢＶ４とハイブリダイズする配列の 全部または部分、あるいはこれら後者の断片を含んで成る組換えＤＮＡ法である 。 本発明の好適な態様において、上記定義のヌクレオチド配列は発現ベクターの 部分を形成し、それは自律的に複製または統合できる。 上述のように、本発明はさらに特別にはプリスチナマイシンの生合成のための 遺伝子にて説明されるが、得られた結果をすべてのストレプトグラミンに応用す ることは明らかである。 より特別には本発明で開発されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristina espiralis ）からのストレプトグラミンの生合成に関するタンパク質の精製また は遺伝子のクローニングに関する技術は、ストレプトグラミンを生産する他の微 生物にも応用できる（表１参照）。 したがってエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）からの酵 素活性の精製により、ストレプトグラミンを生産する別の株からの同一活性を精 製することも可能である。したがって本発明は生合成 に参加するタンパク質を精製し、そして次にそれらのＮＨ２−末端配列を使用し て対応する遺伝子をクローン化できるオリゴヌクレオチドプローブを合成するこ とにより、任意の生産微生物からストレプトグラミンの生合成に関する遺伝子の クローニングすることに応用できる。次に染色体ウォーキング（chromosome wal king）は全生合成クラスターを同定することを可能にする。 さらに本出願で同定した遺伝子から、ハイブリダイゼーションによりストレプ トグラミンの生合成の遺伝子を別の生産微生物のＤＮＡから直接的にクローン化 することも可能である。実質的にプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子は 別のストレプトグラミンの遺伝子と強くハイブリダイズする。したがってストレ プトグラミンの生合成に関する遺伝子は、プローブとしてｓｎａ、ｓｎｂまたはｐａｐ 遺伝子を使用して、あるいは後者の断片、あるいは本発明に表すような他 のｓｎａおよびｓｎｂ遺伝子を含有する遺伝子に隣接する断片をプローブとして 使用してハイブリダイゼーションによりクローン化することが可能である。これ は１）種々の微生物により生産されるストレプトグラミンは同一であり、同様な 構造を持つ（第３図を参照のこと）、２）ストレプトグラミンの生合成に関する 遺伝子はクラスター中に組織化されている、そして３）この生合成の原因となる 酵素系はそれらの基質に対して絶対的な特異性を持っていない、という事実によ るものである。 さらにストレプトグラミンの生合成に関与する遺伝子のクローニングは、縮退 オリゴヌクレオチド（上記のｓｎａまたはｓｎｂ遺伝子の配列から調製された） 、またはそれら遺伝子の断片、あるいはこれらの遺伝子に隣接する断片を使用し ても行うことができる。したがって種々のス トレプトグラミン生産株のＡおよびＢ成分の生合成のための遺伝子の中から好き なものを選ぶことが可能である。これらの株はストレプトミセス（Streptomyces ）属に、そして他の属にも属することができる（表１を参照のこと）。加えて、 使用する出発株のゲノムＤＮＡがストレプトミセス（Streptomyces）に観察され るものとは異なるＧ＋Ｃ組成を有するならば、使用するプローブは、ＤＮＡを単 離するために所望する遺伝子の属または種に対して特異的なコドンの偏りで合成 できる。 本発明の別の主題は上記定義のヌクレオチド配列の発現に由来するポリペプチ ドに関する。より詳細には本発明はポリペプチドＳｎａＡ（配列番号２）、Ｓｎ ａＢ（配列番号３）、ＳｎａＣ（配列番号７）、ＳｎａＤ（配列番号８）、Ｐａ ｐＡ（配列番号９）、ＰａｐＭ（配列番号１０）、ＳａｍＳ（配列番号４）、Ｓ ｎｂＡ（配列番号５）、ＳｎｂＣ（配列番号１１および１２）、ＳｎｂＤ（配列 番号１３および１４）、ＳｎｂＥ（配列番号１５および１６）、ならびにＳｎｂ Ｒ（配列番号６）のすべてまたは部分、あるいはそれらの誘導体を含んで成るポ リペプチドに関する。本発明に使用する意味において、誘導体という用語はペプ チド配列の遺伝的および／または化学的性質の修飾により得られる任意の分子を 表す。遺伝的および／または化学的性質の修飾とは１つ以上の残基の任意の突然 変異、置換、削除、付加および／または修飾である。そのような誘導体はさまざ まな目的のさめに作成でき、例えば特にペプチドのその基質（１つまたは複数） に対する親和性の増加、その生産レベルの向上、プロテアーゼに対する耐性の上 昇、その活性の増大および／または改変、あるいは新規な生物的性質の付与など である。付加により生じる誘導体の中では、例えば一方の末端に結合した付加的 な相同的部 分を含有するキメラ性のポリペプチドを挙げることができる。誘導体という用語 はまた本発明に記載されたポリペブチドに相同的であり、かつ他の細胞、特にス トレプトグラミンを産する株からから生じるポリペプチドを含んで成る。 本発明の主題は、上記定義のヌクレオチド配列またはベクターを含有する任意 の組換え細胞でもある。本発明の組換え細胞は真核または原核細胞のいずれでも よい。適当な真核細胞の中では、動物細胞、酵母または真菌を挙げることができ る。特に酵母に関してはサッカロミセス（Saccharomyces）、クルイベロミセス （Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、シュワンニオミセス（Schwanniomyces ）またはハンセニューラ（Hansenula）属を挙げることができる。動物細胞に関 しては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７細胞、アフリカツメガエルの卵等を挙げるこ とができる。真菌の中でも特に挙げることができるのは、ミクロモノスポーラ（Micromonospora ）、アスペルギルス ssp.（Aspergillus ssp.）またはトリコダ ーマ ssp.（Trichoderma ssp.）である。原核細胞としては、以下のバクテリア を使用することが好ましい：特にアクチノミセス（Actinomyces）およびストレ プトミセス （Streptomyces）、E.Coli（実施例１１）Ｎバチルス（Bacillus）。 好ましくは本発明の組換え細胞はストレプトグラミンを生産する細胞から選択さ れる（表１を参照のこと）。本発明の組換え細胞は、外来ヌクレオチド配列を細 胞中に導入しうる任意の方法により得ることができる。これは特に、形質転換法 、電気穿孔法、接合法、プロトプラスト融合法、あるいは当業者に周知である他 の任意の方法であることができる。 さらに本発明の主題はストレプトグラミンの生合成に関与するポリペ プチトの生産法であり、それによれば上記定義の組換え細胞が培養され、そして 生産されたポリペプチドが回収される。 また本発明の主題は上記定義の組換え細胞の使用であり、ストレプトグラミン の生合成に関与する少なくとも１つのポリペプチドを生物変換反応で発現する。 特にこれらの細胞はストレプトグラミンを誘導形に転換させることができる。例 えばプリスチナマイシンIIＢをこのようにしてプリスチナマイシンIIＡに転換で きる。同じ理論を、任意の生合成中間体に応用できる。これらの細胞は有利な医 薬的特性を有するハイブリッド抗生物質を製造することができる（Hopwoodら、1 985a、Hopwoodら、1985b、Hutchinsonら、1989）。これらの生物変換は全細胞を 使用するか、あるいは該細胞の無細胞抽出物を使用するいずれかで行うことがで きる。 本発明の別の主題は、上記定義のヌクレオチド配列をストレプトグラミンの生 産を増幅させるために使用することに関する。また本発明はストレプトグラミン の生産法に関し、それによれば本発明の１つ以上のヌクレオチド配列が導入され 、かつ／またはストレプトグラミン生産細胞（あるいはストレプトグラミンの有 望な生産者）中で増幅され、該細胞をストレプトグラミンの生産条件下で培養し 、生産されたストレプトグラミンを回収する。 生合成に関与する特定遺伝子の過剰発現は、生産株のストレプトグラミンＡお よび／またはＢ生産を増大させることができる。この過剰発現は数種の株で行う ことができる：ストレプトグラミンＡ−族の分子のみを生産する株か、ストレプ トグラミンＢ−族の分子のみを生産する株か、あるいはＡおよびＢ成分の両方を 生産する株のいずれかである。これらの過剰発現は合成レベルの増大、すなわち Ａおよび／またはＢ成分のEr lenmeyer中での、または小さい培養槽中での、あるいは大規模な工業的培養槽中 での生産性の増大をもたらすことができる。さらにＡおよび／またはＢ成分の生 合成に関与する遺伝子の特異的な過剰発現は、株により生産されるＡおよびＢ成 分の％を変化させることができ、したがってこれら分子間のより良い相乗効果を 得ることができる。さらにストレプトグラミンを生産する微生物から単離した生 合成遺伝子は、別の生産微生物中で生産を増幅するために使用できる。 本発明の別の主題は、ストレプトグラミンの生合成経路の段階でブロックされ た細胞の調製法に関し、それによれば突然変異がストレプトグラミンを生産する 細胞について少なくとも１つの生合成遺伝子で行われる。 好ましくは突然変異はin vitroまたはin situで、問題とする遺伝子の１つ以 上の塩基のサプレッション、置換、削除および／または付加により行われるか、 または遺伝子分断により行われる。 本発明の別の観点は、実質的にストレプトグラミン生合成の特定段階でブロッ クされた突然変異体の構築にある。その価値は一方では突然変異タンパク質の機 能的研究にあり、他方では生合成中間体を生産する株の生産にある。これらの中 間体は分離後に適当なところで、生産媒体に特定の成分を付加することにより、 または中間体の基質として作用することにより中間体を修飾できるこのように突 然変異した別の遺伝子を株に導入することにより修飾されることができる。これ らの中間体はこのように化学的、生化学的、酵素および／または微生物手段によ り修飾されることができる。この意味において、エス．プリスチナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株の突然変異体ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０５ が構築された：エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaes piralis ）ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０５は自殺プラスミドｐＶＲＣ５０５のｓｎ ａＡ 遺伝子中で相同的統合により単離され、ｐＤＨ５およびｓａｎＡ遺伝子の内 部断片から構築された。以下の突然変異体も構築された：ＳＰ９２ ｓａｍＳ： ：ＱａｍＲ；ＳＰ９２：：ｐＶＲ５０８：ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ４０４およびＳ Ｐ９２：：ｐＶＲＣ１０００（実施例９）。 したがって本発明はまたストレプトグラミンの生合成中間体を調製する方法に 関し、それによれば： −ストレプトグラミンの生合成経路の段階でブロックされる細胞を上記のように 調製し、 −該細胞を培養し、そして −蓄積した中間体を回収する。 本発明はまたはストレプトグラミンから誘導される分子の調製法に関し、それ によれば： −ストレプトグラミンの生合成経路の段階でブロックされる細胞を上記のように 調製し、 −該細胞を培養し、そして −この細胞により蓄積した中間体を培養培地から分離した後、適当なところで修 飾する。 本発明は以下の実施例で説明されるが、それらは説明のためであり、限定する ものではないと考える。図の一覧 第１図：ストレプトグラミンのＡ成分の構造。 第２図：ストレプトグラミンのＢ成分の構造。 第３図：ストレプトグラミンの構造の他の例。 第４図：コスミドｐＩＢＶ１の図解。 第５図：コスミドｐＩＢＶ２の図解。 第６図：コスミドｐ１ＢＶ３の図解。 第７図：コスミドｐＩＢＶ４の図解。 第８図：プリスチナマイシンIIＡシンターゼにより触媒される反応。 第９図：３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼにより触媒される反応。 第１０図：ＳｎｂＣにより触媒される反応。 第１１図：ＳｎｂＤにより触媒される反応。 第１２図：ＳｎｂＥにより触媒される反応。 第１３図：ＳｎａＣにより触媒される反応。 第１４図：ＰａｐＭにより触媒される反応。 第１５図：プラスミドｐＶＲＣ４０２（Ａ）およびｐＶＲＣ５０１（Ｂ）の図解 。 第１６図：プラスミドｐＸＬ２０４５の図解。 第１７図：プラスミドｐＶＲＣ１１０５の図解。 第１８図：プラスミドｐＶＲＣ１１０６の図解。 第１９図：プラスミドｐＶＲＣ１１０４の図解。 第２０図：プラスミドｐＶＲＣ９００の図解。 第２１図：プラスミドｐＶＲＣ１０００の図解。 第２２図：プラスミドｐＶＲＣ５０９の図解。 第２３図：プラスミドｐＶＲＣ９０３の図解。 第２４図：プラスミドｐＶＲＣ４０９の図解。 第２５図：プラスミドｐＶＲＣ５０５の図解。 第２６図：プラスミドｐＶＲＣ７０１の図解。 第２７図：プラスミドｐＶＲＣ７０２の図解。 第２８図：プラスミドｐＶＲＣ５０８の図解。 第２９図：プラスミドｐＶＲＣ４０４の図解。 第３０図：プラスミドｐＶＲＣ５０７の図解。 第３１図：プラスミドｐＶＲＣ７０６の図解。 第３２図：一般的マップ。材料 Bio-Sil SEC 125および250カラム（バイオラッド:Bio-Rad） MonoQ HR 5/5,10/10および16/10カラム（ファルマシア:Pharmacia） PD-10カラム（ファルマシア） Superose 6 HR 10/30カラム（ファルマシア） Superdex 200 Hi-Load 16/60および75 HR 10/30カラム（ファルマシア） Superose 12 prep gradeカラム（ファルマシア） Vydac C4およびC18カラム（ザ セパレーショングルーブ:The Separation Gro up） Nucleosil 5-C18カラム（マーシェリー−ナゲル:Macherey-Nagel） Phenyl Superose HR 10/10カラム（ファルマシア） TSK G2000 SWカラム（トーソー:Tosoh、日本） Phenyl Sepharose（ファルマシア） FMN-アガロース（シグマ:Sigma） Q Sepharose Fast Flow（ファルマシア） Sephadex G-25 Fine（ファルマシア） Centricon 10または30（アミコン:Amicon） Centriprep 10または30（アミコン） Centrilutor（アミコン） 実施例１：ストレプトミセスプリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinae spiralis ）SP92株の全DNAの単離 この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）SP92 株のDNAをどのように精製できるかを説明する。 エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）SP92株は、エス．プ リスチナエスピラリス （S.pristinaespiralis）DS5647株（ATCC25486）由来のも のである。 50mlのYEME培地（３４％シュクロース、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２５％グリ シン（D.Hopwoodら、1985））を１０⁸のエス．プリスチナエスピラリス（S.pris tinaespiralis ）SP92株の胞子とともに植菌し、カルチャーを30℃にて40時間、2 80rpmで撹拌しながらインキュベーションする。 菌糸体を回収し、１５ｍｌの１０．３％シュクロースで洗浄する。約１ｇの菌 糸体ペレットを３４％のシュクロースを補充した５ｍｌのＴＥに溶解し、そこに １ｍｌのリゾチームを５０ｍｇ／ｍｌ濃度（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液、 ｐＨ８．０、および１ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０中）で加える。 ３０℃で３０−６０分間インキュべーションした後、混合物に０．８ｍｌの１０ ％サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）を加えて透明化する。２ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１０ｍｌのＴＥ、１８ｇのＣｓＣｌおよび１．２ｍｌの ＥＴＢ（１０ｍｇ／ｍｌ濃度で）を次に加える。調製物を、２０℃にて５５，０ ０ ０ｒｐｍで一晩超遠心する。 染色体ＤＮＡ（ＣｓＣｌ勾配中にバンド状態で存在する）をパスツールピペッ トで回収する。ＥＴＢをＴＥ緩衝液、５Ｍ ＮａＣｌで飽和としたイソプロパノ ール溶液で数回洗浄して除去する。３容量のＴＥおよび４容量のイソプロパノー ルを加えることによりＤＮＡを沈殿させる。７０％エタノールで洗浄した後、Ｄ ＮＡを適当容量のＴＥ中に溶解する。得られた全ＤＮＡ量は菌糸体グラムあたり ２５０から５００μｇの間である。 実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドＤＮＡの単離 この実施例ではＥ．ｃｏｌｉの組換え株からいかにしてＥ．ｃｏｌｉプラスミ ドＤＮＡを調製できるかを説明する。２．１ Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドＤＮＡの大量調製 この実施例ではプラスミドＤＮＡの最大調製物をいかにしてＥ．ｃｏｌｉで生 産させるかを説明する。 この調製は、１５０μｌ／ｍｌのアンピシリンを含有する５００ｍｌのＬＢ培 養培地を使用して行う。抽出法はＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ（１９７９） およびＩｓｈ−ＨｏｒｏｗｉｃｓおよびＢｕｒｋｅ（１９８１）、ならびにMani atisら（１９８９）により記載された方法による。 この抽出後、プラスミドＤＮＡをManiatisら（１９８９）に記載されたＣｓＣ ｌ勾配を使用して精製する。プラスミドＤＮＡを次に３容量のＴＥおよび４容量 のイソプロパノールを加えて沈殿させる。遠心後、ペレットを０．５−１ｍｌの ＴＥに溶解する。２．２ 少量のＥ．ｃｏｌｉ プラスミドＤＮＡの調製 この実施例ではプラスミドＤＮＡの微量調製物をいかにしてＥ．ｃｏｌｉで生 産させるかを説明する。 この調製は、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１．５ｍｌのＬＢ培 養培地を使用して行う。方法はＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ（１９７９）に より記載された方法による。 実施例３：Ｅ．ｃｏｌｉ中でのエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespi ralis ）のゲノムライブラリーの構築およびハイブリダイゼーション用膜の調製 この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ ９２のゲノムＤＮＡライブラリーをいかにしてＥ．ｃｏｌｉで作成するかを説明 する。３．１ ゲノムＤＮＡ断片の調製 この実施例ではとのように高分子量ゲノムＤＮＡ断片が調製できるかを説明す る。 実施例１に記載したように調製したＳＰ９２株の全ＤＮＡを、製造元で推薦す る緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．５ ），１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中のＳａｕ３Ａ（ニュ ーイングランド バイオラボズ：New England Biolabs、ビバリー、マサチュー セッツ州、０１９１５−５５１０、米国）で部分消化する。高分子量ＤＮＡ断片 を得るために使用した酵素量は、経験的に定めた。約０．０２５酵素単位を、１ μｇの全ＤＮＡを３７℃にて２０分間で消化するために使用する。反応を次に６ ５℃で１５分間インキュベーションすることにより停止し、そして酵素を等容量 のフェノール／クロロホルムを加えて除去する。遠心後、部分的に消化 した全ＤＮＡを含有する上澄みを、最終的に０．３Ｍの酢酸ナトリウムおよび２ ．５容量のエタノールを加えて沈殿させる。 約１００μｇの全ＤＮＡがこのようにして消化され、そして大きさが３０−５ ０ｋｂＤＮＡ断片が１０−４０％のシュクロース勾配で単離される。それらの大 きさは０．４％のアガロースゲル電気泳動で確認する。３．２ コスミドｐＨＣ７９の調製 この実施例ではどのようにコスミドｐＨＣ７９をE.coliから調製するかを説明 する。 コスミドｐＨＣ７９（Ｈｏｈｎ，Ｂ．およびＣｏｌｌｉｎｓ，１９８０）は、 ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｆ．ら、１９７７）の一部分、λのｃｒｏ−ｃ II領域およびＣｈａｒｏｎ ４Ａ（Ｂｌａｔｔｎｅｒ，Ｆ．Ｒ．ら、１９７７） のｃｏｓ配列を含有する領域を含んで成る。 コスミドの抽出は実施例２．１に記載されたように、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１株 （Ｋ１２，Δ（ｌａｃ−ｐｒｏ） ｓｕｐＥ ｔｈｉ ｈｓｄ ＤＳＦ’ｔｒａ Ｄ３６ ｐｒｏＡ⁺Ｂ⁺ ｌａｃＩｑ ＬａｃＺ ΔＭ１５，Ｇｉｂｓｏｎ，１９ ８４）から行った。 ５００ｎｇのコスミドｐＨＣ７９を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ ｐＨ７．９、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂、６ｍＭ ２−メルカプトエタノー ル、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含んで成る２０μｌの緩衝液中のＢａｍＨＩ（ ニューイングランド バイオラボズ ビバリー、マサチューセッツ州、０１９１ ５−５５１０、米国）で消化する。３．３ ＤＮＡ断片およびコスミドの連結 この実施例では、Ｓａｕ３Ａ消化から派生するエス．プリスチナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２ゲノムをどのようにしてＢａ ｍ ＨＩ−直線化ベクターｐＨＣ７９に連結できるかを説明する。 約１５０ｎｇの上記のように直線化したコスミドを、エタノールで、実施例３ ．２に記載されたような３５０ｎｇのエス．プリスチナエスピラリス（S.pristi naespiralis ）ＳＰ９２の全ＤＮＡ断片とともに沈殿させた。ペレットを１０μ ｌの連結緩衝液（ライゲーションバッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ Ｈ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ ＤＴＴ、１Ｍｍ ＡＴＰ、５０μ ｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に溶解し、そして０．５μｌの濃度４００，０００単位／ｍ ｌのＴ４ＤＮＡ リガーゼ（ニューイングランド バイオラボズ ビバリー、マ サチューセッツ州、０１９１５−５５１０、米国））を加えた。インキュベーシ ョンは１５℃で一晩行った。３．４ インビトロでのキャプシド化の実施 この実施例では３．３で構築されたコスミドがどのようにしてインビトロでキ ャプシド化されるのかを説明する。 連結後のハイブリッドコスミドのキャプシド化は、ストラタジーン（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ クローニング システム、ラジョラ、カリフォルニア州、９２０ ３７、米国）で開発されたＧｉｇａｐａｃｋIIＧｏｌｄキットを使用して行った 。 ２×４μlの連結混合物（２×７０ｎｇのハイブリッドコスミドと同等）をイ ンビトロ で供給元により記載された方法に従いキャプシド化した。３．５ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１株およびＨＢ１０１株のトランスフエクション この実施例ではコスミドをどのようにＥ．ｃｏｌｉに導入するかを説明する。 ２つのトランスフェクションを平行してＥ．ｃｏｌｉＤＨ１株（Ｆ ^-ｇｙｒＡ ９６ ｒｅｃＡ１ ｒｅｌＡ１ ｅｎｄＡ１ ｔｈｉ−１ｈｓｄＲ１７ ｓｕｐ Ｅ４４Ｌ−、Ｌｏｗ １９６８）およびＨＢ１０１株（Ｆ ^-ｓｕｐＥ４４ ｈｓ ｄ Ｓ２０（ｒＢ^-ｍＢ^-）ｒｅｃＡ１３ ａｒａ−１４ ｐｒｏＡ２ ｌａｃＹ１ ｇａｌＫ２ ｒｐｓＬ２０ ｘｙｌ−５ ｍｔｌ−１、ＢｏｙｅｒおよびＲｏ ｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ １９６９）で行った。 細胞を以下の方法に従い調製した：１００−ｍｌのプレカルチャーを０．２％ のマルトースおよび１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄を補充したＬＢ培地で４−５時間、Ｏ Ｄ₆₀₀の値が０．８になるまで生成する。カルチャーを次に遠心し、そしてペレ ットを４０ｍｌの１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄に溶解し、そしてＯＤ₆₀₀＝０．５まで同 様の溶液で希釈する。このようにして調製した２００μｌの細胞懸濁液を、１０ ０μｌのキャプシド化混合物と混合する。３７℃での接触２０分後、１ｍｌのＬ Ｂを加え、全体を３７℃で１時間インキュベーションする。トランスフェクショ ン体を次に１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ固体培地で選択する 。得られたトランスフェクション体の数は１μｇの組換えコスミドあたり約１０⁴ である。３．６ エス．プリスチナエスピラリス （S．pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲ ノムＤＮＡライブラリーの保存 この実施例ではどのようにエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespira lis ）ＳＰ９２のゲノムＤＮＡライブラリーが保存されるかを説明する。 コスミドｐＨＣ７９中に挿入された断片の平均の大きさを確認した後、 ＨＢ１０１およびＤＨ１で行ったトランスフェクション体から派生する各約１５ ００コロニーを、２００μｌのＨｏｇｎｅｓｓ培地（８．８％グリセロール、３ ｍＭ 酢酸ナトリウム、５５ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄、２６ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、１ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１５ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１５０μｇ／ｍｌ アンピシリンを 補充したＬＢ培地）を含有する９６ウェルのマイクロタイタープレートにサブク ローン化する。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベーションし、そして 次に−８０℃に保存する。３．７ エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲ ノムライブラリーのハイブリダイゼーション膜の調製 この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ ９２ゲノムライブラリーを構成するコロニーのＤＮＡがどのようにハイブリダイ ゼーション膜上に移されるかを説明する。 これらのハイブリダイゼーション膜は、以下の方法に従い２つの各ライブラリ ーについて２連で作成された： 各ライブラリーの１５のマイクロタイタープレートは、レプリカプレーターを 使用して１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上にレプリカ を取る。３７℃で一晩生育させた後、コロニーをＢｉｏｈｙｌｏｎ Ｚ⁺膜（バ イオプロープ システム：Ｂｉｏｐｒｏｐｅ Ｓｙｓｔｅｍ）上に、以下の手法 に従い移し取る：膜を適当な大きさに切り、そしてコロニーに１分間接触させて おく。次に変性は、膜を０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ溶液に５分間 浸漬させることにより行い、続いて中和化は膜を３Ｍの酢酸ナトリウム溶液に５ 分間浸漬させることにより行う。ＤＮＡは膜をＵＶランプ下に５分間暴露するこ と により固定する。 実施例４４．１ パルスフィールド電気泳動用の試料挿入物としての状態のエス．プリス チナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株およびＳＰ９２由来の株 の染色体ＤＮＡの調製 この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ ９２株およびＳＰ９２由来の株のＤＮＡを、どのようにしてパルスフィールド電 気泳動のための挿入物の状態で調製するかを説明する。この調製は以下のように して得られた菌糸体カルチャーから作成される：０．２５％のグリシンを含有す る３０ｍｌのＹＥＭＥ培地を被検株の１０⁸の胞子とともに植菌し、そしてカル チャーを３０℃で４８時間、２５０ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒｓ中で２８０ｒ ｐｍに撹拌しながらインキュベーションする。菌糸体を次に１０分間の３８００ ｒｐｍの遠心により回収し、１０％のシュクロースで２回洗浄する。菌糸体ペレ ットを次に５ｍｌの溶液Ｉ（２５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、２０．６％シ ュクロース）に再懸濁する。このようにして得られた２００Ｍｌの菌糸体に、４ ００Ｍｌのリゾチーム溶液を５０ｍｇ／ｍｌの濃度（溶液Ｉ中）で、８００Ｍｌ の１％ＬＭＰアガロース（２５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０．３％シュクロース中 、４２℃に維持）とともに加える。混合物を４２℃に維持し、そして次に特別製 のコーム（ｃｏｍｂｓ）のウェル中に注ぎ、これを粘着テープで密閉し、４℃で ３０分間保つ。混合物を固体化し、そしてこのようにして３０−４０の挿入物を 得、そしてウェルに含まれる挿入物を型から注意深く取り出した。 挿入物を始めに４℃で３０分間、２５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０．３ ％シュクロースを含有する溶液中ですすぐ。それらを次に５００ｍＭのＥＤＴＡ 、１％ラウリルサルコシルおよび１ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫで５０℃にて ２４時間２回、時々撹拌しながら浸漬する。挿入物を次に１ｍＭ ＰＭＳＦを含 有するＴＥ中で１時間、各洗浄ごとに溶液を交換しながら３回洗浄する。このよ うにして得られた挿入物を４℃で０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０中で、最長４ ケ月保存する。４．２ エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株お よびＳＰ９２由来の株のＤＮＡ挿入物の消化およびパルスフィールド電気泳動用 による分析 この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ ９２株およびＳＰ９２由来の株の染色体ＤＮＡ（実施例４．１に記載されたよう に調製されたもの）を、どのようにしてパルスフィールド電気泳動用に種々の制 限酵素で切断するかを説明する： ４．２．１．挿入物の状態での染色体ＤＮＡの消化 挿入物を始めにＴＥ中で６回洗浄し、そして次に選択した制限酵素の緩衝液中 に１時間、２回インキュベーションする。各挿入物を次に、１６０Ｍｌの制限酵 素緩衝液および４０単位の酵素を含有するエッペンドルフ試験管のフタの部分に 置く。全体をパラフィルムで覆い、そして緩衝液の蒸発を避けることができるよ うにエッペンドルフをパラフィルムに包んで密閉する。この試験管をインキュベ ーター中にて所望温度で一晩インキュベーションする。４．２．２ 消化ＤＮＡのパルスフィールド電気泳動による分析 この実験のためのパルスフィールド電気泳動法は、Ｃｈｕら（１９８６）によ り開発されたＣＨＥＦ（Ｃｌａｍｐｅｄ Ｈｏｍｏｈｅｎｅｏ ｕｓ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ）系のものであり、これはそれぞれが１２ ０゜に配向された２種類の均一な交互の電場を得、ならびにＤＮＡ分子について は直線的な軌跡を得ることができる。使用した“パルサフォーシステム（Ｐｕｌ ｓａｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ）”はファルマシア−ＬＫＢにより販売されている。 電気泳動的移動度のパラメーター（パルス時間および移動時間など）は、１０ −２５００ｋｂの間の大きさの範囲のＤＮＡ断片について至適な分離が得られる ように変更した。使用した３種の移動条件は次の通りである：２００−１７００ ｋｂの大きさの巨大断片を分離するために、選択した移動条件はパルス時間が９ ０秒で４０時間：５０−４００ｋｂの大きさの断片を分離するために選択した移 動条件はパルス時間が１０秒で２０時間：最後により小さい１０−２００ｋｂの 大きさの断片を分離するために選択した移動条件はパルス時間が１０秒で２４時 間である。これらの３種の移動条件については、電圧を１５０ボルトの定電圧で あり、温度は１３℃に維持し、そして電気泳動ゲルは１．３％のアガロースを含 有する。 エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９ ２株および Ｐ９２由来の株の染色体ＤＮＡを含有する挿入物を、上記の制限酵素で消化し、 そして２つの外科用の刃を使用して電気泳動ゲルのウェルに置く。使用した分子 量マーカーはニューイングランドバイオラボ社で販売している“酵母染色体ＰＦ Ｇマーカー”および“ラムダ ラダーｐＦＧマーカー”である。移動は上記条件 の１つで行い、そして次に４ｍｇ／ｍｌ濃度のＥＴＢ（エチジウムブロミド）浴 で染色し、その後２０分間水中にて脱集落化する。ゲルの写真を取った後、ＤＮ Ａ断片をナイ ロン膜上に移し、そして実施例９．１に記載するように［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ− 標識プローブとハイブリダイズさせる。 実施例５：ストレプトグラミンの生合成に関与する精製タンパク質をコードする 遺伝子を持つコスミドの単離 この実施例では、プリスチナマイシンの生合成に参加し、かつそのＮＨ₂−末 端配列または内部配列が確立されている精製タンパク質から出発して、いかに上 記のように作成されたゲノムライブラリーからこの同一タンパク質に関する構造 遺伝子を持つコスミドを単離することができるか、あるいはコスミドが保持し、 かつすでに配列決定されたこれらの遺伝子から対応する構造物遺伝子を同定でき るかを説明する。５．１ プリスチナマイシンIIＡシンターゼの２つのサブユニットの１つ、また は両方の構造物遺伝子を持つコスミドｐＩＢＶ１およびｐＩＢＶ３の単離 ５．１．１ プリスチナマイシンIIの最終合成段階に関与するタンパク質の１つ の同定および精製：プリスチナマイシンIIＡシンターゼ導入部にて述べたように 、プリスチナマイシンIIＡの最終合成段階は、Ｄ−プロリンの２，３−結合のデ ヒドロプロリンへの酸化に対応する。この活性の原因であるタンパク質はこの実 施例に説明されるように均一に精製された。 ５．１．１．Ａ．プリスチナマイシンIIＡシンターゼ活性のアッセイ この実施例では、未だ記載されず、かつプリスチナマイシンの生産期間中にの み発現される注目すべき特質を有するプリスチナマイシンIIＡの生合成経路の活 性アッセイを説明する。問題の酵素はプリスチナマイシンIIＡシンターゼである が、これはプリスチナマイシンIIＢをプリス チナマイシンIIＡに、プリスチナマイシンIIＢのＤ−プロリン残基を２，３−デ ヒドロプロリン残基（第８図）に、分子酸素およびＦＭＮＨ₂の存在下で酸化し て転換する。このアッセイする酵素画分（０．００２−０．００５単位）を、２ ７℃で１時間、全容量が５００ｍｌの５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝 液ｐＨ６．８（ＮＡＤＨ（５００μＭ）およびＦＭＮ（５μＭ）、プリスチナマ イシンIIＢ（２０μＭ）および０．０２単位のＦＭＮ還元酵素（ベーリンガーマ ンハイム：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する）中でインキ ュベーションする。 生成したプリスチナマイシンIIＡは、５００μｌの０．１Ｎ塩酸および５００ μｌのアセトニトリルでインキュベーションを停止し、そして試料を５０００ｇ で５分間遠心した後、ＨＰＬＣで分析する。１５０μｌの遠心上澄みを１５−ｃ ｍのＮｕｃｌｅｏｓｉｌ ５−Ｃ８カラムに注入し、３４％のアセトニトリルお よび６６％の０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ２．９の混合物で溶出する。プリスチ ナマイシンIIＡおよびIIＢはそれらの２０６ｎｍでのＵＶ吸収により検出される 。 酵素活性の単位は、１時間あたり記載された条件下で１μｍｏｌのプリスチナ マイシンIIＡを合成するために必要な酵素量と定義される。 ５．１．１．Ｂ エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ ９２プリスチナマイシンIIＡシンターゼの精製 この実施例では、プリスチナマイシンIIＡ生合成経路に参加するエス．プリス チナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製さ れるかを説明する。 上記実施例５．１．１．Ａに記載されたアッセイを使用して、以下に 記載のようにプリスチナマイシンIIＡシンターゼの精製を凍結に注意し、そして 必要に応じて連続的な工程間では活性画分を−３０℃に保存して行う。 ０．１Ｍのリン酸緩衝液 ｐＨ７．２（１０容量／容量％のグリセロールを含 有する）で洗浄したエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）Ｓ Ｐ９２カルチャー（プリスチナマイシンの生産初期段階で回収した）の１５０ｇ の遠心ペレットを、４５０ｍｌの５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液 ｐＨ６．８（５ｍＭのＤＴＴおよび０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有）に溶 解する。このように得られた懸濁液を２７℃で４５分間インキュベーションし、 そして５０，０００ｇで１時間遠心する。このようにして集めた粗抽出物を硫酸 アンモニウム沈殿により分画する。４０−５５飽和％の間で沈殿するタンパク質 画分を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｆｉｎｅで脱塩し、ｐＨ６．８の５０ｍ Ｍ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ ＤＴＴ中で（１回の注入あたり １００ｍｇ）、ｍｏｎｏＱ ＨＲ １０／１０カラムに注入する。タンパク質は 直線的なＫＣＩ勾配（０−０．５Ｍ）で溶出する。酵素活性を含む画分（実施例 ５．１．１．Ａに記載された試験のように検出）をプールし、そしてＣｅｎｔｒ ｉｐｒｅｐ １０で２０ｍｌに濃縮する。２Ｍ硫酸アンモニウムを含有する１容 量のｐＨ ６．８ ５０ｍＭのｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ ＤＴ Ｔで希釈した後、タンパク質をＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ １０／ １０カラムで、硫酸アンモニウムの減少的勾配（１．０Ｍ−０Ｍ）により溶出す る。所望の活性を含有する最高の画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １０ で１ｍｌに濃縮し、そしてＢｉｏ−Ｓｉｌ ＳＥＣ ２５０カ ラムに添加（１回の注入あたり２００μl）する。活性ピークを７７，０００付 近の分子量でこの方法により検出する。活性を有する画分をＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５ カラム（ｐＨ６．８、５０ｍＭｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、ＤＴ Ｔ １ｍＭ）に注入し、ＫＣｌの勾配（０−０．５Ｍ）で溶出する。 この工程の後、酵素は純粋であり、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動では３５ ，０００および５０，０００と推定される分子量の２つのサブユニットが確認さ れる。これらは２５−ｃｍ Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラムで、０．０７％のトリフオ ロ酢酸を含有する３０−５０％のアセトニトリル（水中）の直線勾配で分離され る。 精製度は精製中の画分の比活性の上昇から計算する。 ５．１．２ タンパク質配列からのオリゴヌクレオチドの生成； この実施例では実施例５．１．１．Ｂに記載されたプリスチナマイシンIIＡシ ンターゼの２つのサブユニットのＮＨ₂−末端配列から出発して、どのようにオ リゴヌクレオチドを合成できるかを説明する。プリス チナマイシンIIＡシンターゼの２つのサブユニットは、ＳｎａＡおよびＳｎａＢ と呼ばれ、それぞれ実施５．１．１．Ｂに記載された分子量５０，０００および ３５，０００のポリペプチドに対応する。 タンパク質ＳｎａＡおよびＳｎａＢのＮＨ₂−末端配列（プリスチナマイシンI IＡシンターゼのサブユニットに対応する）は、マイクロシークエンシングで導 いた。これはエドマン分解法により、フェニルチオヒダントイン誘導体を同定す るためにＨＰＬＣ装置に連結された全自動シークエンサー（アプライドバイオシ ステムズ モデル ４０７Ａ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用 して行われる。約３０残基がそれぞれについて決定された。タンパク質ＳｎａＡ ： （配列番号２の２−２９残基を参照） タンパク質ＳｎａＢ：（配列番号３の２−３１残基を参照） さらに、これら２つのポリペプチドの内部配列は、ＳｎａＡおよびＳｎａＢの トリプシン消化および得られた断片のＶｙｄａｃ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムでの 精製後、決定された。以下の内部配列が検出された：タンパク質ＳｎａＡ ：（配列番号２の３６５−３８４残基を参照） タンパク質ＳｎａＢ．（配列番号３の１２２−１３６残基を参照） タンパク質ＳｎａＡおよびＳｎａＢの内部断片の各配列について下線を引いた 領域から、ならびにストレプトミセス（Streptomyces）（実施例８を参照）に特 異的な遺伝子コドンの縮退に従い、以下のオリゴヌクレオチドの混合物をＢｉｏ ｓｅａｒｃｈ ８６００の全自動合成機で合成した。それらを次にすでに記載さ れた技術により精製（Ｓａｗａｄｏｇｏ Ｍ．およびＶｏｎ Ｄｙｋｅ Ｍ．Ｗ ．，１９９１）した。ｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子はそれぞれタンパク質Ｓｎ ａＡおよびＳｎａＢの構造遺伝子を表す。ＳｎａＡの内部配列の下線部分に対応する混合物： ＳｎａＢの内部配列の下線部分に対応する混合物： ５．１．３合成オリゴヌクレオチド混合物の標識化およびＳＰ９２株のゲノムＤ ＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション この実施例ではプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子に特異的なオリゴ ヌクレオチドがどのように放射活性的に標識でき、そして次にすでにエス.プリ スチナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムライブラリーの ＤＮＡが移されている膜にハイブリダイズさせることができるかを説明する。 オリゴヌクレオチドの標識化は５−末端位に、ＡＴＰの［γ−³²Ｐ］ リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで転移されることにより行う。この標 識化Maniatisら（１９８９）により記載されたように行う。標識化の後、オリゴ ヌクレオチドを精製せずに使用する。 約２×５００ｎｇの各オリゴヌクレオチド混合物がこのように³²Ｐで標識され 、２つのライブラリーのそれぞれとハイブリダイズするために使用された。 各ライブラリーの膜のハイブリダイゼーションは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ、Ｊ お よびＷａｈｌ，Ｇ．（１９８４）およびＨａｍｅｓ．Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉ ｎｓ，Ｓ．Ｊ．（１９８５）に開発されたものに由来した手順に従って行う：１ ５枚の膜を５０℃にて３時間、以下のものを含有する４０ｍｌの溶液中でプレハ イブリダイゼーションする：デンハーツ（×５）［デンハーツ（×１００）：２ 重量／容量％Ｆｉｃｏｌｌ、２重量／容量％ポリビニルピロリドン、２重量／容 量％ＢＳＡ）］、ＳＳＣ（×５）［ＳＳＣ（×２０）：３Ｍ ＮａＣｌ、０．３ Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ ＮａＰＯ₄ ｐＨ６．５、０．１％ＳＤ Ｓ、２５０μｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡ。］。 次にハイブリダイゼーションは５０℃にて一晩、２０ｍｌの同一溶液中で行い 、そこに５００ｎｇの標識オリゴヌクレオチドを加える。 フィルターを次にＳＳＣ（×６）および０．５％ＳＤＳ溶液中で、室温にて３ ０分間２回洗浄し、そして次に経験的にしだいに高い温度（５０−６５℃）で洗 浄する。これらの後者の洗浄温度は、オリゴヌクレオチド混合物とハイブリダイ ズするクローンの特異性を測定するために連続的なオートラジオグラフィー的暴 露後に次第に上昇させる。 ５．１．４ コスミドｐＩＢＶ１およびｐＩＢＶ３の単離、ならびにｓｎａＡ およびｓｎａＢ遺伝子を含有する領域の決定 この実施例はプリスチナマイシンの生合成の遺伝子を含有する実施例３に記載 されたように構築されたコスミドをどのように単離することが可能であるかを説 明する。 コスミドｐＩＢＶ１およびｐＩＢＶ３は、それぞれＨＢ１０１株中で生産され たライブラリーおよびＤＨ１株中で生産されたライブラリーに由来する２つのク ローンから単離され、これはｐＩＢＶ１については両方のオリゴヌクレオチド混 合物と同時にハイブリダイズし、そしてｐＩＢＶ３についてはタンパク質Ｓｎａ Ａの内部配列に由来するオリゴヌクレオチド混合物とハイブリダイズした。 これらのコスミドを実施例２のように精製する。コスミドｐＩＢ１およびｐＩ ＢＶ３はそれぞれ、大きさがそれぞれ３０ｋｂおよび３４ｋｂと推定されるエス .プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムＤＮＡ挿入 物を含んでいる。マップ（第４および６図）は、製造元（ニューイングランドバ イオラボズ、ビバリー、マサチューセッッ州、０１９１５−５５１０、米国）の 手法に従い、種々の制限酵素で消化したものから確立した。 種々の制限酵素で消化したｐＩＢＶ１およびｐＩＢＶ３ＤＮＡとオリゴヌクレ オチド混合物とのサザンハイブリダイゼーションにより、ｓｎａＡおよび／また はｓｎａＢ遺伝子を含有するコスミドの領域の同定が可能になった。 サザンハイブリダイゼーションはManiatisら（１９８９）により記載されたよ うに行った。制限断片を０．８％アガロースゲルでの電気泳動により分離した後 、ＤＮＡをＢｉｏｈｙｌｏｎ Ｚ⁺膜（バイオプロー プ システム）上に移す。このようにして膜へ移されたＤＮＡとオリゴヌクレオ チド混合物とのハイブリダイゼーションは実施例５．１．３に記載されたように 行った。 これらのサザンハイブリダイゼーションにより、コスミドｐＩＢＶ１は実施例 ５．１．２で合成したプローブ（タンパク質ＳｎａＡおよびＳｎａＢ由来）に相 同的な配列を含有する６−ｋｂのＢａｍＨＩ断片を所有し、同様にタンパク質Ｓ ｎａＡから排他的に派生するプローブに相同的な配列を含有するＢａｍＨＩ断片 内部の２．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を所有することを表すことができた。さら にコスミドｐＩＢＶ３から得たハイブリダイゼーション信号は、それがタンパク 質ＳｎａＡから排他的に派生するプローブに相同的な配列を含有する２．５−ｋ ｂのＥｃｏＲＩ断片のみを所有することを示した。５．２ ３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼ（ｓｎｂＡ）に関する構造 遺伝子を含有するコスミドｐＩＢＶ２の単離 この実施例では、どのようにしてプリスチナマイシンＩの生合成に関する少な くとも１つの遺伝子を含有する、実施例３のように構築されたコスミドが得られ るかを説明する。 ５．２．１ ３−ヒドロキシピコリン酸の活性化に関与するタンパク質の同定お よび精製 この実施例ではどのようにして３−ヒドロキシピコリン酸の活性化の原因であ るタンパク質がエス.プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２ から均一にまで精製できるかを説明する。 ５．２．１Ａ ３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼのアッセイ この実施例ではプリスチナマイシンＩＡの生合成経路の活性のアッセイを説明 する。これはこれまでに記載されたことがなく、そしてプリスチナマイシンの生 産期間中のみに発現されるという注目すべき性質を有するものである。問題の酵 素は３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼであるが、これはその遊離酸お よびＡＴＰからＭｇＣｌ₂存在下で３−ヒドロキシピコリン酸のアデニル酸塩の 形成（第９図）を触媒する。 アッセイする酵素の画分（０．００２−０．０２０単位）を２７℃で１５分間 、全２５０μl容量のｐＨ６．８ ５０ｍＭ ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン緩衝液 、１ｍＭ ＤＴＴ、１０容量／容量％グリセロール中（３−ヒドロキシピコリン 酸（１ｍＭ）、ＡＴＰ（２ｍＭ）、ＭｇＣｌ₂（５ｍＭ）および放射活性のリン 原子の３２同位体で標識したピロリン酸四ナトリウム塩（２００μＭ）の存在下 で）でインキュベーションする。 反応は７５％の０．１Ｍ ピロリン酸四ナトリウム塩および２５％の１４％過 塩素酸の混合物中の１０ｇ／ｌ濃度の１ｍｌの活性炭懸濁液を加えることにより 停止する。撹拌後、活性炭を回収し、そして１ｍｌのピロリン酸／過塩素酸混合 物で２回洗浄する。放射線活性な有機分子を次に１ｍｌの５０％メタノールおよ び５０％のＮアンモニア溶液混合物で３回、１２ｍｌの水を含有する計数容器中 に溶出する。放射線活性はシンチレーションカウンターを装備したＣｅｒｅｎｋ ｏｖ（ＰＡＣＫＡＲＤ Ｍａｎａｘｉ ＴｒｉＣａｒｂ ４０００）により測定 する。 酵素活性の単位は、上記条件下で１時間のタイムコース中に１μｍｏｌのピロ リン酸塩がＡＴＰに取り込まれるのに必要な酵素量と定義される。 ５．２．１．Ｂ エス.プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９ ２ ３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの精製 この実施例では、プリスチナマイシンＩＡの生合成経路に参加するエス.プリ スチナエスピラリス（S .pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製 できるかを説明する。 上記実施例５．２．１．Ａに記載したアッセイを使用して、３−ヒドロキシピ コリン酸：ＡＭＰリガーゼの精製が以下に記載されるように行われる。活性画分 を−７０℃に凍結し、そして必要に応じて連続的な工程の間では−３０℃に保存 することに注意する。 プリスチナマイシン生産フェーズの初期段階で目収したエス.プリスチナエス ピラリス（S .pristinaespiralis）ＳＰ９２のカルチャーの遠心ペレット２３４ ｇ（１０容量／容量％のグリセロールを含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液 ｐＨ ７．２で洗浄したもの）を、２３４ｍｌのｐＨ８．０ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ緩衝液（４ｍＭ ＤＴＥ、１ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、 １５容量／容量％のグリセロールおよび０．６ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有す る）に溶解する。このように得られた懸濁液を２７℃にて３０分間インキュベー ションし、そして５０，０００ｇで１時間遠心する。このようにして回収した粗 抽出物（ｐＨ ８．０ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４ｍＭＤＴＥ， １ｍＭ ベンズアミジン １ｍＭ ＰＭＳＦ、１５容量／容量％グリセロール中 の）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのカラム（８０ｍｌ）に注 入する。タンパク質をＫＣｌの直線勾配（０−０．４Ｍ）で溶出する。酵素活性 を含有する画分を、（実施例５．２．１．Ａに記載された試験法で検出）をプー ルし、２Ｍの硫酸アンモニウ ムを含有する１容量の ｐＨ ８．０ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、 １ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１５容量／容量グリセロールで希 釈する。次にタンパク質をＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのカラム（５０ｍ ｌ）でクロマトグラフィーを行い、ｐＨ ８．０ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ緩衝液、１ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１５容量／容量グリセ ロール中での硫酸アンモニウムの減少勾配（１．０Ｍ−０Ｍ）により溶出する。 ４ｍＭ ＤＴＥを添加した後、活性画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １ ０で５ｍｌに濃縮し、そして次にＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ｐｒｅｐ ｇｒａｄ ｅのカラム（１００ｍｌ）に添加する。所望の活性を含む画分をプールし、そし てｐＨ ８．０ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４ｍＭ ＤＴＥ、１ｍ Ｍ ベンズアミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１５容量／容量グリセロール（１回の 注入あたり６ｍｇ）中にてＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５のカラムに注入し、ＫＣｌ の直線的勾配（０−０．４Ｍ）で溶出する。活性画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉ ｃｏｎ １０で１ｍｌに濃縮し、３容量のｐＨ ６．８ ５０ｍＭ Ｂｉｓ−ｔ ｒｉｓプロパン緩衝液、４ｍＭ ＤＴＥ、 １ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１５容量／容量グリセロールで希釈し、そして後者の緩衝液中にてＭ ｏｎｏＱＨＲ ５／５のカラムに注入し（１回の注入あたり２ｍｇ）、そしてＫ Ｃｌの直線的勾配（０−０．３Ｍ）で溶出する。所望のリガーゼを含有する最高 の画分をプールし、そして次にｐＨ ６．８ ２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝 液、５０ｍＭ 硫酸ナトリウム中にてＢｉｏ−Ｓｉｌ ＳＥＣ ２５０カラムに 添加する。活性ピークをこの方法で分子量６０，０００あたりに検出する。 ３−ヒドロキシピコリン酸の活性化活性を所有するタンパク質を今後ＳｎｂＡ と命名する。 この段階の後、酵素は純粋であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動においてその分 子量は約６７，０００と推定される。 ５．２．２．タンパク質配列からのオリゴヌクレオチドの精製： この実施例ではタンパク質３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼのＮＨ₂ −末端および内部配列から出発して、どのようにオリゴヌクレオチドを合成で きるかを説明する。 タンパク質ＳｎｂＡのＮＨ₂−末端配列を、実施例５．１．２に記載したよう にマイクロシークエンシングにより導いた。約２０残基がこのようにして同定さ れた。 タンパク質ＳｎａＡの内部の約２０アミノ酸配列もトリプシン加水分 解後に同定され、得られた断片の精製をＶｙｄａｃ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムで 行った。 タンパク質３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰ リガーゼのＮＨ₂−末端 （配列番号５に関しては残基１−２１を参照のこと） タンパク質３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰ リガーゼの内部配列 （配列番号５に関しては残基４４８−４６７を参照のこと） 各配列の下線部から、ならびにストレプトミセス（Streptomyces）に特異的な 遺伝子コードの縮退により（実施例８参照）、以下の混合オリゴヌクレオチドが 合成された： タンパク質３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰ リガーゼのＮＨ₂−末端配列 の下線部に対応する混合物 タンパク質３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰ リガーゼの内部配列の下線部 に対応する混合物 ５．２．３ 合成オリゴヌクレオチドの標識およびエス．プリスチナエスピラリ ス（S .pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムＤＮＡライブラリーのハイブリダ イゼーション この実施例ではプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子に特異的なオリゴ ヌクレオチドを、どのように放射活性的に標識し、そしてエス.プリスチナエス ピラリス（S .pristinaespiralis）のゲノムライブラリーのＤＮＡがすでに移さ れた膜とハイブリダイズさせることができるかを説明する。 オリゴヌクレオチドの標識は、実施例５．１．３に記載したように５’−末端 位にＡＴＰの［γ−³²Ｐ］ リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより転 移させることにより行う。 約２×５００ｎｇの各混合オリゴヌクレオチドがこのように³²Ｐで標識され、 そしてそれぞれ２つのライブラリーをハイブリダイズさせるために使用された。 各ライブラリーの膜のハイブリダイゼーションは実施例５．１．３に記載され たように行われる。 ５．２．４．コスミドｐＩＢＶ２の単離および３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭ Ｐリガーゼに関する構造遺伝子を含有する領域の決定 この実施例では、少なくとも１つの３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガー ゼの構造遺伝子を含有する実施例３で構築されたコスミドをどのようにして得る ことができるかを説明する。 コスミドｐＩＢＶ２を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１中で生産されたライブラリーの クローン（これは両方の混合オリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズする） から単離した。 このコスミドを実施例２に記載したように精製した。これは大きさが４７ｋｂ と推定されるエス.プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の ゲノムＤＮＡ挿入物を含有する。マップ（第５図）は実施例５，１，４に記載し たように種々の制限酵素の消化物から確立した。 種々の酵素で消化したｐＩＢＶ２ ＤＮＡと混合オリゴヌクレオチドとのサザ ンハイブリダイゼーションにより、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼ に関する構造遺伝子を含有する領域を同定できた。サザンブロッティングおよび ハイブリダイゼーションは実施例５．１．４に記載したように行った。 ハイブリダイゼーションの結果により、コスミドｐＩＢＶ２は実施例５．２． ２で合成されたプローブに相同的な配列を含有する５．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｂａｌ II断片を保有した。５．３ コスミドｐＩＢＶ３についてプリスチナマイシンＩシンターゼII（Ｓｎ ｂＣ）に関する構造遺伝子部分の存在の実証 この実施例ではすでに単離された（実施例５．１）コスミドについて、プリス チナマイシンＩの生合成に関する遺伝子の存在をどのように同定することができ るかを説明する。 ５．３．１ トレオニンおよびアミノ酪酸残基のペプチド鎖プリスチナマイシン ＩＡ中への取り込みに関与するプリスチナマイシンＩシンターゼIIの同定 この実施例はトレオニンおよびアミノ酩酸残基の、プリスチナマイシンＩＡの ペプチド鎖への取り込みの原因であるタンパク質が、エス．プリスチナエスピラ リス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２からどのように均一にまで精製できるか を説明する。 ５．３．１．Ａ プリスチナマイシンＩシンターゼIIの部分活性のアッセイ この実施例ではプリスチナマイシンＩＡの生合成経路の活性のアッセイを説明 する。これはこれまでに記載されたことがなく、そしてプリスチナマイシンの生 産期間中のみに発現されるという注目すべき性質を有するものである。問題の活 性はＡＴＰおよびＭｇＣｌ₂の存在下で、トレオニンおよびアミノ酪酸残基の、 プリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖への取り込みの原因であるペプチドシンタ ーゼの部分活性である。 トレオニン：ＡＭＰリガーゼおよびアミノ酪酸：ＡＭＰリガーゼ活性は、３− ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼについて５．２．１．Ａに記載されたも のと同様に、ＡＴＰ−ピロリン酸変換の酵素試験で測定する。 酵素とトレオニンまたはアラニン（プリスチナマイシンＩＣで見いだされるア ミノ酪酸の類似体）とのアミノアシル化反応は、ＡＴＰ−ピロリン酸変換に影響 するかもしれない他の酵素（特にアミノアシル−ｔＲＮＡシンターゼ）からペプ チドシンターゼを分別することができる。以下に記載した酵素とトリチウム−標 識トレオニンとのアミノアシル化の試験はこの実施例に使用したものである。 アッセイする酵素画分（０．２−２単位）を２７℃で１５分間、全容量が２５ ０μｌのｐＨ ６．８ ５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ ＤＴＴ、１０容量／容量％グリセロール（１μＣｉの［３−³Ｈ］−Ｌ−トレオ ニン（１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＡＴＰ（２ｍＭ）およびＭｇＣｌ₂（５ｍＭ）の 存在下）中でインキュベーションする。 反応を１５０μlの２５％トリクロロ酢酸溶液を加えて停止する。沈殿したタ ンパク質をマイクロフィルター上に回収し、４００μlの７％トリクロロ酢酸で ３回洗浄し、その後４００μlのＮ水酸化ナトリウムで２回、計数容器（１ｍｌ のＮ ＨＣｌおよび１２ｍｌのシンチレーションカクテル（ベックマン リーデ ィゲル：Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｒｅａｄｙｇｅｌ）を含有する）中に溶出する。こ の容器に含まれる放射線活性をシンチレーションカウンター（ＰＡＣＫＡＲＤ Ｍｉｎａｘｉ ＴｒｉＣａｒｂ ４０００）で測定する。これは所望のペプチド シンターゼに共有的に結合したトレオニンの量を表す。 酵素活性の単位は１ピコモルのトレオニンが、上記条件下で１５分間に共有的 に結合するために要する酵素量と定義する。 ５．３．１．Ｂ．プリスチナマイシンＩシンターゼIIの精製 この実験では、プリスチナマイシンＩＡの生合成経路に参加するエス．プリス チナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製で きるかを説明する。 上記実施例５．３．１．Ａに記載した酸を使用して、トレオニンおよびアミノ 酪酸残基のプリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖への取り込みの原因であるペプ チドシンターゼの精製は以下に記載されるように行われる。４℃で操作し、活性 画分は−７０℃に保存することに注意する。 プリスチナマイシン生産フェーズの初期段階で回収したエス.プリスチナエス ピラリス（S .pristinaespiralis）ＳＰ９２のカルチャーの遠心ペレット１５０ ｇを（１０容量／容量％のグリセロールを含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液 ｐ Ｈ７．２で洗浄したもの）を、４５０ｍｌのｐＨ ８．０ １００ｍＭ Ｔｒｉ ｓ−ＨＣｌ緩衝液（４ｍＭ ＤＴＥ、 １ｍＭ ペンズアミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｅ ＧＴＡ、１５容量／容量％のグリセロールを含有する）に溶解する。このように 得られた懸濁液を、５０００ｐｓｉの圧力に調整したフレンチプレスを使用して 粉砕し、そして５０，０００ｇで１時間遠心する。このようにして回収した粗抽 出物を、（ｐＨ ８ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４ｍＭ ＤＴＥ、 ２ｍＭ ベンズアミジン、２ｍｇ／ｌ ロイペプチン、１ｍｇ／ｌ Ｅ−６４、 １５容量／容量％グリセロール中の）Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌ ｏｗのカラム（２００ｍｌ）に注入する。タンパク質をＫＣｌの直線勾配（０− ０．６Ｍ）で溶出する。カラムから溶出した各画分を、その１−１０容量の１ｍ Ｍ ＰＭＳＦ、５ｍＭ ＥＤＴＡＮ ５ｍＭ ＥＧＴＡ溶液で処理する。酵素活 性を含む画分（実施例５．３．１．Ａに記載された試験法で検出）をプールし、 そしてｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３０の限外濾過により２８ｍｌの最終容量に再濃 縮する。この濃縮物を４−ｍｌのアリコートとしてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｈｉ−Ｌｏａｄ １６／６０浸透カラム（ｐＨ ６．８ ５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔ ｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ ベンズアミジン、４ｍＭ ＤＴＥＮ ０．２ｍ Ｍ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＫＣｌ、２０容量／容量 グリセロールで平衡化した）に注入する。アッセイ後、活性画分をプールし、そ してｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３０により１５ｍｌに再濃縮し、次にＰＤ−１０（ ｐＨ ８．０ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４ｍＭ ＤＴＥ、２ｍＭ ベンズアミジン、２ｍｇ／ｌ ロイペプチン、１ｍｇ／ｌ Ｅ−６４、２０重 量／重量％グリセロール中）で脱塩し、２部分にて、同一緩衝液で平衡化したＭ ｏｎｏＱ ＨＲ １０／１０カラム に添加し、そして同一緩衝液中の０．４Ｍ ＫＣｌの直線的勾配で溶出する。所 望の活性を含む画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３０そして次にＣｅｎ ｔｒｉｃｏｎ３０で１ｍｌの最終容量に再濃縮し、そして５部分にてＳｕｐｅｒ ｏｓｅ ６ ＨＲ １０／３０（ｐＨ ６．８ ５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプ ロパン緩衝液、１ｍＭ ベンズアミジン、４ｍＭ ＤＴＥ、０．２ｍＭ Ｐｅｆ ａｂｌｏｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＫＣｌ、２０容量／容量グリセロー ル中）に注入する。活性ピークをこの方法で分子量４５０，０００あたりに検出 する。 この段階の後、酵素は純粋であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動においてその分 子量は約２４０，０００と推定される。このバンドはまたトリチル化トレオニン でのアミノアシル化により標識されたタンパク質のすべての放射線活性を含む。 この段階で、１００μＣｉ／ｍｌのトレオニン（１５ｃｉ／ｍｍｏｌ）の濃縮 物を使用した酵素の最大活性は、３６７０単位／ｍｇにのぼる；また酵素は、Ｌ −アミノ酪酸またはＬ−アラニンでアデニル酸を形成できる；酵素とトリチル化 アラニンとのアミノアシル化反応が見いだされ、そして２００μＣｉ／ｍｌの［ ２，３−³Ｈ］−Ｌ−アラニン（１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で１５分間の最 大活性は２２９０ｐｍｏｌ／ｍｇである。 ５．３．２．タンパク質配列からのオリゴヌクレオチドの生産： この実施例ではプリスチナマイシンＩシンターゼIIの内部配列から出発して、 どのようにオリゴヌクレオチドを合成できるかを説明する。 プリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖中へトレオニンおよびアミノ酪酸残基を 取り込む原因となるペプチドシンターゼの内部配列を、トリプシン加水分解の後 、得られた断片をＶｙｄａｃ Ｃ１８カラムで精製した後、実施例５．１．２に 記載したようにマイクロシークエンシングにより導き出した。 タンパク質プリスチナマイシンＩシンターゼIIの内部配列 （配列番号１２に関しては残基４９−６１を参照のこと） これらの配列の下線部領域から、ならびにストレプトミセス（Streptomyces） に特異的な遺伝子コードの縮退により（実施例８参照）、以下の混合オリゴヌク レオチドが合成された： タンパク質プリスチナマィシンＩシンターゼIIの内部の配列１の下線部に対応 する混合物 タンパク質プリスチナマイシンエシンターゼIIの内部配列２の下線部に対応す る混合物 ５．３．３ 合成オリゴヌクレオチド混合物の標識およびコスミドＰＩＢＶ３ ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション この実施例ではプリスチナマイシンＩの生合成に関する遺伝子に特異的なオリ ゴヌクレオチドを、どのように放射活性的に標識し、そしてコスミド ｐＩＢＶ ３ ＤＮＡがすでに移された膜とハイブリダイズさせることができるかを説明す る。 オリゴヌクレオチドの標識は、実施例５．１．３に記載したように５’−末端 位にＡＴＰの［γ−³²Ｐ］ リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより転 移させることにより行う。 約５００ｎｇの混合オリゴヌクレオチドがこのように³²Ｐで標識され、そして 種々の酵素で消化したｐＩＢＶ３ ＤＮＡのサザンハイブリダイ ゼーションのために使用された。これらのハイブリダイゼーションで、プリスチ ナマイシンＩシンターゼIIに関する構造遺伝子部分がコスミドＰＩＢＶ３に保持 されていることを示すことができ、そしてこの遺伝子を含有する領域を同定する ことができる。サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションは実施例５ ．１．４に記載されたように行われる。 ハイブリダイゼーションの結果は、コスミドｐＩＢＶ３が実施例５．３．２で 合成されたプローブに相同的な配列を含有する６．２−ｋｂのＳｐｈＩ断片を保 持することを示すことができた。５．４．コスミドｐＩＢＶ３について、プリスチナマイシンＩシンターゼIII（ ＳｎｂＤ）に関する遺伝子部分の存在の実証 この実施例ではすでに単離された（実施例５．１）コスミドについて、プリス チナマイシンＩの生合成に関する遺伝子の存在をどのように同定することができ るかを説明する。 ５．４．１ プロリンおよびｐ−ジメチルアミノフェニルアラニン残基のプリス チナマイシンＩＡのペプチド鎖中への取り込みに関与するプリスチナマイシンエ シンターゼIIIの同定 この実施例はプロリンおよびｐ−ジメチルアミノフェニルアラニン残基の、プ リスチナマイシンＩＡのペプチド鎖への取り込みの原因であるタンパク質が、ど のようにエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２から 均一にまで精製できるかを説明する。 ５．４．１．Ａ プリスチナマイシンＩシンターゼIIIの部分活性のアッセイ この実施例ではプリスチナマイシンＩＡの生合成経路の活性のアッセ イを説明する。これはこれまでに記載されたことがなく、そしてプリスチナマイ シンの生産期間中のみに発現されるという注目すべき性質を有するものである。 問題の活性はＳＡＭ、ＡＴＰおよびＭｇＣｌ₂の存在下で、プロリンおよびパラ −ジメチルアミノフェニルアラニン残基の、プリスチナマイシンＩＡのペプチド 鎖への取り込みの原因であるペプチドシンターゼの部分活性である。 プロリン：ＡＭＰリガーゼおよびｐ−ジメチルアミノフェニルアラニン：ＡＭ Ｐリガーゼ活性は、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼについて５．２ ．１．Ａに記載されたものと同様に、ＡＴＰ−ピロリン酸変換の酵素試験で測定 する。 酵素とプロリンおよびｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンとのアミノアシル 化反応は、ＡＴＰ−ピロリン酸変換を行うことができる他の酵素（特にアミノア シル−ｔＲＮＡシンターゼ）からペプチドシンターゼを分別することができる。 同じく酵素でアシル化されたｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンのα−アミノ 官能基のＮ−メチル化について応用する。したがって後者の試験のＮ−メチル化 の特徴を、この実施例に使用する。 アッセイする酵素画分（０．２−２単位）を２７℃で１５分間、全容量が２５ ０μlのｐＨ ６．８ ５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ ＤＴＴ、１０容量／容量％グリセロール（１μＣｉの［メチル−³Ｈ］−ＳＡＭ （１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、パラ−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン（１ｍ Ｍ）、ＡＴＰ（２ｍＭ）およびＭｇＣｌ₂（５ｍＭ）の存在下）中でインキュベ ーションする。 反応を１５０μlの２５％トリクロロ酢酸溶液を加えて停止する。沈殿 したタンパク質をマイクロフィルター上に回収し、４００μlの７％トリクロロ 酢酸で３回洗浄し、その後４００μlのＮ水酸化ナトリウムで２回、計数容器（ １ｍｌのＮ ＨＣｌおよび１２ｍｌのシンチレーションカクテル（ベックマン リーディゲル）を含有する）中に溶出する。この容器に含まれる放射線活性をシ ンチレーションカウンター（ＰＡＣＫＡＲＤ Ｍｉｎａｘｉ ＴｒｉＣａｒｂ ４０００）で測定する。これは所望のペプチドシンターゼに共有的に結合したＮ −メチル化パラ−ジメチルアミノフェニルアラニンの量を表す。 酵素活性の単位は１ピコモルのＮ−メチル化ｐ−ジメチルアミノフェニルアラ ニンが、上記条件下で１５分間に共有的に結合するために要する酵素量と定義す る。 ５．４．１．Ｂ．プリスチナマイシンＩシンターゼIIIの精製 この実験では、プリスチナマイシンＩＡの生合成経路に参加するエス．プリス チナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製で きるかを説明する。 上記実施例５．４．１．Ａに記載したアッセイを使用して、プロリンおよびパ ラ−ジメチルアミノフェニルアラニン残基のプリスチナマイシンＩＡのペプチド 鎖への取り込みの原因であるペプチドシンターゼの精製は以下に記載されるよう に行われる。４Ｃで操作し、活性画分は−７０℃に保存することに注意する。 プリスチナマイシン生産フェーズの初期段階で回収したエス.プリスチナエス ピラリス（S .pristinaespiralis）ＳＰ９２のカルチャーの遠心ペレット２５０ ｇを（０．１Ｍのリン酸緩衝液 ｐＨ７．２、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍＭ ＥＤ ＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５Ｍ ＫＣｌ、 １０容量／容量％のグリセロールで洗浄したもの）を、７５０ｍｌのｐＨ ８ ．０ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（４ｍＭ ＤＴＥ、４ｍＭ ベンズ アミジン、０．２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴ Ａ、２ｍｇ／ｌ ロイペプチン、２ｍｇ／ｌＳＴＩ、２ｍｇ／ｌ アプロチニン 、１ｍｇ／ｌ Ｅ−６４、２０容量／容量％のグリセロールを含有する）に溶解 する。このように得られた懸濁液を、５０００ｐｓｉの圧力に調整したフレンチ プレスを使用して粉砕し、そして５０，０００ｇで１時間遠心する。このように して回収した粗抽出物を硫酸アンモニウム沈殿により分画する。０から３５％飽 和硫酸アンモニウムの間に沈殿するタンパク質画分を破壊緩衝液中に再溶解し、 そして平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ７５ Ｆｉｎｅで脱塩し、同じ緩衝液 で溶出する。このようにして得られたタンパク質を、（ｐＨ ８．０ １００ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４ｍＭ ＤＴＥ、２ｍＭ ベンズアミジン、２ｍ ｇ／ｌ ロイペプチン、１ｍｇ／ｌ Ｅ−６４、２０容量／容量％グリセロール 中の）Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのカラム（２００ｍｌ）に 注入し、そしてＫＣｌの直線勾配（０−０．６Ｍ）で溶出する。カラムから溶出 した各画分を、その１−１０容量の２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、５ｍＭ ＥＤＴ Ａ、 ５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ベンズアミジン溶液で処理する。酵素活性を 含む画分（実施例５．４．１．Ａに記載された試験法で検出）をプールし、そし て８０％飽和の硫酸アンモニウムで沈殿させる。沈殿するタンパク質をｐＨ ６ ．８ ５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ ベンズアミジン、 １ｍＭ ＤＴＥ、０．２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍｇ／ｌ ロイ ペプチン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０容量／容量％グリセロールに再溶解し、 ５４−ｍｌアリコート部分を、同一緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２０ ０ Ｈｉ−Ｌｏａｄ １６／６０浸透カラムに注入し、そして同一緩衝液で溶出 する。アッセイ後、活性画分をプールし、そしてｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３０に より３ｍｌに再濃縮し、次に２０ｍｌのｐＨ ８．０ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ緩衝液、４ｍＭ ＤＴＥ、１ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、 ２０容量／容量％グリセロールで再希釈し、２部分にて同一緩衝液で平衡化した ＭｏｎｏＱ ＨＲ １０／１０カラムに添加し、そして同一緩衝液中の０．４Ｍ ＫＣｌの直線的勾配で溶出する。所望の活性を含む最高画分をプールし、酵素活 性の特性決定のための材料およびそのマイクロシークエンシングとして使用する 。 この段階の後、酵素は純粋であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動においてその分 子量は約２５０，０００と推定される。このバンドはまたトリチル化ＳＡＭおよ びパラ−ジメチルアミノフェニルアラニンでのアミノアシル化により標識された タンパク質のすべての放射線活性も含む。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＲ １０／ ３０の浸透において、酵素の天然の分子量は７００，０００と推定される。 この段階で、この酵素はプロリンとアデニル酸塩を形成することもできる；ト リチル化プロリンとの酵素のアミノアシル化反応が検出され、２００μＣｉ／ｍ ｌの［５−³Ｈ］−Ｌ−プロリン（３４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で１５分間の 最大活性は、２４９０単位／ｍｇである。 ５．４．２．タンパク質配列からのオリゴヌクレオチドの生産 この実施例ではプリスチナマイシンＩシンターゼIIIの内部配列から出発して 、どのようにオリゴヌクレオチドを合成できるかを説明する。 プリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖中へプロリンおよびパラ−ジメチルアミ ノフェニルアラニン残基を取り込む原因となるペプチドシンターゼの内部配列を 、シアノーゲンブロミド処理および得られた断片をＶｙｄａｃ Ｃ１８カラムで 精製した後、実施例５．１．２に記載したようにマイクロシークエンシングによ り導き出した。 タンパク質プリスチナマイシンＩシンターゼIIIの内部配列 １（配列番号１３に関しては残基２−２０を参照のこと） この配列の下線部領域から、ならびにストレプトミセス（Streptomyces）に特 異的な遺伝子コードの縮退により（実施例８参照）、以下の混合オリゴヌクレオ チドが合成された： タンパク質プリスチナマイシンＩシンターゼIIIの内部配列の下線部に対応す る混合物 ５．４．３ 合成オリゴヌクレオチド混合物の標識およびコスミドＰＩＢＶ３ ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション この実施例ではプリスチナマイシンＩの生合成に関する遺伝子に特異的なオリ ゴヌクレオチドを、どのように放射活性的に標識し、そしてコスミド ｐＩＢＶ ３ ＤＮＡがすでに移された膜とハイブリダイズさせることができるかを説明す る。 オリゴヌクレオチドの標識は、実施例５．１．３に記載したように５’−末端 位にＡＴＰの［γ−³²Ｐ］ リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより転 移させることにより行う。 約５００ｎｇの混合オリゴヌクレオチドがこのように³²Ｐで標識され、そして 種々の酵素で消化したｐＩＢＶ３ ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのた めに使用された。これらのハイブリダイゼーションで、プリスチナマイシンＩシ ンターゼIIIに関する構造遺伝子部分がコスミドｐＩＢＶ３に保持されているこ とを示すことができ、そしてこの遺伝子を含有する領域を同定することができる 。サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションは実施例５．１．４に記 載されたように行われ る。 ハイブリダイゼーションの結果では、コスミドｐＩＢＶ３が実施例５．４．２ で合成されたプローブに相同的な配列を含有する８．４−ｋｂのＳｐｈＩ断片を 保持することを示すことができた。５．５ コスミドｐＩＢＶ３についてプリスチナマイシンＩシンターゼIV（Ｓｎ ｂＥ）に関する構造遺伝子部分の存在の実証 この実施例ではすでに単離された（実施例５．１）コスミドについて、プリス チナマイシンＩの生合成に関する遺伝子の存在をどのように同定することができ るかを説明する。 ５．５．１ フェニルグリシン残基をプリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖中に 取り込む原因となるペプチドシンターゼII定（プリスチナマイシンＩシンターゼ IVと言う）。 ５．５．１．Ａ フェニルグリシン残基をプリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖 中に取り込む原因となるペプチドシンターゼ（プリスチナマイシンＩシンターゼ IV）により保持される酵素活性のアッセイ この実施例ではプリスチナマイシンＩＡの生合成経路の酵素活性のアッセイを 説明する。これはこれまでに記載されたことがなく、そして野生型微生物中での プリスチナマイシンの生産期間中のみに発現されるという注目すべき性質を有す るものである。問題の活性はＡＴＰおよびＭｇＣｌ₂の存在下で、Ｌ−フェニル グリシン残基を、ペプチド鎖（第１２図）へ取り込む原因となるペプチドシンタ ーゼ（プリスチナマイシンＩシンターゼIV）の活性である。プリスチナマイシン ＩシンターゼIVのフェニルグリシン：ＡＭＰリガーゼ活性は、インキュベーショ ン緩衝液中Ｌ−フェニルグリシン（１ｍＭ）およびＫＣｌ（５０ｍＭ）の存在下 で、 ３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼ活性について５．２．１．Ａに記載 されたものと同様に、ＡＴＰ−ピロリン酸変換の酵素試験で測定する。 ５．５．１．Ｂ．フェニルグリシン残基をプリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖 中に取り込む原因となるペプチドシンターゼ（プリスチナマイシンＩシンターゼ IVの精製 この実施例では、プリスチナマイシンＩＡの生合成経路に参加するエス．プリ スチナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製 できるかを説明する。上記実施例５．５．１．Ａに記載したアッセイを使用して 、プリスチナマイシンＩシンターゼIVの精製は以下に記載されるように行われる 。すべての操作を４℃で行う。活性を含む画分はすぐに凍結し−７０℃に保存す る。 ７０ｇの湿潤細胞（実施例５．２．１．Ｂに記載したように回収）を、２５０ ｍｌの細胞溶解緩衝液（２５％のグリセロール、４ｍＭ ＤＴＥ、１ｍＭ ＥＧ ＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍｇ／１Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ ＳＴＩ、２ｍｇ／ｌ α₂−マクログロブリン、１ｍｇ／ｌ ロイペプチン、 ２ｍｇ／ｌアプロチニン、５ｍＭ ベンズアミジン、０．６ｍｇ／ｍｌリゾチー ムを含有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ ８．０）に再懸濁する 。このように得られた溶液を、４℃に１時間撹拌しながら保ち、そして次に５０ ，０００ｇで１時間遠心する。このようにして得られた上澄みを、溶解緩衝液中 でＳｅｐｈｄｅｘ Ｇ−２５のカラムに注入し、そして排除画分（各クロマトグ ラフィー操作に約２５０ｍｇのタンパク質を注入）をＭｏｎｏＱ ＨＲ １６／ １０（ファルマシア）（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ緩衝液ｐＨ ８．０、４ｍＭ ＤＴＥ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ 、１ｍｇ／１ Ｅ−６４、２ｍｇ／１ ＳＴＩ、２０％グリセロールで平衡化） に注入する。タンパク質をＫＣｌの直線勾配（０−０．６Ｍ）で溶出し、カラム からの溶出時に、各画分をその１−１０容量の２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、５ｍ Ｍ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で処理する。酵素活性を含む画分をプール し、そして画分３容量あたり１容量の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ ８．０、１５％のグリセロール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ベンズアミジン 、４ｍＭ ＤＴＴ、３．４Ｍ 硫酸アンモニウムと混合する。この溶液をＰｈｅ ｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ １０／１０（各クロマトグラフィー操作に１ ／５の溶液を注入）に注入し、そしてタンパク質を硫酸アンモニウムの減少的勾 配（０．９−０Ｍ）で溶出する。活性を含有する画分をプールし、そして溶液を Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３０で３５００μlに濃縮し、そして２部に分けてＳｕ ｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｈｉ−Ｌｏａｄ １６／６０カラム（５０ｍＭ ｂｉｓ −ｔｒｉｓプロパン緩衝液 ｐＨ ６．８、２０％グリセロール、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ベンズアミジン、１ｍ Ｍ ＥＤＴＡで平衡化および溶出）に注入する。活性画分を９容量の２５％グリ セロール、４ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ベンズアミジンを含有 する５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液 ｐＨ ６．８で希釈し、同一 緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５カラムに注入する。所望の活性を ０−０．４Ｍ ＫＣｌの直線的勾配で溶出し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で６３ ０μlに濃縮する。次に所望のタンパク質は、試料を８０℃で１０分間ＳＤＳ／ メルカプトエタノール混合物で加 熱することにより変性させた後、６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動で精製 する。電気泳動およびクーマシーブルーでゲルを染色した後、タンパク質を含有 するゲルのバンドを切り出し、そしてタンパク質をゲルからＣｅｎｔｒｉｌｕｔ ｏｒ中に電気溶出する。 注意：プリスチナマイシンＩシンターゼIVに対応するバンドはトリチル化（ト リチル化フェニルグリシンとの共有結合：実施例５．５．２．を参照にされたい ）したものとの比較により同定する。 この段階の後、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において酵素は純粋である。そ の分子量は約１７０，０００と推定される。 ５．５．２．プリスチナマイシンＩシンターゼIV、酵素に対する放射活性フェニ ルグリシンのチオエステル化による標識 フェニルグリシン：ＡＭＰリガーゼ活性を介してアデニル酸の状態で活性化し た後、フェニルグリシンを伸長化中にペプチド鎖中に取り込まれる前に、フェニ ルグリシンを酵素の活性部位のチオール基に転移させる（ペプチド抗生物質の一 般的な生合成過程では“チオテンプレート メカニズム（ｔｈｉｏｔｅｍｐｌａ ｔｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）”という名前で知られている）。一般的に、アミノ 酸ノ活性化に影響するタンパク質の放射線標識は、放射活性な状態のアミノ酸で チオエステル誘導体を調製することにより行うことができる。 例として、プリスチナマイシンＩシンターゼIV標識化は、５０μｇのタンパク 質（ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５クロマトグラフィーカラムからの溶出活性画分；上 記実施例５．５．１．Ｂを参照のこと）を、２７℃で１時間１００μＣｉの（Ｒ Ｓ）−２−フェニル［２−³Ｈ］グリシン（１８Ｃｉ／ｍｍｏｌ；アマシャム： Ａｍｅｒｓｈａｍ）と、７０μlの ５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液中 ｐＨ ６．８（２０％グリセロ ール、２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＡＴＰ、０．１５ＭＮａＣｌ、４ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有 する）でインキュベーションすることにより行われる。変性（メルカプトエタノ ール無しでＳＤＳのみ）後、タンパク質を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、６％ゲ ル）で分離し、クーマシーブルーで視覚化する。タンパク質バンドの計数および オートラジオグラフィー（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＭＰ；ゲルにアマシャムのＡｍ ｐｌｉｆｙを染み込ませた後のフルオログラフィー）による放射活性のプロフィ ールの分析では、分子量１７０，０００の単一放射活性バンドが現れる。 ５．５．３．プリスチナマイシンＩシンターゼIVが保持する他の活性 実施例５．５．２に記載されたようにフェニルグリシンの取り込みの原因であ るペプチドシンターゼの精製により、分子量が１７０，０００の純粋なタンパク 質が得られる。このタンパク質は試験した他のアミノ酸（特にピペコリン酸また は４−オキソピペコリン酸）を活性化しない。このタンパク質の第２の調製は、 Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ の工程を排除して５．５．１．Ｂに記載され たように行われるが、別のエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespirali s ）ＳＰ９２カルチャーから出発して、５．４．１Ｂに記載するようにフレンチ プレスで調製された粗抽出物を、ＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５の工程の溶出時のタ ンパク質として得、これは純度において同じ実施例５．５．１．Ｂに記載した工 程で得られたタンパク質と同等であるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２５０，０００ の分子量を有した。この新規調製物は、フェニルグリシンの活性化およびチオエ ステル化の能力があったが、加えて３−ヒドロキシピコリン酸について記載した ５．２．１．Ａと同様に、変換試験においてＬ−ピペコリン酸（１ｍＭ）でＡＴ Ｐ−ピロリン酸変換活性を有した。さらに、１７０，０００のタンパク質は、大 変不純なタンパク質調製物であってもＬ−ピペコリン酸でＡＴＰ−ピロリン酸変 換活性をもたない。エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）Ｓ Ｐ９２は天然には４−オキソピペコリン酸の代わりにピペコリン酸残基を有する 少量のプリスチナマイシンＩＡ類似体を生産することに注目すべきである。した がって、このことはフェニルグリシンの取り込みの原因であるペプチドシンター ゼ（プリスチナマイシンＩシンターゼIVが以前の残基（おそらくピペコリン酸） も取り込むことを触媒することを実証 するものである。２つの調製物においてプリスチナマイシンＩシンターゼIVにつ いて得られた異なる分子量（１７０，０００および２５０，０００）は、初めの 場合における部分的タンパク質開裂現象に起因し、Ｌ−ピペコリン酸の活性化活 性の損失を導く。 ５．５．４． タンパク質配列からのオリゴヌクレオチドの生産 この実施例ではプリスチナマイシンＩシンターゼIVの内部配列から出発して、 適当に選択したオリゴヌクレオチドを使用してどのように対応する遺伝子の試験 を開始できるかを説明する。 １５アミノ酸のプリスチナマイシンＩシンターゼIVの内部配列は、精製タンパ ク質をシアノーゲンブロミド開裂し、そして得られた断片をＶｙｄａｃ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムで精製した後に同定した。 タンパク質プリスチナマイシンＩシンターゼIVの内部配列 （配列番号１６に関しては残基８２−９８を参照のこと） 各これらの配列の下線部領域から、ならびにストレプトミセス（Streptomyces ）に特異的な遺伝子コードの縮退により（実施例８参照）、以下の混合オリゴヌ クレオチドが合成された： 混合はタンパク質プリスチナマイシンＩシンターゼIVの内部配列の下線部分に 対応する： ５．５．５ 合成オリゴヌクレオチド混合物の標識およびコスミドｐＩＢＶ３ ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション この実施例ではプリスチナマイシンＩの生合成に関する遺伝子に特異的なオリ ゴヌクレオチドを、どのように放射活性的に標識し、そしてコスミド ｐＩＢＶ ３ ＤＮＡがすでに移された膜とハイブリダイズさせることができるかを説明す る。 オリゴヌクレオチドの標識化は、実施例５．１．３に記載したように５’−末 端位にＡＴＰの［γ−³²Ｐ］リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより転 移させることにより行う。 約５００ｎｇの混合オリゴヌクレオチドがこのように³²Ｐで標識され、そして 種々の酵素で消化したｐＩＢＶ３ ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのた めに使用された。これらのハイブリダイゼーションで、プリスチナマイシンＩシ ンターゼIIに関する構造遺伝子部分がコスミドｐＩＢＶ３に保持されていること を示すことができ、そしてこの遺伝子を含有する領域を同定することができる。 サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションは実施例５．１．４に記載 されたように行われる。 ハイブリダイゼーションの結果は、コスミドｐｌＢＶ３が実施例５．５．４で 合成されたプローブに相同的な配列を含有する６．６−ｋｂのＳｐｈＩ断片を保 持することを示すことができた。５．６ ＦＭＮレダクターゼ（ｓｎａＣ）の構造遺伝子を含有するコスミドｐＩ ＢＶ４の単離 この実施例ではＰIIの生合成に関する少なくとも１つの遺伝子を含有する実施 例３に記載されたように構築されたコスミドを、どのようにし て得ることができるかを説明する。 ５．６．１ プリスチナマイシンIIＡシンターゼに関連するＦＭＮレダクターゼ の同定 この実施例ではＮＡＤＨによりＦＭＮを還元してＦＭＮＨ₂（プリスチナマィ シンIIＡシンターゼにより触媒される反応に必要である）形成の原因となるタン パク質が、どのようにエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis） ＳＰ９２から均一にまで精製できるかを説明する。 ５．６．１．Ａ．ＦＭＮレダクターゼ活性のアッセイ この実施例ではプリスチナマイシンIIＡの生合成経路の活性のアッセイを説明 する。これはこれまでに記載されたことがなく、そしてプリスチナマイシンの生 産期間中のみに発現されるという注目すべき性質を有するものである。問題の酵 素はＦＭＮレダクターゼであり、これはまたＮＡＤＨ：ＦＭＮオキシドレダクタ ーゼとも呼ばれるが、ＮＡＤＨの存在下で、ＦＭＮからＦＭＮＨ₂（第１３図） への還元を触媒する。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに特異的な、または特異的では ない同様な反応を触媒し、そして他の生合成経路に関連するＦＭＮレダクターゼ はいたるところに記載されている（Ｄｕａｎｅら １９７５、Ｊａｂｌｏｎｓｋ ｉら １９７７、Ｗａｔａｎａｂｅら １９８２）。 この活性を検出するために２つのアッセイを使用する： 第一は実施例５．１．１に記載したプリスチナマイシンIIＡシンターゼとのカ ップリングを基本とし、そして精製の第一段階に使用する。アッセイする酵素画 分（０．００２−０．００５単位）を、実施例５１１に記載したように２７℃で １時間、全容量が５００μｌの５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液 ｐＨ６．８（ＮＡＤＨ（５００μＭ）、ＦＭ Ｎ（２μＭ）、プリスチナマイシンIIＢ（２０μＭ）および０．０１単位のプリ スチナマイシンIIＡシンターゼを含有する）中でインキュベーションする。生成 したプリスチナマイシンIIＡは、実施例５．１．１．Ａに記載したようにＨＰＬ Ｃで分析する。 酵素活性の単位は、上記に記載された条件下で１分間に１μｍｏｌのプリスチ ナマイシンIIＡを合成するために必要な酵素量と定義される。 第二アッセイは分光光度的アッセイであり、少なくとも部分精製された画分に のみ使用することができる。アッセイする酵素画分（０．００６−０．０３０単 位）を、２７℃で１３分間、全容量が３ｍｌの５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロ パン緩衝液 ｐＨ６．８（ＮＡＤＨ（５００μＭ）およびＦＭＮ（２μＭ）を含 有する）中でインキュベーションする。インキュベーション７分後、酵素が存在 しない参考曲線に対して、６つの吸光度を３４０ｎｍで、１−分間の間隔をおい て読む。μｍｏｌ／分での活性は、６．２の定数（３４０ｎｍでの１ｍｏｌＮＡ ＤＨの吸光度）で１分間の吸光度の減少勾配を割り算することにより算出する。 酵素活性の単位は、上記に記載された条件下で１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨ が消費されるのに要する酵素量と定義する。 ５．６．１．Ｂ エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiraIis）ＳＰ ９２ ＦＭＮレダクターゼの精製 この実施例ではプリスチナマイシンIIＡの生合成経路に参加するエス．プリス チナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製で きるかを説明する。 上記実施例５．６．１．Ａに記載したアッセイを使用して、ＦＭＮレ ダクターゼの精製は以下に記載するように行われ、凍結に注意し、そして活性画 分は必要に応じて連続的工程の間では−３０℃に保存する。 プリスチナマイシン生産フェーズの初期段階で回収したエス．プリスチナエス ピラリス（S .pristinaespiralis）ＳＰ９２のカルチャーの遠心ペレット５００ ｇを（１０容量／容量％のグリセロールを含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液 ｐ Ｈ７．２で洗浄したもの）を、１５００ｍｌの５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロ パン緩衝液 ｐＨ ６．８（５ｍＭ ＤＴＴ、１０容量／容量％のグリセロール および０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する）に溶解する。このように得ら れた懸濁液を２７℃で４５分間インキュベーションし、そして５０，０００ｇで １時間遠心する。このようにして回収した粗抽出物を硫酸アンモニウム沈殿によ り分画する。４０から７５％飽和硫酸アンモニウムの間に沈殿するタンパク質画 分をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｆｉｎｅで脱塩し、ｐＨ６．８ ５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、５ｍＭ ＤＴＴ、１０容量／容量％のグリセ ロール中にてＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのカラム（３００ｍ ｌ）に注入する。活性タンパク質はカラムに保持されず、そしてそれらをＳｅｐ ｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｆｉｎｅで脱塩し、そして再度ｐＨ ８．２ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、５ｍＭ ＤＴＴ、１０容量／容量％のグリセロール 中にてＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのカラム（３５ｍｌ）に注 入し、ＫＣｌの直線勾配（０−０．５Ｍ）で溶出する。酵素活性を含有する画分 （実施例５．６．１．Ａに記載された第一試験で検出）をプールし、Ｓｅｐｈａ ｄｅｘ Ｇ−２５ Ｆｉｎｅで脱塩し、そしてｐＨ８．２ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ緩衝液、５ｍＭ ＤＴＴ、１０容 量／容量％のグリセロール中にてＭｏｎｏＱ ＨＲ １０／１０カラムに注入す る。保持されたタンパク質を０．２Ｍ ＫＣｌを添加した同一緩衝液で直接溶出 する。これらを１ｍｌ容量で回収し、これを直ぐにＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ Ｈ Ｒ １０／３０のカラムに注入し、ｐＨ ６．８ ５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓ プロパン緩衝液、１ｍＭ ＤＴＴ、１０重量／重量％のグリセロールで溶出する 。所望の活性を含む画分（実施例５．６．１．Ａに記載されたような分光光度的 試験によりこの段階で検出される）をプールし、そしてプールした全量を７ｍｌ とする：この７ｍｌを８ｍｌのＦＭＮ−アガロースが充填されたカラムに添加す る；カラムをｐＨ ６．８ ５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍ Ｍ ＤＴＴ、１０容量／容量％のグリセロールで洗浄し、そして次に１０μＭの ＦＭＮを含む同一緩衝液で溶出する。活性画分をプールし、ＰＤ−１０カラムで 脱塩し、ｐＨ ８．２ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、５ｍＭ ＤＴＴ、 １０容量／容量％のグリセロール中にてＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５カラムに注入 し、ＫＣｌの直線勾配（０−０．２５Ｍ）で溶出する。 この段階の後、酵素は純粋である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動において単一で 明瞭な広いバンドが見られ、その分子量は約２８，０００と推定されるが、一方 Ｂｉｏ−Ｓｉｌ ＳＥＣ １２５ゲル浸透クロマトグラフィーでは、分子量約３ ０，０００付近に対照的なピークを形成する。 シークエンシングのために、このタンパク質を２５−ｃｍのＶｙｄａｃ Ｃ４ カラムで脱塩し、そして０．０７％のトリフルオロ酢酸を含有する３０−７０％ のアセトニトリル（水中）の直線勾配で溶出する。 ５．６．２ タンパク質配列からオリゴヌクレオチドの生成 この実施例ではタンパク質ＦＭＮレダクターゼのＮＨ₂−末端配列および内部 配列から出発して、どのようにオリゴヌクレオチドを合成できるかを説明する。 ＦＭＮレダクターゼのＮＨ₂−末端配列は実施例５．１．２に記載されたよう にマイクロシークエンシングで導き出した。約３０残基がこのように同定された 。 （第４番目および第１１番目の残基から始まるＮＨ₂−末端配列もシークエン シングした試料の中に見いだされた。） １３および２１アミノ酸のＦＭＮレダクターゼの２つの内部配列がトリプシン 加水分解および得られた断片のＶｙｄａｃ Ｃ１８カラムでの精製後に同定され た。 タンパク質ＦＭＮレダクターゼのＮＨ₂−末端配列 （配列番号７の２−２５残基を参照） タンパク質ＦＭＮレダクターゼの内部配列 （配列番号７の１０２−１２２残基を参照） 各配列の下線領域、ならびにストレプトミセス（Streptomyces）（実施例８を 参照）に特異的な遺伝子コドンの縮退に従い、以下のオリゴヌクレオチドの混合 物を合成した。タンパク質ＦＭＮレダクターゼのＮＨ₂−末端配列に対応する混合物： タンパク質ＦＭＮレダクターゼの内部配列に対応する混合物： ５．６．３．合成オリゴヌクレオチド混合物の標識化およびエス．プリスティナ エスピラリス（S .pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムＤＮＡライブラリーと のハイブリダイゼーション この実施例ではプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子に特異的なオリゴ ヌクレオチドがどのように放射活性的に標識でき、そして次にすでにエス．プリ スティナエスピラリス（S .pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムライブラリー のＤＮＡが移されている膜にハイブリダイズさせることができるかを説明する。 オリゴヌクレオチドの標識化は、実施例５．１．３に記載されたように５’− 末端位に、ＡＴＰの［γ−³²Ｐ］リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで転 移させることにより行う。 約２×５００ｎｇの各オリゴヌクレオチド混合物がこのように³²Ｐで標識され 、２つのライブラリーのそれぞれとハイブリダイズするために使用された。 各ライブラリーの膜のハイブリダイゼーションは、実施例５．１．３に記載さ れたように行う。 ５．６．４ コスミドｐＩＢＶ４の単離、ならびにＦＭＮレダクターゼに関する 構造遺伝子（ｓｎａＣ）を含有する領域の決定 コスミドｐＩＢＶ４は、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株中で生産されたライブラ リーのクローンから単離され、これは３つのすべてのオリゴヌクレオチドの混合 物と同時にハイブリダイズした。 これらのコスミドを実施例２のように精製する。これは大きさが４８ｋｂと推 定されるエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の ゲノムＤＮＡ挿入物を含んでいる。マップ（第７図）は、実施例５．１．４に記 載されたように、種々の制限酵素で消化したものから確立した。 種々の酵素で消化したｐＩＢＶ４ ＤＮＡとオリゴヌクレオチド混合物とのサ ザンハイブリダイゼーションにより、ｓｎａＣ領域（ＦＭＮレダクターゼの構造 遺伝子）を含有する領域の同定が可能になった。サザンブロッティングおよびハ イブリダイゼーションは実施例５．１．４に記載されたように行った。 これらのサザンハイブリダイゼーションにより、コスミドｐＩＢＶ４は実施例 ５．６．３で合成したプローブに相同的な配列を含有する４−ｋｂのＢａｍＨＩ −ＢａｍＨＩ断片を所有することを表すことができた。５．７ コスミドｐＩＢＶ２についてｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル− Ｎ）−メチルトランスフェラーゼに関する構造遺伝子の存在の実証 この実施例では精製されたタンパク質から出発して、実施例６．７および７． ８に記載されるようにすでに分析そして配列決定され、そして実施例１１に記載 されるようにE.Coli中で発現された遺伝子の中から、 どのように対応する構造遺伝子を同定できるかを説明する。 ５．７．１ ｐ−アミノフェニルアラニンからｐ−ジメチルアミノフェニルアラ ニンへのメチル化に関与するタンパク質の同定および精製 この実施例はｐ−アミノフェニルアラニンからｐ−ジメチルアミノフェニルア ラニン［ｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル−Ｎ）−メチルトランスフェラ ーゼ］へのメチル化の原因であるタンパク質が、エス．プリスチナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株からどのように均一にまで精製でき、そし てどのようにしてE.Coliの組換え株から純粋に得られるかを説明する。 ５．７．１．Ａ ｐ−アミノフェニルアラニンからｐ−メチルアミノフェニルア ラニンへのメチル化活性、およびｐ−メチルアミノフェニルアラニンからｐ−ジ メチルアミノフェニルアラニンへのメチル化活性のアッセイ この実施例ではプリスチナマイシンＩＡの成分であるｐ−ジメチルアミノフェ ニルアラニンの生合成の２つの末端活性のアッセイを説明する。これらの活性は これまでに記載されたことがなく、そしてプリスチナマイシンの生産期間中のみ に発現されるという注目すべき性質を有するものである。それらはｐ−アミノフ ェニルアラニンからｐ−メチルアミノフェニルアラニンへのメチル化（メチル化 １）であり、一方ｐ−メチルアミノフェニルアラニンからｐ−ジメチルアミノフ ェニルアラニンへのメチル化（メチル化２）であり、これらの両方の活性はＳＡ Ｍをメチル基供与体として利用する（第１４図）。 アッセイする酵素画分（１−２０単位）を２７℃で３０分間、全容量が２００ μｌのｐＨ ６．８ ５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩 衝液（ＳＡＭ（２００μl）を含有し、その中のメチル基は炭素原子の１４同位 体で放射標識されている（２Ｃｉ／ｍｏｌ））中で、メチル化１のアッセイには ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（１ｍＭ）の存在下で、そしてメチル化２の アッセイにはｐ−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン（２．５ｍＭ）の存在下 でインキュベーションする。 反応を１６μlの３７％塩酸溶液そして次に２０μlのヘプタンスルホン酸ナト リウムを２４０ｇ／ｌの濃度で加えて停止する。遠心後、１５０μlの上澄みを 以下の勾配様式でＨＰＬＣシステムに注入する。 −移動相： 溶出Ａ＝１．２ｇのヘプタンスルホン酸ナトリウム ＋２．５ｍｌの氷酢酸＋水（全量が１０００ｍｌ） 溶出Ｂ＝１．２ｇのヘプタンスルホン酸ナトリウム ＋２．５ｍｌの氷酢酸＋３００ｍｌのアセトニトリ ル＋水（全量が１０００ｍｌ） 勾配：ｔ（時間） ％Ｂ ０ ３０ １６ ３０ １７ １００ ２０ １００ ２１ ３０ ２５ ３０ −固定相：１５０×４．６ｍｍ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ５μm Ｃ１８ カラム（マーシェリー−ナゲル） カラムから溶出時に、酵素反応の基質および生成物を２５４ｎｍの吸 収で定量する。この検出はＧＴ４００−Ｕ４固体シンチレーションセルを装備し たＢｅｒｔｈｏｌｄ ＬＢ５０６型検出器により、ライン化された放射線化学検 出に連結されている。これにより放射線活性メチル基が反応生成物に取り込まれ るのを特異的に監視することができる。 メチル化１（メチル化２）に関する酵素活性の単位は１ｎｍｏｌのメチル基が 、ｐ−アミノフェニルアラニン（ｐ−メチルアミノフェニルアラニン）に取り込 まれるの必要な酵素量と定義する。 ５．７．１．Ｂ．ｐ−アミノフェニルアラニンからｐ−ジメチルアミノフェニル アラニンへのメチル化を触媒するＳＡＭ−依存性Ｎ−メチルトランスフェラーゼ ［ｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル−Ｎ）−メチルトランスフェラーゼ］ のエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２からの精製 この実験では、プリスチナマイシンＩＡの生合成経路に参加するエス．プリス チナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製で きるかを説明する。 上記実施例５．７．１．Ａに記載したアッセイを使用して、ＳＡＭ−依存性Ｎ −メチルトランスフェラーゼの精製は以下に記載されるように行われる。凍結に 注意し、必要に応じて活性画分は連続工程の間では−７０℃に保存する。 プリスチナマイシン生産フェーズの初期段階で回収したエス．プリスチナエス ピラリス（S .pristinaespiralis）ＳＰ９２カルチャーの遠心ペレット２４０ｇ を（ｐＨ７．２ １００ｍＭ リン酸緩衝液、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍＭ ＥＤ ＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５Ｍ ＫＣｌ、１０容量／容量％のグリセロール で洗浄したもの）を、４８０ｍｌの ｐＨ ８．０ ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（４ｍＭ ＤＴＥ、５ｍＭ ベンズアミジン、０．２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、 １００μｇ／ｌ Ｅ−６４ 、２ｍｇ／ｌ ロイペプチン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍｇ／ ｌ ＳＴＩ、２ｍｇ／ｌ アプロチニン、２０容量／容量％のグリセロールおよ び２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する）に溶解し、この緩衝液は＋４℃に維持す る。このように得られた懸濁液を４℃で激しく撹拌する。３０分間撹拌した後、 ０．２ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩおよび５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を添 加する。９０分間撹拌した後、抽出物を５０，０００ｇで１時間遠心する。上澄 みを約１８０ｍｌの３分画に分割する。各々を５００ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｆｉｎｅカラム（４ｍＭ ＤＴＥ、 ５ｍＭ ベンズアミジン、０． ２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１００μｇ／ｌ Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ ロイペプ チン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍｇ／ｌ ＳＴＩ、２ｍｇ／ｌ アプロチニン、２０容量／容量％ グリセロールを含有するｐＨ ６．８ ２ ０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓ緩衝液で自然流速で平衡化した）のゲル浸透により脱 塩する。溶出したタンパク質を次にＭｏｎｏＱ ＨＲ １６／１０カラムで流速 ６ｍｌ／分でクロマトグラフィーを行い（各サイクルについて４００ｍｇのタン パク質）、４ｍＭ ＤＴＥ、２ｍＭ ベンズアミジン、１００μｇ／ｌ Ｅ−６ ４、２ｍｇ／ｌ ロイペプチン、２０容量／容量％ グリセロールを含有するｐ Ｈ ６．８ ２０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液中で塩化ナトリウムの 増加直線勾配（０−０．３Ｍ）で溶出する。カラムからの溶出時に、画分に４ｍ Ｍ ＤＴＥ、３０ｍＭ ベンズアミジン、２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１００μ ｇ／ｌ Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ ロイペ プチン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍｇ／ｌ ＳＴＩ、１０ｍ ｇ／ｌ アプロチニン、２０容量／容量％ グリセロールを含有する１０容量／ 容量％のｐＨ ６．８ ２０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓ緩衝液を補充する。このよ うな条件下で、両方のメチル化活性（１および２）が排除画分および第一溶出画 分中に同様に検出される。これらの画分をプールし、そしてＣｅｎｔｒｉｐｒｅ ｐ １０の限外濾過により濃縮する。この濃縮物を０．８５Ｍ の硫酸アンモニ ウムとし、そして次にＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ １０／１０カラ ムで流速１ｍｌ／分でクロマトグラフィーを行い（各サイクルについて２０−８ ０ｍｇのタンパク質）、４ｍＭ ＤＴＥ、２ｍＭ ベンズアミジン、１００μｇ ／ｌ Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ ロイペプチン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧ ＴＡ、１０容量／容量％ グリセロールを含有するｐＨ６．８ ５０ｍＭ ｂｉ ｓ−ｔｒｉｓ緩衝液中で硫酸アンモニウムの減少直線勾配（０．８５−０Ｍ）で 溶出する。カラムからの溶出時に、画分に４ｍＭ ＤＴＥ、３０ｍＭ ベンズア ミジン、２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１００μｇ／ｌ Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ ロイペプチン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡＮ １０ｍｇ／ｌ ＳＴＩ 、 １０ｍｇ／ｌ アプロチニン、１０容量／容量％ グリセロールを含有する １０容量／容量％のｐＨ ６．８ ５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓ緩衝液を補充す る。このような条件下で、両方のメチル化活性（１および２）が約０．１５Ｍの 硫酸アンモニウムに対応する画分に同様に検出される。これらの画分をプールし 、そしてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １０の限外濾過により濃縮し、４ｍＭ ＤＴＥ 、２ｍＭ ベンズアミジン、１００μｇ／ｌ Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ ロイペプ チン、２０容量／容量％ グリセロ ールを含有するｐＨ８．２（５℃で）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中で平衡化し たＰＤ−１０カラムで脱塩し、同一緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／ ５カラムで流速１ｍｌ／分でクロマトグラフィーを行う（各サイクルについて１ ０ｍｇのタンパク質）。これらの条件下では２つの活性はカラムに保持されない 。したがってカラムからの溶出時に、２つの活性を含有する排除画分に４ｍＭ ＤＴＥ、３０ｍＭ ベンズアミジン、２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１００μｇ／ ｌ Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ ロイペプチン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴ Ａ、２０容量／容量％ グリセロールを含有する１０容量／容量％のｐＨ ８． ２ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液を補充する。これらの画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ １０の限外濾過により濃縮し、そして次に３００×７．５ ｍｍの１０μｍ ＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷカラム（０．５ｍｌ／分の流速で４ｍＭ ＤＴＥＮ ０ ．２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０容量 ／容量％ グリセロール、０．１５Ｍ 塩化ナトリウムを含有するｐＨ ７．０ ５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液で平衡化した）でクロマトグラフィーを行う。こ の方法で分子量３０，０００付近に対応する保持時間で２つの活性が共に溶出す る。この段階の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでかなりのタンパク質が視覚化される。そ れはおよそ３２，０００に位置する。 ５．７．１．Ｃ エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ ９２の組換えタンパク質（ｐ−アミノフェニルアラニンのｐ−ジメチルアミノフ ェニルアラニンへのメチル化を触媒するＳＡＭ−依存性Ｎ−メチルトランスフェ ラーゼ活性を表す）のE.coli ｐＶＲＣ７０６からの精製 この実験では、プリスチナマイシンＩＡの生合成経路に参加し、そしてｐａｐ Ｍ 遺伝子のクローニングによりE.coli中で発現されるエス．プリスチナエスピラ リス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製できるかを説明 する。 上記実施例５．７．１．Ａに記載したアッセイを使用して、我々は組換えE.co ll：：ｐＶＲＣ７０６の粗抽出物がメチル化１およびメチル化 ２について強い活性を表すことを示したが、一方対照E.coli株（ｐＭＴＬ２３） ではどちらの活性も検出されないことを示した。次にｐ−アミノフェニルアラニ ンのｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンへのメチル化を触媒するＳＡＭ−依存 性ｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル−Ｎ）−メチルトランスフェラーゼの 精製を行った。 実施例５．７．１．Ｂに開示された条件と同じ条件下で、しかしクロマトグラ フィー段階（ＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５の精製段階）を排除して、ＴＳＫ２００ ０カラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで実施例５．７．１．Ｂで精製したタンパク質 が持つ分子量と同一の分子量を有するタンパク質を均一に精製した。 ５．７．２ ｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル−Ｎ）−メチルト ランスフェラーゼの構造遺伝子の同定 実施例５．７．１．Ｂで精製した３２，０００のタンパク質のＮＨ₂−末端配 列を実施例５．１．２に記載されたマイクロシークエンシングで決定した。１０ 残基がこのようにして決定された： 実施例５．７．１．Ｃで精製した３２，０００のタンパク質のＮＨ₂−末端配 列を実施例５．１．２に記載されたマイクロシークエンシングで決定した。１０ 残基がこのようにして決定された： 両方の場合において、同じ残基が見いだされ、そしてこの配列はｐａｐＭ遺伝 子の配列から導かれたタンパク質配列の開始部分に正確に対応する（配列番号１ ０の２−１１残基を参照のこと）。したがって精製されたｐ−アミノフェニルア ラニン（フェニル−Ｎ）−メチルトランスフェラーゼはタンパク質ＰａｐＭであ る。 実施例６：実施例３のように調製されたコスミド中にクローン化され、かつ目的 遺伝子を含有するＤＮＡ断片のサブクローニング この実施例では実施例３で記載したように構築され、かつプリスチナマイシン IIまたはプリスチナマイシンＩの生合成に関連する遺伝子を含有するコスミドか ら出発して、どのようにこれらの遺伝子を含有するＤＮＡ断片をサブクローン化 できるかを説明する。 これらのサブクローニングは同定された遺伝子の核酸配列を連続的に導き出す ことをできるようにするために、ならびに以下の実施例で与えられる種々の構築 物が実施できるようにするために行われた。６．１ ３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼに関する構造遺伝子を含有 する５．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇａｌII断片の単離 この実施例では、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼに関す る構造遺伝子を含有するコスミドｐＩＢＶ２から出発して、どのようにしてより 小さい大きさのこの遺伝子を含有するＤＮＡ断片をサブクローン化することがで きるかを説明する。 約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ２を、制限酵素ＢｇａｌIIおよびＥｃｏＲＩ（ ニューイングランドバイオラボズ）で製造元で薦める条件下で連続的に切断した 。このようにして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し 、そして５．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇａｌII片をManiatisら（１９８９）に より記載されるように電気的溶出により単離した。 ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断した約１００ｎｇのｐＵＣ１９（Ｖｉｅｒ ａおよびＭｅｓｓｉｎｇ １９８２）を、２００ｎｇの５．５−ｋｂのＢｇａｌ II−ＥｃｏＲＩ断片と実施例３．３に記載した条件下で連結した。 ＴＧ１株の形質転換および形質転換体を固体ＬＢ培地（１５０μｇ／ｍｌのア ンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含有する）でManiatisら（１９ ８９）に記載された方法により選択した後、所望の断片を持つクローンを単離し た。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ４０２と命名した。この制限マップを第１ ５（Ａ）図に表す。これはハイブリダイゼーションにより（実施例５．２）、５ ．５−ｋｂのＢｇａｌII−ＥｃｏＲＩ断片がエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis ）ＳＰ９２の３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの 構造遺伝子を含有することが示された。したがってプラスミドｐＶＲＣ４０２はエス ．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の３−ヒドロ キシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの構造遺伝子を含有する。６．２．コスミドｐＩＢＶ２由来の４．６−ｋｂのＢｇａｌII−ＢｇａｌII断片 の単離 この実施例では、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの構造遺伝子に 隣接する領域中にプチスチナマイシンＩの生合成に関与する他の遺伝子の存在を 同定を目的として、どのようにより小さい大きさのＤＮＡ断片をサブクーン化す ることができるかを説明する。 上記のように種々のクローニング工程を行った。 約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ２を、制限酵素ＢｇａｌIIで切断した。このよ うにして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し、そして ４．６−ｋｂのＢｇａｌII−ＢｇａｌII断片を電気的溶出により単離した。 ＢａｍＨＩで切断した約１００ｎｇのｐＵＣ１９を、２００ｎｇのＢｇａｌII −ＢｇａｌII断片と連結した。 実施例６．１に記載したようにＴＧ１株の形質転換後、所望の断片を持つクロ ーンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ５０１と命名した。この制限 マップを第１５（Ｂ）図に表す。６．３． プチスチナマイシンIIＡシンターゼの２つのサブユニットに関する構 造遺伝子を含有する６−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片の単離 この実施例ではコスミドｐＩＢＶ１から出発して、どのようにプチスチナマイ シンIIＡシンターゼの２つのサブユニットに関する構造遺伝子を含有するより小 さい大きさのＤＮＡ断片をサブクローン化することができるかを説明する。 上記のように種々のクローニング工程を行った。 約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ１を、ＢａｍＨＩで切断した。このようにして 得た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し、そして６ｋｂのＢａｍＨ Ｉ断片を電気的溶出により単離した。 ＢａｍＨで切断した約１００ｎｇのｐＢＫＳ^-（ストラタジーン クローニン グシステム、ラジョラ カリフォルニア州）を、２００ｎｇの６−ｋｂのＢａｍ ＨＩ断片と連結した。 ＴＧ１株の形質転換後、所望の断片を持つクローンを単離した。この組換えプ ラスミドをｐＸＬ２０４５と命名した。この制限マップを第１６図に表す。実施 例５．１のハイブリダイゼーションにより、６−ｋｂのＢａｍＨＩ断片はエス．プリスチナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のプチスチナマイシ ンIIＡシンターゼの２つのサブユニットをコードするｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺 伝子を含有することが示された。したがってプラスミドｐＸＬ２０４５はエス．プリスチナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のプチスチナマイシ ンIIＡシンターゼの２つのサブユニットをコードするｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺 伝子を含有する。６．４． プチスチナマイシンＩシンターゼIIに関する構造遺伝子一部分を含有 する６．２−ｋｂのＳｐｈＩ断片の単離 この実施例ではコスミドｐＩＢＶ３から出発して、どのようにプチスチナマイ シンＩシンターゼIIに関する構造遺伝子の一部分を含有するより小さい大きさの ＤＮＡ断片をサブクローン化することができるかを説明する。 上記のように種々のクローニング工程を行った。 約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ３を、ＳｐｈＩで切断した。このよう にして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し、そして６ ．２ｋｂのＳｐｈＩ断片をバイオ１０１−オーザイム（Ｂｉｏ１０１−Ｏｚｙｍ ｅ）社により販売されている“Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ”キット法により単離した。 ＳｐｈＩで切断した約１００ｎｇのｐＵＣ１９を、２００ｎｇの６．２−ｋｂ のＳｐｈＩ断片と連結した。 ＴＧ１株の形質転換後、所望の断片を持つクローンを単離した。この組換えプ ラスミドをｐＶＲＣ１１０５と命名した。この制限マップを第１７図に表す。６．５． プチスチナマイシンＩシンターゼIIIに関する構造遺伝子の一部分を 含有する８．４−ｋｂのＳｐｈＩ断片の単離 この実施例ではコスミドｐＩＢＶ３から出発して、どのようにプチスチナマイ シンＩシンターゼIIIに関する構造遺伝子の一部分を含有するより小さい大きさ のＤＮＡ断片をサブクローン化することができるかを説明する。 上記のように種々のクローニング工程を行った。 約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ３を、ＳｐｈＩで切断した。このようにして得 た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し、そして８．４ｋｂ のＳｐｈＩ断片をバイオ１０１−オーザイム社により販売されている“Ｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ”キット法により単離した。 ＳｐｈＩで切断した約１００ｎｇのｐＵＣ１９を、２００ｎｇの８．４−ｋｂ のＳｐｈＩ断片と連結した。 ＴＧ１株の形質転換後、所望の断片を持つクローンを単離した。この組換えプ ラスミドをｐＶＲＣ１１０６と命名した。この制限マップを第 １８図に表す。６．６． プチスチナマイシンＩシンターゼIVに関する構造遺伝子の一部分を含 有する６．６−ｋｂのＳｐｈＩ断片の単離 この実施例ではコスミドｐＩＢＶ３から出発して、どのようにプチスチナマイ シンＩシンターゼIVに関する構造遺伝子の一部分を含有するより小さい大きさの ＤＮＡ断片をサブクローン化することができるかを説明する。 上記のように種々のクローニング工程を行った。 約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ３を、ＳｐｈＩで切断した。このようにして得 た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し、そして６．６ｋｂ のＳｐｈＩ断片をバイオ１０１−オーザイム社により販売されている“Ｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ”キット法により単離した。 ＳｐｈＩで切断した約１００ｎｇのｐＵＣ１９を、２００ｎｇの６．６−ｋｂ のＳｐｈＩ断片と連結した。 ＴＧＩ株の形質転換後、所望の断片を持つクローンを単離した。この組換えプ ラスミドをｐＶＲＣ１１０４と命名した。この制限マップを第１９図に表す。６．７ コスミドｐＨＣ７９を含有し、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガ ーゼ（プチスチナマイシンＩシンターゼＩ）の上流に位置する遺伝子を持つ１７ −ｋｂのＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII断片の単離 この実施例では３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼに関する構造遺伝 子を含有するコスミドｐＩＢＶ２から出発して、どのようにこのコスミドの大部 分を削除し、かつ３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの上流に位置する 部分のみを保持することができるかを説明す る。 約２００ｎｇのコスミドｐＩＢＶ２を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した。この 酵素を供給元の推薦により８５℃で３０分間変性させた。このようにして消化し たコスミドｐＩＢＶ２をエタノールでManiatisら（１９８９）に記載されたよう に沈殿させ、５０μlの容量でそれ自身と再連結させた。 ＴＧ１株の形質転換および形質転換体を固体ＬＢ培地（１５０μｇ／ｍｌのア ンピシリンを加えた）でManiatisら（１９８９）に記載された方法により選択し た後、コスミドｐＨＣ７９および３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの 上流に位置する部分（対応する全体は約１７ｋｂの大きさ）を含有するクローン を単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ９００と命名した。この制限マッ プを第２０図に表す。６．８ コスミドｐＩＢＶ３に由来する１．４−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳＳｔＩ断 片の単離 この実施例ではＰIIＡシンターゼの巨大サブユニットをコードするｓｎａＡ遺 伝子を含有するコスミドｐＩＢＶ３から出発して、上流に位置するＤＮＡ断片を 研究し、そしてシークエンシングするためにどのようにしてそれをサブクーン化 することができるかを説明する。 約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ３を連続的に制限酵素Ｓ_SｔＩおよびＢａｍＨ Ｉで切断した。このようにして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気 泳動で分離し、そして１．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片をバイオ１０１− オーザイム社により販売されている“Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ”キット法により単離 した。 ＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩで切断した約１００ｎｇのｐＤＨ５（Ｈｉ ｌｌｅｍａｎら １９９１）を、２００ｎｇのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片と実施 例３．３に記載した条件下で連結した。 ＴＧ１株の形質転換および形質転換体を固体ＬＢ培地（１５０μｇ／ｍｌのア ンピシリンおよびＸ−ｇａｌを加えた）でManiatisら（１９８９）に記載された 方法により選択した後、所望する断片を持つクローンを単離した。この組換えプ ラスミドをｐＶＲＣ１０００と命名した。この制限マップを第２１図に表す。６．９． ＦＭＮレダクターゼに関する構造遺伝子を含有する４−ｋｂのＢａｍ Ｈ−ＢａｍＨ断片の単離 この実施例ではＦＭＮレダクターゼに関する構造遺伝子（ｓｎａＣ）を含有す るコスミドｐＩＢＶ４から出発して、どのようにこの遺伝子を含有するより小さ い大きさのＤＮＡ断片をサブクローン化することができるかを説明する。 上記のように種々のクローニング工程を行った。 約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ４を種々の制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。こ のようにして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルで分離し、そして４−ｋ ｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片を電気的溶出により単離した。 ＢａｍＨＩで切断した約１００ｎｇのｐＵＣ１９を、２００ｎｇの４−ｋｂのＢａｍ Ｈ−ＢａｍＨＩ断片と連結した。 E.Coli DH5α株（supE44 D1acU169(f801acZDM15)hsdR17 recAl endAl gyrA9 6 thi-1 relA1）（Hanahan、1983）の形質転換および形質転換体を固体ＬＢ培地 （１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを加えた）でManiatisら（ １９８９）に記載された方法により選択した 後、所望する断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ ５０９と命名した。この制限マップを第２２図に表す。 実施例７：エス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２ のプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子を含有する単離されたＤＮＡ断片 の配列 この実施例では、一方ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespi ralis） のプリスチナマイシンＩ族のプリスチナマイシンの生合成に関与する遺 伝子、他方では同プリスチナマイシンII族のプリスチナマイシンの生合成に関与 する遺伝子を持つＤＮＡ断片のシークエンシングを説明する。７．１． ５−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片のシークエンシング この実施例ではどのようにエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespi ralis） ＳＰ９２のｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子を含有する断片のヌクレオチ ド配列を得ることができるかを説明する。 ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片は、実施例６．３に記載されたプラスミドｐＢＫＳ −中でクローン化され得られたプラスミドｐＸＬ２０４５の６−ｋｂのＢａｍＨ Ｉ−ＢａｍＨＩ断片の一部である。この５−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ副断片 （サブフラグメント：ｓｕｂｆｒａｇｍｅｎｔ）挿入物は、酵素的消化により得 られ、そしてその後ファージＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９（Ｍｅｓｓｉ ｎｇら、１９８１）中に両方向でサブクローン化された。使用したサブクローニ ング部位は次のとおりである：ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＮｒｕＩ、Ｅ ｃｏ ＲＩ、ＮｒｕＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよ びＸｈｏＩ、そして第１６図に示す。 これらの種々の挿入物は，合成プライマーとしてユニバーサルプライマー（un iversal primer：Maniatisら1989）を、または合成され（実施例５）、かつシー クエンシングする挿入物の２０ヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド を使用してチェーン−ターミネーション反応法（chain-termination reaction m ethod）によりシークエンシングされた。 これら種々の挿入物間の重複により、５３９２ｂｐから成るＢａｍＨＩ−Ｘｈ ｏ Ｉ断片の全ヌクレオチド配列が両鎖について確立できた（配列番号１）。７．２． ５．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇａII断片の１８７０ｂｐ領域のシー クエンシング この実施例ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）Ｓ Ｐ９２のｓｎｂＡ遺伝子を含有する断片のヌクレオチド配列を得ることができる かを説明する。 シークエンシングされた１８７０ｂｐ領域は、実施例６（第１５（Ａ）図）に 記載されたプラスミドｐＵＣ１９中でクローン化され得られたプラスミドｐＶＲ Ｃ４０２の５．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇａII断片の一部である。この５．５ −ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇａII挿入物の副断片挿入物は、酵素的消化により得ら れ、そしてその後ファージＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９中で両方向でサ ブクローン化された。サブクローニング部位は：ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ、Ｈｉ ｎ ｄIIIであり、そして第１５（ａ）図に示す。 これら種々の断片の重複により、１８７０ｂｐから成るＳａｕ３Ａ−Ｓａｕ３ Ａ領域の全配列（配列番号５）が確立できた。７．３． ４．６−ｋｂのＢｇａII−ＢｇａII断片の１８３０ｂｐ領域の配列 この実施例ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）Ｓ Ｐ９２のｓｎｂＡ遺伝子を含有するヌクレオチドに隣接する断片のヌクレオチド 配列を得ることができるかを説明する。 この配列はｐＶＲＣ５０１（実施例６）からの１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ および２．１ｋｂのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片（第１５（Ｂ））をベクターＭ１ ３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９中にサブクローン化することにより導かれた。 このＰｓｔＩ部位はこの部位に重複するＳａｕ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ断片をサブクロ ーニングすることにより妨害され、続いてシークエンシングされた。このように して得られた１８３０ｂｐを（配列番号６）に示す。７．４． ６．２−ｋｂのＳｐｈＩ断片の２つの２２７ｂｐおよび２４７ｂｐ領 域のシークエンシング この実施例ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）の プリスチナマイシンＩシンターゼII（ｓｎｂＣ）に関する構造遺伝子の一部を含 有する断片のヌクレオチド配列をどのように得ることができるかを説明する。 配列決定される２２７および２４７ｂｐの領域は、実施例６．４（第１７図） に記載されるプラスミドｐＵＣ１９中にクローン化されプラスミドｐＶＲＣ１１ ０５を与えた６．２ｋｂのＳｐｈＩ断片の一部である。６．２−ｋｂのＳｐｈＩ 挿入物の副断片は酵素開裂により得られ、そしてファージＭ１３ｍｐ１８および Ｍ１３ｍｐ１９に両方向でサブクローン化された。サブクローニング部位はＸｈ ｏ Ｉ、ＰｓｔＩおよびＢｇａ ｌ IIであり、第１７図に示す。２２７−ｂｐのＰｓｔＩ−ＢｇａｌII断片を完全 にシークエンシングし、そして２４７ｂｐは９００−ｂｐＸｈｏＩ断片からシー クエンシングした：これらの配列を配列番号１１および１２に表す。７．５． ８．４−ｋｂのＳｐｈＩ断片の２つの１９２ｂｐおよび４７４ｂｐ領 域のシークエンシング この実施例ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）の プリスチナマイシンＩシンターゼIII（ｓｎｂＤ）に関する構造遺伝子の一部を 含有する断片のヌクレオチド配列をどのように得ることができるかを説明する。 配列決定される１９２および４７４ｂｐの領域は、実施例６．５（第１８図） に記載されるプラスミドｐＵＣ１９中にクローン化されプラスミドｐＶＲＣ１１ ０６を与えた８．４ｋｂのＳｐｈＩ断片の一部である。８．４−ｋｂのＳｐｈＩ 挿入物の副断片は酵素開裂により得られ、そしてファージＭ１３ｍｐ１８および Ｍ１３ｍｐ１９に両方向でサブクローン化された。サブクローニング部位はＸｈ ｏ Ｉ、ＰＳｔＩ、ＳＰｈＩおよびＢｇａｌIIであり、第１８図に示す。 １９２−ｂｐのＢｇａｌII−ＳｐｈＩおよび４７４ｂＰのＰ_SｔＩ−ＸｈｏＩ 断片を完全にシークエンシングされ、これらの配列を配列番号１３および１４に 表す。７．６． ６．６−ｋｂのＳｐｈＩ断片の２つの４８５ｂｐおよび２９１ｂｐ領 域のシークエンシング この実施例ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）の プリスチナマイシンＩシンターゼIV（ｓｎｂＥ）に関する構造遺伝 子の一部を含有する断片のヌクレオチド配列をどのように得ることができるかを 説明する。 配列決定される２９１および４８５ｂｐの領域は、実施例６．６（第１９図） に記載されるプラスミドｐＵＣ１９中にクローン化されプラスミドｐＶＲＣ１１ ０４を与えた６．６ｋｂのＳｐｈＩ断片の一部である。６．６−ｋｂのＳｐｈＩ 挿入物の副断片は酵素開裂により得られ、そしてファージＭ１３ｍｐ１８および Ｍ１３ｍｐ１９に両方向でサブクローン化された。サブクローニング部位はＸｈ ｏ Ｉ、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩであり、第１９図に示す。４８５−ｂｐのＸｈｏ Ｉ−ＳｐｈＩ断片は完全にシークエンシングされ、そして２９１ｂｐは１５００ ｂｐのＰｓｔＩ断片からシークエンシングされ、これらの配列を配列番号１５お よび１６に表す。７．７． ｐＶＲＣ９００から単離された３．４−ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断 片中の６４５ｂｐ領域の配列 この実施例ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のｓｎｂＡ 遺伝子を含有ヌクレオチド配列の上流に位置する断片のヌクレオチド配 列をどのように得ることができるかを説明する。 この配列を導くために、あらかじめ３．４−ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片を 実施例６．７に記載されたベクターｐＶＲＣ９００からのベクターｐＵＣ１８中 にサブクローン化した。種々のクローニング工程が６．１に記載されたように行 われた：プラスミドｐＶＲＣ９００を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、そしてこれに より得られた断片を０．８％アガロースで分離した。３．４ｋｂのＸｈｏＩ−Ｘ ｈｏ Ｉ断片を電気的溶出により精製し、制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＵＣ１８ と連結した。ＴＧ１ 株の形質転換後、３．４−ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片を持つクローンを単離 した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ９０３と命名した。この制限マップを第 ２３図に表す。 この６４５ｂｐの配列は次に、上記ｐＶＲＣ９０３からの１．４−ｋｂのＰｖ ｕ II−ＥｃｏＲＩおよび０．９−ｋｂのＰｖｕII−ＥｃｏＲＩ断片（第２３図） をベクターＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９中にサブクローニングすること により導かれた。これらのクローニングを行うために、ベクターＭ１３ｍｐ１８ およびＭ１３ｍｐ１９は始めに制限酵素ＢａｍＨＩで消化された；ＰｕｖII消化 により遊離する末端に対応できる平滑末端を作成するために、遊離した粘着末端 をManiatisら（１９８９）に記載された方法によりＤＮＡポリメラーゼＩの巨大 断片（クレノー：ニューイングランドバイオラボ）で満たした；ベクターを次に 制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。ＰｖｕII部位を２．２−ｋｂのＰ_SｔＩ−Ｐ_Sｔ Ｉ断片（ＰＶＲＣ９０３から単離した）で分断し、この部位を重複させる。これ により得られた６４５ｂｐの配列を配列番号９に示す。７．８． ｐＶＲＣ９００から単離された４．１−ｋｂのＰｓｔＩ−ＰＳｔＩ断 片中の１０５０ｂｐ領域の配列 この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のｓ ｎｂＡ 遺伝子を含有するヌクレオチド配列の上流に位置する断片のヌクレオチド 配列をどのように得ることができるかを説明する。 この配列を導くために、あらかじめ４．１−ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片を 実施例６．７に記載されたベクターｐＶＲＣ９００由来のベクターｐＵＣ１９中 にサブクローン化した。種々のクローニング工程が６． １に記載されたように行われた：プラスミドｐＶＲＣ９００を制限酵素ＰｓｔＩ で消化し、そしてこれにより得られた断片を０．８％アガロースゲルにより分離 した。この４．１−ｋｂのＰ_SｔＩ−ＰＳｔＩ断片を電気溶出により精製し、そ して制限酵素ＰｓｔＩで切断したｐＵＣ１９と連結した。ＴＧ１株中での形質転 換後、４．１−ｋｂのＰ_SｔＩ−ＰｓｔＩ断片を持つクローンを単離した。この 組換えプラスミドをｐＶＲＣ４０９と命名した。この制限マップを第２４図に表 す。 この配列は次に、上記ｐＶＲＣ４０９からの０．７−ｋｂのＸｈｏＩ−Ｘｈｏ Ｉおよび１−ｋｂのＸｈｏＩ−ＳｔｕＩ断片（第２４図）をベクターＭ１３ｍｐ １８およびＭ１３ｍｐ１９中にサブクローニングすることにより導かれた。配列 内部のＸｈｏＩ部位はプラスミドｐＶＲＣ４０９から二本鎖シークエンシングに より横断された。これにより得られた１０５０ｂｐの配列を配列番号１０に示す 。７．９． １．４−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片中の６４０ｂｐ領域の配列 この実施例ではＰIIＡシンターゼの２つのサブユニットをコードするエス．プ リスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis） のｓｎｂＡおよびｓｎａＢ遺伝 子を含有ヌクレオチド配列に隣接する断片のヌクレオチド配列をどのように得る ことができるかを説明する。 この配列はｐＶＲＣ１０００（実施例６．８）からの１．４−ｋｂのＢａｍＨ Ｉ−ＳｓｔＩ断片（第２１図）を、ベクタ−Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１ ９中にサブクローニングすることにより導かれた（実施例７．１参照のこと）。 得られた６４０ｂｐの配列を配列番号８に示す。７．１０． ４−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片中に存在する６９４ｂｐの ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ領域の配列 この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のｓ ｎａＣ 遺伝子を含有する断片のヌクレオチド配列をどのように得ることができる かを説明する。 シークエンシングする６９４ｂｐの領域はプラスミドｐＵＣ１９中にクローン 化され、実施例６．９に記載されたプラスミドｐＶＲＣ５０９を与える４−ｋｂ のＢａｍＨＩ−ＢａｍＨ断片の一部である。プラスミドｐＶＲＣ５０９を制限酵 素ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで二重消化することにより得られ、そして５．６に記 載される３つのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする６９４−ｂｐ のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片を、ファージＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９中 にクローン化する。ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩサブクローニング部位を第２２図に 示す。これにより得られた６９４−ｂｐの断片の配列を配列番号７に示す。 実施例８：読み取り枠の決定によるヌクレオチド配列の分析 この実施例では実施例７で明確にしたヌクレオチド配列中に存在する読み取り 枠をどのように決定することができるか、そしてエス．プリスチナエスピラリス （S .pristinaespiralis）ＳＰ９２のプチスチナマイシンＩおよびプリスチナマ イシンIIの生合成に関与する遺伝子ならびにこれらの遺伝子によりコードされる ポリペプチドをどのように同定できるかを説明する。８．１ ５−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（ｐＸＬ２０４５） この実施例では上記のように単離され、そして実施例６および７で配列決定さ れた５−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片中に存在する読み取 り枠をどのようにして決定できるかを説明する。 我々はストレプトミセス（Streptomyces）ＤＮＡが高い割合のＧおよびＣ塩基 を有すると同時に、コーディング枠を構成するコドンの使用について強い偏向が あるという事実（Bibbら、１９８４）を利用して、５−ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｘｈ ｏ Ｉ断片中に読み取り枠の存在を探した。すでに配列決定され、そしてBISANCE データー処理サーバー（data-processing server）から得られた１９６７３個の コドンを含むファイル中に正しく並べられているストレプトミセス（Streptomyc es ）遺伝子のコドンの使用に基づいてStadenおよびMcLach1an（１９８２）法に より、コーディング枠の可能性が計算できるようになる（Dessenら、１９００） 。 この方法により以下の表に示す４つの有望な読み取り枠が５−ｋｂのＢａｍＨ Ｉ−ＸｈｏＩ断片中に特性付けられることができた。それらをそれらのＢａｍＨ Ｉから出発する位置に従い枠１−４と命名する。それぞれについて、塩基長、断 片中の位置（ＢａｍＨＩ部位が１位に位置する）、ならびに対応するタンパク質 の分子量（ｋＤａ）を表す。枠１３および４は同じ鎖によりコードされ、そして 枠２は相補鎖である（第１６図）。 −枠１および３はそれぞれ上記実施例５に記載されたように単離されたタンパク 質ＳｎａＡ（配列番号２）およびＳｎａＢ（配列番号３）に対応し、その遺伝子 のクローニングに関しては実施例６に詳細に記載されいる。実質的にＯＲＦｓ１ および３の生産物のＮＨ₂−末端配列は、切除されるアミノ末端メチオニンは別 として、て実施例５．１．２に記載されたタンパク質ＳｎａＡおよびＳｎａＢに 関して見いだされたＮＨ₂−末端配列とそれぞれ同一である。さらに配列から算 出された分子量は、実施例５に記載された見かけ上のＳＤＳ−ＰＡＧＥで推定さ れるものに相当する。 −読み取り枠４の生産物とＮＢＲＦバンクに含まれるタンパク質配列の比較によ り、種々の、特にE.Coli（Markhamら（１９８４）、ラット（Horikawaら、１９ ８９）、およびエス．セルビシエ（S.Cerevisiase）（Thomasら、１９８８）のＳ −アデノシルメチオニン（またはＳＡＭ）シンターゼとの相同性が明らかにな る。Ｋａｎｅｈｉｓａ（１９８４）の アルゴリズムを使用してすべての配列について計算された相同性の値は、５１． ８−５５．４％で変化する。 したがってこれらの配列比較は、読み取り枠４の生成物がプリスチナマイシン ＩまたはIIの生合成に関与するＳＡＭシンターゼであることを実証することがで きる。この遺伝子をＳａｍＳ（配列番号４）と命名した。 ＳａｍＳ遺伝子のプリスチナマイシン生合成への関与は、この遺伝子を破壊す る、実施例９．２に示すようなＳＰ９２突然変異体の構築により確かに実証され る。 −読み取り枠２の生産物の配列とＧｅｎｐｒｏバンクに含まれるタンパク質配列 の比較により、このタンパク質の内部配列が、アナバエナ（Anabaena）（Bancro ftおよびWolk、１９８９）の挿入配列（ＩＳ８９１）の第一読み取り枠の内部配 列と３６％の相同性であることを明らかになる。この結果は読み取り枠２（ＯＲ Ｆ４０１と命名された）が挿入配列に属し、したがってｓｎａＡおよびｓｎａＢ 遺伝子間に位置した挿入配列あることを示唆している。８．２ １８７０−ｂｐのＳａｕ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ断片（ｐＶＲＣ４０２１） この実施例では上記のように単離され、そして実施例６および７に記載された ように配列決定された１８７０−ｋｂのＳａｕ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ断片中に存在す る読み取り枠をどのように決定することができるかを説明する。 Ｓａｕ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ断片に関する読み取り枠に関する調査は、上記のよう に行われた。単一の完全な読み取り枠をこのように実証するこ とができた。その特徴は次の通りである：この枠はＳａｕ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ断片 の１０９位から１８５８位に伸び、これは分子量６１４００Ｄａを有する５８２ アミノ酸のタンパク質をコードする１７４９塩基の枠に対応する。このタンパク 質は上記実施例５に記載されたように精製されたタンパク質ＳｎｂＡに対応し、 そしてその遺伝子のクローニングは実施例６に詳細に記載されている。実質的にＳａｕ ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ断片に存在するＯＲＦの生産物のＮＨ₂−末端配列は、 実施例５．２のタンパク質ＳｎｂＡに見いだされるＮＨ₂−末端配列と同一であ る。配列から算出された６１４００Ｄａの分子量は、タンパク質ＳｎｂＡの分子 量としＳＤＳ−ＰＡＧＥで推定される６７０００Ｄａ、および実施例５．２．１ ．Ｂに記載されているゲル浸透による６００００Ｄａに相当する。 したがってｓｎｂＡ遺伝子は、１分子の３−ヒドロキシピコリン酸と１分子の ＡＴＰ：３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼからアシルアデニレート３ −ヒドロキシピコリニル−ＡＭＰの形成を触媒する酵素をコートする（配列番号 ５）。８．３ １８３０−ｂｐ 断片（ｐＶＲＣ５０１） この実施例では上記のように３．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片から単 離された１８３０−ｋｂの断片中に存在する読み取り枠をどのように決定するこ とができるかを説明する。 １８３０−ｂｐ断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。単 一の完全な読み取り枠をこのように実証することができた。その特徴は次の通り である：この枠の開始点はおそらくＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片から配列決定さ れた１８３０ｂｐの領域の１０３位に位置し、そして１６８６で終了し、これは 分子量約５４０００を有する５２８ア ミノ酸のタンパク質に対応する。 このタンパク質の配列をGeneproバンクに含まれる配列と比較すると、種々の 代謝物、特に種々の微生物中でのテトラサイクリン（KhanおよびNovick、１９８ ３；Hoshinoら，１９８５）、エス．コエリコーラー（S.coelicolor）、 アク チノローディン（actinorhodine：Fernandez-Morenoら、１９９１）およびメチ レノマイシン（methylenomycin：NealおよびChater、１９８７ｂ）の転移機能を 持つタンパク質との相同性が；明らかになる。 これらのデータにより、３．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片中に含有さ れる読み取り枠の生成物は、プリスチナマイシンＩ（そしておそらくプリスチナ マイシンII）を細胞外に運搬することができる転移タンパク質であることが指示 される。このタンパク質はＳｎｂＲと命名され、そして遺伝子ｓｎｂＲに対応す る（配列番号６）。 KyteおよびDoolittle（１９８２）の方法によるタンパク質ＳｎｂＲの疎水性 プロフィールの分析は、その膜の局存性の確証となり、したがってその転移機能 の確証となる。８．４ １０５０−ｂｐ 断片（ｐＶＲＣ４０９） この実施例では上記実施例７．８に記載のように配列決定されたｐＶＲＣ４０ ９由来の１０５０−ｋｂの断片中に存在する読み取り枠をどのように決定するこ とができるかを説明する。 １０５０−ｂｐ断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。単 一の完全な読み取り枠をこのように実証することができた。その特徴は次の通り である：この相は配列決定された部分の８４位から９６２位に拡がり、これは分 子量３２０００Ｄａを有する２９２アミノ酸 のタンパク質をコードする８７８塩基の枠に対応する。このタンパク質はタンパ ク質ＰａｐＭと命名された。これはさらに実施例５に記載されたようにエス．プ リスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株から精製された。配 列から算出されたタンパク質の３２０００Ｄａの分子量は、実施例５のようなＳ ＤＳ−ＰＡＧＥで推定される見かけ上の分子量３２０００と同一である。さらに このタンパク質のＮＨ₂−末端配列は実施例５から導かれるように、１０５０ｂ ｐの配列（配列番号１０）の読み取り枠での分析から同定されたタンパク質Ｐａ ｐＭのＮＨ₂−末端配列とよく対応する。８．５ ２２０−ｂｐおよび２４７−ｂｐ断片（ｐＶＲＣ１１０５） この実施例では上記実施例６および７に記載のように配列決定されたｐＶＲＣ １１０５からの２２７−ｂｐおよび２４７−ｂｐ断片中に存在する読み取り枠を どのように決定することができるかを説明する。 これら２つの断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。両方 の場合において断片の全長にわたって不完全な読み取り枠を実証することができ た。 ９００−ｂｐのＸｈｏＩ断片から単離された２４７−ｂｐ断片について同定され た読み取り枠から得た配列は実施例５に記載されたように精製されたタンパクＳ ｎｂＣの内部配列の１つを含む。 ｐＶＲＣ１１０５から単離された２２７−ｂｐおよび２４７−ｂｐ断片につい て同定された読み取り枠の生成物とGeneproバンクに含まれる配列と比較すると 、それらはペプチドシンターゼと相同的であることが明らかになる。２２７−ｂ ｐ断片から導かれた断片の１つは、アクレモニウム クリソゲニウム（Acremoni um chrysogenum）（α−アミノアジ ピル）システイニルバリンシンターゼと２４．５％の相同性を表す（Gutierrez ら、１９９１）。２４７−ｂｐ断片から導かれた断片、バチルス グラミシジン ＳシンターゼII（Horiら、１９９１）と３４．９％の相同性を、そしてアクレモ ニウム クリソゲニウム（Acremonium chrysogenum）（α−アミノアジピル）シ ステイニルバリンシンターゼと２８％の相同性を表す（Gutierrezら、１９９１ ）。 これにより、実施例５．１で単離されたコスミドｐＩＢＶ３は、まさに実施例 ５．３に記載したプリスチナマイシンＩシンターゼIIの構造遺伝子の一部を含み 、これをＳｎｂＣと命名する（配列番号１１および１２）。８．６ １９２−ｂｐおよび４７４−ｂｐ断片（ｐＶＲＣ１１０６） この実施例では上記実施例６および７に記載されたｐＶＲＣ１１０６からの１ ９２−ｂｐおよび４７４−ｂｐ断片中に存在する読み取り枠をどのように決定す ることができるかを説明する。 これら２つの断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。ｐＶ ＲＣ１１０６から単離された１９２−ｂｐ断片についても不完全な読み取り枠を 実証することができた。その特徴は次の通りである：この枠はＢｇａｌΠの方向 に配列決定された部分の２９位から始まる。停止コドンは同定されず、これはこ の読み取り枠が終了しないことを指示している。 １９２−ｂｐのＢｇａｌII−ＳｐｈＩ断片に関する読み取り枠から得られた配 列は、実施例５に記載されたように精製されたタンパク質ＳｎｂＤの内部配列を 含み、実際これはタンパク質のＮＨ₂−末端配列であることを証明する。 ４７４−ｂｐのＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ断片全長に関して不完全な読み取り枠が実 証できた。 ｐＶＲＣ１１０６から単離された４７４−ｂｐ断片について同定された読み取 り枠の生成物とＧｅｎｅｐｒｏバンクの配列とを比較すると、このタンパク質が ペプチドシンターゼと３０−４０％の相同性を表すことが明らかとなり、例えば バチルス グラミシジンＳシンターゼII（ＨｏｒｉＤ、１９９１）と３９．４％ の相同性を、そしてアクレモニウム クリソゲニウム（Acremonium chrysogenum ）（α−アミノアジピル）システイニルバリンシンターゼと３４％の相同性を表 す（Gutierrezら、１９９１）。 このことは実施例５．１で単離されたコスミドｐＩＢＶ３が、まさに実施例５ ．４に記載したプリスチナマイシンＩシンターゼIII構造遺伝子の一部を含み、 これをＳｎｂＤと命名する（配列番号１３および１４）。８．７ ２９１−ｂｐおよび４８５−ｂｐ断片（ｐＶＲＣ１１０４） この実施例では上記実施例６および７に記載されたｐＶＲＣ１１０４からの２ ９１−ｂｐおよび４８５−ｂｐ断片中に存在する読み取り枠をどのように決定す ることができるかを説明する。 これら２つの断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。両方 の場合において断片の全長にわたって不完全な読み取り枠を実証することができ た。 １４５０−ｂｐ ＰｓｔＩ断片から単離された２９１−ｂｐについて同定され た読み取り枠から得た配列は実施例５に記載されたように精製されたタンパクＳ ｎｂＥの内部配列を含む。 ｐＶＲＣ１１０４から単離された４８５−ｂｐのＸｈｏＩ−ＳｐｈＩ断片につ いて同定された読み取り枠の生成物とGeneproバンクに含まれる配列と比較する と、それらはペプチドシンターゼと相同的であることがあきらかになる。例えば バチルス グラミシジンＳシンターゼII（Horiら、１９９１）と３４．７％の相 同性を、そしてアクレモニウム クリソゲニウム（Acremonium chrysogenum）（ α−アミノアジピル）システイニルバリンシンターゼと３６．２％の相同性を表 す（Gutierrezら、１９９１）。 これにより、実施例５．１で単離されたコスミドｐＩＢＶ３は、まさに実施例 ５．５に記載したプリスチナマイシンＩシンターゼIVの構造遺伝子の一部を含み 、これをＳｎｂＥと命名する（配列番号１５および１６）。８．８ ６４５−ｂｐ断片（ｐＶＲＣ９０３） この実施例では上記実施例６．７に記載されたプラスミドｐＶＲＣ９０３から 上記のように配列決定された６４５−ｂｐ断片中に存在する読み取り枠をどのよ うに決定することができるかを説明する。 この６４５−ｂｐ断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。 このように不完全な読み取り枠を実証することができた。その特徴は次のとおり である。この枠には翻訳開始について２つの可能性があり、それは配列決定され た部分の６１位のＧＴＧおよび７０位のＧＴＧである（１２４位に位置するＡＴ Ｇは後に記載する配列相同性のために考慮しない）。シャイン−ダルガーノ領域 の存在の見込ではこれらのどのコドンが開始に対応するかを区別することができ ない。停止コドンは同定されないので、これはこの読み取り枠が終了しないこと を指示す る。このようにして同定された遺伝子をｐａｐＡと呼び、そしてタンパク質はタ ンパク質ＰａｐＡと呼ぶ（配列番号９）。 ｐＶＲＣ９００から単離された３．４−ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片につい て同定された読み取り枠の生成物とＧｅｎｅｐｒｏバンクに含まれる配列と比較 すると、それらはｐ−アミノベンゾエートシンターゼおよびアントラニレートシ ンターゼ型のタンパク質の第II成分と相同的であることかき明らかになる。それ らはそれぞれ種々の微生物のｐ−アミノ安息香酸（葉酸前駆体）の合成およびア ントラニル酸（トリプトファン前駆体）の合成に関与する。それは特にアゾスピ リウム （Azospirillum）のタンパク質ＴｒｐＧと４８％相同的（Zimmer W.,Apar icio C.,およびElmerich c.Mol Gen.Genet．（１９９１） ２２９：４１−５１ ）であり、そしてクレブシーラ プノウモニエ（Klebsilla pneumoniae）のタン パク質ＰａｂＡと４７％の相同的である（Kap1anJ.B.,Merkel W．K．およびNich ols B.P.J.Mol.Biol．（１９８５）１８３：３２７−３４０）。タンパク質Ｔｒ ｐＧおよびＰａｂＡはコリスミン酸のアミノ基転移に関与するグルタミナーゼ活 性を持つ。実証された相同性はタンパク質ＰａｐＡもクロスミックアシッドのア ミノ基転移活性に関与するかもしれないことを表す傾向がある。コリスミン酸はストレプトミセス （Streptomyces）により導かれる抗生物質であるクロラムフェ ニコールの合成で推定されるｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンの前駆体（プ リスチナマイシンＩの成分）と考えられる（Sharka B.,Westlake D.W.S．および Vining L.C.（１９７０）Chem Zvesti ２４、６６−７２）。 タンパク質ＰａｐＡの役割はｐａｐＡ遺伝子でのＳＰ９２株の突然変異体の分 析により引き続き（実施例９．３）示されるであろう。８．９ １．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片（ｐＶＲＣ１０００） この実施例では上記実施例６．８および７．９に記載されたように単離そして 配列決定された１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片中に存在する読み取り枠 をどのように決定することができるかを説明する。 １．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片中に存在する６４０ｂｐの配列決定領 域に関する調査は、実施例８．１のように行われた。このように単一の完全な読 み取り枠が実証できた。翻訳開始および停止コドンが実証できなかったことは、 配列決定した６４０ｂｐの領域ばおそらくさらに大きな読み取り枠の内部であろ うことを指示し、これはｓａｎＤと命名する（配列番号８）。 ６４０ｂｐ領域でコードされるタンパク質配列とＧｅｎｅｐｒｏおよびＮＢＲ Ｆバンクに含まれるタンパク質配列と比較すると、このタンパク質がビー．ブレ ビス （B.brevis）グラミシジン シンターゼＩ（Horiら、１９８９）、ビー．ブ レビス （B.brevis）チオシジンシンターゼＩ（Weckermannら、１９８８）、およ びアクレモニウム クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）ＡＣＶシンターゼ （Gutierrezら、１９９１）のようなペプチドシンターゼの内部部分と２０−２ ５％相同的であることが明らかとなる。 これらのデータは６４９ｂｐ領域に部分的にコードされるタンパク質が、おそ らくプリスチナマイシンIIのペプチド部分の生合成に関与するペプチドシンター ゼであることを示している。実質的にプリスチナマイシンＩの生合成に関与する すべてのペプチドシンターゼは、他のエス．プリスチナエスピラリス（S.Pristi naespiralis ）染色体の領域ですに同定されている（実施例５．２、５．３、５ ．４および５．５）。８．１０ ６９４−ｂｐ断片（ｐＶＲＣ５０９） この実施例では上記実施例６および７に記載されたｐＶＲＣ５０９から上記の ように配列決定された６９４−ｂｐ断片中に存在する読み取り枠をどのように決 定することができるかを説明する。 この６９４−ｂｐ断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。 このように不完全な読み取り枠を実証することができた。その特徴は次のとおり である。この枠は配列決定された領域の２１０位から始まる。停止コドンは同定 されないので、これはこの読み取り枠が終了しないことを指示する。したがって 対応するタンパク質の分子量は算出できず、実施例５．６で記載したＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥで推定されるＦＭＮレダクターゼの見かけ上の分子量２８，０００とも比 較てきない。一方このように６９４−ｂｐの配列の読み取り枠の分析により同定 されたタンパク質のＮＨ₂−末端は、実施例５に記載したように精製されたタン パク質ＳｎａＣのＮＨ₂−末端と同一である。同様に、実施例５．６に記載した ＦＭＮレダクターゼの２つの内部タンパク質が、配列決定した部分から導かれた 。これはコスミドｐＩＢ４から単離された遺伝子がまさに実施例５．６に記載し たタンパク質ＦＭＮレダクターゼに対応することを確証するものであり、これを ＳｎａＣ（配列番号７）と命名する。 コスミドｐＩＢＶ１からｐＩＢＶ２が持つエス．プリスチナエスピラリス（S.Pristinaespiralis ）のＤＮＡ断片は、プリスチナマイシンIIおよびプリスチナ マイシンＩの生合成に関与する数個の遺伝子の存在を実証した。ｓｎａＡ、ｓｎ ａＢ およびｓａｍＳ遺伝子はプリスチナマイシンII、プリスチナマイシンIIＡシ ンターゼおよびおそらくＳＡＭシンターゼの生合成に参加する酵素をコードし、 そしてプラスミドｐＩＢＶ １にクローン化された巨大ＤＮＡ断片上に物理的に一緒に群を成す。同様にｓｎ ｂ Ａ、ｓｎｂＲ、ｐａｐＡ、およびｐａｐＭ遺伝子（これらはプリスチナマイシ ンＩ、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼ（ＳｎｂＡ）の生合成に参加 するタンパク質、おそらくプリスチナマイシンＩの転移の原因であるＳｎｂＲタ ンパク質、コリスミックアシッドからｐ−アミノフェニルアラニンの生合成に関 与するタンパク質Ｐａｐａ、およびｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル−Ｎ ）−メチルトランスフェラーゼ（ＰａｐＭ）をコードする）は、コスミドｐＩＢ Ｖ２中にクローン化された巨大ＤＮＡ上に一緒に群を成す。同様にｓｎａＡおよ びｓｎａＤ遺伝子（これらはプリスチナマイシンIIの生合成に参加するタンパク 質、ＳｎａＤはおそらくペプチドシンターゼであるタンパク質をコードする）、 ならびにｓｎｂＣ、ｓｎｂＤおよびｓｎｂＥ遺伝子（これらはその６つの別個の アミノ酸からプリスチナマイシンＩのペプチド鎖の形成に関与する３つのペプチ ドシンターゼＳｎｂＣ、ＳｎｂＤおよびｓｎｂＥをコードする）はコスミドｐＩ ＢＶ３中にクローン化された巨大ＤＮＡ上に一緒に群を成す。これらの結果はプ リスチナマィシンIIの生合成に関与する遺伝子、ならびにプリスチナマイシンＩ の生合成に関与する遺伝子が一緒に群を成しているという仮定を確証するもので あり、そして調査した領域の上流および下流の染色体を歩くことにより、これら の生合成に関与する他の遺伝子のクローニングの可能性を与える。 さらに様々な株で生産されるストレプトグラミン（表１参照のこと）の全ＤＮ ＡとｓｎａＡ、ｓｎａＢ、ｓｎａＣ、ｓｎａＤ、ｓａｍＳ、ｓｎｂＡ、ｓｎｂＲ 、ｓｎｂＣ、ｓｎｂＤ、ｓｎｂＥ、ｐａｐＡおよびｐａｐＭ遺伝子とをハイブリ ダイゼーションさせることにより、または染 色体ウォーキングにより同定された遺伝子、あるいはこれらの遺伝子の断片とハ イブリダィゼーションさせることによりストレプトグラミンを生産する他の微生 物で同じ機能に対応する遺伝子を単離することが可能である。これはプリスチナ マイシンについて行われたものと同様な研究法により、種々のストレプトグラミ ンの生合成に関与するすべての遺伝子を単離することを可能にする。 実施例９：遺伝子破壊によるＤＮＡ断片の遺伝的研究 この実施例では、生産株由来の株を構築し、そしてこれらの遺伝子を破壊して 突然変異させ、さらにそのような突然変異体の表現型を分析することによりスト レプトグラミンの生合成について遺伝子の関与をどのように実証できるかを説明 する。この実施例ではさらに唯一の、または他のストレプトグラミンのＡおよび Ｂ成分を生産している株、あるいはＳＰ９２株とは異なる割合でＡおよびＢ成分 を生産している株をどのように得るかを説明する。９．１ ｓｎａＡ遺伝子が破壊されたエス ．プリスチナエスピラリス（S.pristi naespiralis ）ＳＰ９２の突然変異体の構築 この実施例ではｓｎａＡ遺伝子の破壊により、もはやプリスチナマイシンIIＡ を生産せず、対照的にプリスチナマイシンIIＢを生産するエス．プリスチナエス ピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株をどのように構築できるかを説明 する。 この突然変異体はＳｎａＡの機能を確認し、そして実質的に改変されることが できるプリスチナマイシンIIの中間体の生産を与えることを目的として構築され た。 その構造はE.coli中のみで複製できるが、ストレプトミセス（Strept omyces ）中で発現する耐性マーカーを持つ自殺プラスミドを使用して行った。こ のベクターはｐＤＨ５であるが、Hillemamら（１９９１）により開発された。 ９．１．１． プラスミドｐＶＲＣ５０５の構築 この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ ９２中では複製せず、そして単一相同的組換えによりｓｎａＡ遺伝子を破壊する ために使用できるプラスミドをどのように構築できるかを説明する。 プラスミドｐＶＲＣ５０５は、実施例６．３に記載されるプラスミドｐＸＬ２ ０４５から、ｓｎａＡ遺伝子が破壊されたＳＰ９２染色体突然変異体を生成する ために構築された。 ｐＸＬ２０４５中にクローン化された６−ｋｂのＢａｍＨＩ断片（第１６図） を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断した。このように得られた断片を １％アガロースゲルで分離した後、ｓｎａＡ遺伝子の５’末端を含有する０．７ −ｋｂの断片を単離し、そしてGeneclen（バイオ１０１、ラジョラ、カリフォル ニア州）で精製した。 ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ二重消化により直線化された１００ｎｇのベクターｐＤ Ｈ５を、実施例３．３に記載するように１００ｎｇの０．７ｋｂ断片と連結した 。所望の断片を持つクローンをＴＧ１株による形質転換後に単離した。この組み 換えプラスミドをｐＶＲＣ５０５と命名した。プラスミドｐＶＲＣ５０５は実施 例２．１．に記載されたように調製した。その制限マップを第２５図に示す。 ９．１．２． 相同的組み換えによりｓｎａＡ遺伝子が破壊されたＳＰ９２突然 変異体の単離 この実施例ではｓｎａＡ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S .pristinaespiralis）の突然変異体をどのように構築できるかを説明する。 突然変異体は自殺プラスミドｐＶＲＣ５０５でＳＰ９２株を形質転換して単離 した。 プロトプラストの調製およびその形質転換は、Hopwoodら（１９８５）に記載 されているように行った。 ＳＰ９２株をＹＥＭＥ培地、３４％シュクロース、５ｍＭ ＭｇＣ１₂、０． ２５％グリシンで３００℃にて４０時間培養した。菌糸体をリゾチームの存在下 でプロトプラストに転換し、そして５×１μｇのｐＶＲＣ５０５をプロトプラス トの形質転換に使用した（ＰＥＧを使用する方法による）。Ｒ２ＹＥ培地（D.Ho pwoodら １９８５）でのプロトプラストの一晩の再生後、組み換え体を２．６ μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有する３ｍｌのＳＮＡ培地（D.Hopwoodら、 １９８５）を上層させて選択した。 実施した５つの形質転換の中で、３つのチオストレプトン−耐性クローンが単 離された。これは１μｇのＤＮＡあたり１より低い組み換え効率である。これら の組み換え体はＳＰ９２株の染色体が持つｓｎａＡ遺伝子と自殺プラスミドｐＶ ＲＣ５０５の０．７ｋｂ断片との間の単一相同的組み換えの結果である。ｐＶＲ Ｃ５０５中に挿入されたより小さい断片（０．７−ｋｂ）は低い組み換え効率を 説明している。 組み換え体の胞子を４００μｇ／ｍｌのチオストレプトンを補充したＲ２ＹＥ 培地にまいて生育させ、そして再度同一培地にまいて単離コロニーを得た。 プラスミドｐＶＲＣ５０５の統合位置を確認するために、数種の組み換えクロ ーンの全ＤＮＡ（これは適当な制限酵素で消化した）の種々のサザンブロットが 作成され、そしてManiatisら（１９８９）に記載されたように［α−³²Ｐ］−ｄ ＣＴＰでランダムプライミングにより標識（ランダムプライムド ＤＮＡ 標識 キット、ベーリンガーマンハイム、仏国：Random Primed Iabeling kit,Boehrin ger Mannheim,France）した後、連続的にプローブとして使用したベクタ−ｐＤ Ｈ５および０．７−ｋｂ断片とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション の結果では組み換え体クローンのゲノム中にベクタ−ｐＤＨ５の大きさのＥｃｏ ＲＩ−ＰｓｔＩバンドの出現が示され、これは後者とハイブリダイズし、同様に さらに両方のプローブとハイブリダイズするＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩハンドの出 現が示される。これらの突然変異体の１つはＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０５と命名さ れた。この突然変異体は単一相同的組み換えによるｓｎａＡ遺伝子中のプラスミ ドｐＶＲＣ５０５の統合によく対応する。 ９．１．３ 突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０５によるプリスチナマイシンの 生産 この実施例ではプラスミドｐＶＲＣ５０５の統合によりｓｎａＡ遺伝子が破壊 されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然 変異体が、もはやプチスチナマイシンΠＡを生産せず、一方プチスチナマイシン IIＢを生産し続けることをどのように測定するかを説明する。 突然変異体ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０５、同様に対照としてＳＰ９２株を液体 生産培地で培養した。発酵は以下のように行われた：０．５ｍ ｌの上記株の胞子の懸濁液を、滅菌条件下で３００−ｍｌのエーレンマイヤー中 の４０ｍｌの植菌培地に加える。植菌培地は１０ｇ／ｌのコーンスティープ、１ ５ｇ／ｌのシュクロース、１０ｇ／ｌの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１ｇ／ｌのＫ₂ＨＰＯ₄ 、３ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏおよび１．２５ｇ ／ｌのＣａＣＯ₃から成る。炭酸カルシウムを導入する前にｐＨを６．９に水酸 化ナトリウムで調整する。エーレンマイヤーは２７℃で４４時間、３２５ｒｐｍ の速度で回転スターラーで撹拌する。４４時間経過後、上記カルチャー２．５ｍ ｌを滅菌条件下で、３００−ｍｌのエーレンマイヤー中の３０ｍｌの生産培地に 加える。生産培地は２５ｇ／ｌの大豆粉、７．５ｇ／ｌの澱粉、２２．５ｇ／ｌ のグルコース、３．５ｇ／ｌの補充酵母、０．５ｇ／ｌの硫酸亜鉛および６ｇ／ ｌの炭酸カルシウムから成る。炭酸カルシウムを導入する前にｐＨを６．０に塩 酸で調整する。エーレンマイヤーは２７℃で２４、２８および３２時間撹拌する 。各時間で、１０ｇの果膠が均質なエーレンマイヤー中で計られ、これに６２． ５％のアセトニトリルおよび３７．５％の０．１Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄溶液（Ｈ₃ＰＯ₄ でｐＨを３．０に調整）から成る２０ｍｌの移動相（そしてこれはプリスチナマ イシンの抽出を可能にする）を加える。スターラーで室温にて２０分間撹拌（３ ２５ｒｐｍ）した後、全体を濾紙により濾過し、そしてプリスチナマイシンを実 施例５．１．１．Ａに記載するようにＨＰＬＣにてアッセイする。 結果は、実施した発酵条件下で突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０５は対照で あるＳＰ９２と同等量のプリスチナマイシンＩを生産し、これは試験した３回の 場合でそうであった。対照的に対照は約７０％のプリ スチナマイシンIIＡおよび３０％のプリスチナマイシンIIＢを、２４、２８およ び３２時間の発酵で生産し、突然変異体ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０５はプリスチ ナマイシンIIＢを１００％、これらと同時に生産し、その量はＳＰ９２株が生産 したプリスチナマイシンIIＡ＋プリスチナマイシンIIＢの総和に等しかった。し たがって突然変異体はまさにプリスチナマイシンIIの生合成段階（これは中間体 プリスチナマイシンIIＢのＤ−プロリンの２，３結合の酸化に対応する）でブロ ックされた。したがってこの突然変異体はプリスチナマイシンIIＢを蓄積する。 これはプリスチナマイシンIIＢからプリスチナマイシンIIＡへの転換におけるＳ ｎａＡの機能的関与をよく表している。 この実施例は生合成に関するクローン化遺伝子から出発して、プリスチナマイ シンの生合成段階で突然変異した株を構築できることを示している。これはプリ スチナマイシンIIに関しても示されたが、ストレプトグラミンの種々の成分に関 して応用することにより、同じ結果がプリスチナマイシンＩについても得ること ができる。種々の中間体を生産する株はこのように得ることができる。これら株 は化学的、生化学的、酵素的などの修飾（１つまたは複数）により新規分子を生 産するために使用できる。１つ、または他のストレプトグラミンの成分の生合成 経路の初期段階でのブロックにより、唯一の、または他の成分を生産するように された突然変異株も導くことができる。９．２ ｓａｍＳ遺伝子が分断されたエス．プリスチナエスピラリス （ｓ.prist inaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体の構築 この実施例ではｓａｍＳ遺伝子の破壊により、野生型のＳＰ９２株に比較して ３５％低いＰＩＡ、および１０倍多いＰＩＢ（その化学構造を 第２図に示す）を生産するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespirali s ）ＳＰ９２株をどのように構築できるかを説明する。この突然変異体はｓａｍ Ｓ 遺伝子にコードされるタンパク質に関して推定されるＳＡＭシンターゼ機能を 確証し、そして野生型ＳＰ９２株よりも多いＰＩＢを合成する株を得ることを目 的として構築された。 ９．２．１． プラスミドｐＶＲＣ７０２の構築 プラスミドｐＸＬ２０４５（実施例６．３に記載される）から、３．２−ｋｂ のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を酵素的開裂により単離し、そして１％のアガロ ースゲルの電気泳動の後Genecleanキット法で精製した（実施例６．８参照）。 この断片はｓｎａＢ遺伝子およびｓａｍＳ遺伝子（第１６図）を持つ。この断片 を次に以下の方法によりプラスミドｐＵＣ１８中にクローン化した：５０ｎｇの ｐＵＣ１８を酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを使用する二重消化により直線化 し、そしてＴＳＤＮＡリガーゼ（バルオラボズ）の存在下で３００ｎｇの３．２ −ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片と連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１株のコ ンピテント細胞をこの連結混合物で形質転換した後、この３．２−ｋｂの挿入物 を有するプラスミドｐＵＣ１８を持つ組換えクローンを単離でき、そしてこれを ｐＶＲＣ７０１と命名した（第２６図）。 プラスミドｐＶＲＣ７０２は、のｓａｍＳ遺伝子（第２７図）の中央に位置す る２つのＳｓｔＩ部位の間に、アムラマイシンおよびゲニチシンに対する耐性を コードするａｍＲ遺伝子を持つカセットを導入することによりプラスミドｐＶＲ Ｃ７０１から派生する。このために、ＱａｍＲカセットを持つ２．２−ｋｂのＢ ａｍ ＨＩ−ＢａｍＨ断片が最初にプラスミドｐＨＰ４５０ＱａｍＲ（J.L.Pernod et、Laboratoire de Genet iqe d'Oesayに与えられている）から、上記と同様な手法を使用してＢａｍＨＩ 消化により単離された。２００ｎｇのこの断片を、酵素ＢａｍＨＩで直線化した ５０ｎｇのプラスミドｐＵＣ１３１８（ＫａｙおよびＭａｃｐｈｅｒｓｏｎ、１ ９８７）と連結し、そしてこの連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１株のコンピテ ント細胞に導入した。ＱａｍＲカセットを含有するプラスミドｐＵＣ１３１８を 有する組換えゾーンから、酵素Ｓｓｔ１を使用する部分開裂によりＱａｍＲカセ ットを含有する５０ｎｇの２．２−ｋｂのＳｓｔ１−Ｓｓｔ１断片を再単離する ことができ、そしてこの断片を３０ｎｇのＳｓｔ１（第２６図）で切断したプラ スミドＰＶＲＣ７０１と連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞で形質転換した後、 プラスミドＰＶＲＣ７０２を得、その構造を第２７図に表す。 これにより得たプラスミドｐＶＲＣ７０２を上記実施例２．１に記載したよう に大量に調製した。 ９．２．２．ｓａｍＳ：：ＱａｍＲ染色体遺伝子を有する株の構築 この株はエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のプロトプ ラストを１μｇの自殺プラスミドｐＶＲＣ７０２（これはストレプトミセス（St reptomyces ）細胞中では複製できない）で形質転換することにより得られた。プ ロトプラストの調製法およびその形質転換法は、上記（実施例９．１）と同じで ある。実施例１０．１に関しては抗生物質の選択について変更しただけである。 本場合には３００℃でＲ２ＹＥ培地で１８時間再生した後、組換えプロトプラス トを５０μｇ／ｍｌのゲニチシン（シグマ化学社）存在下で選択した。すなわち ３８３μｇ／ｍｌのゲニチシンを含有する３ｍｌのＳＡＮを各Ｒ２ＹＥ培地の皿 に上層した。 このように５００個のゲニチシン−耐性クローンを単離することができ、これ は染色体とプラスミドｓａｍＳとの間の単一相同的組換え後のプラスミドｐＶＲ Ｃ７０２の染色体への統合か（単一交差の場合）、あるいは二重相同的組換え後 の染色体ｓａｍＳ遺伝子とプラスミドｓａｍＳ：：ＱａｍＲプラスミド遺伝子の 交換の結果（二重交差の場合）のいずれかの結果でありうる。この２つの適例に おいて、ＱａｍＲカセットは株の染色体上に転移され、そして世代にわたって安 定なａｍＲ耐性を付与する。 組換えクローンをプレートにまき、そして最終的に５０μｇ／ｍｌのゲニチシ ンを含有するＨＴ７培地で生育させ、そしてコロニーハイブリダイゼーション法 により単離する。実施例９．１に記載されるように、ｐＶＲＣ７０２および対応 するｐＵＣ１８に由来する２．７ｋｂのＢａｍＨ１−ＥｃｏＲＩ断片から得た第 一プローブでのクローンのハイブリダイゼーション、ならびにＱａｍＲカセット を持つ２．２−ｋｂのＢａｍＨ１断片に対応する第２プローブでのハイブリダイ ゼーションは、単一交差（両方のプローブとハイブリダイズする）を二重交差（ 第２プローブとのみハイブリダイズする）から区別することを可能にする。これ により選択される二重交差から生じる３つのクローンを、プレートにまいて、そ して終濃度が５０ｍｇ／ｍｌのゲニチシンを含有るすＹＶＤ培地で生育させ、そ して胞子のストックを得た。 ３つの二重組換え体のゲノム構造を確認するために、これらのクローンを酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した染色体ＤＮＡの様々なサザンブロットを 作成し、そして以下の３つのプローブとハイブリダイズさせた：ｐＶＲＣ７０２ の２．２−ｋｂのＢａｍＨＩ断片から得たＱ ａｍＲカセットに対応するプローブ、ｐＶＲＣ７０１の２．７−ｋｂのＢａｍＨ Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片から得たｐＵＣ１８に対応するプローブ、そして最後にｓｎ ａＢ 遺伝子を持ち、かつｓａｍＳの始まりであるｐＶＲＣ７０１の１．３−ｋｂ のＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ断片から得たプローブ。これらのハイブリダイゼーショ ンにより試験した３つのクローンがまさに、ＱａｍＲカセットにより妨害された 突然変異ｓａｍＳ遺伝子により完全な染色体ｓａｍＳ遺伝子置換を可能にする二 重相同的組換えの結果であることを確証することができる。 これら３つのうちの１つの突然変異クローンをＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲ と命名した。９．２．３．突然変異株 ｓａｍＳ：：ＱａｍＲ株によるプリスチナマイシンの生 産 この実施例では破壊されたｓａｍＳ遺伝子を持つ突然変異体ＳＰ９２ｓａｍＳ ：：ＱａｍＲが野生型のＳＰ９２株に比較して３５％低いプリスチナマイシンＩ Ａ、および１０倍多いプリスチナマイシンＩＢを生産することをどのように測定 するかを説明する。 突然変異体ＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲならびに対照ＳＰ９２株は液体培地 で培養し、そしてそれらの生産物のプリスチナマイシンIIおよプリスチナマイシ ンＩを実施例９．１に記載したようにアッセイした。 結果は、実施した発酵条件下で突然変異体ＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲは対 照であるＳＰ９２と同等量のプリスチナマイシンIIを生産し、これは試験した３ 回の場合でそうである。対照的に突然変異体ＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲは対 照株よりも約３５％低いプリスチナマイシンＩＡおよび１０倍多いプリスチナマ イシンＩＢを、試験した３回のすべ てについて生産する。したがってプリスチナマイシンのＩＢ形は突然変異体ＳＰ ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲが生産する全プリスチナマイシンＩ型の集合の２０％ を表し、一方対照株はＰＩＢを１％のオーダーで生産するのみである。プリスチ ナマイシンのＩＢ形がＩＡ形と異なる点は、プリスチナマィシンＩＡの第５番残 基がｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンの代わりにりｐ−メチルアミノフェニ ルアラニンである点である。突然変異体ＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲがより多 くのプリスチナマイシンＩＢを生産し、そしてより少ないプリスチナマイシンＩ Ｂを生産するという事実は、ｓａｍＳ遺伝子の破壊がプリスチナマイシンＩの第 ５残基のメチル化の程度を減少させ、したがってｓａｍＳ遺伝子はおそらくメチ ル基供与体、ＳＡＭの生合成に関与し、すなわちそれはＳＡＭシンターゼをコー ドする。９．３ ｐａｐＡ遺伝子が破壊されたエス ．プリスチナエスピラリス（S.pristi naespiralis）ＳＰ９２の突然変異体の構築 この実施例ではｐａｐＡ遺伝子の破壊により、もはやＰＩを生産しないエス．プリスチナエスピラリス （S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株をどのように構築 できるかを説明する。この突然変異体はｐａｐＡタンパク質の機能を確認するこ とを目的として構築された。その構築は実施例９．１に記載したように自殺プラ スミドｐＤＨ５を使用して行われた。 ９．３．１． プラスミドｐＶＲＣ５０８の構築 この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ ９２中では複製せず、そして単一相同的組換えによりｐａｐＡ遺伝子を破壊する ために使用できるプラスミドをどのように構築できるかを説明する。 プラスミドｐＶＲＣ５０８は実施例７．７に記載されるプラスミドｐＶＲＣ９ ０３から、ｐａｐＡ遺伝子が破壊されたＳＰ９２染色体突然変異体を作成するよ うに構築された。 実施例７．７において、ｐａｐＡ遺伝子のシークエンシングを目的として１． ４−ｋｂ ＰｖｕII−ＥｃｏＲＩ断片のＭ１３ｍｐ１８（プラスミドｐＶＲＣ９ ０３から）へのクローニングが記載された（この断片はベクタ−ｐＶＲＣ９００ 中に存在する１．４ｋｂのＰｖｕII−ＸｈｏＩ断片に対応する、第２３図）。 Ｍ１３ｍｐ１８中のこの構築物を、制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩで 消化した。ベクタ−Ｍ１３ｍｐ１８およびｐａｐＡ遺伝子を含有する１．４−ｋ ｂ断片を０．８％のアガロースゲルで分離後、後者の断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎ （バイオ１０１ ラ ジョラ カリフォルニア）により単離、そして精製した。ｐａｐＡ 遺伝子中の断片の位置を第２３図に表す。 制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩを使用した二重消化により直線化した １００ＮｎｇのベクターｐＤＨ５を、実施例３．３に記載されたように２００ｎ ｇの１．４−ｋｂの断片と連結した。所望の断片を持つクローンをＴＧ１株での 形質転換後、単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ５０８と命名した。プ ラスミドｐＶＲＣ５０８は実施例２．１に記載されたように調製した。その制限 マップを第２８図に表す。 ９．３．２． 相同的組み換えによりｐａｐＡ遺伝子が破壊されたＳＰ９２突然 変異体の単離 この実施例ではｐａｐＡ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S .pristinaespiralis）の突然変異体をどのように構築できる かを説明する。この突然変異体は自殺プラスミドｐＶＲＣ５０８によるＳＰ９２ 株の形質転換により単離した。プロトプラストの調製およびその形質転換は、実 施例９．１に記載されているように行った。ＳＰ９２のプロトプラストを形質転 換した後、組み換え体を２．６ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するで３ｍ ｌのＳＮＡ培地を上層させて選択した。１μｇのプラスミドｐＶＲＣ５０８で５ 回実施した５回の形質転換の中で、１０個のチオストレプトン−耐性クローンが 単離された。これは１μｇのＤＮＡあたり約２の組み換え効率である。これらの 組み換え体はＳＰ９２株の染色体が持つｐａｐＡ遺伝子と１．４ｋｂの自殺プラ スミドｐＶＲＣ５０８の断片との間の単一相同的組み換えの結果である。 組み換え体の胞子を４００μｇ／ｍｌのチオストレプトンを補充したＲ２ＹＥ 培地にまいて生育させ、そして再度同一培地にまいて単離コロニーを得ることに より単離した。 プラスミドｐＶＲＣ５０８の統合位置を確認するために、数種の組み換えクロ ーンの全ＤＮＡ（上記のように精製した）の種々のサザンブロットが作成され、 そしてＭaniatisら（１９８９）に記載されたように［α−³²Ｐ］−ｄＣＴＰで ランダムプライミングにより標識した後、連続的にプローブとして使用したベク ターｐＤＨ５および１．４−ｋｂ断片とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼ ーションの結果では制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した（１．４−ｋｂの断片の周辺 を含む部位）の組み換え体クローンのゲノム中から６．８−ｋｂのＥｃｏＲＩバ ンドが消失し、そして対照のＳＰ９２株と比較してにさらに１４−ｋｂ断片とハ イブリダイスする２．４ｋｂのもの、および他のｐＤＨ５および１．４−ｋｂ断 片の両方とハイブリダイズする１０．５ｋｂのものの出現が示され る。制限酵素ＰｓｔＩによる組換えクローンの消化では対照のＳＰ９２株と比較 してにさらに１．４−ｋｂ断片とハイブリダイズする１．０ｋｂ、ならびに他の ｐＤＨ５および１．４−ｋｂ断片の両方とハイブリダイズする５．１ｋｂの出現 が示される。これらの中の１つをＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０８と命名した。 ９．３．３ 突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８によるプリスチナマイシンの 生産 この実施例ではプラスミドｐＶＲＣ５０８の統合によりｐａｐＡ遺伝子が破壊 されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然 変異体が、もはやＰＩを生産しないことをどのように測定するかを説明する。 突然変異体ＳＰ９２： ｐＶＲＣ５０８、同様に対照としてＳＰ９２株を液体 生産培地で培養した。発酵およびプリスチナマイシンＩおよびIIのアッセイは実 施例９．１に記載されたように行った。 結果は、実施した発酵条件下で対照ＳＰ９２株は標準的な量のプリスチナマイ シンＩを生産したが、突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８は微量のＩ型プリス チナマイシンも発酵果膠中に検出されなかった。さらに突然変異体ＳＰ９２：ｐ ＶＲＣ５０８によるプリスチナマイシンIIの生産はＳＰ９２対照と等しかった。 突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８はプリスチナマイシンIIのみを生産するよ うにされた。これらの結果はｐａｐＡ遺伝子がプリスチナマイシンＩの生合成に 関与することを明らかに表している。 突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８中で行われる破壊の有極性が無いことを 確認するために、後者をｐ−ジメチルアミノフェニルアラニン の存在下で発酵させた。突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８は上記のように発 酵させ、さらに１００ｍｇ／ｍｌのｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンを発酵 １７時間後に加えた。このような相補性の条件下で、突然変異体ＳＰ９２：ｐＶ ＲＣ５０８はＳＰ９２株が生産するプリスチナマイシンＩと等量のプリスチナマ イシンＩを生産した。プリスチナマィシンIIの生産は両方の株で等量である。こ れにより突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８のｐ−ジメチルアミノフェニルア ラニンの生合成に参加する遺伝子（ｐａｐＡ遺伝子）がまさに破壊されているの で、プリスチナマイシンを生産しないことが結論できる。この突然変異体のｐ− ジメチルアミノフェニルアラニンの相補性は、プリスチナマイシンＩを生産する 能力を再保有し、この突然変異が他のプリスチナマイシンＩ前駆体、またはこれ らの前駆体の縮合に対して極性効果を持たないことを証明する。 この実施例では生合成に関与するクローン化遺伝子から出発して、プリスチナ マイシン（特にプリスチナマイシンＩ）の生合成段階で突然変異した株が構築で きることを示す。またこの実施例は、この研究法により、特にプリスチナマイシ ンIIを生産するエス．プリスチナエスピラリス（S．pristinaespiralis）株を、 特にプリスチナマイシンＩを生産する株に拡張することにより構築できることを 示す。この研究法はまた、トレプトグラミンを生産する放線菌類の他の株にも使 用することができる。９．４ ｓｎｂＡ遺伝子が破壊されたエス ．プリスチナエスピラリス（S.pristi naespiralis）ＳＰ９２の突然変異体の構築 この実施例ではｓｎｂＡ遺伝子の破壊により、もはやプリスチナマイ シンＩを生産しないエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）Ｓ Ｐ９２株をどのように構築できるかを説明する。この突然変異体はＳｎｂＡタン パク質の機能を確認することを目的として構築された。その構築は実施例９．１ に記載したように自殺プラスミドｐＤＨ５を使用して行われた。 ９．４．１． プラスミドｐＶＲＣ４０４の構築 この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ ９２中では複製せず、そして単一相同的組換えによりｓｎｂＡ遺伝子を破壊する ために使用できるプラスミドをどのように構築できるかを説明する。 プラスミドｐＶＲＣ４０４は実施例６．２に記載されるプラスミドｐＶＲＣ４ ０２から、ｓｎｂＡ遺伝子が破壊されたＳＰ９２染色体突然変異体を作成するよ うに構築された。プラスミドｐＶＲＣ４０２を制限酵素ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄ IIIで消化する。このような断片を０．８％のアガロースゲル電気泳動で分離後 、ｓｎｂＡ遺伝子の内部を含有する１１７０−ｂｐの断片をGeneclean（バイオ １０１、ラ ジョラ カリフォルニア州）で単離そして精製した。ｓｎｂＡ遺伝 子中の断片の位置は第１５図に示す。 ＳｍａＩ消化により直線化された１００ｎｇのベクターｐＤＨ５を実施例３． ３に記載された２００ｎｇの１１７３−ｂｐ断片と連結した。所望の断片を持つ クローンをＴＧ１株の形質転換後に単離した。組換えプラスミドをｐＶＲＣ４０ ４と命名した。プラスミドｐＶＲＣ４０４を実施例２．１に記載されるように調 製した。その制限マップを第２９図に示す。 ９．４．２．相同的組み換えによりｓｎｂＡ遺伝子が破壊されたＳＰ９２突然変 異体の単離 この実施例ではｓｎｂＡ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S .pristinaespiralis）ＳＰの突然変異体をどのように構築できるかを説明する 。 この突然変異体は自殺プラスミドｐＶＲＣ４０４によるＳＰ９２株の形質転換 により単離した。プロトプラストの調製およびその形質転換は、実施例９．１に 記載されているように行った。ＳＰ９２のプロトプラストを形質転換した後、組 み換え体を２．６ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するで３ｍｌのＳＮＡ培 地を上層させて選択した。１μｇのプラスミドｐＶＲＣ４０４で５回実施した５ 回の形質転換の中で、約３０個のチオストレプトン−耐性クローンが単離された 。これは１μｇのＤＮＡあたり約５の組み換え効率である。これらの組み換え体 はＳＰ９２株の染色体が持つｓｎｂＡ遺伝子と１１７０ｂｐの自殺プラスミドｐ ＶＲＣ４０４の断片との間の単一相同的組み換えによる統合の結果である。組み 換え体の胞子を４００ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを補充したＲ２ＹＥ培地に まいて生育させ、そして再度同一培地にまいて単離コロニーを得た。プラスミド ｐＶＲＣ４０４の統合位置を確認するために、数種の組み換えクローンの全ＤＮ Ａ（上記のように精製した）の種々のサザンブロットが作成され、そしてManiat isら（１９８９）に記載されたように［α−³²Ｐ］−ｄＣＴＰでランダムプライ ミングにより標識した後、連続的にプローブとして使用したベクタ−ｐＤＨ５お よび１１７０−ｂｐ断片とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーシヨンの結 果では制限酵素ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した組み換え体クローンの ゲノム中から、対照のＳＰ９２株（ベクターｐＤＨ５＋１．１７ｋｂ）と比較し てにさらにｐＤＨ５および１１７０ｂｐ断片の両方とハイブリダイズする４．７ −ｋｂのＸｈｏＩＨｉｎｄIIIバンドの出現が示される。制限酵素Ｐｆ１ＭＩ（ １１７０−ｂｐのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII断片を含む部位）による組換えクロー ンの消化では、３．１−ｋｂ（１）Ｐｆ１ＭＩ−Ｐｆ１ＭＩバンドが消失し、そ して両方のプローブにハイブリダイズする８．８ｋｂのバンドの出現が示される 。これらの結果は分析したクローンのゲノム構造は、まさにｐＶＲＣ４０４と染 色体ｓｎｂＡ遺伝子間の単一相同的組換え後起こったものと思われる。これらの 中の１つをＳＰ９２：：ｐＶＲＣ４０４と命名した。 ９．４．３ 突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ４０４によるプリスチナマイシンの 生産 この実施例ではプラスミドｐＶＲＣ５０８の統合によりｓｎｂＡ遺伝子が破壊 されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然 変異体が、もはやＰＩを生産しないことをどのように測定するかを説明する。 突然変異体ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ４０４、同様に対照としてＳＰ９２株を液体 生産培地で培養した。発酵およびプリスチナマイシンＩおよびIIのアッセイは実 施例９．１に記載されたように行った。結果は、実施した発酵条件下で対照ＳＰ ９２株は標準的な量のプリスチナマイシンＩを生産したが、突然変異体ＳＰ９２ ：ｐＶＲＣ４０４は微量のＩ型プリスチナマイシンも発酵果膠中に検出されなか った。さらに突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ４０４によるプリスチナマイシンII の生産はＳＰ９２対照と等しかった。突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ４０４はプ リスチナ マイシンIIのみを生産するようにされた。これらの結果は、実施例５．２の精製 中に示されたようにｓｎｂＡ遺伝子がプリスチナマイシンＩの生合成に関与する タンパク質ＳｎｂＡをコードすることを明らかに表している。 この実施例では前記条件と同様に生合成に関与するクローン化遺伝子から出発 して、プリスチナマイシン（特にプリスチナマイシンＩ）の生合成段階で突然変 異した株が構築できることを示す。またこの実施例は以下の実施例９．５に記載 するように、この研究法により、特にプリスチナマイシンII生産するエス．プリ スチナエスピラリス （S.pristinaespiralis）株を、プリスチナマイシンＩを特 に生産する株に拡張することにより構築できることを示す。同様な研究法もまた 、ストレプトグラミンを生産する放線菌類の他の株にも使用することができる。９．５ おそらくプリスチナマイシンIIの生合成に関与するペプチドシンターゼ をコードするｓｎｓＤ遺伝子が破壊されたエス ．プリスチナエスピラリス（S.pr istinaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体の構築 この実施例ではおそらくプリスチナマイシンIIの生合成に関与するペプチドシ ンターゼをコードするｓｎｂＡ遺伝子の破壊により、もはやプリスチナマイシン IIを生産しないエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９ ２株をどのように構築できるかを説明する。この突然変異体はｓｎａＤ遺伝子の 機能を確認し、そしてプリスチナマイシンＩのみを生産するようにされたＳＰ９ ２株由来の株を得ることを目的として構築された。 その構築は実施例６．８に記載したように、E.coli中でのみ複製でき、そして ストレプトミセス（Streptomyces）中で発現する耐性マーカーを 持つ自殺プラスミドｐＤＨ５由来のプラスミドＰＶＲＣ１０００を使用して行わ れた（実施例９．１を参照のこと）。 ９．５．１． プラスミドｐＶＲＣ１０００の構築 この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ ９２中では複製せず、そして単一相同的組換えによりｓｎａＤ遺伝子を破壊する ために使用できるプラスミドをどのように構築できるかを説明する。ｓｎａＤ遺 伝子の一部を持つプラスミドｐＶＲＣ１０００構造は実施例６．８に記載される 。 ９．５．２．相同的組み換えによりｓｎａＤ遺伝子が破壊されたＳＰ９２突然変 異体の単離 この実施例ではｓｎａＤ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S .pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体をどのように構築されたかを説明 する。この突然変異体はＳＰ９２を自殺プラスミドｐＶＲＣ１０００で形質転換 株して単離した。プロトプラストの調製およびその形質転換は、実施例９．１に 記載されているように行った。１ｍｇのｐＶＲＣ１０００で行った５回の形質転 換の中で約１５００個のチオストレプトン−耐性クローンを単離した。これは１ μｇのＤＮＡあたり約３７５の組み換え効率である。これらの組み換え体はＳＰ ９２株の染色体が持つｓｎａＤ遺伝子と自殺プラスミドｐＶＲＣ１０００の１． ５ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片との間の単一相同的組み換えの結果である 。約２０個の組換え体が４００μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するＲ２Ｙ Ｅ培地上でサブクローン化され、そしてこれら組換え体の胞子を再度４００μｇ ／ｍｌのチオストレプトンを補充したＲ２ＹＥ培地にまいて生育させることによ り単離した。 プラスミドｐＶＲＣ１０００の統合位置を確認するために、上記のように精製 した７種の組み換えクローンの全ＤＮＡの種々のサザンブロットが作成され、そ して実施例９．１に記載されたように［α−³²Ｐ］−ｄＣＴＰで標識した後、連 続的にプローブとして使用したベクターｐＤＨ５および１．５ｋｂの断片とハイ ブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの結果では７個の組換えクローンで 、これら２つのプローブハイブリダイズする１３．８−ｋｂのＥｃｏＲＩバンド および約１７−ｋｂのＢａｌIIバンド、ならびに１．２ｋｂのＢａｍＨ−Ｓｓｔ Ｉプローブとハイブリダイズする３．７ｋｂのＥｃｏＲＩバンドの出現を示す。 これらの中の１つをＳＰ９２：：ｐＶＲＣ１０００と命名し、これは単一相同的 組換えによりｓｎａＤ遺伝子中にプラスミドｐＶＲＣ１０００が統合されている ことによく対応する。 ９．５．３ 突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ１０００によるプリスチナマイシン の生産 この実施例ではプラスミドｐＶＲＣ１０００の統合によりｓｎａＤ遺伝子が破 壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突 然変異体が、もはやプリスチナマイシンIIを生産しないがプリスチナマイシンＩ のみを生産することをどのように測定するかを説明する。突然変異体ＳＰ９２： ：ｐＶＲＣ１０００、同様に対照としてＳＰ９２株を液体生産培地で培養し、そ してプリスチナマイシンIIおよびＩの生産を実施例９．１に記載したようにアッ セイした。 結果は、実施した発酵条件下で、そして試験したすべての場合で、突然変異体 ＳＰ９２：ｐＶＲＣ１０００は０ｍｇ／ｍｌのプリスチナマイシンIIを生産し、 そしてプリスチナマイシンＩの生産量はＳＰ９２対照 と等しかった。したがって突然変異体はプリスチナマイシンIIの生合成段階でま さにブロックされ、これはｓｎａＤ遺伝子がプリスチナマイシンIIの生合成に関 与する酵素をコードし、そしてそれはまさしくペプチドシンターゼであろうこと を示す。 これらの結果は、前記実施例のように生合成に関与するクローン化遺伝子から 出発して、プリスチナマイシン（特にプリスチナマイシンII）の生合成段階で突 然変異した株が構築できることを示す。またこの実施例はこの研究法により、特 にプリスチナマイシンＩを生産するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristina espiralis ）株を、特にプリスチナマイシンIIを生産する株に拡張することによ り構築できることを示す。同様な研究法もまた、ストレプトグラミンを生産する 放線菌類の他の株にも使用することができる。実施例１０：ＳＰ９２の非生産突然変異株の相補性 この実施例ではプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子をどのように発現 できるかを説明する。この発現はより特別にはＳＰ９２：：ＳＰ１２０から派生 した突然変異体中のコスミドｐＩＢＶ１により保持されるｓｎａＡおよびｓｎａ Ｂ 遺伝子に関して実施された。この突然変異体はプリスチナマイシンIIＡの生産 しない。これはプリスチナマイシンII：プリスチナマイシンΠＢの生合成経路の 最終中間体を蓄積する。１０．１ ｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子のシャトルベクターｐＩＪ９０３中へ のクローニング この実施例ではｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子を含有するコスミドｐＩＶＢ１ の副断片が、どのようにイー．コリー（E.coli）およびストレプトミセス（Stre ptomyces ）の両方で複製できるベクター中にクローン 化できるかを説明する。 ベクターｐＩＪ９０３（Lydiate D.J．ら、１９８５）はコピー数が低い（細 胞あたり１−３個）シャトルベクターであり、これはｐＢＲ３２２の複製起源の 結果としてイー．コリーE.coli中で、そしてＳＣＰ２⁺の複製起源の結果としてストレプトミセス （streptomyces）中で、それらの両方の中で複製でる。アンピ シリン耐性遺伝子によりE. coli中での選択が可能であり、そしてチオストレプ トン耐性遺伝子によりストレプトミセス（streptomyces）中での選択が可能であ る。 コスミドｐＩＢＶを制限酵素ＳＳｔＩで消化した。ｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺 伝子を含有する大きな７．６ｋｂのＤＮＡ断片を０．８％のアガロースゲル電気 泳動および電気溶出により単離した。５００ｎｇの断片を、ＳｓｔＩで直線化し た１００ｎｇのベクターｐＵＣ１８１３（kayおよびMcPherson、１９８７）と連 結した。 E.Coli ＤＨ５α株（supE44 Δ1acU169(f801acZΔM15）hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 re1A1）での形質転換、および形質転換体を固体ＬＢ培地（１５ ０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含有する）で 選択した後、７．６−ｋｂ断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミ ドをｐＶＲＣ５０６と命名した。この組換えプラスミドの調製は実施例２．１に 記載されているように行った。 ベクターｐＩＪ９０３へのクローニングはＨｉｎｄIII部位で行われた。プラ スミドｐＶＲＣ５０６をＨｉｎｄIIIで切断し、そしてｓｎａＡおよびｓｎａＢ 遺伝子を含有する７．６ｋｂの断片を０．８％のアガロースゲル電気泳動および 電気溶出により単離した。５００ｎｇの断片を、ＨｉｎｄIIIで直線化した５０ ０ｎｇのベクターｐＩＪ９０３と連結した。E .Coli ＤＨ５α株での形質転換、および形質転換体を固体ＬＢ培地（１５０μ ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する）で選択した後、７．６−ｋｂ断片を持つク ローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ５０７と命名した。この組 換えプラスミドの調製は実施例２．１に記載されているように行った。そのマッ プを第３０図に示す。１０．２ ｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子の突然変異体ＳＰ１２０中での発現 この実施例では対応する構造遺伝子を持つプラスミドをエス．プリスチナエス ピラリス （S.pristinaespilalis）中に導入することにより、どのようにしてそ の株の中でタンパク質ＳｎａＡおよびＳｎａＢを生産できるかを説明する。ｓｎ ａＡ およびｓｎａＢ遺伝子の発現は突然変異体ＳＰ１２０株を５００ｎｇのプラ スミドｐＶＲＣ５０７で形質転換させた後行った。ＳＰ１２０のプロトプラスト の形質転換およびチオストレプトンでの形質転換体の選択は実施例９．２．１に 記載されているように行った。 多くの形質転換体をこのようにして得、そしてその中の３個を液体培地での生 産のため選択した。プラスミドｐＩＪ９０３を持つＳＰ１２０株を対照として選 択した。発酵および生合成産物の抽出は、実施例９．１．３に記載されているよ うに行った。 結果は実施した発酵条件下で、対照（プラスミドｐＩＪ９０３を持つＳＰ１２ ０）が１００％のＰIIＢおよび０％のＰIIＡを、２４、２８および３２時間の発 酵で生産するのに対して、プラスミドｐＶＲＣ５０７で形質転換したＳＰ１２０ 株の３つのクローンは同じ時間で約８５−８０％のプリスチナマイシンIIＢ、そ して１５−２０％の時プリスチナマ イシンIIＡを生産し、その総和は対照株（プラスミドｐＩＪ９０３を持つＳＰ１ ２０）のプリスチナマイシンIIＢの生産量に等しい。ｐＶＲＣ５０７を持つクロ ーンはまさにプリスチナマイシンIIの生合成段階が部分的に相補され、これは中 間体プリスチナマイシンIIＢのＤ−プロリンの２，３−結合の酸化に対応する。 これはプリスチナマイシンIIＡシンターゼ活性の酵素活性により実施例５．１． １．Ａに記載されるように、ｐＶＲＣ５０７を持つＳＰ１２０、およびｐＩＪ９ ０３を持つＳＰ１２０株について確認された。一方ｐＩＪ９０３を持つ対照株Ｓ Ｐ１２０は、プリスチナマイシンIIＡシンターゼ活性を表さず、ｐＶＲＣ５０７ を持つＳＰ１２０株がＰIIＡシンターゼ活性を表す。 この実施例ではストレプトグラミンの生合成に関する遺伝子を発現することが できることを示す。発現はよりより詳細にプリスチナマイシンIIシンターゼをコ ードする遺伝子に関して調査されたが、他のプリスチナマイシンIIおよびプリス チナマイシンＩの生合成に関する遺伝子、ならびに種々のストレプトグラミンの 成分の生合成に関与する遺伝子もこのように発現できる。この発現は実施例１０ の場合のように、突然変異株で行ってもよいが、ストレプトグラミンの生産量レ ベルを上昇させるために生産株中で行ってもよい。発現は種々のコピー数（低い または高い）を持つベクター中、または統合的ベクター中に遺伝子をクローニン グすることにより、あるいはこれらの遺伝子のデレギュレーション（deregulati on）により、あるいはこれらの遺伝子を相同的なまたは異種のプロモーター（強 い、または特別に制御されたプロモーター）の制御下でクローニングすることに よりモデファイすることができる。ストレプトグラミンの生合成に関する種々の 遺伝子の発現は、ハイブリッド抗 生物質を生成するために適当な発現ベクターを使用して異種株中で行ってもよい 。 実施例１１：E.coli中でのエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilali s ）のｐａｐＭ遺伝子の発現 この実施例は、エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）遺伝 子にコードされるタンパク質を同定し、精製し、そして調査するために、どのよ うにしてこの遺伝子をE.coli中で発現できるかを説明する。１１．１ プラスミドｐＶＲＣ７０６の構築 E.coli中でのｐａｐＭ遺伝子の発現は、この遺伝子をE.coliのｌａｃＺ遺伝子 のプロモーターの下流およびリボゾーム結合部位に配置することにより得る。 実施例７．８に記載したように、１．７−ｋｂのＭｌｕＩ−ｓｔｕＩ断片をプ ラスミドｐＶＲＣ４０９から単離し、そしてＢａｍＨＩで切断され、そして続い てクレノー酵素（Maniatisら、１９８９）で満たされたプラスミドｐＭＴ１２３ （Chambersら、１９８８）中にＭｌｕＩ部位でクローン化し、第３１図に示すプ ラスミドｐＶＲＣ７０６を得た。ＭｌｕＩ部位でのクローニングは、プラスミド ｐＭＴＬ２３のｌａｃＺ遺伝子にコードされるβ−ガラクトシダーゼの最初の３ ２アミノ酸とｐａｐＭのすぐ上流の遺伝子の最後の１１アミノ酸の間のフレイム 内融合（in-frame fusion）を可能にする。これによりｐａｐＭ遺伝子とこの上 流遺伝子の間（実施例７．８に示されるヌクレオチド配列の下）に存在すること を表す翻訳結合（translatjon coupling）が保存される。したがってｌａｃＺとｐａｐＭ の上流の遺伝子との間のハイブリッド遺伝子 の発現、ならびにｐａｐＭ遺伝子の発現が、ｌａｃＺ遺伝子の発現シグナルの制 御下にある。１１．２ E.coli ＤＨ５ａ株中でのｐａｐＭ遺伝子生産物の発現 プラスミドｐＶＲＣ７０６およびｐＭＴＬ２３は形質転換によりE.coli ＤＨ ５ａ株中に導入され、そしてそれらの遺伝子の発現がｌａｃＺ遺伝子のプロモー ターがすでに記載されたように（Maniatisら、１９８９）誘導される条件下で調 査された。プラスミドｐＶＲＣ７０６または他の対照プラスミドｐＭＴＬ２３を 持つE.coli株は５００ｍｌのＬＢ富栄養培地（１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン および１ｍＭ ＩＰＴＧを含む）中で培養され、ｌａｃＺ遺伝子のプロモーター の誘導を可能にした。これらのカルチャーを６００ｎｍの光学密度が１の領域に 達した時、試料として採取し、そしてタンパク質抽出物を以下に記載するように 調製した。１１．３ E.coli中で発現したｐａｍＭ遺伝子産物の活性アッセイ ｐａｐＭ遺伝子によりコードされるタンパク質に対応する活性を、プラスミド ｐＶＲＣ７０６またはプラスミドｐＭＴＬ２３を持つE.coliカルチャーから調製 された２つの抽出物についてアッセイする実施例５．７）。E.coli：：ｐＶＲＣ ７０６株からの抽出調製物は、ｐ−アミノフェニルアラニンのｐ−ジメチルアミ ノフェニルアラニンへのメチル化を触媒し、その活性は２３５単位／ｍｇであり 、一方対照E.coli：：ｐＭＴＬ２３株の抽出物中の活性は無い（実施例５．７． １．Ｃを参照のこと）。これらの結果はE.coli中でのエス．プリスチナエスピラ リス （S.pristinaespilalis）のｐａｐＭ遺伝子の発現が可能であることを指示 し、そして対応するタンパク質はまさに、ｐ−アミノフェニルアラニンをｐ− ジメチルアミノフェニルアラニンへのメチル化を触媒するタンパク質であること が指示される。この実施例は抗生物質の前駆体あるいはさらに天然またはハイブ リッド抗生物質を生産するために、異質株（例えばE.coliのような、しかし他の 微生物中でも）中で、適当な発現ベクターを使用してストレプトグラミンの生合 成に関する遺伝子を発現させることができることを示す。 実施例１２：種々のストレプトミセス（Streptomyces）中のストレプトグラミン の生合成に関与する遺伝子の相同性の実証 この実施例では全ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより、ストレプトグラミ ンを生産する種々のストレプトミセス（Streptomyces）株について、ストレプト グラミンの生合成に関与する種々の遺伝子間に存在する相同性を、どのように実 証することが可能であるかを説明する。１２．１ ストレプトグラミンを生産する種々のストレプトミセス（Streptomyc es）の全ＤＮＡの抽出 この実施例ではストレプトグラミンを生産する種々の株のＤＮＡがどのように 精製できるかを説明する。これらのストレプトミセス（Streptomyces）株は表１ に記載された中から選択された：ストレプトミセス ロイデンシス（Streptomyces loidensis）ストレプトミセス オリバセウス（Streptomyces olivaceus）ストレプトミセス オステログリセウス（Streptomyces osteogriseus）ストレプトミセス バージニエ（Streptomyces vjrginiae） ストレプトグラミンを生産しない株：ストレプトミセス ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）を陰性 対照として選択した。 ＹＥＭＥ培地中のカルチャーから種々の全ＤＮＡの抽出を、実施例１に記載さ れるように行った。１２．２ ストレプトグラミン生産株の全ＤＮＡと、プリスチナマイシンの生合 成に関与し、エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）ＳＰ９２ 株から単離された遺伝子のＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーション この実施例は前記実施例に記載されたプリスチナマイシンの生合成に関与し、 ＳＰ９２株から単離された遺伝子から出発して、ストレプトグラミン生産株の全 ＤＮＡのハイブリダイゼーションによりどのように相同的遺伝子が実証できるか を説明する。 プローブとして使用したＤＮＡ断片は： 実施例６．５に記載されたｐＶＲＣ１１０６から単離された３．９−ｋｂのＸ ｈｏ Ｉ−ＸｈｏＩ断片、その制限マップは第１８図に示される。この断片はプリ スチナマイシンＩシンターゼIIをコードする遺伝子の一部を含む。 実施例６．３に記載されたプラスミドｐＸＬ２０４５から単離された６−ｋｂ のＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片、その制限マップは第１６図に示される。この断 片はＰIIＡシンターゼの２つのサブユニットに関する構造遺伝子を含む。 ４種のストレプトグラミン生産株の全ＤＮＡ、エス．ハイグロスコピカス（S.hygroscopicus ）株そしてまたＳＰ９２株を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏ Ｉで消化した。このようにして得られたＤＮＡ断片を０．７％アガロースゲルで 分離し、そしてManiatisら（１９８９）により記載されるようにＤＮＡをナイロ ン膜に移した。３．６ｋｂのＸｈｏ Ｉ−ＸｈｏＩ断片および６−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片の標識化を、実 施例９．２．１に記載したようにランダムプライミングによる標識化により行っ た。膜のハイブリダイゼーションをホルムアミドの存在下で４２℃でManiatisら （１９８９）に記載されたように行った。ハイブリダイゼーション後の膜の洗浄 を５０および６０℃で、１０倍に希釈ＳＳＣしおよび０．１％ＳＤＳ（Manlatis ら、１９８９）を含有する溶液中で行った。 以下の結果がこれらのハイブリダイゼーションで実証された： エス．ハイグロスコピカス（S.hygroscopicus）株は使用した２つのプローブ とのハイブリダイゼーションを示さなかった。 エス．オステオグリセウス（S.osteogriseus）、エス．オリバセウス（S.oliv aceus ）、エス．ロイデンシス（S.loidensis）およびエス．バージニエ（S.virg iniae ）の全ＤＮＡ（ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した）はすべてＳＰ９２ 株の全ＤＮＡについて観察されたものに匹敵するハイブリダイゼーションシグナ ルの強さを使用した両方のプローブについて表す。 エス．バージニエ（S.virginiae）の全ＤＮＡ（ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで 消化した）は使用した両方のプローブとシグナルを示すが、しかしその強さはＳ Ｐ９２で観察されたものよりも弱い。 この実施例は前記実施例のように、ストレプトグラミンを生産する種々のスト レプトミセス （Streptomyces）がエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaes pilalis ）ＳＰ９２株中から単離された遺伝子であり、そしてプリスチナマイシ ンの生合成に関与する遺伝子とハイブリダイズすることを示す。これらのハイブ リダイゼーションはしたがってＳＰ９ ２株のストレプトグラミンの生合成に関与する遺伝子と、ストレプトグラミンの 生合成に関与する遺伝子または他のストレプトグラミン生産株との間に相同性が 存在することを実証する。 したがってこの実施例はＳＰ９２から単離され、そしてストレプトグラミンの 生合成に関与する遺伝子から出発して、ハイブリダイゼーションおよびクローニ ングにより、他のストレプトグラミン生産株に存在する相同的遺伝子を単離する ことができることを示す。実施例１３：プリスチナマイシンＩおよびプリスチナマィシンIIの生合成に関与 する種々のエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）ＳＰ９２遺 伝子の物理的結合の調査 この実施例ではプリスチナマイシンＩおよびIIの生合成に関与する種々のエス ．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespjlalis）ＳＰ９２遺伝子の物理的結 合がどのように調査できるかを説明する。この実施例ではすべてのこれらの遺伝 子が染色体上にクラスター状態で一緒に群を成していることを示し、したがって すでに同定された遺伝子から染色体ウォーキングによりプリスチナマイシンＩお よびIIの生合成に関与する他の遺伝子をできることを示すことを目的として行わ れた。このような研究法はストレプトグラミンの生合成に関与する遺伝子に関し ても考えられる。１３．１ パスルフィールド電気泳動のために使用する制限酵素 エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）ＳＰ９２ゲノムはＧ およびＣに７０％−７５％かたよっているヌクレオチド配列から成る。このゲノ ムを少数の巨大な断片に切断するために、ＡＴが豊富な配列を認識するＡｓｅＩ （ＡＴ／ＴＡＡＴ）およびＳｓｐＩ（ＡＡＴ ／ＡＴＴ）のような、しかしＨｉｎｄIII（Ａ／ＡＧＣＴＴ）、ＥｃｏＲＩ（Ｇ ／ＡＡＴＴＣ、ＮｄｅＩ（ＣＡ／ＴＡＴＧ）およびＣｌａＩ（ＡＴ／ＣＧＡＴ） を使用した。１３．２．パスルフィールド電気泳動に使用するプリスチナエスピラリス株 プリスチナマイシンＩおよびプリスチナマイシンIIの生合成に関与する遺伝子 の物理的結合をパスルフィールド電気泳動により研究するために、数種の株の染 色体ＤＮＡを使用した。実施例４．１に記載するように、エス．プリスチナエス ピラリス （S.pristinaespilalis）ＳＰ９２株の染色体ＤＮＡ、および実施例９ ．１および９．４に構造が記載されるＳＰ９２株から派生した株の染色体ＤＮＡ の試料挿入物を調製した。これらはｓｎａＡ遺伝子がプラスミドｐＶＲＣ５０５ の統合により破壊されたＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０５株（実施例９．１）およびｓｎｂＡ 遺伝子がプラスミドｐＶＲＣ４０４の統合により破壊されたＳＰ９２： ：ｐＶＲＣ４０４株（実施例９．４）である。後者の２つの株は、染色体ＤＮＡ をめったに切断しないプラスミドｐＶＲＣ５０５およびｐＶＲＣ４０４中のＡｓ ｅ Ｉ、ＳｓｐＩ、ＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩおよびＣｌａＩ部位の存 在を利用することにより正確に染色体上にｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子を位置 ずけることができるので、この調査に加えられた。１３．３パスルフィールド電気泳動で単離された断片のハイブリダイゼーション に使用するＤＮＡプローブ 実施例９．１に記載したように、放射標識プローブを得るために、種々のＤＮ Ａ断片を使用し、これを上記３種の染色体ＤＮＡ試料挿入物を 酵素的開裂し、そしてパスルフィールド電気泳動で分離した後の断片とハイブリ ダイズさせた。プローブは次のとおり：ｓｎａＢおよびｓａｍＳ遺伝子を持つプ ラスミドｐＶＲＣ７０１から単離した３．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片 （実施例９．２参照）、ｓｎａＤ遺伝子の一部を持つプラスミドｐＶＲＣ１００ ０から単離した１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片（実施例６．８参照）、ｓｎｂＡ 遺伝子を持つプラスミドｐＶＲＣ４０２から単離した１．１ｋｂのＸｈ ｏ Ｉ−ＨｉｎｄIII断片（実施例６．１参照）、ｐａｐＡ遺伝子を持つプラスミ ドｐＶＲＣ９００から単離した２．４ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片（実施例６ ．７参照）、およびｓｎａＣ遺伝子を持つプラスミドｐＶＲＣ５０９から単離し た１．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片（実施例６．９参照）。１３．４プリスチナマイシンＩおよびIIの生合成に関与する種々の遺伝子の染色 体上の位置、およびそれらの物理的結合の調査 上述の６つの酵素を使用する単一消化、または二重消化で切断したエス．プリ スチナエスピラリス （S.pristinaespilalis）ＳＰ９２株、ＳＰ９２：：ｐＶＲ Ｃ４０４およびＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０５の染色体ＤＮＡの、上記の様々なプ ローブとのハイブリダイゼーションにより第３２図に示す一般的マップが導かれ る：プリスチナマイシンＰＩおよびＰIIの生合成に関与する遺伝子の翻訳位置お よび方向とともに主要部位の位置を指示した。したがって同定された遺伝子を含 有する３つの染色体領域（すなわちｓｎｂＡ、ｓｎｂＲ、ｐａｐＡおよびｐａｐ Ｍ 遺伝子（コスミドｐＩＢＶ２、実施例５．２））、（ｓｎａＡ、ｓｎａＢ、ｓ ａｍＳ 、ｓｎａＤ、ｓｎｂＣ、ｓｎｂＤおよびｓｎｂＥ遺伝子（コスミドｐＩＢ Ｖ１および３、実施例５．１）、（そして最後にｓｎａＣ遺伝 子（コスミドｐＩＢＶ４、実施例５．６））を分割する距離を計算できる。例え ばｓｎａＡおよびｓｎｂＡ遺伝子間の距離は、約１６０−１７０ｋｂである。こ れはすでに同定された遺伝子はすべてエス．プリスチナエスピラリス（S.pristi naespilalis ）株の２００ｋｂのみに含まれることを示し、これは全ゲノム長の ３％より少ないものに等しく、パルスフィールド電気泳動法で７５００ｋｂと推 定できた。 これらの結果はプリスチナマイシンＩおよびIIの生合成に関与する遺伝子が染 色体上にクラスクー状態で一緒に群を成すことを示し、したがってすでに同定さ れた遺伝子の染色体ウォーキングにより、プリスチナマイシンＩおよびプリスチ ナマイシンIIの生合成に関与する他の遺伝子を単離できることを示す。さらに一 般的に、任意のストレプトグラミンの生合成に関与する遺伝子から染色体ウォー キングによりこの生合成に関与する他の遺伝子を同定することも可能である。 使用した略号： ＤＮＡ： デオキシリボ核酸 ＡＭＰ： アデノシン5'-1リン酸 ＡＴＰ： アデノシン5'-3リン酸 ＥＴＢ： エチジウムブロシド bis-tris： (ビス[2-ヒドロキシルエチル]イミノトリス[ヒドロキシルメチル ]-メタン) bis-trisプロパン：(1,3-ビス[トリス(ヒドロキシメチル)-メチルアミノ]プロパ ン) ＢＳＡ： ウシ血清アルブミン ＨＰＬＣ 高性能液体クロマトグラフイー ＯＤ： 光学密度 ＤＴＥ： ジチオエリスリトール ＤＴＴ： ジチオスレイトール Ｅ６４： トランス-エポキシスクシンル-L-ロイシルアミノ-(4-グアニジノ )ブタン ＥＤＴＡ： エチレンジアミン四酢酸 ＥＧＴＡ： エチレングリコールビス(β-アミノエチル)四酢酸 ＦＭＮ： フラビン モノヌクレオチド ＦＭＮＨ₂： 還元型フラビンモノヌクレオチド Ｈepes： (Ｎ-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸] ) ＩＰＴＧ： イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド ｋＤａ： キロダルトン kb： キロベース ＬＢ： ルリア ブロス(E. coli用の富栄養培地) ＮＡＤ： ニコチンアミド ジヌクレオチド ＮＡＤＨ： 還元型ニコチンアミド ジヌクレオチド ＰＡＧＥ： ポリアクリルアミド ゲル 電気泳動 bp： 塩基対 ＰＭＳＦ： フエニルメチルスルホニル フルオリド ＰＰｉ： ピロリン酸塩 rpm： 毎秒回転数 Ａ．Ｓ．： 硫酸アンモニウム ＳＡＭ： Ｓ−アデノシルメチオニン ＳＤＳ： ドデシル硫酸ナトリウム ＳＴＩ： 大豆トリプシン インヒビター ＴＥ： 10mM Tris-Hcl，１mM EDTAを含む緩衝液，pH7.5 Ｔris： 2-アミノ-2-ヒドロキシルメチル-1,3-プロパンジオール ＵＶ： 紫外線 Ｘgal： 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル b-D-ガラクトシド ＹＥＭＥ： 酵母抽出物-麦芽抽出物培地(ストレプトミセス(Streptomyces)の富栄養成 長培地) ＰＥＧ： ポリエチレン グリコール ＬＭＰ 低融点 ＭＷ 分子量 引用文献 配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人 （Ａ）氏名：ローヌ−プーラン ローラー エス．エー． （Ｂ）通り：レイモンド アロン アベニュー２０ （Ｃ）市：アントニー （Ｅ）国：仏国 （Ｆ）郵便番号：９２１６５ （ii）発明の名称：ストレプトグラミンの生合成に関するポリペプチド、これ らポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその使用 （iii）配列の数：１６ （iv）コンピューター読み取り先： （Ａ）媒体：テープ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ （Ｃ）実行システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース＃１．０、バージョン＃１． ２５（ＥＰＯ） （２）配列番号１に関する情報 （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：５３９２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ii）分子型：ｃＤＮＡ （iii）仮定：無し （iii）アンチセンス：無し （iv）起源 （Ａ）微生物：ストレプトミセス プリスチナエスピラリス （xi）配列の記載：配列番号１ （２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：１２６９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ii）分子型：ｃＤＮＡ （iii）仮定：無し （iii）アンチセンス：無し （iv）起源 （Ａ）微生物：ストレプトミセス プリスチナエスピラリス （ix）特徴 （Ａ）名前／キー：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１．．１２６９ （xi）配列の記載：配列番号２ （２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ ８３４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ii）分子型：ｃＤＮＡ （iii）仮定：無し （iii）アンチセンス：無し （iv）起源 （Ａ）微生物：ストレプトミセス プリスチナエスピラリス （ix）特徴 （Ａ）名前／キー ＣＤＳ （Ｂ）位置：１．．８３４ （xi）配列の記載：配列番号３ （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：１２０９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 クルーゼ，ジヨエル フランス国エフ―75012パリ・リユデムー ニエ48―52 (72)発明者 ジヤツク，ナタリー フランス国エフ―75015パリ・リユプリユ メ16 (72)発明者 ラクロワ，パトリシア フランス国エフ―94360ブリ―シユール― マルヌ・アベニユードウリグニ54 (72)発明者 テイボー，デニ フランス国エフ―75013パリ・リユジヤン ―コリー28 (72)発明者 ザゴレク，モニク フランス国エフ―75002パリ・リユデユマ イユ19

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ストレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチドをコードするヌクレオ チド配列。 ２．（ａ）ｓｎａＡ（配列番号２）、ｓｎａＢ（配列番号３）、ｓｎａＣ（配列 番号７）、ｓｎａＤ（配列番号８）、ｐａｐＡ（配列番号９）、ｐａｐＭ（配列 番号１０）、ｓａｍＳ（配列番号４）、ｓｎｂＡ（配列番号５）、ｓｎｂＣ（配 列番号１１および１２）、ｓｎｂＤ（配列番号１３および１４）、ｓｎｂＥ（配 列番号１５および１６）およびｓｎｂＲ（配列番号６）遺伝子の全部または一部 、 （ｂ）生合成クラスターを構成し、かつストレプトグラミンの生合成に関与する ポリペプチドをコードする遺伝子（１つまたは複数）に隣接する配列、 （ｃ）遺伝子（ａ）または（ｂ）の全部または一部とハイブリダイスし、かつス トレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチドをコードする配列、ならびに （ｄ）遺伝的コードの縮退により配列（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から誘導され る配列、 から選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載のヌクレオチド配列。 ３．ｓｎａＡ、ｓｎａＢ、ｓｎａＣ、ｓｎａＤ、ｐａｐＡ、ｐａｐＭ、ｓａｍＳ 、ｓｎｂＡ、ｓｎｂＣ、ｓｎｂＤ、ｓｎｂＥおよびｓｎｂＲから選択されること を特徴とする請求の範囲第２項記載のヌクレオチド配列。 ４．ストレプトグラミンの生合成の遺伝子を含んで成る組換えＤＮＡ。 ５．第４−７図に示されるコスミドｐＩＢＶ１、ｐＩＢＶ２、ｐＩＢＶ３または ｐＩＢＶ４の全部または部分、あるいはコスミドｐＩＢＶ１−ｐＩＢＶ２とハイ ブリダイズする配列の全部または一部、あるいは後者の断片とハイブリダイズす る配列の全部または一部を含んで成ることを特徴とする請求の範囲第４記載の組 換えＤＮＡ。 ６．請求の範囲１ないし３項のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列、あるい は請求の範囲４および５項のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡを含んで成るこ とを特徴とする自律的に複製できる、かつ／または統合可能な発現ベクター。 ７．コスミドｐＩＢＶ１（第４図）、ｐＩＢＶ２（第５図）、ｐＩＢＶ３（第６ 図）、ｐＩＢＶ４（第７図）、プラスミドｐＶＲＣ４０２（第１５（Ａ）図）、 ｐＶＲＣ５０１（第８（Ｂ）図）、ｐＸＬ２０４５（第９図）、ならびにそれぞ れ第１７−３１図に示されるプラスミドｐＶＲＣ１１０５、ｐＶＲＣ１１０６、 ｐＶＲＣ１１０４、ｐＶＲＣ９００、ｐＶＲＣ１０００、ｐＶＲＣ５０９、ｐＶ ＲＣ９０３、ｐＶＲＣ４０９、ｐＶＲＣ５０５、ｐＶＲＣ７０１、ｐＶＲＣ７０ ２、ｐＶＲＣ５０８、ｐＶＲＣ４０４、ｐＶＲＣ５０７およびｐＶＲＣ７０６か ら選択されることを特徴とする請求の範囲第６項記載のベクター。 ８．請求の範囲１ないし７項のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列、かつ／ または組換えＤＮＡかつ／または発現ベクターを含有する組換え細胞。 ９．請求の範囲第８項記載の組換え細胞を培養し、そして生産されたポリペプチ ドが回収されることを特徴とする、ストレプトグラミンの生合成に関与するポリ ペプチドの生産法。 １０．少なくとも１つのストレプトグラミンの生合成に生物変換反応で関与する ポリペプチドを発現する、請求の範囲第８項記載の組換え細胞の使用。 １１．ストレプトグラミン生産を増幅させるための請求の範囲第１ないし５項の いずれか１項に記載のヌクレオチド配列の使用。 １２．−請求の範囲１ないし７項のいずれか１項記載の１つ以上の配列および／ またはベクターを、ストレプトグラミンまたはストレプトグラミンの可能な前駆 体を生産する細胞に導入し、かつ／または該細胞中で増幅させ、 −該細胞をストレプトグラミン生産条件下で培養し、そして −生産されたストレプトグラミンを回収することを特徴とするストレプトグラミ ンの生産法。 １３．プリスチナマイシン、ミカマイシンまたはバージニアマイシンの生産であ る請求の範囲第１２項記載の方法。 １４．ストレプトグラミンを生産する細胞について、少なくとも１つの生合成経 路の遺伝子の突然変異がなされていることを特徴とする、ストレプトグラミンの 生合成段階でブロックされた細胞を調製する方法。 １５．突然変異がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｓｉｔｕで、少なくとも１つの 問題の遺伝子中の塩基のサプレッション、置換、削除かつ／または付加あるいは 遺伝子破壊により行われることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。 １６．少なくとも１つの遺伝的修飾を、ストレプトグラミンの生合成に関与する 遺伝子に保有することを特徴とする、ストレプトグラミンを生産する微生物の突 然変異体。 １７．−ストレプトグラミンの生合成経路の段階でブロックされた細胞を請求の 範囲第１４項記載のように調製し、 −該細胞を培養し、そして −蓄積された中間体を回収する、 ことを特徴とするストレプトグラミンの生合成の中間体の生産方法。 １８．−ストレプトグラミンの生合成経路の段階でブロックされた細胞を請求の 範囲第１４項記載のように調製し、 −該細胞を培養し、そして −細胞により蓄積された中間体を培養培地から分離した後に適当なところで修飾 する、 ことを特徴とするストレプトグラミンから誘導される分子の製造方法。 １９．請求の範囲第１６項に記載の細胞に請求の範囲第１ないし７項のいずれか １項記載のヌクレオチド配列および／または組換えＤＮＡおよび／または発現ベ クターをさらに加えて、培養することを含んで成る、ストレプトグラミンの生産 法。 ２０．ハイブリッド抗生物質を生成するための請求の範囲第１ないし７項のいず れか１項記載の配列および／またはベクターの使用。 ２１．請求の範囲第１ないし５項のいずれか１項記載の配列の発現から生じるポ リペプチド。 ２２．ポリペプチドＳｎａＡ（配列番号２）、ＳｎａＢ（配列番号３）、Ｓｎａ Ｃ（配列番号７）、ＳｎａＤ（配列番号８）、ＰａｐＡ（配列番号９）、Ｐａｐ Ｍ（配列番号１０）、ＳａｍＳ（配列番号４）、ＳｎｂＡ（配列番号５）、Ｓｎ ｂＣ（配列番号１１および１２）、ＳｎｂＤ（配列番号１３および１４）、Ｓｎ ｂＥ（配列番号１５および１６）および ＳｎｂＲ（配列番号６）またはその誘導体の全部または一部を含んで成るポリペ プチド。