CN114591951A - 一种编辑pomk基因的系统及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及POMK基因的编辑，尤其是筛选到针对POMK的敲除效率较高的sgRNA序列，其包含的间隔子序列如SEQ ID NO：16所示。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和基因遗传修饰技术领域，涉及基于CRISPR/Cas9技术的POMK基因的编辑及其用途。
背景技术
POMK也称为蛋白O-甘露糖激酶，其在脑、睾丸及其他25个组织中均有表达。
(protein O-mannose kinase):O-mannose蛋白激酶。该基因编码一种蛋白，该蛋白可能参与-dystroglycan(a-dg)的laminin结合O型碳水化合物链的呈现，在细胞外基质和外骨骼之间形成跨膜连接。一种具有磷酸化修饰功能的分泌性蛋白；虽然与Ser/Thr蛋白激酶家族有关，但没有蛋白激酶活性，而是作为甘露糖激酶。据报道，POMK能在内质网管腔内使α-Dystroglycan糖蛋白上的甘露糖残基磷酸化，进而调控其后续糖链延伸。POMK的病变会引起α-Dystroglycan的功能异常，影响肌肉和脑的发育，造成先天性肌肉营养不良症。
发明内容
目前，CRISPR技术作为一种新的基因组工程化工具，由于其操作简单，靶向精确，已被广泛应用于细胞的基因组编辑和免疫疗法的开发中。最常用的包括II型、V型、VI型等CRISPR系统。以II型CRISPR系统为例，在外源DNA入侵时，来自CRISPR重复阵列的转录物被Cas9和RNase III核酸酶加工为成熟的crRNA，随后与tracrRNA和Cas9组成复合体。通过识别PAM，crRNA将该复合体引导至靶标DNA，并通过crRNA包含的间隔区序列与靶DNA的结合，解开DNA双链，再由Cas9中的HNH结构域剪切crRNA的互补DNA链，RuvC结构域剪切非互补链，最终在靶标DNA处引入双链断裂。人们还发现，引导Cas9结合并切割特定的DNA序列不需要RNA复合物。通过使用设计的嵌合单向导RNA(sgRNA)可以简单地实现该过程。
术语“单向导RNA”或“sgRNA”是指通过将crRNA和tracrRNA分子融合成“单个向导RNA”的人工工程化RNA，当与Cas9蛋白结合时，其能够识别并切割向导RNA特异性的DNA靶标。sgRNA一般包含间隔子序列(spacer)和骨架序列，这两个序列可以在同一个分子中或不同的分子中。间隔子序列的作用是指导Cas9蛋白切割与间隔子序列互补的DNA位点，也即靶序列。一般而言，间隔子序列是与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交、并且指导CRISPR复合物与该靶序列特异性结合的任何多核苷酸序列。间隔子序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％或更多。一般间隔子序列的长度为约20个核苷酸。骨架序列为sgRNA中必须的，除间隔子序列之外的其余序列，一般包含tracr序列和tracr配对序列，这些序列一般不会因为靶序列的变化而改变。由于骨架序列不影响sgRNA对靶序列的识别，因此，骨架序列可以是现有技术中任何可行的序列。骨架序列的结构可参见如文献Nowak et al.Nucleic AcidsResearch 2016.44:9555-9564。
在本文中可采用的骨架序列如下表1所示。
表1.示例性的sgRNA骨架序列
sgRNA，尤其是其中间隔子序列的设计需要考虑很多因素，例如长度、碱基组成、靶基因的结合位置、与非靶标位点的结合率、是否包含SNP、二级结构等等。目前已经可以通过各种在线工具来设计sgRNA。然而，由于Cas酶可以切割任何邻近PAM位点的靶序列，针对特定的靶基因而言，在线工具设计的大量sgRNA的编辑效率都不尽相同，甚至差异很大，例如，PAM位点是5'-NGG-3'的编辑效率通常就比5'-NGA-3'或5'-NAG-3'的高。因此，筛选特异性高的sgRNA对于CRISPR系统编辑效率的提高至关重要。
因此，在第一个方面，本发明提供一种靶向POMK的sgRNA，其包含的间隔子序列如SEQ ID NO：16所示。
在一个优选的实施方案中，所述sgRNA还包含选自SEQ ID NO：1-12的骨架序列。
在第二个方面，本发明还提供表达本发明所述的sgRNA的DNA分子以及包含所述DNA分子的载体。
在第三个方面，本发明还提供一种基因编辑系统，其包含Cas9酶和本发明所述的sgRNA序列。
在第四个方面，本发明提供了一种在体外敲除细胞中的POMK基因的方法，包括将该细胞与Cas9酶和sgRNA接触，其中所述sgRNA包含如SEQ ID NO：16所示的间隔子序列。
在一个实施方案中，所述Cas9酶是蛋白或编码核酸的形式，所述sgRNA是RNA分子、其编码核酸或载体的形式。例如，可以将细胞与Cas9蛋白和sgRNA直接接触，或者将细胞与Cas9蛋白的编码核酸和sgRNA接触，或者将细胞与Cas9蛋白和sgRNA的编码核酸直接接触。
在一个实施方案中，所述细胞是免疫细胞，例如293T细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞等。优选地，所述免疫细胞是T细胞、NK细胞或NKT细胞，所述T细胞优选CD4+CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞。
下面将结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式
实施例1.sgRNA载体构建
使用CRISPR在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)，根据评分系统，分别针对POMK的1号外显子和2号外显子设计sgRNA，并根据sgRNA序列设计相应的寡核苷酸链，其序列分别如下表2和表3所示。
表2.sgRNA的间隔子序列及寡核苷酸序列
| 名称 | 间隔子序列 |
| sgRNA-1 | GAGAGGCCUCGCCCCCCGAG(SEQ ID NO：13) |
| sgRNA-2 | GAGAGGUGCCGCCAGCUGUU(SEQ ID NO：14) |
| sgRNA-3 | GGGUCCACAGUGGAUUGUCG(SEQ ID NO：15) |
| sgRNA-4 | CUCACCUUGGCUGUCCUGCG(SEQ ID NO：16) |
| sgRNA-5 | ACACAUGUUGUCACGCUGCU(SEQ ID NO：17) |
| sgRNA-6 | CAGUGUCUUCGGCAGGUCGU(SEQ ID NO：18) |
表3.sgRNA间隔子序列的寡核苷酸序列
将1μg LentiCRISPR V2质粒(Addgene，52961)用BsmbI酶于37℃酶切30分钟，并用天根胶回收试剂盒(天根，DP209-02)纯化酶切质粒产物。将一对sgRNA oligo退火形成双链，并与酶切的LentiCRISPR V2质粒进行连接，16℃孵育2h。然后，将连接质粒转化至感受态细胞DH5α，均匀涂至amp抗性LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，然后挑取单个菌落扩大培养并提取质粒，通过测序确定sgRNA序列被正确克隆入LentiCRISPRV2质粒。
实施例2.细胞转染并检测敲除效率
使用脂质体转染法将携带sgRNA序列的LentiCRISPR V2质粒转染入293T细胞。具体地，提前用完全培养基(10％胎牛血清的高糖DMEM培养基)接种293T细胞，并于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养1天，待细胞达到70-90％汇合度时进行转染。将转染试剂(125μlOpti-MEM、3.75μl Lipo3000R)与DNA预混液(125μl Opti-MEM、5μg LentiCRISPR V2质粒、10μl P3000TM)以1：1的比例混合，25℃孵育5分钟后，将其加入293T细胞。将细胞置于37℃培养培养箱继续培养48-72小时后，用含1ng/ml嘌呤霉素的完全培养基进行抗性筛选，并将阳性细胞用完全培养基恢复培养2-3天。收集细胞，并用FACs法鉴定基因敲除效率，结果如下表4所示。
表4.不同sgRNA的敲除效率
| 名称 | 敲除效率 |
| sgRNA-1 | 12.0％ |
| sgRNA-2 | 33.3％ |
| sgRNA-3 | 66.7％ |
| sgRNA-4 | 90.0％ |
| sgRNA-5 | 30.0％ |
| sgRNA-6 | 15.0％ |
从上表可以看出，sgRNA-4的敲除效率最高，达到90％，远远高于其他5个sgRNA的敲除效率。
实施例3.基因表达验证
提取经嘌呤霉素筛选的阳性293T细胞的RNA，并将其逆转录为cDNA，然后用以下引物检测细胞中的POMK基因的表达情况，结果如表5所示。
P-F：AATGACTTGGACGCCTTACC(SEQ ID NO：25)
P-R：GGAAACTGGAGATGTCTGGG(SEQ ID NO：26)
表5POMK的表达水平
需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏浦珠生物医药科技有限公司
<120> 一种编辑POMK基因的系统及其用途
<130> PZCN11
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 89
<212> RNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA骨架序列
<400> 1
guuuuagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60
uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuu 89
<210> 2
<211> 79
<212> RNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA骨架序列
<400> 2
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuu 79
<210> 3
<211> 48
<212> RNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA骨架序列
<400> 3
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuuuuu 48
<210> 4
<211> 54
<212> RNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA骨架序列
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guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucauu uuuu 54
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<211> 68
<212> RNA
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<220>
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<400> 5
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
guuuuuuu 68
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<211> 90
<212> RNA
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<220>
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guuuuagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60
uugaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuuu 90
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<211> 90
<212> RNA
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<223> sgRNA骨架序列
<400> 7
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uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 90
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<212> RNA
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guggcaccga gucggugcuu uuu 83
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<212> RNA
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<220>
<223> sgRNA骨架序列
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aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuuuu 97
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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu u 101
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<211> 82
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<220>
<223> sgRNA骨架序列
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ggcaccgagu cggugcuuuu uu 82
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
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<223> sgRNA-4
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA-5
<400> 17
acacauguug ucacgcugcu 20
<210> 18
<211> 20
<212> RNA
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cagugucuuc ggcaggucgu 20
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<211> 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
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<210> 22
<211> 25
<212> DNA
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<223> sgRNA-2 oligo2
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aaacaacagc tggcggcacc tctcc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA-3 oligo1
<400> 23
caccggggtc cacagtggat tgtcg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA-3 oligo2
<400> 24
aaaccgacaa tccactgtgg acccc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
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<223> sgRNA-4 oligo1
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caccgctcac cttggctgtc ctgcg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
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<223> sgRNA-4 oligo2
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aaaccgcagg acagccaagg tgagc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA-5 oligo1
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caccgacaca tgttgtcacg ctgct 25
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<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA-6 oligo1
<400> 29
caccgcagtg tcttcggcag gtcgt 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA-6 oligo2
<400> 30
aaacacgacc tgccgaagac actgc 25
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> P-F
<400> 31
aatgacttgg acgccttacc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<220>
<223> P-R
<400> 32
ggaaactgga gatgtctggg 20
Claims (9)
1.一种靶向POMK的sgRNA，其包含的间隔子序列如SEQ ID NO：16所示。
2.权利要求1所述的sgRNA，其包含选自SEQ ID NO：1-12的骨架序列。
3.一种DNA分子，其编码权利要求1或2所述的sgRNA。
4.一种载体，其包含权利要求3所述的DNA分子。
5.一种基因编辑系统，其包含Cas9酶和权利要求1或2所述的sgRNA序列。
6.一种在体外敲除细胞中的POMK基因的方法，包括将该细胞与Cas9酶和权利要求1或2所述的sgRNA接触。
7.权利要求6所述的方法，其中所述Cas9酶是蛋白或编码核酸的形式，所述sgRNA是RNA分子、其编码核酸或载体的形式。
8.权利要求6所述的方法，所述细胞是293T细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞。
9.权利要求8所述的方法，所述T细胞是CD4+CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞或αβ-T细胞。
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| CN202011416237.XA CN114591951A (zh) | 2020-12-07 | 2020-12-07 | 一种编辑pomk基因的系统及其用途 |
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