Aufgabe
der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein weiteres Verfahren
anzugeben, welches die Synthese von enantiomer angereicherten α-Hydroxyketonen
bewerkstelligen hilft. Insbesondere sollte das erfindungsgemäße Verfahren
im Stande sein, die Synthese dieser Verbindungen in einem technischen
Maßstab vom ökonomischen
und/oder ökologischen
Standpunkt aus gesehen vorteilhaft durchzuführen. Hierbei ist das Augenmerk
ganz besonders auf die Tatsache der Einsparung kostspieliger Synthesehilfsstoffe,
wie z. B. des Cofaktors ThPP und/oder der Effizienz der ins Auge
gefassten Reaktion zu legen.
Diese
und weitere nicht näher
genannte, sich jedoch aus dem Stand der Technik in naheliegender
Weise ergebende Aufgaben werden durch ein Verfahren mit den Merkmalen
des Anspruchs 1 gelöst.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen
des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden in den folgenden Unteransprüchen zwei bis fünf unter
Schutz gestellt. Auf einen erfindungsgemäßen Ganzzellkatalysator und
seine Verwendung in der Synthese zur Herstellung von α-Hydroxyketonen sind
die abschließenden
Ansprüche
6 bis 15 gerichtet.
Dadurch,
dass man in einem Verfahren zur Herstellung von enantiomer angereicherten α-Hydroxyketonen
durch Reaktion zweier Aldehyde in Gegenwart eines Thiamindiphosphat(ThPP)-abhängigen Enzyms
mit CC-Ligase- und/oder CC-Lyaseaktivität in einem wässrigen
Medium bei einem pH-Wert von 8-10 arbeitet, gelangt man völlig überraschend
und äußerst vorteilhaft
zur Lösung
der gestellten Aufgabe. Bisher wurde in der Literatur immer ein
pH-Wert von 6,0 bis 7,5 für
die gegenständliche
Reaktion favorisiert. Auch die vergleichsweise ähnlich agierenden, eine CC-Bindung
bildenden Enzyme, wie z.B. die PDC, haben ihr pH-Optimum ebenfalls
im neutralen pH-Bereich. Zudem bestand die Gefahr, dass die bei
der erfindungsgemäßen Reaktion entstehenden α-Hydroxyketonen
als C,H-acide Verbindungen in dem angegebenen pH-Wertbereich der
Racemisierung sowie der Aldolkondensation unterliegen. Beides hätte den
Fachmann von der Anwendung der beschriebenen Reaktionsbedingungen
abgehalten. Insofern kann von einem naheliegenden der erfindungsgemäßen Reaktion
nicht ausgegangen werden.
Prinzipiell
können
in die Reaktion alle dem Fachmann für den vorliegenden Zweck in
Frage kommenden Aldehyde eingesetzt werden. Vorzugsweise können zwei
gleiche oder zwei unterschiedliche, lineare oder verzweigtkettige
aliphatische oder aromatische Aldehyde in die erfindungsgemäße Reaktion
eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Verbindungen
der allgemeinen Formel II in diesem Zusammenhang,
worin
R
1 H,
(C
1-C
15)-Alkyl,
(C
2-C
15)-Alkenyl,
(C
2-C
15)-Alkinyl,
(C
2-C
15)-Alkoxyalkyl,
(C
6-C
18)-Aryl, (C
7-C
19)-Aralkyl, (C
3-C
18)-Heteroaryl,
(C
4-C
19)-Heteroalkyl,
(C
1-C
8)-Alkyl-(C
6-C
18)-Aryl, (C
1-C
8)-Alkyl-(C
3-C
19)-Heteroaryl, (C
3-C
8)-Cycloalkyl,
(C
1-C
8)-Alkyl-(C
3-C
8)-Cycloalkyl,
(C
3-C
8)-Cycloalkyl-(C
1-C
8)-Alkyl bedeuten
kann.
Erstaunlicherweise
konnte gezeigt werden, dass durch die Verwendung von BAL bzw. BFD
ausgehend von entsprechenden Aldehyden die Synthese von hoch enantiomerenangereicherten
aliphatischen, sowohl gesättigt
als auch ungesättigt, α-Hydroxyketonen der
Formel 3 ermöglicht
wird (s. Tabelle 3),
worin
R, R', R'', R''', R'''',
R''''' unabhängig voneinander
H, (C
1-C
15)-Alkyl,
(C
2-C
15)-Alkenyl,
(C
2-C
15)-Alkinyl, (C
2-C
15)-Alkoxyalkyl
bedeuten können.
Bevorzugte Reste sind (C
1-C
8)-Alkyl
und (C
2-C
8)-Alkoxyalkyl.
Besonders bevorzugt sind Reste R = R'''' = iso-Propyl, R = R'' =
R'''' =
R''''' = Methyloxy sowie
R = R " " = n-Butyl. Dies war
so aus den aus der Literatur bekannten Daten nicht ohne weiteres
ableitbar. Insbesondere aus sterischen Gründen ist die Akzeptanz solcher
verzweigter Reste überraschend.
Der
Fachmann ist frei in der Wahl der Enzyme, welche er für die erfindungsgemäße Reaktion
einsetzt. Es sind dies solche mit CC-Ligase und/oder CC-Lyaseaktivität (EC 4.1.2).
Im Rahmen der Erfindung wird unter CC-Ligase bzw. CC-Lyaseaktivität die Fähigkeit
verstanden, CC-Bindungen zwischen zwei Carbonylfunktionen dergestalt
zu knüpfen,
dass α-Hydroxyketone
erhalten werden, bzw. die CC-Bindung zwischen einer Carbonylfuktion
und einer dazu α-ständigen Hydroxylgruppe
zu spalten. Bei der Ligasereaktion wird die CC-Bindung entsprechend
dem oben Gesagten dergestalt aufgebaut, dass ein hoch enantiomerenangereichertes α-Hydroxyketon entsteht.
Bei der Lyase wird die enantioselektive Spaltung von racemischen
oder gering enantiomer angereicherten α-Hydroxyketonen betrieben, was
wiederum zu hoch enantiomerenangereicherten α-Hydroxyketonen im nicht umgesetzten
Isomer führt.
Derartig
einsetzbare Enzyme sind beschrieben in Enzyme Catalysis in Organic
Synthesis, 1995, Vol. II, S. 575 und Pohl, M.; Sprenger, G. A.;
Müller,
M. Current Opinion in Biotechnology 2004, 15(4), 335-342. Weitere
Quellorganismen für
derartige Enzyme können
Streptomyces, S. cervisiae, Acinetobacter, Archaea, E. coli, Hefen,
Zymomonas, Bacteroides fragilis, Klebsiella sein.
Bevorzugt
ist der Einsatz einer Benzaldehydlyase(BAL) oder Benzoylformiatdecarboxylase(BFD)
oder den von diesen Enzymen abgeleiteten Mutanten in diesem Zusammenhang.
Diese stammen vorteilhafterweise aus dem Organismus Pseudomonas, ganz
besonders bevorzugt Pseudomonas fluorescens (Seq. ID NO: 2) oder
Pseudomonas putida (Seq. ID NO: 1). Bzgl. der Generierung geeigneter
Mutanten sei auf Verfahren des Standes der Technik verwiesen (S.
Chusacultanachai, Y. Yuthavong, Methods in Molecular Biology, Vol 270,
Ed. S. E. Melville, Humana Press, page 319-333; B. Lingen, J. Grötziner,
D. Kolter, M.-R. Kula, M. Pohl, Protein Engineering, 2002, 15, 858-593).
Die
gegenständliche
Reaktion kann in Wasser als Lösungsmittel
durchgeführt
werden. Aus Gründen der
Löslichkeit
der eingesetzten Substrate kann es jedoch vorteilhaft sein, die
zu Grunde liegende Reaktion in einem wässrigen Medium durchzuführen, bei
dem der Wasserphase mindestens ein weiteres in Wasser lösliches
oder unlösliches
organisches Lösungsmittel
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Ethern, Alkoholen, Estern, Ketonen,
Säureamiden,
Alkanen, Aromaten und Sulfoxiden zugesetzt ist. Ganz besonders bevorzugt
ist der zusätzliche
Einsatz von Lösungsmitteln
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Ethern und Sulfoxiden.
Bei
manchen Anwendungen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, auf ein
Zwei-Phasensystem aus Wasser und einer mit Wasser nicht mischbaren
organischen Phase, vorzugsweise Ether bzw. Ester, auszuweichen. Insbesondere
bevorzugt sind Methyl-tert.-butylether und Ethylacetat in diesem
Zusammenhang.
Durch
die Verwendung des Zweiphasensystems lässt sich eine deutlich erhöhte Substrat-
und Produktkonzentration im Medium erreichen, was zu einer höheren Raum/Zeit-Ausbeute
führt.
Während
bis dato in der Literatur Molaritäten von maximal 65 mM bei der
Umsetzung beschrieben sind, lassen sich so mit dem hierin beschriebenen
Verfahren Molaritäten
von 1 M an Substrat erreichen. Während
in einphasigen Systemen oftmals ein deutlich erhöhter Überschuss an Akzeptor-Aldehyd
(bis zu 6-fachem Überschuss)
zugegeben werden muss, ist dies bei Verwendung des Zwei-Phasen-Systems nicht mehr
notwendig. Dies hilft Einsatzkosten zu sparen und ist daher vor
dem ökonomischen
Hintergrund besonders vorteilhaft. Für die Ergebnisse der Umsetzungen
im Zwei-Phasensystem sei auf die Tabellen 1 und 2 verwiesen.
Wie
oben schon angedeutet hat es sich im Gegensatz zu der aus dem Stand
der Technik bekannten Lehre für
die erfindungsgemäße Reaktion
als vorteilhaft erwiesen, diese in einem pH-Bereich von 8,0 bis
10 durchzuführen.
Wie in 1 gezeigt, liegt das Optimum des pH-Werts für die gegenständliche
Reaktion bei pH 9,5. Vorzugsweise wird daher die erfindungsgemäße Reaktion
in einem pH-Bereich von 9,5 ±0,5,
besonders bevorzugt bei 9,5 ±0,2
durchgeführt.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch ein rekombinanter Ganzzellkatalysator
aufweisend ein kloniertes Genkonstrukt, welches für ein Thiamindiphosphat(ThPP)-abhängiges Enzym
mit CC-Ligase und/oder CC-Lyaseaktivität codiert, wobei der Wirtsorganismus
DSM 14459 ist.
Für den Einsatz
bestimmter Enzyme mit der gewünschten
Aktivität
sei auf das oben in Bezug auf das Verfahren Angegebene verwiesen.
Ganz besonders bevorzugt ist auch hier der Einsatz eines Genkonstruktes, dass
für eine
Benzaldehydlyase(BAL) oder Benzoylformiatdecarboxylase(BFD) oder
den von diesen Enzymen abgeleiteten Mutanten codiert.
Die
Herstellung des Ganzellkatalysators erfolgt nach Methoden des Standes
der Technik (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989),
Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Plasmide, mit denen
das die erfindungsgemäße Nukleinsäure aufweisende
Genkonstrukt vorzugsweise in den Wirtsorganismus kloniert wird,
sind dem Fachmann ebenfalls bekannt (s.a. WO04005517; s.u.). Als
Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen
Zweck zur Verfügung
stehenden Ausführungsformen
in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. von Studier und
Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff
J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression
of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61-89) oder den Broschüren der
Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco
BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden
werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol.
I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D.
T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and
their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990),
Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185,
3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular
cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Plasmide,
mit denen die die ins Auge gefassten Nukleinsäuresequenzen aufweisenden Genkonstrukte in
ganz bevorzugter Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden können, sind
oder basieren auf: pUC18/19 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche
Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals), pKK223-3 (Amersham Pharmacia
Biotech), pKK-233-3 (Stratagene) oder pET (Novagen). Äußerst bevorzugt
in diesem Zusammenhang sind pBAL, pBALhis,
PKK233_2_BALhis; pBFD/trc, pBDF PKK233_2_BFDhis (3 und 4)
Einen
abschließenden
Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildet die Verwendung eines
rekombinanten Ganzzellkatalysators aufweisend ein kloniertes Genkonstrukt,
welches für
ein Thiamindiphosphat(ThPP)-abhängiges Enzym
mit CC-Ligase und/oder CC-Lyaseaktivität codiert in einem Verfahren
zur Herstellung von enantiomer angereicherten α-Hydroxyketonen.
Bezüglich der
bevorzugten Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Verwendung
des Ganzzellkatalysators sei auf das oben beim Einsatz der Enzyme
im erfindungsgemäßen Verfahren
Gesagte verwiesen. Die dortigen bevorzugten Ausführungsformen können beim
Einsatz des Ganzzellkatalysators in äquivalenter Art und Weise angewendet
werden.
Für den erfindungsgemäßen Ganzzellkatalysator
eignen sich sämtliche
bekannte Wirtszellen. Als solche sind diesbezüglich Organismen wie z.B. Hefen
wie Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae,
Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus subtilis oder Eukaryonten, wie
Säugerzellen,
Insektenzellen oder Pflanzenzellen zu nennen. Die Verfahren zur
Klonierung sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook, J.; Fritsch,
E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual,
2
nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York). Vorzugsweise sind E. coli-Stämme für diesen Zweck zu benutzen.
Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101,
JM109, JM105, RR1, DH5α,
TOP 10-, HB101, BL21 codon plus, BL21 (DE3) codon plus, BL21, BL21
(DE3), MM294. Äußerst bevorzugt
ist der Einsatz des Organismus in diesem Zusammenhang, welcher in
der
EP 1444367 beschrieben
ist (DSM 14459).
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verwendung
wird der Ganzzellkatalysator vorzugsweise ohne vorherige Lysebehandlung – direkt
aus der Fermentation kommend – in
die Reaktion eingesetzt. Es kann jedoch auch vorteilhaft sein, ihn
vor dessen Einsatz so vorzubehandeln, dass die Permeabilität der Zellmembran
für die
Substrate und Produkte gegenüber
dem intakten System gesteigert ist. Besonders bevorzugt ist dabei
ein Verfahren, bei dem der Ganzzellkatalysator beispielsweise durch
Einfrieren und/oder Behandlung mit einer organischen Komponente,
z.B. Toluol vorbehandelt wird.
Gemäß der Erfindung
kann die Verwendung des Ganzzellkatalysators überraschenderweise ohne Zugabe
eines „externen" Cofaktors durchgeführt werden
(2). Dies bedeutet, dass dem Ganzzellansatz kein zusätzlicher
Cofaktor zugegeben werden muss, da die Zellen selbst bereits einen
für die
Umsetzungsreaktion geeigneten Cofaktor enthalten und offensichtlich
nutzen können.
Unter für
die Umsetzung geeigneten Cofaktoren ist insbesondere ThPP zu verstehen.
Dies
ist jedoch vor dem Hintergrund besonders überraschend, dass die intrazelluläre Menge
an ThPP eigentlich zu gering für
eine präparative
Umsetzung ist. Der Cofaktor kann in den abgestorbenen Zellen nicht mehr
nachgebildet werden, wie dies bei Fermentationsprozessen, wie z.B.
bei der Verwendung der Pyruvat-Decarboxylase zur Herstellung von
Ephedrin-Vorstufen der Fall ist. Die hohen Umsätze und Produktivitäten mit
dem Ganzzellkatalysator unter den geschilderten Randbedingungen
waren deshalb keinesfalls zu erwarten. Die hohen Ausbeuten an Produkt
sind auch unter dem Aspekt, dass in der Zelle andere Enzyme vorhanden
sind, die zu Nebenreaktionen mit den Substraten führen können, wie
zum Beispiel Alkoholdehydrogenasen, um so überraschender. Auch die leichte
Diffusion der Substrate durch die Zellwände und Membranen sowie die
Rückdiffusion
der Produkte ins Medium war nicht vorherzusehen.
Der
Ganzzellkatalysator kann wie weiter vorne schon im Verfahren beschrieben
sowohl für
die enantioselektive Synthese der α-Hydroxyketone eingesetzt als
auch in der enantioselektiven Spaltung von racemischen oder gering
enantiomer angereicherten α-Hydroxyketonen
verwendet werden. In beiden Fällen
erhält man
hoch enantiomer angereicherte Produkte.
Für das erfindungsgemäße Verfahren
kann das betrachtete Enzym in freier Form als homogen aufgereinigte
Verbindungen oder als rekombinant hergestelltes Enzym verwendet
werden. Wie oben schon angedeutet kann das Enzym auch als Bestandteil
eines intakten rekombinant hergestellten Gastorganismus eingesetzt
werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig
hoch aufgereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus.
Möglich ist
ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form (Sharma
B. P.; Bailey L. F. und Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialiern – Techniken
und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852). Vorteilhafterweise erfolgt
die Immobilisierung durch Lyophilisation (Paradkar, V. M.; Dordick,
J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly
Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010; Mori,
T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipicoated glycoside hydrolases
as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic
solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974; Otamiri, M.; Adlercreutz,
P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin
and ethyl cellulose as a means to solbilize the enzyme in active
form in toluene, Biocatalysis 6, 291-305). Ganz besonders bevorzugt ist die
Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie
Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG)
oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Kamiya, N.; Okazaki,
S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex
catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11,
375-378). Die Verwendung als CLECs ist ebenfalls denkbar (St. Clair,
N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked
enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int.
Ed. 39, 380-383).
In
einer generellen Ausführungsform
beim Einsatz der angesprochenen Enzyme im erfindungsgemäßen Verfahren
geht der Fachmann bevorzugt so vor, dass er Substrat und Enzyme
mit der entsprechenden Aktivität
in der angedachten Form (homogen auf gereinigte, als CLECS, immobilisiert
etc.) in einem entsprechenden Medium, vorzugsweise ein wässriges Zweiphasengemisch,
suspendiert und bei entsprechender Temperatur, die im Bereich von
0 bis 100 Grad Celsius, vorzugsweise im Bereich von 20 bis 80 Grad
Celsius und ganz besonders bevorzugten Bereich von 30 bis 50 Grad
Celsius liegt, belässt.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
im Hinblick auf den Einsatz der Enzyme und die Verwendung des Ganzzellkatalysators
kann im Batch-Prozess erfolgen. Die Biomasse lässt sich durch Filtration oder
Zentrifugation leicht vom Produkt abtrennen. Die erhaltenen α-Hydroxyketonen
können
dann nach gängigen
Verfahren isoliert werden (Chromatografie, Kristallisation etc.).
Das
gegenständliche
Verfahren und insbesondere die Verwendung der Ganzzellkatalysatoren
kann jedoch auch kontinuierlich durchgeführt werden. Dazu erfolgt die
Reaktion in einem so genannten Enzym-Membran-Reaktor, in dem hochmolekulare
Stoffe – die
Biomasse – hinter
einer Ultrafiltrationmembran zurückgehalten
werden und niedermolekulare Stoffe – wie die produzierten Produkte – die Membran
passieren können. Eine
derartige Verfahrensweise wurde im Stand der Technik schon mehrfach
beschrieben (Wandrey et al. in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik
und Chemieingenieurwesen, VDI, S. 151ff; Kragl et al., Angew. Chem. 1996,
6, 684).
Die
Umsetzung des eingesetzten Substrates zu dem gewünschten Produkt kann – wie schon
angedeutet – in
Zellkultur unter Einsatz eines geeigneten Ganzzellkatalysators erfolgen.
Hierbei wird je nach verwendetem Wirtsorganismus ein geeignetes
Nährmedium
eingesetzt. Die für
die Wirtszellen geeigneten Medien sind allgemein bekannt und kommerziell
erhältlich.
Den Zellkulturen können
außerdem übliche Zusätze zugegeben
werden, wie z.B. Antibiotika, wachstumsfördernde Mittel, wie z.B. Seren
(fötales
Kälberserum
usw.) und ähnliche
bekannte Zusatzstoffe.
Wie
aus den nachfolgenden Ergebnissen der experimentelle Arbeiten hervorgeht,
können
mit dem gegenständlichen
Ganzzellkatalysator bzw. den freien Enzymen hervorragende Ausbeuten
und Enantiomerenüberschüsse im jeweils
erhaltenen α-Hydroxyketon
erzielt werden (Tabelle 1 bis 3). Tabelle
1. – BAL-katalysierte
Carboligation unterschiedlicher Substrate im Zweiphasensystem.
a - a: MTBE 25 mL.
25 ml Puffer (100 mM pH 7-9). 1 g BAL Ganzzellkatalysator ohne Cofaktor-Zugabe.
- b) Die Konznetration ist auf das eingesetzte
Volumen in der wäßrigen Phase
bezogen
Tabelle
2. BFD-katalysierte Carboligation von Benzaldehyd und Acetaladehyd
im Zweiphasensystem.a - a): MTBE 25 mL.
25 ml Puffer 100 mM pH 7-9. 1 g BFD Ganzzellkatalysator ohne Cofaktor-Zugabe.
- b) 60g/l Ganzzellkatalysator
Tabelle
3. – Carboligation
aliphatischer Aldehyde katalysiert durch BAL and BFD.a - a) Freies Enzym: 1000 U
- b) Ganzzell-Katalysator 40g/l
Die
Vorteile, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. dem Einsatz
der erfindungsgemäßen Ganzzellkatalysatoren
bei der asymmetrischen enzymatischen Carboligation und deren Rückreaktion
erzielt werden, sind durch den Stand der Technik nicht nahe gelegt.
Die Ausführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
im entsprechenden pH-Bereich und/oder im Zweiphasensystem erlaubt
einen wesentlich effektiveren Einsatz der betrachteten Enzyme. Beim
Einsatz des Ganzzellkatalysators kann vorzugsweise auf die Zugabe
teurer Cofaktoren verzichtet werden, was Stoffeinsatzkosten sparen
hilft.
Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist unter einem „Ganzzellkatalysator" eine intakte Zelle
zu verstehen, in der wenigstens ein Gen exprimiert wird, das den
erfindungsgemäßen Umsatz
eines Substrates zu einem Produkt katalysieren kann. Erfindungsgemäß ist die
intakte Zelle in der Lage eine ThPP-abhängige CC-Lyase und/oder CC-Ligase
zu exprimieren. Bevorzugt handelt es sich bei dem Ganzzellkatalysator
um einen gentechnisch veränderten,
den Bedürfnissen
der gewünschten
Umsetzung angepassten Mikroorganismus. Als besonders geeignete Ganzzellkatalysatoren
sind die beiden im experimentellen Teil beschriebenen Ganzzellkatalysatoren
bevorzugt.
Als
(C1-C8)-Alkyl sind
anzusehen Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl,
sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl oder Octyl samt aller
Bindungsisomeren. Dieser kann einfach oder mehrfach mit halogenhaltigen
und/oder anderen heteroatomhaltigen Resten substituiert sein. (C1-C15)-Alkyl ist
ensprechend zu verstehen, nur das hier bis zu 15-C-Atome im Rest
präsent
sein können.
Als
(C2-C8)-Alkenyl
ist mit Ausnahme von Methyl ein wie oben dargestellter (C1-C8)-Alkyl-Rest
zu verstehen, der mindestens eine Doppelbindung aufweist. (C2-C15)-Alkenyl ist
ensprechend zu verstehen, nur das hier bis zu 15-C-Atome im Rest
präsent
sein können.
Unter
(C2-C8)-Alkinyl
ist mit Ausnahme von Methyl ein wie oben dargestellter (C1-C8)-Alkyl-Rest
zu verstehen, der mindestens eine Dreifachbindung aufweist. (C2-C15)-Alkinyl ist
ensprechend zu verstehen, nur das hier bis zu 15-C-Atome im Rest präsent sein
können.
Unter
(C1-C8)-Acyl versteht
man einen über
eine C=O-Funktion
ans Molekül
gebundenen (C1-C8)-Alkyl-Rest.
Unter
(C3-C8)-Cycloalkyl
versteht man Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl bzw.
Cycloheptylreste etc.
Unter
einem (C6-C18)-Arylrest
wird ein aromatischer Rest mit 6 bis 18 C-Atomen verstanden. Insbesondere
zählen
hierzu Verbindungen wie Phenyl-, Naphthyl-, Anthryl-, Phenanthryl-,
Biphenylreste. Dieser kann einfach oder mehrfach mit (C1-C8)-Alkyl, (C1-C8)-Alkoxy, (C1-C8)-Haloalkyl,
Halogen, OH, N((C1-C8)-Alkyl)2, NO2, (C1-C8)-Acyl, NH(C1-C8)-Acyl, N((C1-C8)-Acyl)2 substituiert sein.
Ein
(C7-C19)-Aralkylrest
ist ein über
einen (C1-C8)-Alkylrest an das
Molekül
gebundener (C6-C18)-Arylrest.
(C1-C8)-Alkoxy ist
ein über
ein Sauerstoffatom an das betrachtete Molekül gebundener (C1-C8)-Alkyl-Rest.
(C2-C8)-Alkoxyalkyl
ist ein (C1-C8)-Alkyl-Rest
mit einem Sauerstoffatom in der C-Kette.
(C1-C8)-Haloalkyl ist
ein mit einem oder mehreren Halogenatomen substituierter (C1-C8)-Alkyl-Rest.
Ein
(C3-C18)-Heteroarylrest
bezeichnet im Rahmen der Erfindung ein fünf-, sechs- oder siebengliedriges
aromatisches Ringsystem aus 3 bis 18 C-Atomen, welches Heteroatome
wie z. B. Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel im Ring aufweist.
Als solche Heteroaromaten werden insbesondere Rest angesehen, wie 1-,2-,3-Furyl,
wie 1-,2-,3-Pyrrolyl, 1-,2-,3-Thienyl, 2-,3-,4-Pyridyl, 2-,3-,4-,5-,6-,7-Indolyl,
3-,4-,5-Pyrazolyl, 2-,4-,5-Imidazolyl, Acridinyl, Chinolinyl, Phenanthridinyl,
2-,4-,5-,6-Pyrimidinyl. Dieses kann einfach oder mehrfach mit (C1-C8)-Alkyl, (C1-C8)-Alkoxy, (C1-C8)-Haloalkyl,
Halogen, OH, NO2, N((C1-C8)-Alkyl)2, (C1-C8)-Acyl, NH(C1-C8)-Acyl, N((C1-C8)-Acyl)2 substituiert sein.
Unter
einem (C4-C19)-Heteroaralkyl
wird ein dem (C7-C19)-Aralkylrest
entsprechendes heteroaromatisches System verstanden.
Als
Halogene (Hal, Halogenatom) kommen Fluor, Chlor, Brom und Iod in
Frage. Bevorzugt ist Chlor und Brom. Dies gilt für die Halogenid-Ionen entsprechend.
Die
dargestellten chemischen Strukuren beziehen sich auf alle möglichen
Stereoisomeren, die durch Abänderung
der Konfiguration der einzelnen chiralen Zentren, Achsen oder Ebenen
erreicht werden können, also
alle möglichen Diastereomere,
sowie alle darunter fallende optische Isomere oder deren Gemische.
Unter
dem Begriff enantiomerenangereichert oder enantiomer angereichert
wird im Rahmen der Erfindung der Anteil eines Enantiomers im Gemisch
mit seiner optischen Antipode in einem Bereich von >50 % und <100 % verstanden.
Unter
dem Begriff Diastereomerenanreicherung wird im Rahmen der Erfindung
der Anteil eines Diastereomers im Gemisch mit seinen anderen in
einem Bereich von >50
% und <100 % verstanden.
Erläuterung der Abbildungen:
1 pH-Profil
der BAL bei der Umsetzung von Benzaldehyd zu Benzoin sowie von Benzaldehyd und
Acetaldehyd zu 2-HPP.
