JP3563432B2 - 大腸菌宿主を用いてベクターを増殖させる方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、大腸菌(Escherichia coli)宿主を用いてベクターを大腸菌宿主内で安定に保持または増殖させる方法に関し、特にrecA変異及びrecJ変異を導入した大腸菌を用いてベクターを大腸菌宿主内で安定に保持または増殖させる方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、ベクターDNAを大腸菌宿主内で保持または増殖させる際、ベクターDNA、特に外来性のDNAが組換えを起こしDNAの構造が変化するために、ベクターが宿主内で安定に保持、増殖されなかったり、発現産物の収率が悪化するという問題があった。そのため、ベクターDNAをクローニングするための宿主または外来DNAを発現させるための宿主として、相同的組換えの遺伝子であるrecA変異株が用いられることがあった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
recA変異株宿主中では、相同的組換えは抑制されるが、非相同的組換えは一般にrecAタンパク質に依存していないので、recA変異株宿主中のベクターDNAの非相同的組換えを効果的に抑制することはできなかった。本願発明は、宿主中の相同的組換え及び非相同的組換えの両者を押さえることによって、宿主中のベクターの組換え頻度を顕著に抑制し、ベクターDNAを安定に増殖させることを課題とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本願発明は、宿主中のベクターの組換え頻度を顕著に抑制し、ベクターDNAを安定に増殖させるための大腸菌宿主を用いてベクターDNAを宿主大腸菌内で安定に保持または増殖させる方法に関する。
【0005】
大腸菌のrecA遺伝子及びrecJ遺伝子は、相同的組換えに関与する遺伝子として知られている(recA:▲1▼Clark A.J.,Annu.Rev.Genet.,7,p67−86(1973),▲2▼Genetic Recombination,Raju Kucherlapati et al.,American Society for Microbiology,Chapter 6(1988))(recJ: ▲1▼Horii Z.I.et al.,J.Mol.Biol.,80,p327−344(1973), ▲2▼Lovett S.T.et al.,J.Bacteriol.,157,p190−196(1984),▲3▼Lovett S.T.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,p2627−2631(1989))
本願発明は、ベクターDNAの宿主大腸菌として、recA/recJ二重変異株を用いることを特徴とする。該変異株は、相同的組換え遺伝子であるrecA遺伝子が変異しているので、相同的組換えが顕著に抑制される。更に、本願発明者らは、意外にも、recA/recJ二重変異株においては、非相同的組換えが顕著に抑制されることを見出した。このことから、recA/recJ二重変異株においては、相同的組換えと非相同的組換えを合わせた組換え頻度全体が、極度に減少することが明らかになった。更に、本願発明者らは、recA/recJ二重変異株は、二重変異株であるにも関わらず、培地中で良好に増殖することを見出した。このことから、recA/recJ二重変異株は、ベクターを宿主大腸菌内で安定に保持または増殖させ、必要に応じて遺伝子の発現産物を取得するための宿主として、十分に実用に耐え得るものであることが判明した。
【0006】
本願発明の宿主は、recA/recJ二重変異を有する大腸菌であれば、原則的にはいずれの株でも使用可能であるが、例えばR594株(Virology,27,p.329(1965) )、C600株(genetics,39,p.440(1954) )、NM538株(J.Mol.Biol.,170,p.827(1983) )にrecA/recJ二重変異を導入したものなどが用いられる。各菌株にrecA変異及びrecJ変異を導入するにはP1トランスダクション法(別冊 蛋白質核酸酵素 細菌・ファージ遺伝実験法,p.71−72,共立出版株式会社(1972))等の公知の方法が用いられる。recA変異株では形質導入の効果が低下するので、recJ変異を導入後、recA変異を導入するのが望ましい。
【0007】
ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクターいずれでもよく、例えばプラスミドベクターとしてはpUC系プラスミド、pBR系プラスミド、ファージベクターとしては、EMBL系ファージ、λgt系ファージなどが挙げられる。なお、本願発明の宿主−ベクター系は、P1ベクター、コスミドなどの長大な外来性DNAを有するベクターの増殖に特に有効である。ベクターは、クローニングベクターでも発現ベクターでもよい。発現ベクターの場合、プロモーターの下流に構造遺伝子を接続すれば、宿主内で該構造遺伝子を発現させ、発現産物を取得することができる。
【0008】
ベクターによって形質転換された宿主は、常法に従い培養することができる。培地としては、大腸菌が増殖すればいずれのものでもよいが、例えばL培地、LB培地、M9培地、SOB培地などが挙げられる。培養は振盪条件下、温度25℃〜40℃、pH5〜9で行うのが望ましい。
【0009】
培養した形質転換宿主からのベクターの回収は、常法に従って行うことができる。例えば、プラスミドベクターの場合は、アルカリ法、ボイリング法等によって行うことができ(Molecular Cloning 第2版,J.Sambrook et al.,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989),1.21−1.52)、ファージベクターの場合は、ファージライセートからファージを回収することによって行うことができる(Molecular Cloning 第2版,J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),2.60−2.80)。
【0010】
また、発現ベクターを保持する形質転換された大腸菌による構造遺伝子の発現と発現産物の回収は、常法に従って行うことができる(Molecular Cloning 第2版.J.Sambrook et al.,C’old Spring Harbor Laboratory Press(1989)第17章「Expression of Cloned Genes in Escherichia coli」)。
【0011】
以下、本願発明に関する実施例を示すが、本願発明の技術的範囲は当該実施例に限定されない。なお、以下の実施例は、recA/recJ二重変異を有する大腸菌宿主において、非相同的組換え頻度が低下していることを示すためのものであり、該大腸菌宿主において、相同的組換え頻度が低下していることはいうまでもない。
【0012】
【実施例】
[実施例1] 非相同的組換えを検出するシステム
溶原化したλファージが誘発される際、通常はプロファージ両端に位置するatt 部位同志の部位特異的組換えによってファージDNAの切り出しが起こる。しかし低頻度で、att 部位以外の部位での非相同的組換えによるλファージDNAの切り出しも起こる。その結果、プロファージ座近傍の大腸菌のgal 遺伝子又はbio 遺伝子をゲノム内に取り込んだ、形質導入ファージλgal 又はλbio が形成される。
【0013】
λファージはP2ファージ溶原菌を宿主として増殖できない。この性質は「 Spi− 」(sensitive to P2 interferenceの略)といわれる。しかし例外的にλ red− γ− はP2ファージ溶原菌を宿主として増殖できる(λ Spi− )。
【0014】
本願発明者らは、λファージが溶原化した野生株を様々な条件で誘導して得た、λ Spi− のゲノム構造をPCR法によって調べたところ、84株中82株がbio 遺伝子をゲノム内に取り込んでいることを見出だした。
【0015】
そこで、λbio の形成頻度を調べる代わりに、λ Spi− の形成頻度を調べ、非相同的組換え頻度の指標とした。
【0016】
このλ Spi− の検出による非相同的組換え頻度の測定方法は、ノイズが極めて少ない、信頼性の高い方法である。
【0017】
[実施例2] UV照射による誘発
溶原菌をλPY培地(1リットル中バクトトリプトン10g、NaCl2.5g、イ−スト・エキストラクト1g、寒天10gを滅菌し、1MMgSO4 1.5mlとM9A液10mlを加える)中で一晩培養した。培養液1/100容をλPY培地中30℃で菌数が約1.5×108 /mlになるまで成育させ、この培養液2mlをプレート(直径8.5cm)中に分注して、攪拌しながら紫外線を0.55mW/cm2 の強度で10秒照射した。培養液を回収し、42℃で15分間振盪し、その後37℃で2時間振盪培養し溶菌させた。溶菌液に数滴のCHCl3 を加え、さらに5分間振盪した後、3000rpmで15分間遠心して上清を得た。このファージ液をM9培地で希釈し、指示菌(Ymel)一晩培養物0.1ml、λトップ培地(1リットル中ポリペプトン10g、NaCl2.5g、寒天4g)2.5mlとともにλプレート(1リットル中ポリペプトン10g、NaCl2.5g、寒天4g)にまき、一晩培養し、プラ−クを形成させ、全ファージ数を測定した。
【0018】
[実施例3] λ Spi− ファージ数の測定
2×107 個のファージを、指示菌(WL95(P2): metB supE supF hsdRk tonA trpR (P2))一晩培養物0.1ml、λトップ培地2.5mlとともにλトリプティケ−スプレート(1l中BBL トリプティケ−スペプトン (BBL Trypticase Peptone,BECTON DICKINSON 社) 10g、NaCl2.5g、寒天10g)にまき、一晩培養し、プラ−クを形成させ、λ Spi− ファージ数を測定した。
【0019】
[実施例4] λ Spi− ファージ形成頻度の測定
培養物0.1ml中の全ファージ数(実施例2で測定した値)に対する、培養物0.1ml中のλ Spi− ファージ数(実施例3で測定した値)を計測し、λ Spi− ファージの形成頻度とした。
【0020】
[実施例5] 野生株または変異株におけるλ Spi− ファージの形成頻度の測定野生株、recA変異株、recJ変異株またはrecA/recJ二重変異株のλ Spi− ファージの形成頻度を表1に示す。
【0021】
【表1】
表1に示すように、野生株に比べて、recJ変異株においては、λ Spi− ファージの形成頻度が約1/7に減少した。このことから、野生株に比べて、recJ変異株においては、非相同的組換え頻度が減少することが判明した。
【0022】
また、表1に示すように、recJ変異株に比べて、recA/recJ二重変異株においては、λ Spi− ファージの形成頻度が更に約1/4に減少した。即ち、野生株に比べて、recA/recJ二重変異株においては、λ Spi− ファージの形成頻度が約1/25に減少した。このことから、野生株に比べて、recA/recJ二重変異株においては、非相同的組換え頻度が顕著に減少したことが判明した。
【0023】
[実施例6] 野生株または変異株における大腸菌の増殖速度の測定
λPY培地中で、R594株(Virology,27,p.329(1965) )の野生株、R594株のrecA変異株、R594株のrecJ変異株またはR594株のrecA/recJ二重変異株を、37℃で培養した。対数増殖期において菌数が2倍になるのに必要な時間(doubling time )を測定した。結果を表2に示す。
【0024】
【表2】
表2に示すように、野生株、recA変異株、recJ変異株またはrecA/recJ二重変異株の間で、増殖速度に顕著な差異は見られなかった。
【0025】
【発明の効果】
本願発明によって、宿主中のベクターの組換え頻度を顕著に抑制し、宿主大腸菌内でベクターDNAを安定に保持または増殖させることが可能になった。
Claims (1)
- ベクターを保持するかまたはベクターによって感染されたrecA変異及びrecJ変異を導入した大腸菌(Escherichia coli)を培養することを含む、ベクターDNAを大腸菌宿主内で安定に保持または増殖させる方法。
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