KR20050019808A - 스트렙토마이세스 속 세균의 ＰａｐＭ 폴리펩타이드의신규 변이체 - Google Patents

스트렙토마이세스 속 세균의 ＰａｐＭ 폴리펩타이드의신규 변이체 Download PDF

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KR20050019808A
KR20050019808A KR10-2004-7021459A KR20047021459A KR20050019808A KR 20050019808 A KR20050019808 A KR 20050019808A KR 20047021459 A KR20047021459 A KR 20047021459A KR 20050019808 A KR20050019808 A KR 20050019808A
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아방티 파르마 소시에테 아노님
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Abstract

본 발명은 야생형 폴리펩타이드와 비교하여 기질 특이성을 갖고/갖거나 효율이 증진된 스트렙토마이세스 속 세균의 PapM 폴리펩타이드의 신규 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 당해 변이체를 암호화하는 핵산, 당해 핵산이 도입된 미생물 및 스트렙토그라민 B 성분을 생산하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

스트렙토마이세스 속 세균의 ＰａｐＭ 폴리펩타이드의 신규 변이체{Novel variants of the PapM polypeptide of bacteria of genus Streptomyces}
도 1은 프리스티나마이신 II의 구조에 대한 예를 보여준다.
도 2는 프리스티나마이신 I의 구조에 대한 예를 보여준다.
도 3은 PIB 및 PIA 각각의 전구체인 MMPAPA 및 DMPAPA에 대한 생합성 경로를 보여준다.
도 4는 [14C-Me]-SAM의 존재하에 각각 PAPA 및 MMPAPA로부터 MMPAPA 및 DMPAPA의 동시 메틸화에 의해 표지시켜 PapM 돌연변이를 스크리닝하는데 사용되는 효소 분석의 원리를 설명한다.
도 5는 플라스미드 pVRC706을 도시한 것이다.
도 6은 플라스미드 pUC4K를 도시한 것이다.
도 7은 야생형 papM 유전자의 서열 및 해독을 도시한다. 돌연변이의 위치는 돌연변이된 클론 49 및 66에 대해 동정되었다.
도 8은 플라스미드 pVRC721을 도시한 것이다.
도 9는 플라스미드 pVRC1303을 작제하기 위한 방법을 도시한다.
도 10은 플라스미드 pVRC1303과 에스 프리스티나에스피랄리스의 염색체 간에 이중 교차하는 경우 및 재조합 균주의 염색체 구조를 도시한 것이다.
도 11은 pVRC1306을 작제하기 위한 방법을 도시한다.
도 12는 플라스미드 pVRC1306과 재조합 균주 SP216의 염색체 사이에 선택된 단일 교차의 경우를 도시한 것이다.
도 13은 papM 유전자의 돌연변이된 대립형질 유전자중 하나를 보여주는 재조합 균주를 생산하는 제2 재조합 반응의 경우를 도시한 것이다.
문헌참조
실시예 1
효소적 스크리닝을 위한 방법 및 프로토콜
당해 실시예는 하이드록실아민으로 돌연변이 처리에 의해 유도된 효소 집단을 사용하여, 신규 역학적 특성을 나타내는 PapM 효소의 돌연변이된 형태를 스크리닝하는 방법을 설명한다(실시예 2 및 3 참조). 특히, 본 실시예는 당해 효소에 대한 2개의 천연 기질에 대해 특이성이 변형된 돌연변이된 형태의 PapM의 제조 방법을 설명한다.
1.1 방법
papM 메틸라제는 선행 기술에서 클로닝되고 정제되고 특성이 분석되었다[문헌참조: Blanc. et al., 1994; Blanc et al., 1997]. PapM은 L-PAPA의 L-MMPAPA로의 N-메틸화 및 L-MMPAPA의 L-DMPAPA로의 N-메틸화 둘다를 촉매하는 이작용성 효소이다(도 4 참조).
L-PAPA 및 L-MMPAPA는 각각 마이클(Michaelis) 상수(Km)가 240 및 530μM인 PapM에 대한 2개의 경쟁 기질이고 이에 대한 PapM의 최대 반응 속도(Vmax)은 각각 PapM mg당 시간당 55 및 71μmol이다[문헌참조: Blanc et al., 1997].
L-PAPA 및 L-MMPAPA의 메틸화에 대한 각각의 반응 속도 V1 및 V2의 비율은 수학식 V1/V2=(Vmax1/Km1)[S1]/(Vmax2/Km2)[S2]에 따라 PapM의 역학적 계수(L-PAPA에 대한 Km1 및 Vmax1, L-MMPAPA에 대한 Km2 및 Vmax2)에 의존하고 또한 L-PAPA 및 L-MMPAPA의 각각의 농도 S1 및 S2에 의존한다.
S1 및 S2의 고정된 농도에서 메틸화 V1 및 V2의 2개의 반응 속도에 대한 동시 측정은 L-PAPA 및 L-MMPAPA의 역학적 상수의 비율을 결정할 수 있도록 해준다. 당해 비율은 분석에 사용되는 PapM의 양과는 무관하다. 돌연변이된 PapM 효소의 특이성이 L-PAPA에 대해 증가하는 경우, V1/V2의 비율은 증가해야만 하고 역으로, 당해 비율은 돌연변이된 PapM 효소가 우선적으로 L-MMPAPA를 메틸화시키는 경우 감소해야만 한다.
최종적으로, Km에서의 작은 변화를 회피하고 반대로 Km의 큰 변화 또는 Vmax 값의 변화를 촉진하기 위해, L-PAPA 및 L-MMPAPA의 농도를 Km의 약 6배로 고정하여 포화조건하에 있도록 한다. 당해 조건하에서, 야생형 PapM 효소에 대해 메틸화 1 및 메틸화 2의 비율은 실질적으로 동일하다.
PapM의 2개의 메틸화 활성에 대한 동시 분석은 실시예 7.1에 기재되어 있다. PapM의 메틸라제 활성에 대한 당해 분석은 1.5mM L-PAPA, 3mM L-MMPAPA 및 70㎕의 SAM의 존재하에 수행한다.
1.2. 돌연변이된 PapM 효소 집단의 스크리닝
실시예 3에 기재한 바와 같이 제조된 돌연변이된 PapM 효소를 생산하는 이. 콜리의 라이브러리에 대한 96웰 플레이트를 23℃에서 해빙시킨다. 다음에, 혼합물 A 25㎕를 각각의 웰에 함유된 LB 배지상의 배양물 200㎕에 첨가한다. (1) 디하이드로클로라이드 형태로 L-PAPA 12mg 및 (DL)-MMPAPA 71mg이 용해되고 문헌[참조:WO 96/01901-A1에 기재된 바와 같이 제조된 50mM 비스-트리스-프로판 완충액(pH 10) 3ml, (2) 물중의 4mM SAM 0.7ml, (3) 25μCi/ml 및 60mCi/mmol에서 [14C-Me]-SAM(AMERSHAM) 0.7ml, (4) 100mM 비스-트리스-프로판 완충액(pH 6.8) 0.6ml 및 (5) EDTA 이나트륨 염 56mg을 연속적으로 첨가함에 의해 혼합물 A를 수득한다. 혼합물 A의 양은 5ml 용적으로 제조된다. 당해 플레이트를 이어서 접착 필름으로 밀봉시킴에 이어서 27℃에서 2시간동안 항온처리한다. 반응을 종결 용액 40㎕를 사용하여 종료시킨다. 종결 용액(4ml의 용적에 대해)은 물중에서 24mg/ml의 나트륨 헵탄설포네이트 용액 2.2ml을 진한 염산 1.8ml과 혼합함에 의해 수득한다. 플레이트를 5분동안 3000g에서 원심분리한 후, 각각의 웰의 상등액 100㎕를 실시예 7.1에 기재된 시스템에서 HPLC로 분석한다.
각각의 웰에 대해, 방사선 화학 검출의 판독으로부터 유래된 MMPAPA 및 DMPAPA 피크의 각각의 면적 A1 및 A2를 통합한다. 이어서 비율 r은 수학식 r= A1/(A1 + A2)로 계산한다.
야생형 PapM 메틸라제의 경우, r은 0.50±0.05이다.
메틸화 2 보다 상당히 메틸화 1에 대해 활성인 돌연변이된 PapM 효소에 고정된 비율 r의 역치는 약 0.60이다.
실시예 2: 하이드록실아민을 사용한 papM 유전자의 돌연변이 유발
당해 실시예는 이. 콜리에서 복제할 수 있는 플라스미드로 클로닝된 스트렙토마이세스의 플라스미드 DNA를 사용한 papM 유전자의 돌연변이 유발 방법을 설명한다.
2.1 돌연변이 유발 제제의 선택
화학적 돌연변이 유발은 시토신 잔기와 특이적으로 결합하여 N4-하이드록시-시토신을 형성하여 아데닌 잔기와 쌍을 형성할 수 있는 하이드록실아민(NH2OH)를 사용하여 수행하였다. 따라서, 하이드록실아민은 G:C > A:T 전이를 유발한다. 당해 돌연변이 제제의 선택은 특히, GC 잔기를 70 내지 75% 함유하는 스트렙토마이세스 DNA와 같은 GC 풍부 DNA의 돌연변이를 수행하는데 유리하다.
2.2. 돌연변이 유발을 수행하기 위한 플라스미드의 선택
돌연변이 유발은 2개의 상이한 플라스미드, 즉, 플라스미드 pVRC706 및 플라스미드 pUC4K을 대상으로 동시에 수행하였다.
플라스미드 pVRC706(도 5)는 돌연변이 유발이 수행되어야만 하는 papM 유전자를 함유한 플라스미드 pVRC409(문헌참조: Blanc et al., 1994; Blanc et al., 1997)로부터 유래된 1.7kb MluI-StuI 단편이 유일한 MluI 및 BamHI 부위[BamHI에 의해 절단된 말단은 문헌(참조: Sambrook et al., (1989))에 따른 클레노우(Klenow) 효소의 작용에 의해 평활 말단화된다] 사이에 클로닝된 pMTL23(문헌참조: Chambers et al., 1988)의 유도체이다. 클레노우 효소를 사용하여 충전된 pMTL23의 BamHI 부위로의 StuI 말단의 클로닝은 후속 클로닝동안에 재사용될 수 있는 BamHI 부위를 재구성시킬 수 있다. MluI 부위에서의 클로닝은 플라스미드 pMTL23의 lacZ 유전자에 의해 암호화된 β-갈락토시다제의 처음 32개의 아미노산과 papM 유전자의 업스트림에 위치한 papB 유전자의 마지막 11개의 아미노산 사이에 상 융합될 수 있도록 한다. 이것은 뉴클레오타이드 서열 관점에서 당해 2개의 유전자 사이에 존재하는 것으로 나타난 해독 커플링을 보존한다[문헌참조: Blanc et al., 1994]. 당해 작제물에서, papM 유전자의 발현은 IPTG 1mM을 첨가함에 의해 유도될 수 있는 lacZ 유전자의 Plac 프로모터에 의해 조절된다. 이전에 당해 발현 시스템이 이. 콜리에서 총 단백질의 약 0.5%를 차지하는 활성 및 가용성 단백질 형태로 PapM 메틸라제를 생산할 수 있는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Blanc et al., 1994].
플라스미드 pUC4K(도 6)는 앰피실린과 가나마이신에 내성을 부여하는 2개의 유전자를 함유한 벡터 pUC4의 유도체이다[문헌참조: Vieira and Messing, 1982]. 당해 플라스미드는 하기의 이유때문에 돌연변이 유발 대조군으로서 선택하였다: (1) 이의 크기(3.9kb)는 플라스미드 pVRC706(4.4kb)와 유사하고 (2) 2개의 플라스미드 pUC4K와 pVRC706은 이들 모두가 pUC 계열의 벡터로부터 유래하기 때문에 매우 유사한 구조 및 성질을 갖고 (3) pUC4K가 함유한 2개의 내성 유전자인 ampP 및 KanR의 존재는 선택된 항생제에 민감한 클론을 계수함에 의해 이들 유전자중 하나가 돌여변이된 클론의 %를 용이하게 평가할 수 있다.
2.3. 돌연변이 유발 프로토콜
하이드록실아민을 사용한 2개의 돌연변이 유발은, 항온처리 온도(80℃ 및 85℃)를 다양하게 하고 염화세슘 밀도구배상에서 정제된 플라스미드 DNA 5mg을, 인산나트륨 0.05M 및 EDTA 0.5mM을 함유하는 완충액중에서 목적하는 온도(80℃ 또는 85℃)에서 35분동안 100ml의 최종 용적에서 하이드록실아민 0.4M(pH 6)과 접촉시키는, 험프리(Humprey) 등(1976)에 따라 수행하였다. 돌연변이 유발 반응은 인산나트륨 0.1M 및 EDTA 1mM를 함유한 완충액 100ml을 첨가함에 의해 종료시키고 하이드록실아민을 TES 완충액(10mM 트리스, pH 7.5, 1mM EDTA 및 100mM NaCl) 2ℓ에 대해 8개의 연속 희석 욕조를 사용하여 제거한다. 따라서 처리된 DNA를 3M 나트륨 아세테이트(pH 8)의 10분 1 용적 및 95% 에탄올 2.5 용적을 첨가함에 의해 침전시킨다. DNA 펠렛은 세정하고 건조시키고 이어서 TE 완충액(10mM 트리스-HCl 및 1mM EDTA, pH 7.5) 100㎕중에 용해시킨다. 각각의 플라스미드에 대해, 돌연변이 유발 반응에 대한 대조군은 하이드록실아민의 부재하에 연구된 온도에서 수행하였다.
2.4. 돌연변이 유발이 수행된 플라스미드를 수용한 이. 콜리 균주의 제조
이 콜리 균주 DH5α(supE44 DlacU169(f801lacZDM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1)(문헌참조: Hanahan, 1990)을 사용하여 상기된 프로토콜에 따라 돌연변이 유발이 수행된 플라스미드 pVRC706 및 pUCK4로 형질전환시킨 후 돌연변이 유발을 평가하였다.
전기천공에 의한 형질전환을 위해 이 콜리 DH5α세포 컴피턴트를 하기의 프로토콜에 따라 제조하였다. LB 배지중의 1ℓ배양물을 OD(600nm에서)가 0.5 내지 0.8에 도달할때까지 37℃에서 제조하였다. 이어서, 세포를 30분동안 빙상에 놓고 이의 성장을 종료함에 이어서 15분동안 4000g에서 40℃에서 원심분리한다. 세포 펠렛을 냉각된 멸균수 1ℓ, 냉수 0.5ℓ 및 10% 글리세롤을 함유하는 냉 용액 20ml로 연속적으로 세정한다. 각 세정 후, 세포를 15분동안 4000g에서 4℃에서 원심분리한다. 최종적으로, 세포 펠렛을 10% 농도의 글리세롤 2ml중에 첨가한다. 따라서, 제조된 세포를 즉각적으로 전기천공하거나 동결시켜 후속적 사용을 위해 40ml 적정액 형태로 -80℃에서 저장한다. 전기 컴피턴트 세포의 형질전환 효율은 pUC18 플라스미드 DNA ㎍당 109 콜로니 정도이다.
따라서, 제조된 이 콜리 DH5α세포는 등가의 시험 플라스미드 5ng와 함께 전기천공시킨다. 이를 위해, 전기 컴피턴트 세포 40㎕를 4℃에서 1분동안 플라스미드 DNA 5ng을 함유하는 용액 1 내지 2㎕의 용액과 접촉시킨다. 전기천공기(Bio-Rad)는 펄스 25mF 및 2500V로 설정한다. 펄스 조절기의 저항은 200Ω으로 설정한다. 세포/DNA 혼합물을, 폭이 0.2cm인 전기천공 큐벳에 놓고 전기 펄스를 가한다. 통상적으로 펄스 시간은 4.5 내지 5ms이다. 펄스 후, SOC 배지(2% 박토-한천, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4, 20mM 글루코스) 1ml을 신속하게 세포에 첨가하고 전체 혼합물을 5ml 들이 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 1시간동안 37℃에서 항온처리한다. 당해 단계는 세포가 회수되도록 하고 세포로 침투된 플라스미드상에 존재하는 내성 유전자의 발현을 개시하도록 한다. 항온처리 말기에, 세포 배양물을 적합하게 희석(희석 인자는 통상적으로 10-1 내지 10-4이다)시키고 형질전환된 콜로니를 선별 항생제(앰피실린 50㎍/ml 또는 가나마이신 50㎍/ml) 함유 고형 LB 배지상에서 선별한다.
2.5. 돌연변이 유발 평가 및 선별 온도 조건의 결정
시험된 2개의 돌연변이 유발 온도는 하기의 2개의 기준에 따라 평가하였다: 첫번째로, 돌연변이 유발이 수행된 플라스미드의 이 콜리 균주를 형질전환시키는 능력 및 두번째로, 돌연변이 유발이 수행된 pUC4K 플라스미드로 형질전환되고 당해 플라스미드에 의해 암호화된 2개의 내성 유전자중 하나가 결실된 이 콜리 클론의 %.
2개의 플라스미드 pVRC706 및 pUCK4에 대해, 하이드록실아민으로 돌연변이 유발이 수행된 플라스미드의 이 콜리 균주 DH5α를 형질전환시키는 능력을 측정하였다. 당해 능력을 돌연변이 유발이 수행되지 않았고 하이드록실아민 부재하에 항온처리 온도에 대한 대조군으로 제조된 플라스미드의 능력과 비교하였다. 특히, 하이드록실아민의 작용은 플라스미드에서 및 보다 특히, 재조합 클론이 선별될 수 있도록 하는 내성 유전자 및 또한 복제 오리진을 함유한 영역에서 치명적 돌연변이를 발생시켜야만 한다. 따라서, 돌연변이 유발 처리가 보다 효율적일 수록 플라스미드의 형질전환 능력은 감소하는 것으로 간주될 수 있다. 돌연변이 유발이 수행된 2개의 플라스미드의 형질전환 능력(돌연변이 유발이 수행되지 않은 대조군 플라스미드 능력의 %로서 표현됨)은 하기 표 1에 나타낸다.
pVRC706 pUC4K
80℃ 85℃ 80℃ 85℃
앰피실린 12.5 1.5 14 1.5
가나마이신 - - 16 0.3
이들 결과는 명백하게, 85℃에서의 돌연변이 유발이, 전기 컴피턴트 이 콜리 DH5α세포를 여전히, 형질전환시킬 수 있고 복제할 수 있으며 수득한 클론에 앰피실린 내성을 부여할 수 있는 플라스미드가 단지 1.5%에 불과하도록 통계학적으로 10배 더 플라스미드 실체를 변화시키기 때문에 2개의 플라스미드 pVRC706 및 pUC4K에 대해 보다 효율적임을 나타낸다. 추가로, pUC4K에 대해 관찰된 결과는 어떠한 선별((AmpiR) 또는 (KanaR)) 과정이 선택되더라도 매우 유사하고 이것은 하이드록실아민의 작용이 이들 2개의 내성 발현에 필수적인 영역에서 균일하게 작용함을 나타낸다.
평가를 위한 제2 기준은 돌연변이 유발이 수행된 플라스미드 pUC4K에 대해, 앰피실린(AmpiR)에 내성인 클론중에서 가나마이신(KanaS)에 민감한 클론의 % 및 그 반대의 경우의 %를 계산하는 것으로 이루어진다. 이들 퍼센테이지는 하이드록실아민의 효과하에 연구중인 내성 유전자(ampR 또는 KanR)에서 발생하고 완전히 차단(전사 또는 해독 정지)되거나 절단되고/되거나 불활성 단백질의 합성을 유도함에 의해 내성 유전자의 발현이 방해된 돌연변이의 빈도수를 반영한다.
이들 퍼센테이지를 평가하기 위해, 이 콜리 균주 DH5α의 전기 컴피턴트 세포를, 돌연변이 유발이 수행되거나 수행되지 않은 플라스미드 pUC4K로 형질전환시킨 후 수득한 클론으로부터 선택된 200개의 (KanaR) 또는 (AmpiR) 클론을 각각 앰피실린 또는 가나마이신을 함유하는 고체 LB 배지상에 계대배양하였다. 2개의 항생제중 하나에 민감성인 클론을 성장시킨지 24시간 후에 계수하였다. 하이드록실아민으로 돌연변이 유발이 수행되었거나 수행되지 않았던 플라스미드 pUC4K로 형질전환된 클론중에서 앰피실린 또는 가나마이신에 민감성인 클론의 퍼센테이지는 하기 표에 나타낸다.
pUC4K + 하이드록실아민 돌연변이 유발이 수행되지 않은 pUC4K
80℃ 85℃ 80℃ 85℃
(AmpiS)/(KanaR) 1.3 3.2 0 0
(KanaS)/(AmpiR) 1.5 6 0 0
당해 결과는 하이드록실아민으로의 처리만이 pUC4K의 2개의 내성 유전자중 하나의 발현에 영향을 미치는 돌연변이를 발생시는 것으로 결론지을 수 있다. 이들은 또한 85℃에서 수행되는 돌연변이 유발이 80℃에서 수행되는 돌연변이 유발 보다 플라스미드 pUC4K의 2개의 내성 유전자에 대해 3 내지 4배 이상 효율적이라고 결론지을 수 있다. 최종적으로, 이들 샘플은 하이드록실아민의 작용이 2개의 내성 유전자 ampR 및 KanR에 대해 비교적 유사함을 보여준다.
따라서, 하이드록실아민은 2개의 플라스미드 pUC4K 및 pVRC706 모두에 작용하고 85℃에서 형성된 돌연변이 유발이 아마도 플라스미드 pVRC706에 함유된 papM 유전자에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 가정하는 것이 합당할 수 있다. 이러한 돌연변이 유발 조건의 대비는 남은 연구동안에 본 발명자가, 85℃에서 수행된 하이드록실아민으로 돌연변이 유발된 것으로부터 유래하는 플라스미드 pVRC706에 의한 이 콜리 균주 DH5α의 전기 컴피턴트 세포의 형질전환으로부터 비롯된 클론만을 선별할 수 있도록 해준다.
실시예 3
플라스미드 pVRC706을 함유한 이 콜리 DH5α라이브러리의 구성 및 이용
당해 실시예는 85℃에서 하이드록실아민으로 화학적 돌연변이 유발된 플라스미드를 함유한 이 콜리 균주 DH5α에 대한 6000개 클론의 라이브러리의 구성 및 이용을 설명한다.
상기된 바와 같은 papM 유전자를 함유한 플라스미드 pVRC706을 85℃에서 하이드록실아민으로 돌연변이 유발시키는 경우, 하이드록실아민이 모든 플라스미드 pVRC706(실시예 2 참조)상에 작용한다는 가정하에 당해 플라스미드를 함유하는 6000개의 이. 콜리 클론의 라이브러리는 클론의 특정 퍼센테이지가 돌연변이된 papM 유전자를 발현하는 돌연변이 라이브러리를 구성한다고 평가할 수 있다. 상응하는 PapM 단백질에 의해 촉매되는 2개의 메틸화 활성을 동시에 평가함에 의한 6000개 클론의 라이브러리에 대한 분석은 당해 가정을 확인시켜준다(실시예 4 참조).
당해 라이브러리를 구성하기 위해,이 콜리 균주 DH5α의 전기 컴피턴트 세포를 형질전환시킨 후 앰피실린 50mg/ml을 함유하는 LB 배지상에서 선택된 6000개의 클론을, 각각 앰피실린 100㎍/ml이 보충된 호그니스 배양물 및 보존 배지(문헌참조: Sambrook et al., 1989) 200ml을 함유하는 96웰 미세역가 플레이트의 웰에 계대배양하였다. 따라서 구성된 스톡 플레이트를 24시간동안 160rpm의 약한 진탕과 함께 37℃에서 배양하고 클론을 증식시키고 증식 정지 상에 도달한 세균으로 포화된 현탁액을 형성시킨다. 이어서 스톡 플레이트 각각의 웰의 적정 배양액을 사용하여 스톡 플레이트를 앰피실린 100㎍/ml 및 IPTG 1mM이 보충된 LB 배양 배지 200ml을 함유하는 2개의 96웰 플레이트 각각의 웰에 다시 접종하여 2개로 복제한다. 이와 같이 수득된 당해 플레이트는 분석 플레이트로 불리우고 24시간(37℃, 160rpm)동안 배양하여 클론을 증식시키고 증식 정지 상에 도달한 세균의 포화된 현탁액을 형성시킨다. 세균 세포내 플라스미드 pVRC706의 존재 유무는 앰피실린을 사용하여 선별하고 당해 플라스미드에 함유된 papM 메틸라제 유전자의 발현은 배양 개시때 IPTG를 첨가하여 유도한다. 이어서 당해 플레이트를 -80℃에서 동결시킨 후 조 세균 현탁액상에서 메틸화 활성을 분석한다(실시예 1 참조).
일단 2회 복제된 스톡 플레이트를 -80℃에서 보존하고 이들은 분석될 6000개의 클론의 장기간 저장 형태를 구성한다.
실시예 4: 돌연변이 유발이 수행된 플라스미드 pVRC706을 함유하는 이 콜리 균주 DH5α라이브러리의 스크리닝 결과
본 실시예는 소형 활성 분석을 사용하여 6000개의 클론의 라이브러리를 신속하게 분석하여 유리한 성질을 갖는 효소를 암호화하는 돌연변이된 유전자를 함유하는 클론을 선별하는 방법을 설명한다.
4.1. 6000개 클론의 스크리닝에 대한 미분석 결과
실시예 3에서 제조된 6000개 클론의 라이브러리에 대해 실시예 1에서 기재된 바와 같이 수행된 첫번째 스크리닝 말기에,
- 제로이거나 검출 불가능한 메틸화 활성, 즉 7.3% 수준을 나타내는 441개의 클론 및
- 제2 반응 보다 제1 메틸화 반응을 선호하는 것으로 나타나는 9개의 클론(즉, 여기서 클론은 비율 r(실시예 1.2에서 정의된 바와 같음)이 0.6을 초과하고 따라서, 당해 돌연변이의 출현 빈도수는 매우 낮은 0.15%이다)을 선별한다.
이들 제1 결과는 하기에 기재된 바와 같이 입증된다.
4.2. 선택된 클론을 확인하는 방법
제1 스크리닝동안에 선택된 모든 클론의 메틸화 활성은 실시예 3에서와 같이 제조된 복제 플레이트를 사용하여 시스템적으로 재분석하고 하기의 동일한 프로토콜에 따라 제1 분석 결과를 확인한다. 대다수의 클론에 대한 분석 결과가 확인된다.
따라서,
- 360개의 클론이 제로 메틸화 활성(즉, 6% 수준)을 나타내고
- 8개의 클론이 제2 반응보다는 제1 메틸화 반응을 선호하는 것으로 나타나고 즉, 당해 클론은 비율 r(실시예 1.2에서 정의된 바와 같음)이 0.6을 초과함에 따라서 당해 돌연변이의 출현 빈도수가 매우 낮은 0.13%임을 확인한다.
효소 효율 비율이 0.60을 초과하는 8개의 클론에 대해, 2개의 다른 확인 단계를 확립한다:
(1) 이들 클론의 플라스미드 DNA를 표준 기술(문헌참조: Sambrook et al., 1989)을 사용하여 분리하고 이 콜리 균주 DH5α의 신선한 전기 컴피턴트 세포로 재도입한다. 본 단계를 통해 8개의 클론중에서 관찰되는 메틸화 활성 비율 r의 변화가 클론의 염색체와는 무관하고 단지 선별된 클론으로부터 유래된 플라스미드에 의존한다는 것을 입증할 수 있다.
(2) 하기의 입증 단계는 선별된 클론에 존재하는 papM 유전자를 신선한 발현 벡터 pMTL23으로 재클로닝하는 것으로 이루어진다. 이를 위해, papM 유전자를 함유한 1.7kb의 MluI-BamHI 단편을 선별된 클론으로부터 추출된 플라스미드 DNA로부터 분리하고 pMTL23의 유일한 MluI 및 BamHI 부위 사이에 재클로닝한다. 이들 클로닝을 위해 요구되는 단계(플라스미드 DNA의 분리, 제한 효소를 사용한 플라스미드 DNA의 분해, 아가로스 겔 전기영동에 의한 효소 분해물의 이동 및 분석, 전기영동 이동후에 DNA 단편의 제조, 연결 반응)는 문헌[참조: Sambrook et al., (1989)]에 기재된 표준 프로토콜에 따라 수행하였다.
수득한 플라스미드는 pVRC706(도 5)의 구조와 유사한 구조를 갖고 차이점은 수득한 플라스미드가 papM 유전자에 대한 8개의 돌연변이된 대립형질 유전자중 하나를 함유한다는 것이다. 이들을 pVRC710에서 pVRC717(각각의 숫자는 각각의 8개의 돌연변이된 대립형질 유전자에 부여된 것이다)로 명명하고 이 콜리 균주 DH5α의 신선한 전기 컴피턴트 세포에 재도입한다. 수득한 클론의 메틸화 활성은 상기된 바와 같이 재분석한다. 본 단계를 통해 당해 클론에서 관찰되는 메틸화 활성의 비율 r의 변화가 papM 유전자 외부의 pVRC706 영역에서 발생되는 하나(또는 그 이상)의 돌연변이와는 무관하고 단지 papM 유전자의 내부에 위치한 하나( 또는 그 이상)의 돌연변이에 의존한다는 것을 입증할 수 있다.
모든 입증 단계를 통해, 미리 선별된 8개의 돌연변이체중 7개의 표현형을 확인할 수 있다. 예를 들어, 실시예 1.2에 기술된 바와 같이 계산된 2개의 메틸화 활성의 비율은 돌연변이 49(클론 49C9)에 대해서는 0.63이고 돌연변이 66(클론 66A9)에 대해서는 0.67인 반면 동일한 실험에서 야생형 papM 유전자를 발현하는 클론에 대해서는 단지 0.40인 것으로 관찰된다.
실시예 5: 플라스미드 pVRC706에 대해 85℃에서 하이드록실아민으로 수행된 돌연변이 유발로부터 유래된 돌연변이 papM 유전자의 유전학적 특성 분석.
본 실시예는 화학적 돌연변이 유발된 유전자의 유전학적 특성 분석을 설명한다. 유전학적 특성 분석은 돌연변이된 유전자를 클로닝하고 이의 서열을 분석하여 야생형 유전자의 서열과 비교하고 관찰된 표현형과 관련된 돌연변이를 입증함에 의해 수행한다. 당해 유전학적 특성 분석은 돌연변이된 유전자(실시예 7 참조)가 암호화하는 단백질의 생화학적 특성 분석과 함께 수행하여 관찰되는 아미노산의 변화와 당해 효소에서 나타나는 촉매 성질의 변형과의 상호 관계를 규명한다.
5.1 방법
플라스미드 pVRC706에 대해 85℃에서 하이드록실아민으로 수행된 돌연변이 유발로부터 유래하는 papM 유전자의 경우에, 7개의 선별된 클론의 papM 유전자를 서브클로닝하고 서열 분석하였다. 돌연변이 유발이 수행된 플라스미드 pVRC706의 1.7kb MluI-BamHI 영역 부분은 돌연변이된 papM 유전자를 함유하고 당해 영영 부분을 2개의 서브 삽입물로서 생거 방법[문헌참조: Sambrook et al., 1989]에 의한 DNA 서열 분석에 적합한 M13 파아지로부터 유래하는 벡터에 서브클로닝하였다. papM 유전자의 3' 부위를 함유하는 0.7kb SmaI-AgeI 단편은 벡터 M13mp18의 SmaI 부위에 클로닝하였고 5' 부위를 함유하는 0.4kb SalI-PstI 단편은 벡터 M13mp18과 M13mp19(도 5)의 SalI과 PstI 부위 사이에 클로닝하였다. 당해 서브클로닝을 위해 요구되는 단계는 문헌[참조: Sambrook et al., (1989)]에 기재된 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 당해 2개의 삽입물은 제조원[Applied Biosystems]으로부터 시판되는 PRISM 준비 반응 염료 데옥시 종결인자 사이클 서열 분석 키트의 형광 디데옥시뉴클레오타이드를 사용하는 "생거" 쇄 종결 방법에 의해 서열 분석된 이본쇄였다. 서열 분석 반응은 합성 프라이머로서, 서열분석되고 바이오서치 8600 자동화 합성기(문헌참조: Blanc et al., 1995)에 의해 합성될 삽입체의 20개 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 일반적인 프라이머(문헌참조: Blanc et al., 1995) 또는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 일본쇄 DNA를 대상으로 PCR 기계로 수행한다. 이어서 이들 반응의 생성물은 서열의 전기영동적 이동을 수행하여 이들을 판독하는 어플라이드 바이오시스템스 370A 자동화 서열분석기를 사용하여 분석한다. 이어서 당해 서열은 특히, 단백질로의 이의 연결, 해독 및 야생형 서열과 비교할 수 있는 프로그램(the BISANCE server of the Infobiogen bioinformatics center(Dessen et al., 1990))을 사용하여 프로세싱한다.
5.2. 결과
처음에, 하기의 7개의 클론을 일본쇄 서열 분석하고 비율 r을 다시 결정하였다(야생형 PapM 효소에 대한 비율이 0.40과 동일한 것으로 밝혀진 실험에서).
돌연변이체 비율 돌연변이 돌연변이(핵산)
45 0.52 Thr274>Ile ACC>ATC
49 0.63 Gly249>Ser GGC>AGC
52 0.66 Gly249>Asp GGC>GAC
66 0.67 Thr192>Ile ACC>ATC
69 0.51 Met226>Ile ATG>ATA
74D4 0.63 Gly249>Ser GGC>AGC
74D5 0.52 Met226>Ile ATG>ATA
플라스미드 pVRC706에 대해 85℃에서 하이드록실아민으로 수행된 돌연변이 유발로부터 유래하는 돌연변이된 papM 유전자가 암호화하는 단백질의 서열과 야생형 papM 유전자(문헌참조: Blanc et al., Blanc et al., 1997)가 암호화하는 단백질의 서열의 비교 결과는 도 7 및 하기의 표에 나타내고 7개의 선별된 클론중 2개의 서열은 양 쇄상에서 입증되었다.
돌연변이 49(클론 49C9) 돌연변이 66(클론 66A9)
papM 유전자내 뉴클레오타이드 돌연변이 GGC>AGC ACC>ATC
PapM 단백질내 아미노산 치환 Gly249>Ser Thr192>Ile
당해 표에서, 상응하는 단백질에서 아미노산 변화를 유발하는 돌연변이만을 지적한다. 몇몇 클론에 대해서 및 특히 돌연변이 66으로 호칭되는 클론 66A9에 대해 기타 "사일런트" 돌연변이는 유전학적 코드의 축퇴성으로 인해 아미노산 서열에 변화를 유도하지 않는 것으로 관찰된다.
선별되고 서열 분석된 7개의 클론 각각에 대해서, 아미노산 변화를 유도하고 하이드록실아민으로 처리후 예상되는 C>T 또는 G>A의 변화 유형에 실질적으로 상응하는 papM 유전자내 점 돌연변이를 입증할 수 있음을 주지한다. 분석된 7개의 클론중에서, 몇몇 당해 돌연변이는, 이들 7개의 클론이 영향받은 위치에 의존하여 4개 부류의 돌연변이로 분류될 수 있는 것으로 여러번 밝혀졌다. 상기된 클론은 따라서 구성된 4개의 부류중 2개를 나타낸다.
보다 특히, 2개 돌연변이의 효과는 남은 연구 수행동안에 연구되었다. 이들은 서열 1을 기준으로, 첫번째로 658 위치의 시토신이 티민으로 치환(C658T)되고 두번째로, 828 위치의 구아닌이 아데닌으로 치환(G828A)된 것이다(돌연변이된 대립 형질 유전자 49).
당해 유전학적 특성 분석과 병행하여, 실시예 7에 기재된 바와 같은 돌연변이된 유전자가 암호화하는 단백질의 생화학적 특성 분석을 통해 야생형 papM 유전자가 암호화하는 단백질과 비교되는 당해 효소의 촉매 성질의 변화를 관찰할 수 있다.
따라서, 관찰된 아미노산 변화와 당해 효소에서 나타나는 촉매 성질의 변화의 상호관련성을 규명할 수 있다.
따라서, 돌연변이 66에 대해, 변형된 아미노산은 위치 193 내지 196(도 7)에 위치한 NPPY 모티프 바로 직전의 192번에 위치하는 트레오닌임을 주지한다. 당해 모티프는 모든 N-메틸라제 및 보다 특히 DNA N-메틸라제(아데닌의 6 위치 및 시토신의 4 위치를 메틸화시키는)에서 보존되어 있고 당해 효소의 촉매 도메인의 일부인 것으로 사료된다(문헌참조: Schluckebier et al., 1995). 따라서 극성 아미노산인 트레오닌 잔기의 소수성인 이소류신 잔기로의 변형은 아마도 상응하는 단백질의 촉매 성질에 중요한 것이다. 돌연변이된 유전자 66이 암호화하는 효소 촉매 성질 및 보다 특히, 제2 메틸화 반응(실시예 7)에 대한 상당한 변화가 실질적으로 나타난다.
실시예 6: 플라스미드 pVRC706상에 수행된 돌연변이 유발로부터 유래하는 돌연변이된 papM 유전자를 사용한 이중 돌연변이된 papM 유전자의 유전학적 가공에 의한 작제
본 실시예는 효소적 스크리닝(실시예 4 참조)에 의해 선별되고 서열분석(실시예 5 참조)에 의해 특성화되는, 플라스미드 DNA(실시예 2 참조)상에 하이드록실아민으로 수행된 돌연변이 유발 후 수득한 단일 돌연변이를 나타내는 유전자를 사용하여 이중 돌연변이된 유전자의 유전학적 가공에 의한 작제 방법을 설명한다. 놀랍게도 당해 전략을 통해 단일 돌연변이체에서 관찰되는 성질을 갖고 있는 보다 유리하게 돌연변이된 유전자를 수득할 수 있다.
쌍으로 이루어진 여러 조합된 돌연변이를 수행한다. 예로서, 돌연변이 49와 66의 조합은 하기에서 상세하게 설명된다. 이러한 효과에, 돌연변이된 papM 유전자 66의 5' 부위를 돌연변이된 papM 유전자 49의 3' 부위에 연결시켜 키메릭 유전자를 제조한다. 이를 위해, 하기의 DNA 단편을 분리한다:
- 0.65kb MluI-XhoI 단편을 돌연변이된 papM 유전자 66(실시예 4 참조)을 함유한 플라스미드 pVRC713으로부터 분리한다. 당해 단편은, 돌연변이되어 변형된 메틸라제 66(도 7 참조)의 위치 192에서 발견되는 이소류신을 암호화하는 ATC 코돈 함유 대립형질 유전자 66의 개시부위를 함유한다.
- 1.05kb XhoI-BamHI 단편은 돌연변이된 papM 유전자 49(실시예 4 참조)를 함유한 플라스미드 pVRC711로부터 분리한다. 당해 단편은 돌연변이되어 변형된 메틸라제 49(도 7 참조)의 위치 249에서 발견되는 세린을 암호화하는 AGC 코돈 함유 대립형질 유전자 49의 말단을 함유한다.
당해 2개의 단편은 플라스미드 pMTL23(문헌참조: Chambers et al., 1988)의 유일한 MluI-BamHI 부위 사이에 표준 프로토콜(문헌참조: Sambrook et al., (1989)에 따라 동시 클로닝되어 플라스미드를 재구성하여 pVRC706(도 5)와 유사한 구조를 갖지만 단지 차이는 이것이 위치 192 및 249에서 변형된 단백질을 암호화하는 papM 유전자의 이중 돌연변이된 대립형질 유전자를 함유한다는 것이다. 수득한 플라스미드는 pVRC718로 명명되고 이 콜리 균주 DH5α의 전기 컴피턴트 세포의 형질전환 및 IPTG 1mM을 첨가함에 의해 Plac 프로모터의 유도 개시후 이중 돌연변이된 유전자 49/66을 발현한다.
이중 돌연변이된 대립형질 유전자 49/66을 이어서 T7 파아지 RNA 폴리머라제가 인지하는 강한 PT7 프로모터를 사용하는 제2 발현 벡터 pET11c(Novagen)로 옮긴다. 이를 위해, papM 유전자 49/66을 함유한 1.8kb BglII-BamHI 단편을 플라스미드 pVRC718로부터 분리하고 pET11c의 유일한 BamHI 부위에 클로닝한다. papM 유전자의 업스트림에 위치한 T7 파아지의 유전자 10 및 papB 유전자 사이의 해독 융합체를 제조하기 위한 삽입 방향에 상응하는, pVRC721로 명명되고 도 8에 기재된 재조합 플라스미드를 선별한다. 이어서 당해 플라스미드는 T7 파아지 RNA 폴리머라제를 발현하는 이 콜리 발현 균주 B121(DE3)에 도입함에 따라서 T7 프로모터로부터 전사되는 papM 유전자 49/66을 발현시킨다.
T7 파아지 발현 시스템을 사용하는 유사한 작제물을 사용함으로써 플라스미드 pVRC706을 사용하여 수득된 생산량 보다 10배 이상으로 야생형 PapM 단백질이 과생성되는 것으로 관찰되었다(문헌참조: Blanc et al., 1997). 유사하게 T7 파아지를 사용하는 시스템을 통해 이중 돌연변이된 유전자 49/66이 암호화하는 변형된 메틸라제를 과생산할 수 있고 이것을 실시예 7에 기재된 바와 같이 정제하고 특성 분석한다.
실시예 7: 이 콜리 균주에서 발현되는 에스 프리스티나에스피랄리스의 papM 유전자(야생형 또는 돌연변이된)의 생성물의 생화학적 특성 분석
본 실시예는 PapM 단백질(돌연변이되거나 야생형)이 촉매하는 반응에 대한 역학적 상수의 결정 방법을 설명한다. PapM 단백질은 2개의 반응을 촉매한다: 첫번째로, 4-아미노-L-페닐알라닌(L-PAPA)의 4-메틸아미노-L-페닐알라닌(L-MMPAPA)로의 메틸화 및 두번째로는 4-메틸아미노-L-페닐알라닌의 4-디메틸아미노-L-페닐알라닌(L-DMPAPA)로의 메틸화.
7.1. 4-아미노-L-페닐알라닌의 4-메틸아미노-L-페닐알라닌으로의 메틸화 활성 및 4-메틸아미노-L-페닐알라닌의 4-디메틸아미노-L-페닐알라닌으로의 메틸화 활성의 분석
본 실시예는 프리스티나마이신 Ia의 성분인 4-디메틸아미노-L-페닐알라닌의 생합성의 2개의 최종 활성에 대한 분석 방법을 설명한다. 이들은 첫번째로 4-아미노-L-페닐알라닌의 4-메틸아미노-L-페닐알라닌으로의 메틸화(메틸화 1) 및 두번째로는 4-메틸아미노-L-페닐알라닌의 4-디메틸아미노-L-페닐알라닌으로의 메틸화(메틸화 2)이고 이들 2개의 활성은 메틸 그룹 공여체(도 4)로서 SAM을 사용한다.
분석될 효소 분획물(1 내지 20 유니트)을 메틸화 1을 분석하기 위한 4-아미노-L-페닐알라닌(1mM)의 존재 또는 메틸화 2를 분석하기 위한 4-메틸아미노-L-알라닌(2.5mM)의 존재하에 메틸 그룹이 탄소 14 동위원소(2Ci/몰)로 방사능으로 표지된 SAM(200μM)을 함유하는 50mM 비스-트리스-프로판 완충액(pH 6.8)의 총 용적 200㎕중에서 27℃에서 30분동안 항온처리한다.
당해 반응을, 37% 염산 16㎕ 및 이어서 240g/l의 나트륨 헵탄설포네이트 20㎕를 첨가하여 종료한다. 원심분리후, 상등액 150㎕를 하기의 밀도 구배 방식으로 HPLC 시스템으로 주입한다: - 이동상: 용출제 A = 1.2g의 헵탄설포네이트 + 2.5ml의 빙초산 + 물(적정액 1000ml). 용출제 B = 1.2g의 나트륨 헵탄설포네이트 + 2.5ml의 빙초산 + 300ml의 아세토니트릴 + 물(적정액 1000ml). 당해 밀도 구배는 하기의 방식으로 생성된다: t=0에서 용출제 B 30%; t=16(분)에서, 용출제 B 30%; t=17(분)에서 용출제 B 100%; t=20분에서 용출제 B 100%; t는 21분에서 용출제 B 30%; t=25(분)에서 용출제 B 30%.
-정지상: NucleosilR C 18 5㎛ x 4.6mm 칼럼(Macherey-Nagel)
칼럼에서 배출되는 즉시, 효소 반응의 기질 및 생성물을 254nm에서의 흡광도로 정량한다. 당해 검출은 GT400-U4 유형의 고체 섬광 세포가 장착된 Berthold LB506 검출기를 사용하여 온 라인 방사선화학적 검출과 커플링시킨다. 이를 통해, 특이적으로 방사능활성 메틸 그룹을 반응 생성물에 혼입시킬 수 있다.
메틸화 1(및 또한 메틸화 2)에 대한 효소 활성 유니트는 1mmol의 메틸 그룹을 4-아미노-L-페닐알라닌(또는 4-메틸아미노-L-페닐알라닌)으로 혼입시키는데 요구되는 효소의 양으로서 정의된다.
7.2. 4-아미노-L-페닐알라닌의 4-메틸아미노-L-페닐알라닌으로의 메틸화 및 4-메틸아미노-L-페닐알라닌의 4-디메틸아미노-L-페닐알라닌으로의 메틸화를 촉매하는 SAM 의존적 N-메틸트랜스퍼라제 활성을 나타내는 에스 프리스티나에스피랄리스(야생형 및 돌연변이된)의 재조합 단백질의 정제
본 실시예는 변형된 papM 유전자의 클로닝에 의해 이 콜리에서 발현되는 프리스티나마이신 IA에 대한 생합성 경로에 관여하는 에스 프리스티나에스피랄리스 SP92의 효소를 정제하는 방법을 설명한다.
7.2.a. 돌연변이 PapM 효소 49/66의 정제
실시예 7.1에서 이전에 기재된 분석법을 사용하여, 필요할때마다 각 단계 사이에 활성 분획물을 -70℃에서 동결시키고 보존하는 것에 주의하면서 SAM-의존적 N-메틸트랜스퍼라제를 하기에 기재된 바와같이 정제한다.
IPTG로 유도 후 PapM 변이체 49/66을 과생산하는 이 콜리 BL21(DE3)::pVRC721(실시예 6 참조)의 배양물로부터의 원심분리 펠렛을 1mM PMSF, 5mM EDTA, 5mM EGTA, 0.5M KCl 및 10% v/v의 글리세롤을 함유하는 100mM 포스페이트 완충액(pH 7.2)으로 세척한다. 2g의 세척된 펠렛을 4mM DTE, 5mM 벤즈아미딘, 0.2mM 페파블록, 100㎍/l의 E-64, 2mg/l의 류펩틴, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 2mg/l의 아프로티닌, 20%의 글리세롤 및 2mg/ml의 리소자임을 함유하는 0.1M 트리스-HCl 완충액(pH 8) 20ml중에 첨가한다. 당해 완충액을 +4℃에서 유지시킨다. 따라서 수득한 현탁액을 +4℃에서 왕성하게 진탕시킨다. 30분 진탕 후, 데옥시리보뉴클레아제 I 0.2mg/ml 및 5mM MgCl2를 첨가한다. 진탕 90분 후, 추출물을 1시간동안 50,000g에서 원심분리한다. 상응액을 4mM DTE, 5mM 벤즈아미딘, 0.2mM 페파블록, 100㎍/l의 E-64, 2mg/l의 류펩틴, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 2mg/l의 STI, 2mg/I의 아프로티닌 및 20% v/v 글리세롤을 함유하는 20mM 비스-트리스 완충액(pH 6.8)으로 평형화된 PD-10 칼럼(파마시아)상에서 겔 투과에 의해 2.5ml 적정액으로 탈염시킨다. 단백질 용출물 일부를 이어서 4mM DTE, 2mM 벤즈아미딘, 100㎍/l의 E-64, 2mg/l의 류펩틴 및 20% v/v 글리세롤을 함유하는 20mM 비스-트리스 완충액중에서 염화나트륨을 밀도 구배를 선형으로 증가시키면서(0 내지 0.3M) 유속(분당 3ml)으로 MonoQ HR? 10/10 칼럼상에서 크로마토그래피한다(단백질 34mg). 칼럼에서 배출되는 즉시, 분획물에, 4mM DTE, 30mM 벤즈아미딘, 2mM 페파블록, 100㎍/l의 E-64, 2mg/l의 류펩틴, 5mM EDTA, 5mM EGTA, 10mg/l STI, 10mg/l의 아프로티닌 및 20% v/v 글리세롤을 함유하는 10% v/v의 20mM 비스-트리스 완충액(pH 6.8)을 보충한다. 이들 조건하에, 배출 분획물 및 제1 용출 분획물에서 동일한 방식으로 2개의 메틸화 활성(1 및 2)을 검출한다. 이들 분획물을 모으고 센트리프렙? 10에 이어서 센트리콘? 10상에서 초원심분리하여 농축시킨다. 당해 농축물을 황산암모늄 0.85M로 만들고 이어서 4mM DTE, 2mM 벤즈아미딘, 100㎍/l E-64, 2mg/ml의 류펩틴, 1mM EDTA, 1mM EGTA 및 10% v/v 글리세롤을 함유하는 50mM 비스-트리스 완충액중에서 황산암모늄의 밀도 구배를 선형으로 감소(0.85 내지 0M)시키면서 유속 0.5ml/분으로 페닐-슈퍼로스 HR? 5/5 칼럼상에서 크로마토그래피(각 사이클에서 20 내지 80mg)한다. 칼럼으로부터 배출되는 즉시, 분획물에 4mM DTE, 30mM 벤즈아미딘, 2mM 페파블록, 100㎍/l의 E-64, 2mg/l의 류펩틴, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 10mg/l STI, 10mg/l의 아프로티닌 및 10% v/v 글리세롤을 함유하는 10% v/v의 50mM 비스-트리스 완충액(pH 6.8)을 보충한다. 이들 조건하에, 2개의 메틸화 반응(1 및 2)은 약 0.15M 황산암모늄에 상응하는 용출 분획물중에서 동일한 방식으로 검출한다.
이러한 단계 후에, 효소는 순수하다. SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 32000의 분자량 영역에 단일 밴드가 집중되는 것으로 나타난다.
이 콜리 BL21(DE3)::pVRC721로부터 돌연변이 49/66 4-아미노-L-페닐알라닌(페닐 N-)메틸트랜스퍼라제 효소의 정제. 정제 인자는 정제 동안에 분획물의 비활성 증가에 따라 계산된다.
정제 단계 용적(ml) 단백질(mg) 비활성(유니트a/mg) 수율(%) 정제 인자
조 추출물 4.3 33.7 3400 - -
PD 10 6 31.5 3400 93.5 1
MonoQ HR 10/10 17.5 3.0 19365 36.9 4.1
페닐슈퍼로스 1 0.145 28000 3.5 8.2
a 이들은 실시예 7.1에서 정의된 바와 같이 메틸화 1에 대한 효소 활성 단위이다.
7.2.b. 야생형 돌연변이 49 및 돌연변이 66 PapM 효소의 정제
PapM wt, papM49 및 papM66 효소는 각각 플라스미드 pVRC706, pVRC711 및 pVRC713(실시예 4 참조)로 형질전환되고 IPTG로 유도된 이 콜리 DH5α의 배양물로부터 정제한다. 사용되는 정제 프로토콜은 실시예 7.2.a.에 기재된 것과 동일하다.
7.3. 정제된 PapM(야생형 및 돌연변이된) 메틸라제의 Km 및 Vmax 상수의 측정
메틸화 활성을 분석하기 위한 조건은 SAM(이의 메틸 그룹은 탄소 14 동위원소(2Ci/몰)로 방사능으로 표지된다)농도가 2mM인 것을 제외하고는 실시예 7.1에 기재된 것과 동일하다. 메틸화 1에 대한 4-아미노-L-페닐알라닌 및 메틸화 2에 대한 4-메틸아미노-L-페닐알라닌 기질 각각에 대한 농도 범위는 0.1 내지 60mM이다. 각 기질의 농도에 대해 반응 속도는 시간당 및 단백질 mg당 전환되는 nmol로 측정하고 표현한다.
역학적 상수의 값은 엔즈피터(Enzfiter) 소프트웨어를 사용하여 플롯팅된 마이클 멘텐 곡선으로부터 추론된다.
본래의 야생형 PapM 효소와 돌연변이 형태의 PapM 49, PapM 66 및 PapM 49/66에 대해 수득된 값은 하기의 표에 나타낸다.
PAPA MMPAPA 비율 비율
클론 Km1(mM) Vm1(nmol/h/mg) Km2(mM) Vm2(nmol/h/mg) Km2/Km1 Vm1/Vm2
wt 0.5 112600 0.55 11400 1.1 0.99
49 12 10600 30 2820 2.5 3.8
66 0.57 45200 2.2 19700 3.9 2.3
49/66 9 28000 22 9100 2.5 3.1
이들 결과는 당해 방법을 사용하여 천연 효소와 비교하여 신규한 촉매 성질을 나타내는 신규 효소를 수득할 수 있음을 보여준다. 효소 각각의 돌연변이 형태에 대해, 각각의 메틸화 반응(메틸화 1 및 메틸화 2)의 효소 효율을 결정하였다. 당해 효율은 비율 Vm1/Km1(메틸화 1) 또는 Vm2/Km2(메틸화 2)에 의해 정의된다.
이어서, 각각의 형태에 대해, 효소 효율(메틸화 반응 1/메틸화 반응 2)의 비율을 결정한다. 당해 비율은 Vm1.Km2/Vm2.Km1과 동일하다.
야생형 PapM 효소에 대해 수득한 비율은 1.1이다.
효소 효율의 비율이 2.5를 초과하는 PapM 돌연변이를 선별한다. 가장 우수한 돌연변이의 비율은 7을 초과하고 바람직하게는 10의 범위이다.
Km1 Vm1 Km2 Vm2 Vm1/Km1 Vm2/Km2 Vm1.Km2/Vm2.Km1
wt 0.5 112600 0.55 114000 225200 207270 1.08
49 12 10600 30 2820 880 94 9.36
66 0.57 45200 2.2 19700 79300 8950 8.86
49/66 9 28000 22 9100 3110 410 7.58
7.4 2개의 기질 4-아미노-L-페닐알라닌과 4-메틸아미노-L-페닐알라닌 사이의 경쟁 분석
본 실시예는 본 발명자가 PIB를 제조하기 위해 가장 효율적인 메틸라제, 즉, p-메틸-L-아미노페닐알라닌의 p-디메틸아미노-L-페닐알라닌으로의 메틸화에 대한 제2 반응에 비해 p-아미노-L-페닐알라닌의 p-메틸-L-페닐알라닌의 메틸화에 대한 제1 반응을 보다 우수하게 촉매하는 것을 식별할수 있었던 방법을 설명한다.
2개의 경쟁 기질의 전환 속도 비율은 하기의 수학식과 같다:
V1/V2=(Kcat1/Km1)[S1]/Kcat2/Km2)[S2]
(여기서, Kcat는 효소의 턴오버 또는 효소의 몰수당 및 시간 단위당 메틸화된 기질의 몰수이다).
당해 수학식은 S1 및 S2의 모든 농도에 대해 유효하다.
실질적으로, S1 및 S2의 농도가 어떻든지 간에, 효소 반응은 2개의 성분의 합이고 이것은 S1에 작용하고 경쟁적으로 S2에 의해 억제되는 효소와 S2에 작용하고 경쟁적으로 S1에 의해 억제되는 효소로서의 2개의 별도의 효소에 의해 촉매되는 것과 같다.
2개의 기질중 하나의 Km 및/또는 Vmax의 임의의 변화는 다른 하나의 전환율에 영향을 미칠 것이고 비율 V1/V2가 변화할 것이다.
따라서 각각의 기질이 2% 이하로 전환되지 않도록 함에 의해 반응될 기질과 효소의 양을 피한다.
메틸화 활성을 분석하기 위해, SAM의 농도가 2mM이고 이의 메틸 그룹이 탄소 14 동위원소(2.5Ci/몰)로 방사능 표지된다는 것을 제외하고는 실시예 7.1에 기재된 것과 동일한 조건을 사용하고 2개의 기질, 즉 4-아미노-L-페닐알라닌의 농도가 1mM이고 4-메틸아미노-L-페닐알라닌의 농도가 2mM로서 동시에 존재하도록 하여 각각의 반응 속도를 결정할 수 있다.
분석은 동일한 기질 용액을 사용하여 실시예 4 내지 6에 기재된 돌연변이에 대해 동시에 수행하였다.
이들 조건하에서, 이중 돌연변이된 메틸라제 49/66은 가장 특이적인 것으로 나타나고 이것은 제2 반응 보다 7배로 제1 메틸화 반응을 보다 잘 촉매하는 반면에 본래의 효소는 유사한 방식으로 2개의 반응을 촉매한다.
실시예 8: papM 유전자가 붕괴된 에스. 프리스티나에스피랄리스의 재조합 균주의 작제
본 실시예는 papM 유전자가 붕괴된 에스 프리스티나에스피랄리스의 재조합 균주의 작제방법을 설명한다. 당해 균주는 야생형 papM 유전자가 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 수득되고 특성화된 돌연변이된 대립형질 유전자중 하나로 대체된 재조합 균주를 작제하는 제 1단계를 구성한다. 추가로, 이들 균주는 천연적으로 야생형 papM 유전자를 갖는 균주에 의해 합성되지 않는 PI 계열의 PINH2(도 3)의 화합물을 주로 생산한다. 따라서, 이들 균주는 papM 유전자가 붕괴되지 않은 균주로부터 분리할 수 없는 PINH2를 수득하기 위한 경로를 제공한다.
8.1. papM 유전자가 붕괴된 재조합 균주의 작제
papM 유전자의 붕괴는 다수의 에스 프리스티나에스피랄리스 균주에서 수행되었다:
- PI 및 PII의 혼합물을 생산하는 이전에 기재된 균주 에스 프리스티나에스피랄리스 SP92(문헌참조: Blanc et al., 1994);
- 화학적 돌연변이 유발 후 SP92로부터 유래하는 균주 SP213(본 균주는 특이적으로 PI를 생산한다).
papM 유전자가 붕괴된 재조합 균주를 작제하기 위한 방법은 당해 2개의 균주에 대한 것과 동일하다. SP213 균주로 수득한 결과는 나머지 실시예 부분에서 상세하게 제공된다.
당해 작제물은 이 콜리에서만 복제할 수 있고 스트렙토마이세스에서 발현되는 내성 유전자를 갖는 자살 벡터 pDH5로부터 유래하는 플라스미드 pVRC1303(도 9 참조)을 사용하여 제조된다(문헌참조: Hillemann et al., 1991).
8.1.1. 플라스미드 pVRC1303의 작제
하기의 벡터를 사용하여 도 9에 기재된 4개의 주요 클로닝 단계후 플라스미드 pVRC1303을 작제하였다:
- 이 콜리에서 작용성인 복제 오리진, 이 콜리에서 발현되는 앰피실린 내성 유전자 및 스트렙토마이세스에서 발현되는 티오스트렙톤 및 노시헵타이드에 대한 내성 유전자를 함유하는 벡터 pDH5(문헌참조: Hillemann et al., 1991);
- papM 유전자의 다운스트림에 위치한 프리스티나마이신 클러스터 유전자의 일부를 함유하는 2.5kb의 BsiWI-PstI 단편을 제조하기 위한 플라스미드 pVRC409(문헌참조: Blanc et al., 1994);
- papM 유전자의 업스트림에 위치한 프리스티나마이신 클러스터 유전자의 일부를 함유하는 3.3kb PvuII-PvuII 단편을 제조하기 위한 플라스미드 pVRC900(문헌참조: Blanc et al., 1994; Blanc et al., 1997);
- 중간 클로닝 단계 후, 이 콜리 및 스트렙토마이세스에서 발현되는 필수 가나마이신 내성 유전자를 함유하는 3.7kb EcoRI-EcoRI 단편을 제조하기 위한 플라스미드 pHP45Ω-Km(문헌참조: Fellay et al., 1987) 및 pIJ702(문헌참조: Hopwood et al., 1985)(가나마이신 내성 유전자를 함유하는 이러한 Ω-Km 카세트는 pVRC1303으로 클로닝되는 papM 유전자의 업스트립 및 다운스트림 영역 사이에 도입되고 결실된 papM 유전자를 대체한다(도 9)).
당해 클로닝을 위해 요구되는 모든 단계(플라스미드 DNA 분리, 제한 효소를 사용한 플라스미드 DNA 분해, 클레노우 효소로 처리함에 의한 5' 말단의 충전, 아가로스 겔 전기영동에 의한 효소 분해물의 이동 및 분석, 전기영동 이동후 DNA 단편의 제조, 연결 반응, 이 콜리의 형질전환, 재조합 클론의 선별 및 분석)는 문헌[참조: Sambrook et al(1989)에 기재된 표준 프로토콜에 따라 수행하였다.
8.1.2. 플라스미드 pVRC1303과의 상동성 재조합에 의한 papM 유전자가 붕괴된 에스 프리스티나에스피랄리스의 재조합 균주의 작제
재조합 균주는 플라스미드 pVRC1303으로 균주 SP213을 형질전환 시킨 후 분리하였다.
당해 균주의 원형질체의 제조 및 PEG를 사용하는 방법에 의한 이의 형질전환은 문헌[참조: Howood et al.(1985)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. pVRC1303 1㎍으로 5회 형질전환시킨 후, 원형질체를 R2YE 배지상에 도말하고(문헌참조: Hopwood et al., 1985) 10㎍/ml의 가나마이신을 함유하는 SNA 배지 3ml을 그 위에 분주하여 밤새 증식시킨 후 선별한다.
수행된 5개의 형질전환체 중에서 37개의 가나마이신 내성 클론을 분리하였다. 하기와 같은 재조합체를 수득할 수 있다:
- papM 영역의 업스트림 또는 다운스트림에 위치하는 염색체 및 플라스미드 영역 사이에(단순한 교차의 경우) 단순한 상동성 재조합에 이어서 플라스미드 pVRC1303의 염색체로의 통합;
- 또는 papM 유전자의 업스트림 또는 다운스트림에 위치하는 염색체 및 플라스미드 영역 사이에(도 10에 나타낸 이중 교차의 경우) 이중 상동성 재조합 반응에 이어서 염색체 papM 유전자와 가나마이신 내성 유전자를 함유하는 플라스미드 Ω-Km 카세트 사이의 교환.
이들 2개의 경우, Ω-Km 카세트를 재조합 균주의 염색체에 전달하고 염색체에 가나마이신에 대한 내성을 부여한다. 한편, 플라스미드 pVRC1303(도 9)에 존재하는 유전자가 재조합 균주의 염색체에 전달되어 염색체에 티오스트렙톤 및/또는 노시헵타이드에 대한 내성을 부여하는 것은 단지 단순한 교차의 경우이다[문헌참조: Hillemann et al., 1991]. 따라서, 2개의 교차 상황(단순하거나 이중 교차)은 노시헵타이드에 대한 내성 또는 민감성의 표현형을 분석함에 의해 구별될 수 있다.
이를 위해, pVRC1303을 사용한 5개의 형질전환으로부터 유래하고 상기된 바와 같이 10㎍/ml의 가나마이신에 대한 이들의 내성에 대해 선별된 재조합 클론을 10㎍/ml의 가나마이신을 함유하는 HT 배지상에서 패치 형태로 계대배양하고(문헌참조: Hopwood et al., 1985) 이어서 400㎍/ml의 노시헵타이드를 함유하는 HT 배지상에서 시험하였다. 표현형(KanaR, NosiS)을 나타내는 클론은 검색하고자 하는 이중 교차에 해당하기 때문에 이들만을 선별하였다. 이이서 이들 재조합 클론을 하기의 방식으로 정제하였다: 이들 클론의 포자 스톡을 10㎍/ml의 가나마이신을 함유하는 HT 배지상에서 도말하고 증식시킴에 이어서 희석시키고 동일한 배지상에서 다시 도말하여 분리된 콜로니를 수득한 후 문헌[참조: Hopwood et al.(1985)]의 방법에 따라 제조한다. 이들 콜로니는 선별된 클론의 순수한 서브클론을 구성한다. 따라서 5개의 상이한 클론으로부터 유래하는 2개의 서브클론을 분석하였다.
이들 서브클론의 염색체 구조를 입증하기 위해, 이의 게놈 DNA를, 문헌[참조: Hopwood et al(1985)]에 기재된 리소자임을 사용한 용해 기술 및 페놀/클로로포름을 사용한 추출 기술에 따라, 10㎍/ml의 가나마이신을 함유하는 액체 YEME 배지에서 이들을 배양한 후 추출한다. EcoRI 및 SphI로 분해된, 이들 다양한 클론의 총 DNA의 수회에 걸친 서던 블롯팅은 EcoRI로 선형화되고 (α-32P)dCTP 및 제조원[Amersham]으로부터 시판되는 표지 키트로 수득된 무작위 프라이밍에 의해 표지시킨 후 프로브로서 사용되는 플라스미드 pVRC1303과 하이브리드화하여 수행한다. 사용되는 기술은 문헌[참조: Sambrook et al. (1989)]에 기재되어 있다. 하이드리드화 결과는 명백하게 서브클론이, 벡터 pVRC1303과 도 10에 기재된 균주 SP213의 염색체간의 이중 교차에 의해 수득된 것임을 보여준다. 특히, 하이드리드화하는 EcoRI 단편의 크기가 6.8kb인 야생형 균주 SP213에는 존재하지 않는, 프로브와 하이브리드화하는 9.9kb EcoRI 단편이 이들 서브클론내에 존재한다는 것이 입증된다.
유전자형 SP213△papM::ΩkanaR을 갖는 클론중 하나를 SP216으로 명명하였다. 당해 클론은 이의 생성물을 분석하고 야생형 papM 유전자가 이전의 실시예에 기재된 바와 같이 papM이 돌연변이되거나 이중 돌연변이된 대립형질 유전자중 하나로 대체된 재조합 균주를 수득한다는 관점에서 계속적인 유전학적 작제를 위해 선별하였다.
8.2. 돌연변이 SP216에 의한 프리스티나마이신의 생산
본 실시예는 papM 유전자가 붕괴된 에스 프리스티나에스피랄리스 SP216의 돌연변이가 표준 발효 조건하에 주로 PINH2[4ξ-아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA]를 생산한다는 것을 결정하는 방법을 설명한다. PINH2의 구조는 도 2에 나타낸다.
돌연변이 SP216 및 또한 대조군 야생형 균주 SP213을 액체 생산 배지에서 배양하였다. 다음과 같이 발효시켰다: 상기 언급된 균주의 포자 현탁액 0.5ml을 멸균 조건하에 300ml 방지재 삼각 플라스크중의 접종 배지 40ml에 첨가한다. 접종 배지는 10g/l의 옥수수 침지액, 15g/l의 슈크로스, 10g/l의 (NH4)2SO4, 1g/l의 K2HPO4, 3g/l의 NaCl, 0.2g/l의 MgSO4.7H2O 및 1.25g/l의 CaCO 3로 이루어진다. pH는 탄산칼슘을 도입하기 전에 수산화나트륨을 사용하여 6.9로 조정한다. 삼각 플라스크를 325rpm의 속도로 회전식 진탕기상에서 27℃에서 44시간동안 진탕시킨다. 이전의 44시간 배양물 2.5ml을 무균적으로 300ml 들이 삼각 플라스크중의 생산 배지 30ml에 첨가한다. 생산 배지는 25g/l의 대두 가루, 7.5g/l의 전분, 22.5g/l의 글루코스, 3.5g/l의 사료 효모, 0.5g/l의 황산아연 및 6g/l의 탄산칼슘으로 구성된다. pH는 탄산칼슘을 도입하기 전에 염산을 사용하여 6.0으로 조정한다.
삼각 플라스크를 27℃에서 50시간동안 진탕시킨다. 발효를 종료하는 즉시, 과즙액 용적을 측정하고 34%의 아세토니트릴 및 66%의 0.1M KH2PO4 용액(진한 H3 PO4를 사용하여 pH 2.9로 조정)으로 이루어진 2배 용적의 이동상을 첨가하여 프리스티나마이신이 추출되도록 한다. 진탕시킨 후, 전체 혼합물을 여과한다. 프리스티나마이신은 상등액에 함유되어 있다. 이어서 150㎕의 원심분리 상등액을 뉴클레오실 5-C8? 칼럼(4.6 x 150mm)상으로 주입하고 40% 아세토니트릴 및 60% 0.1M 포스페이트 완충액(pH 2.9)으로 용출시키는 HPLC로 이들을 분석한다. 프리스티나마이신을 206nm에서 UV 흡광도로 검출하고 임의로 이들의 형광 방출(370nm 필터, 306nm에서 여기)로 검출한다. 프리스티나마이신의 생산은 하기의 표에 나타낸다.
균주 SP213 및 SP216의 PINH2 생산(mg/l) 수준
균주 PINH2
SP213(papM wt) < 0.1
SP216(△papM::ΩkanaR) 7
이들 결과는 생산 발효 조건하에서 돌연변이 SP216이 필수적으로 PINH2를 생산하는 반면 대조군 SP213은 주로 PIA를 포함하는 표준양의 PI를 생산한다.
실시예 9: 대립형질 49/66 papM 유전자 또는 대립형질 66 papM 유전자를 포함하는 에스 프리스티나에스피랄리스의 재조합 균주의 작제
본 실시예는 PI 계열, PIB(도 2)의 화합물을 선택적으로 생산하기 위한, papM 유전자가 돌연변이된 재조합 균주의 에스 프리스티나에스피랄리스의 능력을 설명한다. PIB는 천연적으로 야생형 papM 유전자를 갖는 균주에 의해 합성되지만 최대가 약 5%인 매우 낮은 수준이다. 따라서, 당해 균주는 대량으로 및 매우 특이적으로 생산되는 PIB를 수득하기 위한 경로를 제공한다.
9.1 papM 유전자가 돌연변이된 재조합 균주의 작제
돌연변이된 papM 유전자 49/66은 PI 및 PII의 혼합물을 생산하는 것으로 이전에 기술된 균주 에스 프리스티나에스피랄리스 SP92(문헌참조: Blanc et al., 1994) 및 화학적 돌연변이 유발 후 SP92로부터 유래하는 균주 SP213으로 도입하였다.
돌연변이된 papM 유전자 66은 SP92로부터 유래하는 균주 SP213으로 도입하였다.
papM 유전자의 돌연변이된 대립형질 유전자중 하나를 갖는 재조합 균주를 작제하기 위한 방법은 papM 유전자 대립형질 유전자(49/66 또는 66)의 돌연변이 유형 및 선택된 균주에 상관없이 동일하다. 이것은 야생형 papM 유전자가 붕괴되고 Ω-Km 카세트(실시예 8 참조)로 대체된 재조합 균주를, 당해 카세트를 papM의 돌연변이된 대립형질 유전자중 하나를 교환시키는 자살 플라스미드로 형질전환시키는 것으로 구성된다.
설명을 위해, 대립형질 유전자 49/66 돌연변이된 papM 유전자를 균주 SP216(균주 216의 생산은 실시예 8에 기재되어 있다)로 도입하는 방법이 하기에 상세하게 기재되어 있다. 당해 작제는 단지 이 콜리에서만 복제할 수 있고 스트렙트마이세스에서 발현되는 티오스트렙톤 또는 노시헵타이드에 대한 유전자를 갖는 자살 벡터 pDH5로부터 유래하는 플라스미드 pVRC1306(도 11 참조)을 사용하여 수행하였다[문헌참조: Hillemann et al., 1991].
실시예 9.2는 SP92 또는 SP213으로부터 유래하고 돌연변이된 papM 유전자 66 또는 돌연변이된 papM 유전자 49/66을 발현하는 여러 재조합 균주를 사용하여 수득된 프리스티나마이신의 생산 결과를 설명한다.
9.1.1. 플라스미드 pVRC1306의 작제
대립형질 49/66 papM 유전자를 갖는 플라스미드 pVRC1306은 papM 유전자가 결실된 플라스미드 pVRC1303으로부터 작제하였다. 당해 작제는 도 11에 기재된 바와 같이 3단계로 수행한다. 이들 클로닝을 위해 하기의 플라스미드를 사용하였다:
- 플라스미드 pBR322는 실시예 8.1.1에 기재된 pVRC1303의 8.9kb EcoRI 단편을 전달하고 특히, 가나마이신 내성 유전자를 갖는 W-Km 카세트로 papM 유전자가 결실된 중간 벡터로서 사용되는 이 콜리에 클로닝하기 위한 벡터이다. 클로닝은 pBR322의 EcoRI 부위에서 수행하였고 수득한 플라스미드는 pVRC1304로 명명하였다.
- 실시예 6에 기재된 플라스미드 pVRC721(도 6)을 사용하여 대립형질 49/66 유전자를 함유하는 1kb의 MluI/AgeI 삽입물을 제조하였다. 당해 삽입물을 이어서 pVRC1304의 4kb의 MIuI/AgeI 단편과 교환하였고 수득한 플라스미드를 pVRC1305로 명명하였다.
- 플라스미드 pVRC1303은 8.9kb EcoRI 단편을 대립형질 49/66 papM 유전자를 함유한 pVRC1305의 5.83kb의 EcoRI 단편으로 교환시킬 수 있다.
따라서, 최종 플라스미드 pVRC1306(도 11)은 대립형질 49/66 papM 유전자 및 또한 당해 유전자의 업스트림 및 다운스트림 일부를 포함하고 전체 어셈블리는 실시예 8.1.1.에 기재된 벡터 pDH5에 클로닝한다.
9.1.2. 플라스미드 pVRC1306과의 상동성 재조합에 의한, 대립형질 49/66 papM 유전자가 돌연변이된 에스 프리스티나에스피랄리스의 재조합 균주의 작제
실시예 8에 기재된 균주 SP216을 플라스미드 pVRC1306으로 형질전환시킨 후 재조합 균주를 분리하였다. 이를 위해, 2개의 단계가 필요하였다. 제1 단계는 표현형(KanaR, NosiR) 분석에 의해 papM 유전자의 업스트림에 위치한 염색체 및 플라스미드 영역 사이에 단순한 상동성 재조합으로부터 유래하는 균주를 선별하는 것으로 이루어진다(도 12). 제2 단계는 균주(KanaR,NosiR)를 사용하여 수득한 클론의 표현형(KanaS, NosiS)의 분석에 의해 제2 상동성 재조합 반응을 선별하는 것으로 이루어진다(도 13).
이들 2 단계는 하기에 기술된 바와 같이 수행한다.
이들 균주의 원형질체의 제조 및 PEG를 사용하는 방법에 의해 이의 형질전환체의 제조는 문헌[참조: Hopwood et al. (1985)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 10개의 독립적인 형질전환은 각각의 하나에 대해 1㎍의 pVRC1306을 사용하여 수행하였다. 원형질체를 R2YE 배지(문헌참조: Hopwood et al., 1985)상에 도말하고 400㎍/ml의 노시헵타이드를 함유하는 SNA 배지 3ml을 분주함에 의해 밤새 증식시킨 후 선별하였다.
수행된 10회의 형질전환 중, 노시헵타이드에 내성인 7개의 클론[문헌참조: Hillemann et al., 1991]을 분리하였다. 이들 재조합체는 papM 유전자의 업스트림에 위치한 염색체 및 플라스미드 영역 사이에 단순한 상동성 재조합(이것은 당해 클론에 가나마이신(형질전환된 균주로 인해) 및 티오스트렙톤(플라스미드의 재조합으로 인해) 둘다에 대한 이중 내성을 부여한다)에 이어서 플라스미드 pVRC1306이 염색체에 통합함으로써 비롯된다. 따라서 7개의 재조합 클론을 10㎍/ml의 가나마이신을 함유한 HT 배지 및 400㎍/ml의 노시헵타이드를 함유한 HT 배지에서 계대 배양하였다. 모든 클론은 예상된 표현형(KanaR, NosiR)을 나타낸다. 이들 클론을 하기의 방법에 따라 2회 정제하였다: 이들 클론의 포자 스톡을 문헌[참조: Hopwood et al. (1985)]의 방법에 따라 제조하고 400㎍/ml의 노시헵타이드를 함유하는 HT 배지상에서 다양하게 희석된 스톡을 도말한 후 분리된 콜로니를 수득한다. 이들 콜로니는 선택된 클론의 순수한 서브클론을 구성한다. 2개의 클론으로부터 유래하는 2개의 서브클론의 염색체 구조는 서던 블롯팅으로 분석하였다.
4㎍/ml의 노시헵타이드를 함유하는 YEME 액체 배지에서 배양시킨 후 게놈 DNA를 추출하였다. 문헌[참조: Hopwood et al. (985)]에 기재된 기술에 따라 리소자임으로 처리하고 페놀/클로로포름으로 추출함에 의해 DNA를 추출하였다. EcoRI 및 AseI 제한 효소들로 분해된 이들 다양한 서브클론의 전체 DNA을 사용하여 수회의 서던 블롯팅을 수행하였다. EcoRI로 분해된 pVRC1303으로부터 유래하는 8.9kb 단편은 (α-32P) dCTP 및 제조원[Amersham]에 의해 시판되는 표지 키트(무작위 프라임된 DNA 표지 키트)를 사용하여 수득된 무작위 프라이밍에 의해 표지시킨 후 프로브로서 사용하였다. 사용되는 기술은 문헌[Sambrook et al.(1989)]에 기재된 기술이다. 하이브리드화 결과(밴드는 6.83, 3.42. 3.125 및 2.06kb에 상응한다)는 명백하게 서브클론이 벡터 pVRC1306과 균주 SP216의 염색체 사이에서 단순한 교차에 수득됨을 보여주었다. 균주 SP216의 DNA는 4.42, 3.125 및 2.06 kb에 상응하는 밴드를 보여주지만 6.83kb에 상응하는 밴드를 나타내지 않는다.
이들 클론중 하나를 SP216::pVRC1306으로 명명하였다.
제2 단계는 균주 SP216::pVRC1306을 사용하여, papM 유전자의 다운스트림에 위치한 염색체와 플라스미드 영역사이에 제2 상동성 재조합 반응을 선별하는 것으로 이루어진다(도 13 참조). 본 단계는 Ω-Km 카세트로 결질된 papM 유전자를 대립형질 유전자 49/66 papM 유전자로 교환하는 재조합 클론의 선별을 유도한다. 재조합 클론의 예상된 표현형은 (KanaS, NosiS)이다.
클론 SP216::pVRC1306을 사용하여, 2회의 성장 주기를 325rpm의 회전 진탕기상에서 30℃에서 수행하여 제2 재조합 반응을 촉진시킨다. 제1 주기는 10ml의 YEME 배지(배양 조건: 30℃, 280rpm, 72시간)중에서 SP216::pVRC1306 포자 스톡 200㎕를 사용하여 수행하였고 제2 주기는 40ml의 YEME 배지(배양조건: 30℃, 280rpm, 72시간)중에서 제1 주기 현탁액 800㎕를 사용하여 수행하였다. 제2 배양물을 3500rpm에서 15분동안 원심분리하고 펠렛을 물 + 0.01% 트윈 600㎕중에 첨가하고 당해 현탁액을 HT 배지상에 도말하여 포자층을 수득하였다. 당해 액체 배양물로부터 유래하는 재조합 클론을 정제하기 위해, 포자를 수거하고 당해 포자의 희석된 현탁액을 HT 배지에 도말하여 분리된 콜로니를 수득하였다.
목적하는 표현형(KanaS, NosiS)을 갖는 클론을 선별하기 위해, 1000개의 분리된 콜로니를 계대배양하고 스크리닝하였다. 이들 콜로니를 항생제 부재의 HT 배지와 10㎍/ml의 가나마이신을 함유한 HT 배지상에서 자동적으로 계대배양하였다. 이러한 제1 단계를 통해 18개의 재조합 KanaS 클론을 선별할 수 있었다. 항생제 부재의 HT 배지로부터, 당해 18개의 클론을 손조작으로 집어내고 항생제 부재의 HT 배지, 10㎍/ml의 가나마이신을 함유한 HT 배지 및 400 ㎍/ml의 노시헵타이드를 함유한 HT 배지상에서 계대배양하였다. 표현형(KanaS, NosiS)을 갖는 3개의 재조합 클론을 잠재적으로 이중 교차로부터 유래하는 것으로서 선별하였다. 당해 클론을 정제하고 포자 스톡을 포자층으로부터 제조하였고 상기된 바와 같이 사용된 방법을 사용하여 게놈 분석을 수행하였다.
재조합 서브클론의 염색체 분석은 2단계로 수행한다: 제1 단계는 대립형질 49/66 papM 유전자가 존재하고 당해 영역의 업스트림 및 다운스트림의 염색체 영역이 변형되지 않았음을 입증하는 것으로 이루어진다. 제2 단계는 W-Km 카세트 및 플라스미드 pDH5에 상응하는 DNA 단편의 부재를 입증하는 것으로 이루어진다.
제1단계를 위해, 재조합 클론의 게놈 DNA 제제를 제조하고 전체 DNA 분석을 상기된 바와 같은 방법에 따른 서던 블롯팅으로 수행하였다. 전체 DNA를 EcoRI 및 AseI 제한 효소들로 분해하였다. 플라스미드 pVRC721은 MluI(대립형질 49/66 papM 유전자를 함유하는 1.7kb 삽입물)로 분해하였다. 당해 표지된 단편은 6.83kb의 밴드와 상응하는 단편과 하이브리드화하는 프로브로서 사용하였다.
추가로, 전체 DNA를 SalI로 분해하였다. pVRC409 및 pVRC803(균주 SP213의 papM 유전자의 업스트림 및 다운스트림 영역을 함유함, Blanc et al., 1994; Blanc et al., 1997)으로부터 유래하는 표지된 단편을 프로브로서 사용하였다. 이들 단편을 통해 하이드리드화후 7개의 밴드(2.45, 0.190, 2.150, 0.725, 1.55, 0.4 및 0.55kb)를 밝힐 수 있었다.
제2 단계는 Ω-Km 카세트 또는 플라스미드 pDH5에 상응하는 DNA 단편이 더이상 존재하지 않는 다는 것을 입증하는 것으로 이루어진다. 전체 DNA를 EcoRI 및 AseI로 분해하였다. pHP45 Ω-Km(문헌참조: Fellay et al., 1987) 및 또한 pDH5의 2.2kb HindIII 단편(Ω-Km 카세트)을 프로브로서 사용하였다.
3개의 재조합 클론은 대립형질 49/66 papM 유전자의 존재 및 가나마이신 내성 유전자의 부재 및 플라스미드 pDH5에 상응하는 단편의 부재를 확인시켜주는 염색체 프로필(도 13)을 나타낸다. 이들 요소는 대립형질 49/66 papM 유전자의 게놈 환경이 온전함을 암시한다. 클론을 선별하고 균주 SP217로서 명명하였다.
동일한 방식으로, 대립형질 49/66 돌연변이된 papM 유전자 또는 대립형질 66papM 유전자가 통합된 에스 프리스티나에스피랄리스의 기타 균주를 작제하였다. 이들은 하기와 같은 균주이다:
- 대립형질 49/66 돌연변이된 papM 유전자를 함유한 플라스미드 pVRC1306을 사용한 균주 SP 92의 형질전환으로부터 유래하는 SP101;
- pVRC1306과 동일하지만 대립형질 49/66 돌연변이된 papM 유전자가 대립형질 66 돌연변이된 papM 유전자로 대체된 플라스미드를 사용한 균주 SP216의 형질전환으로부터 유래하는 SP218.
9.2. 피. 프리스티나에스피랄리스 균주 SP213, SP217, SP218, SP100 및 SP101에 의한 프리스티나마이신의 생산
본 실시예는 다양한 돌연변이체에 의한 프리스티나마이신의 생산방법을 보여준다. 특히, 대조군 papM wt 균주(균주 SP213)과 비교하여 대립형질 49/66 돌연변이된 papM 돌연변이체(균주 SP217) 및 대립형질 66 papM 돌연변이체(균주 SP218)의 PIB의 생산이 증가하였음을 보여준다. 대립형질 49/66 돌연변이된 papM 유전자(균주 SP101)의 효과는 또한 대조군 papM wt 균주(균주 SP92)와 비교하였다.
프리스티나마이신을 생산하고 추출하고 분석하기 위한 기술은 실시예 8.2에 기재된 것과 동일하다.
대조군 균주(SP213 및 SP92)의 양과 비교하여 발현된 다양한 프리스티나마이신의 생산 수준은 하기의 표 9에 나타낸다.
다양한 에스 프리스티나에스피랄리스 균주에 대한 프리스티나마이신 PI의 생산(생산되는 PI 값은 mg/l로 표시된다)
균주 PIA PIB PINH2 기타 PI
SP213(papM wt) 474 39 0 25
SP217(papM 49/66) 0 162 57 19
SP218(papM 66) 19 271 14 32
층 PIA PIB
SP92(papM wt) 100 3
SP101(papM 66) 0 11
이들 결과는 본 발명에 따라 papM 폴리펩타이드 변이체를 발현하는 유전자는 에스 프리스티나에스피랄리스의 균주상에 PIB 생산을 위한 우수한 선택성을 부여함을 확증한다.
본 발명은 야생형 폴리펩타이드와 비교하여 기질 특이성을 갖고 효능이 개선된, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 세균의 PapM 폴리펩타이드의 신규 변이체에 관한 것이다. 또한 당해 변이체를 암호화하는 핵산, 당해 핵산이 도입된 미생물 및 스트렙토그라민의 B 성분을 생산하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
프리스티나마이신은 비르기니아마이신 및 미카마이신이 또한 속하는 스트렙토그라민 계열에 속하는 항생제이다. 스트렙토그라민은 화학적으로 매우 상이한 2개 유형의 분자가 배합되어 이루어진 소형의 동종 신개발 그룹의 항생제를 구성한다. 스트렙토그라민 A는 다중불포화 마크롤락톤이고 스트렙토그라민 B는 데프시펩타이드이다[문헌참조: Cocito C.G. (1979) Microbiol. Rev., 43: 145-198, Cocito C.G. (1983) In Antibiotics 6: (Ed. F.E. Hahn), 296-332]. 프리스티나마이신의 경우에, A 및 B 화합물은 각각 프리스티나마이신 II(PII) 및 프리스티나마이신 I(PI)으로 호칭되고 이의 구조는 도 1 및 2에 나타낸다.
A 및 B 화합물은 특히 그람 양성 세균(예를 들어, 스타필로코씨(Staphylococci) 및 엔테로코씨(Enterococci))에 작용하는 공동상승작용 및 살균 항세균 활성을 갖는다. 당해 화합물은 표적 세포의 리보솜의 50S 서브유니트에 부착하여 단백질 합성을 억제시키는 작용을 한다[문헌참조: Cocito 1979; Di Giambattista M., Chinali G and Cocito C.G. (1989) J. Antim. Chemother., 24:485-507].
스트렙토그라민은 필수적으로 액티노마이세테스(Actinomycetes)에 의해 생산된다. 보다 특히, 프리스티나마이신은 PI 30% 및 PII 70%로 이루어진 천연 혼합물 형태로 사상균인 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis)에 의해 생산된다[문헌참조: Blanc et al.,(1995), J. Bacteriol. 177(18):5206-14]. 각각의 분자 유형에 대해, 천연 대사물에서 일반적으로 관찰되는 바와 같이 다양한 이소폼(isoform)이 동시 생산된다.
프리스티나마이신 PI(프리스티나마이신의 B 성분)의 경우, 생산되는 주요 형태는 아미드 결합 및 에스테르 결합(도 2)에 의해 서로 연결된 하기의 7개 잔기로 이루어진 PIA이다: 3-하이드록시피콜린산, L-트레오닌, D-아미노부티르산, L-프롤린, 4-디메틸아미노-L-페닐알라닌, 4-옥소-L-피페콜산 및 L-페닐글리신. 몇몇 천연 이소폼이 또한 PIA와 함께 동시 생산되고 주로 하기의 잔기에 대한 구조적 변형체에 해당한다: D-아미노부티르산, 4-디메틸아미노-L-페닐알라닌(L-DMPAPA) 및 4-옥소-L-피페콜산(문헌참조: Thibaut et al., (1997) J. Bacteriol. 170(3):697-704). 이들 소수 형태는 에스. 프리스티나에스피랄리스의 균주에 따라 전체 몇 % 정도에 불과한 다양한 퍼센테이지로 합성되고 PIA는 생산되는 PI의 90% 내지 95%를 차지한다. 특히, 에스. 프리스티나에스피랄리스의 다양한 균주는 마크로사이클의 4위치에 4-메틸아미노-L-페닐알라닌(L-MMPAPA)가 존재하여(도 2) PIA와는 상이한 약 5%의 PIB를 합성하는 것으로 밝혀졌다. 소수의 경우, PIB는 특히, 이의 다양한 약리학적 성질때문에 유리한 분자인 것으로 밝혀졌다(WO 96/05219).
PIA의 또 다른 유사체인 PINH2는 4위치에 4-아미노-L-페닐알라닌이 존재하여 상이하고(도 2) 반합성의 신종 제품을 개발하는데 유익하다. 지금까지는 단지 4-아미노-L-페닐알라닌을 에스 프리스티나에스피랄리스 배양 배지에 첨가하는 방법으로 PINH2를 수득할 수 있다(WO 96/01901).
스트렙토그라민의 생산을 개선시키기 위한 다양한 방법들이 고려되고 있고 첫번째 방법은 생산되는 B 성분(프리스티나마이신 I)과 비교하여 생산되는 A 성분(프리스티나마이신 II)의 총 비율을 변화시키는 것이고 두번째 방법은 A 또는 B 성분 각각에 존재하는 다양한 이소폼의 비율을 변화시키는 것이다. 그러나, 지금까지 어떠한 방법도 프리스티나마이신 PIB를 만족할만하게 생산할 수 없었고 프리스티나마이신중에 B 성분(프리스티나마이신 I) 형태는 소수로서 잔류한다.
문헌[WO 93/20182]에 기재된 첫번째 방법은 스트렙토그라민의 A 성분 또는 B 성분을 특이적으로 생산할 수 있는 미생물을 선별하는 것으로 이루어진다. 당해 미생물은 스트렙토그라민-생산 미생물을 돌연변이 유발시키는 임의의 제1 단계 및 스트렙토그라민의 A 또는 B 성분중 하나 또는 다른 하나를 선별적으로 생산하는 미생물을 동정하는 제2 단계를 포함하는 통상적인 선별 기술에 의해 수득된다. 당해 기술은 특히, 프리스티나마이신 PII(A 성분) 또는 프리스티나마이신 PI(B 성분)을 선택적으로 생산하는 에스 프리스티나에스피랄리스의 균주를 수득할 수 있도록 한다. 그러나, 당해 문헌은 항상 주요 형태로 잔류하는 PIA 보다 PIB를 선호하도록 이소폼 비율이 변형되어 선택적으로 프리스티나마이신 PI를 생산하는 임의의 균주를 교시하고 있지 않다.
문헌[참조: WO 94/08014]은 스트렙토그라민의 A 성분의 생합성 경로 및 B 성분의 생합성 경로에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 분리 및 동정을 기재하고 있다. 또한 당해 문헌은 A 또는 B 성분의 생산 수준을 증가시킬 목적으로 당해 유전자의 발현 및 A 또는 B 성분의 생합성 경로의 여러 단계가 차단되어 당해 생합성 경로중 특정 대사물만을 축적하게 되는 돌연변이체를 작제하기 위한 당해 유전자의 용도를 기재하고 있다. 보다 특히, 문헌[참조: WO 94/08014]은 에스 프리스티나에스피랄리스 게놈 DNA 라이브러리로부터 분리된 12개의 유전자, snaA, snaB, snaC, snaD, papA, papM, samS, snbA, snbC, snbD, snbE 및 snbR의 분리 및 특성을 기재하고 있고 A 성분의 생합성 경로에는 snaA, snaB, snaC 및 snaD 유전자가 관여하고 B 성분의 생합성 경로에서는 papA, papM, samS, snbA, snbC, snbD, snbE 및 snbR 유전자가 관여함을 입증하였다.
따라서, 에스 프리스티나에스피랄리스의 균주에서 snaA 유전자의 불활성화는 PIIA(프리스티나마이신의 A 성분의 이소폼중 하나)를 더이상 생산하지 않지만 snaA 유전자의 야생형을 보유하고 있는 대조군 균주에 의해 생산되는 PIIA 및 PIIB의 총합과 동일한 양으로 PIIB(프리스티나마이신의 A 성분의 이소폼중 또 다른 하나)만을 생산하는 균주를 수득할 수 있도록 한다. PI(프리스티나마이신의 B 성분의 모든 이소폼)의 생산은 snaA 유전자가 불활성화된 균주 및 대조군 균주에서 동일하다.
samS 유전자의 불활성화는 균주가 35% 이하의 PIA(프리스티나마이신의 B 성분의 이소폼중 하나) 및 대조군 균주 보다 약 10배 이상의 PIB(프리스티나마이신의 B 성분의 또 다른 이소폼)를 생산하도록 한다. PIB의 수준은 생산되는 전체 I형 프리스티나마이신(PI)의 20%에 달한다. 당해 균주에서 PIB의 생산은 개선되었지만 PIB의 비율은 크지 않고 PIA의 비율보다 여전히 낮다.
papA 유전자 또는 snbA 유전자의 불활성화는 균주가 PII 유형(A 성분)의 프리스티나마이신만을 생산하고 PI 유형(B 성분)의 프리스티나마이신을 더이상 생산하지 않도록 한다.
snaD 유전자의 불활성화는 역으로 균주가 PI 유형의 프리스티나마이신만을 생산하고 PII 유형의 프리스티나마이신을 더이상 생산하지 않도록 할 수 있다.
문헌[참조: WO 96/01901]은 스트렙토그라민의 B 성분과 관련되어 있지만 스트렙토그라민 생산 미생물에 의해 천연적으로 생산되는 B 성분과는 상이한 신규 화합물을 제조하기위한 신규 방법을 기재하고 있다. 당해 방법에 따르면, 스트렙토그라민의 B 화합물의 전구체의 생합성을 변화시키기 위해 돌연변이된 미생물 균주를 사용한다. 돌연변이 균주로서, 특히, papA 또는 pipA 또는 hpaA 유전자가 붕괴되어 B 성분 전구체에 대한 생합성 경로가 변화된 에스 프리스티나에스피랄리스 균주를 사용할 수 있다. 당해 균주는 프리스티나마이신 PI(B 성분)을 더이상 생산하지 않고 프리스티나마이신 PII(A 성분)을 생산한다. 돌연변이 균주는 합성이 변화된 전구체와는 상이한 본래의 전구체가 보충된 배지에서 배양한다. 천연 전구체 대신 데프시펩타이드로의 본래의 전구체의 도입은 스트렙토그라민의 B 성분과 관련되어 있고 유리한 치료학적 성질을 나타내는 신규 화합물의 생산을 유도한다.
상기 문헌[참조: WO 96/01901]에 언급된 방법으로 B 성분중에서 천연적으로 소수로 생산되는 이소폼을 주로 생산하는 미생물 균주를 수득할 수 있다. 그러나, 미생물 균주에서 천연 상태에서는 존재하지 않는 특정 전구체를 배양 배지에 보충할 필요가 있다.
프리스티나마이신에 대한 생합성 경로의 기본적인 생화학적 및 유전학적 연구로 PI에 대해 관찰되는 많은 이소폼의 기원을 밝힐 수 있다. 보다 특히, PIB가 SnbDE 펩타이드 신테타제에 의해, PIA의 마크로사이클로 도입되는 L-DMPAPA의 생합성 중간체인 L-MMPAPA이 마크로사이클로 도입되어 발생하는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Blanc et al., Mol. Microbiol(1997), 23(2):191-202; Thibaut et al., J. Bacteriol. (1997), 179(3): 697-704]. 코리스메이트 기원의 L-MMPAPA 및 L-DMPAPA의 생합성에 관여하는 4개의 유전자, papA, papB, papC 및 papM가 동정되었다[문헌참조: Blanc et al., 1997].
papM 유전자는 도 3에 기재된 반응식에 따라 L-MMPAPA를 통해 4-아미노-L-페닐알라닌으로부터 L-DMPAPA를 생산할 수 있는 2개의 연속 메틸화 반응을 촉매하는 단백질을 암호화한다. 당해 2개의 메틸화 반응은 역학적 계수(반응 비율 및 친화성 상수)가 매우 유사한 PapM에 의해 촉매된다[문헌참조: Blanc et al., 1997]. 에스 프리스티나에스피랄리스의 papM 유전자 및 상응하는 폴리펩타이드(4-아미노-L-페닐알라닌(페닐 N)-메틸트랜스퍼라제)의 서열은 서열 1로 제공된다.
본 발명은 papM 유전자 생성물의 효소 활성을 변화시킴으로써 스트렙토그라민의 B 성분의 특정 소수 이소폼의 생산을 개선시킬 수 있다는 발견을 기초로 한다.
보다 특히, 본 발명은 야생형 폴리펩타이드와 비교하여 기질 특이성을 갖고/갖거나 효능이 개선된 PapM 폴리펩타이드의 신규 변이체의 동정을 기초로 한다. 실질적으로 본 발명자는 papM 유전자에 대해 돌연변이를 유발하여 상응하는 단백질이 제1 메틸화 반응에 대한 충분한 활성을 보유함과 동시에 더이상 제2 메틸화 반응을 촉매할 수 없거나 적어도 제2 메틸화 반응이 제1 반응에 비해 크게 억제될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
에스 프리스티나에스피랄리스의 균주와 같은 스트렙토그라민 생산 미생물내 당해 효소의 존재는 L-MMPAPA을 축적시킴에 따라 주로 PIB의 생산을 유도한다(도 3). 반대로, 또한 papM 유전자에 돌연변이를 유발하여 이에 상응하는 단백질이 제1 메틸화 반응의 효율보다 큰 효율로 제2 메틸화 반응을 촉매할 수 있다. 에스 프리스나에스피랄리스의 균주에서 당해 효소의 존재는 L-DMPAPA를 축적시킴에 따라 PIA의 생산을 증가시켜야만 한다.
본 발명은 또한 PapM 폴리펩타이드의 불활성 형태를 생산하는 미생물 또는 더이상 papM 유전자를 발현하지 않는 돌연변이체가, 야생형 미생물이 천연적으로 합성할 수 있지만 너무 소량이어서 분리될 수 없는 스트렙토그라민의 B 성분을 축적시킨다는 발견을 기초로 한다. 따라서, 본 발명은, 에스 프리스티나에스피랄리스의 많은 야생형 균주가 합성할 수 없고 4-아미노-L-페닐알라닌이 마크로사이클의 4 위치로 도입된 것에 상응하는 PI 계열의 소위 PINH2인 화합물을 주로 생산하는 에스 프리스티나에스피랄리스의 재조합 균주의 작제에 관한 것이다(도 2).
본 발명의 제1 과제는 동일한 기질에 대한 야생형 PapM 폴리펩타이드의 메틸화 효율과 비교하여 상이한 메틸화 기질에 대해 메틸화 효율을 나타내는(증가되거나 감소된) PapM 폴리펩타이드의 변이체에 관한 것이다.
PapM 폴리펩타이드의 변이체는 야생형 PapM 폴리펩타이드와 상이한, 메틸화 기질 1에 대해 비율 Kcat1/Km1에 의해 정의되는 메틸화 1의 효율 및/또는 메틸화 기질 2에 대해서는 비율 Kcat2/Km2에 의해 정의되는 메틸화 2의 효율을 나타낸다. 바람직하게, 본 발명에 따른 PapM 변이체는 서열 1의 PapM 폴리펩타이드의 메틸화 효율과는 상이한, 비율 KcatPAPA/KmPAPA에 의해 정의되는 L-PAPA의 L-MMPAPA로의 메틸화 1의 효율 및/또는 비율 KcatMMPAPA/KmMMPAPA에 의해 정의되는 L-MMPAPA의 L-DMPAPA로의 메틸화 2의 효율을 나타낸다.
제1 양태에 따라, 본 발명에 따른 PapM 변이체는 L-MMPAPA의 L-DMPAPA로의 메틸화 2의 효율 보다 2배 이상 크고, 바람직하게는 5배 이상 크고 보다 바람직하게는 10배 이상 큰 L-PAPA의 L-MMPAPA로의 메틸화 1의 효율을 나타낸다. 당해 변이체는 보다 특히, PIB를 생산하는데 유리하다. 바람직하게, 본 발명에 다른 변이체는 상동성 폴리펩타이드내 Gly 249 잔기(a), Thr 192 잔기(b) 및 (a) 또는 (b)와 동등한 잔기로부터 선택된 하나 이상의 잔기가 대체됨에 의해 야생형 PapM 폴리펩타이드의 서열로부터 유도된다.
본 발명의 목적을 위해, 표현 "상동성 PapM 폴리펩타이드"는 스트렙토마이세스 속의 세균, 예를 들어, 스트렙토마이세스 올리바세우스(Streptomyces olivaceus), 스트렙토마이세스 오스트레오그리세우스(Streptomyces ostreogriseus), 스트렙토마이세스 미타카엔시스(Streptomyces mitakaensis), 스트렙토마이세스 로이덴시스(Streptomyces loidensis), 스트렙토마이세스 그라미노파시엔스(Streptomyces graminofaciens) 또는 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스(Streptomyces diastaticus)로부터 기원하거나 유도된 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입으로 아미노산 서열 1과 상이하고 생물학적 기능이 PapM 폴리펩타이드의 기능과 유사한 미생물로부터 기원하거나 유도된 폴리펩타이드를 지칭한다. 당해 상동성 폴리펩타이드 서열은 서열 1과 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상 및 보다 바람직하게는 서열 1과 80% 이상 유사할 수 있다.
추가의 양태에 따라, 본 발명에 따라 변이체는 폴리펩타이드 서열 1로부터 유도되고 249번 위치에서 글라이신이 세린으로 적어도 1회 치환되었음을 나타낸다.
또 다른 양태에 따라, 본 발명에 따른 변이체는 서열 1의 폴리펩타이드 서열로부터 유도되고 192번 위치에서 트레오닌이 이소류신으로 적어도 1회 치환되었음을 나타낸다.
최종적으로 또 다른 양태에 따라, 본 발명에 따른 변이체는 서열 1로부터 유도되고 249번 위치에서 글라이신이 세린으로 적어도 1회 치환되고 192번 위치에서 트레오닌이 이소류신으로 1회 치환되었음을 나타낸다.
또 다른 양태에 따라, 본 발명에 따른 PapM 변이체는 L-PAPA의 L-MMPAPA로의 메틸화 1의 효율보다 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상 및 보다 바람직하게는 10 배 이상 큰, L-MMPAPA의 L-DMPAPA로의 메틸화 2의 효율을 나타낸다. 당해 변이체는 보다 특히 PIA의 생산을 증가시키는데 유용하다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드의 변이체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 서열 1로 제공된 뉴클레오타이드 서열로부터 돌연변이에 의해 유도된 핵산 또는 유전학적 코드의 축퇴성으로 인해 유도된 서열이 바람직하다. 유리하게, 본 발명에 따른 핵산은 193 내지 196 위치에 존재하는 NPPY 모티프의 업스트립에서 하나 이상의 미스센스 돌연변이를 포함하고 바람직하게, 당해 미스센스 돌연변이는 비보존성 아미노산 변화, 예를 들어, 658 위치에서 시토신의 티민으로의 치환(C658T)(돌연변이된 대립형질 유전자 66)을 유도한다. 또 다른 유리한 양태는 적어도 하나의 828 위치에서 구아닌이 아데닌(G828A)(돌연변이된 대립형질 유전자 49)으로 치환된 것을 포함하는 핵산에 관한 것이다. 최종적으로, 보다 특히 또 다른 유리한 형태는 적어도 하나의 828 위치의 구아닌이 아데닌(G828A)으로 치환되고 적어도 하나의 658 위치의 시토신이 티민(C658T)(돌연변이된 대립형질 유전자 49/66)으로 치환된 것을 포함하는 핵산이다.
본 발명의 과제는 또한 스트렙토그라민 생산 균주에서 B 성분 이소폼의 비율을 변화시키 위한 상기된 바와 같은 핵산의 용도이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 스트렙토그라민 생산 균주로서 스트렙토마이세스 올리바세우스, 스트렙토마이세스 오스트레오그리세우스, 스트렙토마이세스 미타카엔시스, 스트렙토마이세스 로이덴시스, 스트렙토마이세스 그라미노파시엔스, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스등의 균주들이 언급될 수 있다. MMPAPA의 DMPAPA로의 메틸화 2의 효율 보다 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상 및 보다 바람직하게는 10배 이상 큰 PAPA의 MMPAPA로의 메틸화 1의 효율을 나타내는 PapM 변이체를 암호화하는 핵산은 보다 특히 이들이 에스 프리스티나에스피랄리스의 균주에서 발현되는 경우 PIB의 생산을 위해 사용된다. PAPA의 MMPAPA로의 메틸화 1의 효율 보다 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상 및 보다 바람직하게는 10배 이상 큰 MMPAPA의 DMPAPA로의 메틸화 2의 효율을 나타내는 PapM 변이체를 암호화하는 핵산은 보다 특히, 이들이 에스 프리스티나에스피랄리스의 균주에서 발현되는 경우 PIA 생산을 위해 사용된다.
본 발명의 과제는 또한 상기 언급된 바와 같은 핵산을 포함하는 임의의 재조합 DNA이다.
본 발명은 또한 상기 언급된 바와 같은 핵산 또는 재조합 DNA를 포함하는, 자발적으로 복제하고/하거나 통합하는 임의의 발현 벡터, 예를 들어, 특히, 도 11에 나타낸 벡터 pVRC1306 전부 또는 일부를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 과제는 또한 상기 언급된 바와 같은 핵산 및/또는 재조합 DNA 및/또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 본 발명에 따른 숙주 세포는 진핵 세포 및 원핵 세포 둘다일 수 있다. 진핵 세포중에서 적합한 것은 동물 세포, 효모 또는 진균류가 언급될 수 있다. 특히, 효모와 관련하여, 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 슈와니오마이세스(Schwanniomyces) 또는 한세눌라(Hansenula) 속이 언급될 수 있다. 동물 세포와 관련하여 COS, CHO 및 C127 세포, 제노푸스 에그등이 언급될 수 있다. 진균류중에서는 보다 특히, 마이크로모노스포라(Micromonospora), 아스퍼질러스(Aspergillus) 종 또는 트리코더마(Trichoderma) 종이 언급될 수 있다. 원핵 세포로서, 하기의 세균이 사용될 수 있다: 액티노마이세테스 및 특히 스트렙토마이세스, 이 콜리(실시예 7), 바실러스. 우선적으로, 본 발명의 재조합 세포는 스트렙토그라민 생산 세포 및 특히, 스트렙토마이세스 올리바세우스, 스트렙토마이세스 오스트레오그리세우스, 스트렙토마이세스 미타카엔시스, 스트렙토마이세스 로이덴시스, 스트렙토마이세스 그라미노파시엔스, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스등로부터 선택된다. 본 발명의 재조합 세포는 외래 뉴클레오타이드 서열을 세포로 도입하기 위한 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 특히, 이것은 형질전환, 전기천공, 접합, 원형질체 융합 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 기술일 수 있다.
본 발명의 과제는 또한 본 발명에 따른 PapM 폴리펩타이드의 변이체를 제조하는 방법이고, 여기서, 상기 정의된 숙주 세포가 배양되고 생산된 폴리펩타이드가 회수된다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같고 생전환 반응에서 본 발명에 따른 PapM 폴리펩타이드의 변이체를 발현하는 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 특히, 이들 세포는 방향족 아민을 모노메틸화된 아민으로 전환시킬 수 있고 특히 4-아미노-L-페닐알라닌을 4-메틸아미노-L-페닐알라닌으로 전환시킬 수 있다. 이들 생전환은 전체 세포 또는 당해 세포의 비세포성 추출물을 사용하여 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 과제는,
- papM 유전자를 스트렙토그라민 생산 균주 또는 잠재적인 스트렙토그라민 생산 균주에서 불활성화시키고 상기 정의된 바와 같은 papM 변이체를 암호화하는 다수의 핵산 복제물을 도입하는 단계,
- 당해 균주를 스트렙토그라민을 생산하기 위한 조건하에서 배양하는 단계 및
- 생산된 스트렙토그라민의 B 성분을 회수하는 단계를 포함하는, 스트렙토그라민의 B 성분을 생산하는 방법에 관한 것이다.
우선적으로, 스트렙토그라민 생산 균주는 에스 프리스티나에스피랄리스로부터 유래된 프리스티나마이신 생산 균주이고 보다 바람직하게는 균주 에스 프리스티나에스피랄리스 SP92 또는 에스 프리스티나에스피랄리스 ATCC25486으로부터 유래된다. 또한, 하기의 균주로 부터 선택될 수 있다: 스트렙토마이세스 올리바세우스 ATCC12019, 스트렙토마이세스 오스트레오그리세우스 ATCC27455, 스트렙토마이세스 미타카엔시스 ATCC15297, 스트렙토마이세스 로이덴시스 ATCC11415, 스트렙토마이세스 그라미노파시엔스 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스.
유리하게, 스트렙토그라민 생산 균주는 소량 또는 검출 불가능한 양의 스트렙토그라민 A 성분을 생산하는 균주이다. 스트렙토그라민의 A 성분을 생산하지 않는 균주로서 문헌[참조: WO 93/20182]에 기재된 균주 에스 오스테오그리세우스 Pr4Q031/CBS 142.93이 언급될 수 있다. A 성분을 생산하지 않는 에스 프리스티나에스피랄리스 균주의 예로서, 화학적 돌연변이 후 SP92로부터 유래된 균주 SP213(문헌참조: Blanc et al., 1994) 또는 문헌[참조: WO 93/20182]에 기재된 균주 에스 프리스티나에스피랄리스 Pr4R31(CBS182.92로서 기탁됨)이 언급될 수 있고 균주 SP213 및 Pr4R31은 특이적으로 프리스티나마이신 P1을 생산하고 검출 가능한 양으로 프리스티나마이신 PII(A 성분)을 생산하지 않는다.
바람직한 변이체에 따라, 본 발명에 따른 PapM 변이체를 암호화하는 핵산의 도입은 야생형의 papM 유전자를 대체하여 수행된다. 도입된 핵산에 의해 발현되는 변이체에 따라, 스트렙토그라민의 다양한 B 성분의 생산을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 야생형 폴리펩타이드와 비교하여 KcatPAPA.KmMMPAPA/KcatMMPAPA.Km PAPA 비율이 증가된 변이체를 발현하는 에스 프리스티나에스피랄리스의 균주는 PIB를 주로 생산한다. 역으로, 당해 비율의 감소를 나타내는 변이체는 PIA의 생산을 증가시킬 수 있어야만 한다. 우선적으로, PIB를 생산하기 위해, 에스 프리스티나에스피랄리스의 균주는 적어도 돌연변이(G828A) 또는 돌연변이(C658T) 또는 이중 돌연변이(C828A)(C658T)를 나타내는 papM 유전자를 포함한다.
본 발명은 또한 에스 프리스티나에스피랄리스의 papM 유전자의 야생형이 불활성화되고/되거나 PapM 폴리펩타이드의 불활성 형태를 암호화하는 핵산으로 대체된 균주를 사용하는 PINH2 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 과제는 또한 본 발명에 따른 PapM 폴리펩타이드의 변이체를 암호화하는 핵산을 포함하는 에스 프리스티나스피랄리스의 돌연변이 균주이다. 당해 균주는 특히, 야생형 papM 유전자가 파괴되고 papM의 돌연변이 대립형질 유전자중 하나와 카세트의 교환을 가능하게 하는 자살 플라스미드를 사용하여 카세트 Ω-Km(실시예 8 참조)로 대체된 재조합 균주의 형질전환에 의해 수득될 수 있다. 설명을 위해, 본 발명은 돌연변이 C658T(돌연변이 대립형질 유전자 66)를 갖는 핵산을 포함하는 균주 에스 프리스티나에스피랄리스 SP217 또는 이중 돌연변이 C658T 및 G828A(돌연변이 대립형질 유전자 49/66)을 포함하는 균주 에스 프리스티나에스피랄리스 SP218을 기재하고 있다. 이들 돌연변이는 카세트 Ω-Km으로 대체되어 미리 papM 유전자가 파괴된 균주 에스 프리스티나에스피랄리스 SP213에 도입된다. 동일한 방법으로 돌연변이 대립형질 유전자 66을 균주 SP92에 도입하여 균주 에스 프리스티나에스피랄리스 SP101을 작제할 수 있다. 본 발명에 따른 papM 변이체를 합성하는 균주 에스 프리스티나에스피랄리스 SP101, SP218 및 SP217은 주로 PIB를 생산한다.
본 발명의 과제는 또한 PINH2를 생산하기 위한 균주 에스 프리스티나에스피랄리스의 용도이다. 당해 균주는 특히 papM 유전자가 불활성화된 후 주로 PINH2를 생산하는 균주 SP213으로부터 유래하는 균주 SP216에 의해 설명된다.
본 발명은 또한 PapM 폴리펩타이드 또는 상동성 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 변이체를 선별하는 방법에 관한 것이고 이에 따라,
ㆍ화학적 돌연변이 유발 단계는 플라스미드로 클로닝된 papM 유전자 또는 상동성 유전자에 대해 수행되고,
ㆍ돌연변이 유발이 단계 (a)에서 수행된 플라스미드로 수용 균주를 형질전환시킴에 의해 라이브러리를 제조하고,
ㆍr이 기질 1/(기질 1 + 기질 2)인 초기 비율 조건하에 단위 시간당 형질전환되는 메틸화 기질의 양의 비율 "r"이 야생형 폴리펩타이드와 비교하여 20% 이상 증가되고 바람직하게는 0.6 이상이 되도록 하는 메틸화 활성을 나타내는 클론을 선별한다.
이와 관련하여, 본 발명은 시험관내에서 플라스미드로 클로닝된 papM 유전자에 대해 하이드록실아민을 사용한 화학적 돌연변이 유발을 수행하여 특정 돌연변이체의 라이브러리를 구축하고 소형화된 효소적 스크리닝을 사용하여 당해 라이브러리로부터 돌연변이된 papM 유전자(이에 상응하는 단백질은 상기된 바와 같은 촉매 성질을 갖는다)를 발현하고 상기 정의된 바와 같은 비율 "r"이 0.6 이상인 에스케리치아 콜리 클론을 선별하는 방법을 보여준다.
본 발명은 비제한적인 설명으로 간주되어야만 하는 하기의 실시예를 사용하여 설명된다.
<110> AVENTIS PHARMA S.A. <120> Novel variants of the papM polypeptide of bacteria of genus Streptomyces <130> 5-2000-018475-9 <150> FR0208057 <151> 2002-06-28 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1052 <212> DNA <213> Streptomyces pristinaespiralis <220> <221> CDS <222> (84)..(962) <400> 1 ctcgaggacg agtggatcgc ctccggcggc gcccccgtcc ccacgcccgt gcacgcgtcc 60 gcgtccgcgc ggggggccgt gtc gtg acc gcc gcc gca ccc acc ctc gcc cag 113 Val Thr Ala Ala Ala Pro Thr Leu Ala Gln 1 5 10 gcg ctg gac gag gcc acc ggg cag ctg acc ggc gcc ggg atc acc gcc 161 Ala Leu Asp Glu Ala Thr Gly Gln Leu Thr Gly Ala Gly Ile Thr Ala 15 20 25 gac gcc gcc cgg gcc gac acc cgg ctg ctg gcc gcc cac gcc tgc cag 209 Asp Ala Ala Arg Ala Asp Thr Arg Leu Leu Ala Ala His Ala Cys Gln 30 35 40 gtc gcc ccg ggg gac ctc gac acc tgc ctg gcc ggc ccg gtg ccg ccc 257 Val Ala Pro Gly Asp Leu Asp Thr Cys Leu Ala Gly Pro Val Pro Pro 45 50 55 cgg ttc tgg cac tac gtc cgg cgc cgt ctg acc cgc gaa ccc gcc gaa 305 Arg Phe Trp His Tyr Val Arg Arg Arg Leu Thr Arg Glu Pro Ala Glu 60 65 70 cgc atc gtc ggc cac gcc tac ttc atg ggc cac cgc ttc gac ctg gcc 353 Arg Ile Val Gly His Ala Tyr Phe Met Gly His Arg Phe Asp Leu Ala 75 80 85 90 ccc ggc gtc ttc gtc ccc aaa ccc gag acc gag gag atc acc cgg gac 401 Pro Gly Val Phe Val Pro Lys Pro Glu Thr Glu Glu Ile Thr Arg Asp 95 100 105 gcc atc gcc cgc ctg gag gcc ctc gtc cgc cgc ggc acc acc gca ccc 449 Ala Ile Ala Arg Leu Glu Ala Leu Val Arg Arg Gly Thr Thr Ala Pro 110 115 120 ctg gtc gtc gac ctg tgc gcc gga ccg ggc acc atg gcc gtc acc ctg 497 Leu Val Val Asp Leu Cys Ala Gly Pro Gly Thr Met Ala Val Thr Leu 125 130 135 gcc cgc cac gta ccg gcc gcc cgc gtc ctg ggc atc gaa ctc tcc cag 545 Ala Arg His Val Pro Ala Ala Arg Val Leu Gly Ile Glu Leu Ser Gln 140 145 150 gcc gcc gcc cgc gcc gcc cgg cgc aac gcc cgc ggc acc ggc gcc cgc 593 Ala Ala Ala Arg Ala Ala Arg Arg Asn Ala Arg Gly Thr Gly Ala Arg 155 160 165 170 atc gtg cag ggc gac gcc cgc gac gcc ttc ccc gaa ctg agc ggc acc 641 Ile Val Gln Gly Asp Ala Arg Asp Ala Phe Pro Glu Leu Ser Gly Thr 175 180 185 gtc gac ctc gtc gtc acc aac ccg ccc tac atc ccc atc gga ctg cgc 689 Val Asp Leu Val Val Thr Asn Pro Pro Tyr Ile Pro Ile Gly Leu Arg 190 195 200 acc tcc gca ccc gaa gtg ctc gag cac gac ccg ccg ctg gcc ctg tgg 737 Thr Ser Ala Pro Glu Val Leu Glu His Asp Pro Pro Leu Ala Leu Trp 205 210 215 gcc ggg gag gag ggc ctc ggc atg atc cgc gcc atg gaa cgc acc gcg 785 Ala Gly Glu Glu Gly Leu Gly Met Ile Arg Ala Met Glu Arg Thr Ala 220 225 230 gcc cgg ctg ctg gcc ccc ggc ggc gtc ctg ctc ctc gaa cac ggc tcc 833 Ala Arg Leu Leu Ala Pro Gly Gly Val Leu Leu Leu Glu His Gly Ser 235 240 245 250 tac caa ctc gcc tcc gtg ccc gcc ctg ttc cgc gca acc ggc cgc tgg 881 Tyr Gln Leu Ala Ser Val Pro Ala Leu Phe Arg Ala Thr Gly Arg Trp 255 260 265 agc cac gcc tcg tcc cgt ccc acc tgc aac gac ggc tgc ctg acc gcc 929 Ser His Ala Ser Ser Arg Pro Thr Cys Asn Asp Gly Cys Leu Thr Ala 270 275 280 gta cgc aac cac acc tgc gca ccg ccc gcc tga cacggcgtca cggcacggcc 982 Val Arg Asn His Thr Cys Ala Pro Pro Ala 285 290 ggcctgtcgg caacgaccct acgccattga caaaccgacc gtgccgtttt tttaatgtcg 1042 gggtggcgga 1052 <210> 2 <211> 292 <212> PRT <213> Streptomyces pristinaespiralis <400> 2 Val Thr Ala Ala Ala Pro Thr Leu Ala Gln Ala Leu Asp Glu Ala Thr 1 5 10 15 Gly Gln Leu Thr Gly Ala Gly Ile Thr Ala Asp Ala Ala Arg Ala Asp 20 25 30 Thr Arg Leu Leu Ala Ala His Ala Cys Gln Val Ala Pro Gly Asp Leu 35 40 45 Asp Thr Cys Leu Ala Gly Pro Val Pro Pro Arg Phe Trp His Tyr Val 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Thr Arg Glu Pro Ala Glu Arg Ile Val Gly His Ala 65 70 75 80 Tyr Phe Met Gly His Arg Phe Asp Leu Ala Pro Gly Val Phe Val Pro 85 90 95 Lys Pro Glu Thr Glu Glu Ile Thr Arg Asp Ala Ile Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Ala Leu Val Arg Arg Gly Thr Thr Ala Pro Leu Val Val Asp Leu Cys 115 120 125 Ala Gly Pro Gly Thr Met Ala Val Thr Leu Ala Arg His Val Pro Ala 130 135 140 Ala Arg Val Leu Gly Ile Glu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Arg Ala Ala 145 150 155 160 Arg Arg Asn Ala Arg Gly Thr Gly Ala Arg Ile Val Gln Gly Asp Ala 165 170 175 Arg Asp Ala Phe Pro Glu Leu Ser Gly Thr Val Asp Leu Val Val Thr 180 185 190 Asn Pro Pro Tyr Ile Pro Ile Gly Leu Arg Thr Ser Ala Pro Glu Val 195 200 205 Leu Glu His Asp Pro Pro Leu Ala Leu Trp Ala Gly Glu Glu Gly Leu 210 215 220 Gly Met Ile Arg Ala Met Glu Arg Thr Ala Ala Arg Leu Leu Ala Pro 225 230 235 240 Gly Gly Val Leu Leu Leu Glu His Gly Ser Tyr Gln Leu Ala Ser Val 245 250 255 Pro Ala Leu Phe Arg Ala Thr Gly Arg Trp Ser His Ala Ser Ser Arg 260 265 270 Pro Thr Cys Asn Asp Gly Cys Leu Thr Ala Val Arg Asn His Thr Cys 275 280 285 Ala Pro Pro Ala 290

Claims (40)

  1. 에스. 프리스티나에스피랄리스(S. pristinaespiralis)의 야생형 PapM 폴리펩타이드 서열로부터 유래하거나,
    a) 에스. 프리스티나에스피랄리스의 Pap M 폴리펩타이드의 249번 잔기 Gly,
    b) 에스. 프리스티나에스피랄리스의 Pap M 폴리펩타이드의 192번 잔기 Thr 및
    c) 상동성 펩타이드내 (a) 또는 (b) 잔기와 동일한 잔기로 부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 대체된 상동성 폴리펩타이드의 서열로부터 유래하는, 스트렙토마이세스 속 세균의 PapM 폴리펩타이드의 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드 서열(서열 2)로부터 유래하고 249번 위치에서 글라이신이 세린으로 적어도 1회 치환된 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드 서열(서열 2)로부터 유래하고 192번 위치에서 트레오닌이 이소류신으로 적어도 1회 치환된 변이체.
  4. 제1항에 있어서, 서열 2로부터 유래하고 249번 위치에서 글라이신이 세린으로 적어도 1회 치환되고 192번 위치에서 트레오닌이 이소류신으로 치환된 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이체를 암호화하는 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 서열 1의 뉴클레오타이드 서열로부터 유래하거나 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 유도된 서열로부터 유래하는 핵산.
  7. 제6항에 있어서, 193 내지 196번 위치에 위치한 NPPY 모티프의 업스트림에 하나 이상의 미스센스(missense) 돌연변이를 포함하는 핵산.
  8. 제7항에 있어서, 미스센스 돌연변이가 비보존성 아미노산 변화를 유도하는 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 658번 위치에서 시토신이 티민으로 적어도 1회 치환된 것(C658T)을 포함하는 핵산.
  10. 제6항에 있어서, 828번 위치에서 구아닌이 아데닌으로 적어도 1회 치환된 것(G828A)을 포함하는 핵산.
  11. 제8항에 있어서, 828번 위치에서 구아닌이 아데닌으로 적어도 1회 치환된 것(G828A) 및 658번 위치에서 시토신이 티민으로 적어도 1회 치환된 것(C658T)을 포함하는 핵산.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 DNA.
  13. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제12항에 따른 재조합 DNA를 포함하는, 자발적으로 복제하고/하거나 통합하는 발현 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 도 11에 제공된 바와 같은 벡터 pVRC1306의 전부 또는 일부를 포함하는 벡터.
  15. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 핵산 및/또는 제12항에 따른 재조합 DNA 및/또는 제13항 또는 제14항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 이. 콜리(E. coli), 에스. 프리스티나에스피랄리스, 스트렙토마이세스 올리바세우스(Streptomyces olivaceus) ATCC12019, 스트렙토마이세스 오스트레오그리세우스(Streptomyces ostreogriseus) ATCC27455, 스트렙토마이세스 미타카엔시스(Streptomyces mitakaensis) ATCC15297, 스트렙토마이세스 로이덴시스(Streptomyces loidensis) ATCC11415, 스트렙토마이세스 그라미노파시엔스(Streptomyces graminofaciens) 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스(Streptomyces diastaticus)로부터 선택되는 숙주 세포.
  17. 제15항 또는 제16항에 따른 숙주 세포를 배양하고 생산된 폴리펩타이드를 회수함을 특징으로 하는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이체를 제조하는 방법.
  18. 생전환 반응에서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이체를 발현시키기 위한, 제15항 또는 제16항에 따른 숙주 세포의 용도.
  19. 스트렙토그라민 생산 균주에서 스트렙토그라민의 다양한 B 성분의 비율을 변형시키기 위한, 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
  20. 제19항에 있어서, 사용되는 핵산이 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이체를 암호화하는 핵산이고 스트렙토그라민-생산 균주가 에스. 프리스티나에스피랄리스의 균주임을 특징으로 하는, PIB의 생산을 위한 용도.
  21. 제19항에 있어서, 사용되는 핵산이 제8항에 따른 변이체를 암호화하는 핵산이고 스트렙토그라민-생산 균주가 에스. 프리스티나에스피랄리스의 균주임을 특징으로 하는, PIA의 생산을 위한 용도.
  22. - papM 유전자를 스트렙토그라민 생산 또는 잠재적인 스트렙토그라민 생산 균주에서 불활성화시키고 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 papM 변이체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 복제물을 도입시키는 단계,
    - 당해 균주를 스트렙토그라민을 생산하기 위한 조건하에 배양하는 단계, 및
    - 생산된 스트렙토그라민의 B 성분을 회수함을 특징으로 하는, 스트렙토그라민의 하나 이상의 B 성분을 생산하기 위한 방법.
  23. 제22항에 있어서, 스트렙토그라민 생산 균주가 에스. 프리스티나에스피랄리스로부터 유래하고, 바람직하게는 균주 에스 프리스티나에스피랄리스 SP92 또는 스트렙토마이세스 올리바세우스 ATCC12019, 스트렙토마이세스 오스트레오그리세우스 ATCC27455, 스트렙토마이세스 미타카엔시스 ATCC15297, 스트렙토마이세스 로이덴시스 ATCC11415, 스트렙토마이세스 그라미노파시엔스 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스로 부터 유래하는 프리스티나마이신 생산 균주인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 스트렙토그라민 생산 균주가 소량 또는 검출 불가능한 양으로 스트렙토그라민의 A 성분을 생산하는 균주인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 에스. 프리스티나에스피랄리스 SP213으로부터 유래하는 균주를 포함하는 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 PapM 변이체를 암호화하는 핵산이 야생형 papM 유전자를 대체함에 의해 도입되는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 야생형 papM 유전자가 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이체를 암호화하는 핵산으로 대체됨을 특징으로 하는, PIB를 생산하는데 사용하기 위한 방법.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 papM 유전가가 papM 폴리펩타이드의 불활성 형태를 암호화하는 핵산으로 대체됨을 특징으로 하는, PINH2를 생산하는데 사용하기 위한 방법.
  29. 제27항에 있어서, 사용된 균주가 이중 돌연변이로서 (G828A) 및 (C658T)를 나타내는 papM 유전자를 포함하는 방법.
  30. 제27항에 있어서, 사용되는 균주가 돌연변이 (G828A)를 나타내는 papM 유전자를 포함하는 방법.
  31. 제27항에 있어서, 사용되는 균주가 돌연변이(C658T)를 나타내는 papM 유전자를 포함하는 방법.
  32. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는, 에스. 프리스티나에스피랄리스의 돌연변이 균주.
  33. 제32항에 있어서, 에스. 프리스티나에스피랄리스 SP217인 균주.
  34. 제32항에 있어서, 에스. 프리스티나에스피랄리스 SP101인 균주.
  35. 제32항에 있어서, 에스. 프리스티나에스피랄리스 SP218인 균주.
  36. PIB를 생산하기 위한 에스. 프리스티나에스피랄리스 SP217 균주의 용도.
  37. PIB를 생산하기 위한 에스. 프리스티나에스피랄리스 SP101 균주의 용도.
  38. PIB를 생산하기 위한 에스. 프리스티나에스피랄리스 SP218 균주의 용도.
  39. PINH2를 생산하기 위한 에스. 프리스티나에스피랄리스 SP216 균주의 용도.
  40. ·플라스미드로 클로닝된 에스. 프리스티나에스피랄리스의 papM 유전자 또는 상동성 유전자에 대해 화학적 돌연변이를 유발하는 단계,
    ·수용 균주를, 단계 (a)에서 돌연변이 유발된 플라스미드로 형질전환시킴에 의해 라이브러리를 제조하는 단계 및
    ·시간 단위당 전환되는 메틸화 기질의 양에 대한 비율 "r"(여기서 r = 기질 1/(기질 1 + 기질 2))이 0.6 이상이 되는 메틸화 활성을 나타내는 클론을 선별하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 PapM 폴리펩타이드 변이체를 선별하는 방법.
KR10-2004-7021459A 2002-06-28 2003-06-23 스트렙토마이세스 속 세균의 ＰａｐＭ 폴리펩타이드의신규 변이체 KR20050019808A (ko)

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