CN116731950A - 谷氨酸棒杆菌抗逆工程菌及其在生产酸性生物基化学品中应用 - Google Patents
谷氨酸棒杆菌抗逆工程菌及其在生产酸性生物基化学品中应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有改善抗逆性能的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌及其在生产酸性生物基化学品中应用。本发明的基于谷氨酸棒杆菌抗逆工程菌的酸性pH环境转化工艺，具有较高的底物转化率且副产物较少，制备流程简单方便，生产条件温和可控，所生产制备的α‑酮戊二酸在酸性环境中具有更好的稳定性，既能够满足L‑谷氨酸氧化酶的最优催化反应条件，更加高效的催化L‑谷氨酸（盐）生成α‑酮戊二酸，同时也有助于节约碱液使用量，减少高浓度废水产生，可大大节约生产成本和提高产品的分离纯化效率，具有较好的技术应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和合成生物学领域，涉及一种谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌的构建方法，以及其在生产α-酮戊二酸等酸性生物基化学品中应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一种重要的食品安全级工业微生物菌种，已被广泛用于多种氨基酸的工业发酵，以及有机酸、核苷酸和维生素等的生物合成，具有重要的经济价值和应用前景[ Lee JY, Na YA, Kim E, et al. TheActinobacteriumCorynebacterium glutamicum, an Industrial Workhorse. JMicrobiolBiotechnol, 2016, 26: 807-22.]。但是在工业发酵条件下，例如发酵生产谷氨酸及其衍生物等酸性生物基化学品时，谷氨酸棒杆菌时常面临着诸多的生理或非生理逆境胁迫，严重影响菌种的正常生理状态以及相关目标产物的高效积累，其中低酸胁迫等是比较常见的环境胁迫压力[Guan N, Li J, Shin H, et al. Microbial response toenvironmental stresses: from fundamental mechanisms to practicalapplications. ApplMicrobiolBiotechnol, 2017, 101: 3991-4008.]。高性能的微生物菌种是发酵工程的基础，也是提高生物发酵产品产量和质量的重要保障，拥有优良稳定抗逆表型的工程微生物对于实现更高的发酵产量、产率和生产强度是必需的。因此，在深入理解谷氨酸棒杆菌对工业复杂发酵环境的生理适应机制基础上，利用合成生物学等策略和工具对谷氨酸棒杆菌进行生理性能调控，提高菌株在逆境胁迫下的代谢能力和耐受性能，进而充分发挥其工业价值，具有重要的理论研究和现实指导意义。
目前，氨基酸产业仍以传统大宗的中低档产品为主，高附加值氨基酸衍生物产品的开发和生产亟待加强，围绕生物医药、生物饲料、生物环保等，通过生物转化等方法，开发氨基酸产业下游高附加值产品，对于进一步扩大和延伸氨基酸产业链条，实现可持续发展具有重要意义。α-酮戊二酸（α-ketoglutarate, α-KG）是一种重要的有机酸，在有机体细胞碳-氮代谢中发挥着重要作用，也是合成多种糖类、氨基酸以及蛋白质等的重要前体物质，在食品、医药、饲料、精细化工和化妆品等行业中都具有广阔的应用前景[Wu N, Yang M,Gaur U, et al. Alpha-ketoglutarate: physiological functions and applications.BiomolTher, 2016, 24: 1-8.]。目前传统工艺多采用化学合成法生产α-KG，包括草酸类乙酯水解法或酰基氰化物水解法等，但是化学合成法由于条件苛刻、能耗大且得率低，合成工艺中会使用大量氰化物、重金属离子、强酸强碱等有害试剂，严重限制该方法在医药、化妆品和食品等行业的应用。相比于化学合成法，基于发酵法生产α-KG具有生产原料丰富、成本较低、得率较高等优点，但是由于发酵过程产生过多的丙酮酸、富马酸、苹果酸等副产物，并且存在生产菌种资源匮乏、发酵产量偏低、发酵周期过长等不利因素，尚不能满足大规模工业生产的需要。生物转化法由于具有操作简便、条件温和、原料利用率高、转化率高且易分离纯化等优势，在大幅节约生产成本和解决谷氨酸产能过剩方面具有重要应用需求。
L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase, LGOX）能够高效的催化L-谷氨酸转化生成高附加值产品α-KG，是生物转化法生产α-KG的关键酶制剂[Niu P, Dong X, Wang Y, etal. Enzymatic production of alpha-ketoglutaric acid from L-glutamic acid viaL-glutamate oxidase. J Biotechnol, 2014, 179: 56-62.]。LGOX介导的催化反应具有反应条件温和、催化效率高、底物特异性强及环境友好等诸多优势，已被广泛应用于食品、医药、化工及环保等领域。但是由于酶活性普遍较低，最适活性pH偏酸性，并且稳定性较差，实际应用受到很大影响。2017年，申请人课题组以筛选具有潜在高活性的LGOX为出发点，发掘和鉴定出多个不同来源的LGOX，后续通过L-谷氨酸氧化酶诱导性培养基进行复筛后，获得一株具有优良L-谷氨酸氧化酶催化活性的链霉菌[Liu Q, Ma X, Cheng H, et al. Co-expression of L-glutamate oxidase and catalase in Escherichia coli to producealpha-ketoglutaric acid by whole-cell biocatalyst. Biotechnol Lett, 2017, 39:913-919.]。将来源于链霉菌X的L-谷氨酸氧化酶基因在E. coliBL21中进行克隆表达和纯化，粗酶活性达到125.7 U/mg，远远高于目前已知的L-谷氨酸氧化酶。酶学性质研究发现，该酶最适反应pH 6.0，最适反应温度35°C，但是酶的热稳定性稍差，当反应温度高于45 °C时，LGOX酶活会急剧下降。尽管该酶稍有瑕疵，但是其优良的催化活性潜力，为后续开发α-KG高效生物转化制备技术奠定了重要基础。
发明内容
基于以上认识，本发明的主要目的在于提供一种具有优良抗逆性能的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，同时利用该工程菌设计构建高效微生物细胞工厂，能够实现在低pH胁迫环境条件下高效制备α-酮戊二酸等酸性生物基化学品。
优良生物功能元件的挖掘、表征和标准化是合成生物学研究的基石，也是构建高效抗逆微生物底盘的前提。本发明通过测试谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicumATCC 13032）已报道的抗逆候选基因，以及挖掘来源于（Escherichia coliMG1655）、短乳杆菌（Lactobacillus brevisATCC 367）、嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Acid ithiobacillusferrooxidansATCC 23270）和极端嗜热古菌（Thermococcus kodakarensisKOD1）等微生物中潜在的抗逆调控因子、信号响应蛋白、分子伴侣或修复蛋白等功能元件，挖掘和评估适用于谷氨酸棒杆菌的潜在抗酸功能元件。经过生长耐受性测试，本发明提供了多个优良候选抗酸功能元件，其中包括短乳杆菌Cfa [GenBank:ABJ65104.1]、谷氨酸棒杆菌Dps [GenBank: CAF18940.1]、嗜酸性氧化亚铁硫杆菌GroES[GenBank: ACK77997.1]和极端嗜热古菌TK2097 [GenBank: BAD86286.1]，可为构建抗酸胁迫性能提升的谷氨酸棒杆菌提供重要的作用靶点。
由此，本发明提供了一种抗酸胁迫能力强的谷氨酸棒杆菌工程菌，其是将低酸高度特异性响应启动子控制下的抗酸基因导致谷氨酸棒杆菌出发菌中而获得。
具体地，所述低酸高度特异性响应启动子是Pcg2796；所述抗酸基因选自GenBank登录号为 CAF18940.1的Dps、GenBank登录号为BAD86286.1的TK2097和GenBank登录号为ACK77997.1的GroES。
在具体实施方式中，所述出发菌是谷氨酸棒杆菌将野生型谷氨酸棒杆菌，或者将其通过低于pH6的低酸环境下胁迫条件进行传代培养获得的驯化菌，其在低酸环境条件下的菌体生物量高于野生菌。
优选地，进一步在所述出发菌中共表达谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶获得的基因工程菌，以实现α-KG的一步法合成。
更优选地，所述谷氨酸氧化酶是L-谷氨酸氧化酶或其突变体，所述突变体是指在来源于茂源链霉菌野生型L-谷氨酸氧化酶基础上，将其第280位氨基酸由丝氨酸S突变为苏氨酸T，或者第533位氨基酸由组氨酸H突变为亮氨酸L；所述过氧化氢酶是大肠杆菌过氧化氢酶。
更具体地，进一步通过基于基因敲除方法，敲除出发菌中的代谢途径下游α-酮戊二酸脱氢酶编码基因kgd[GenBank: CAF19835.1]、谷氨酸脱氢酶编码基因gdh[GenBank:CAF20415.1]和谷氨酸外排蛋白编码基因mscCG[GenBank: CAF19973.1]，以提高胞内谷氨酸前体供给和胞内α-KG积累水平。
在一个具体实施方式中，所述α-酮戊二酸脱氢酶编码基因是GenBank登录号为CAF19835.1的kgd；所述谷氨酸脱氢酶编码基因是GenBank登录号为 CAF20415.1的gdh；所述谷氨酸外排蛋白编码基因GenBank登录号为CAF19973.1的mscCG。
优选地，所述基因敲除方法是基于同源重组进行靶基因的无痕敲除。
本发明也提供一种生物法制备生产酸性生物基化学品例如α-酮戊二酸的方法，其利用所述谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌生产α-酮戊二酸。
具体地，通过高密度发酵培养制备全细胞催化用菌泥，以L-谷氨酸或其盐为底物进行催化反应获得α-酮戊二酸。
更具体地，所述催化是在温度为35oC，搅拌转速为300 r/min，设置通气量为80NL/min，催化时间为24～40小时。
本发明的有益效果在于：本发明利用适应性进化和合成生物学策略等成功构建了一种抗酸胁迫能力提高的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，并提供了一种利用该工程菌在酸性条件下高效制备α-酮戊二酸等酸性生物基化学品的工艺方法。该方法具有较高的底物转化率且副产物较少，制备方法简单方便，生产条件温和，所制备的α-酮戊二酸在酸性环境中具有更好的稳定性，展示出很好的技术应用前景。本发明所公布的谷氨酸棒杆菌酸性环境转化工艺，既能够满足L-谷氨酸氧化酶的最优催化反应条件，从而更加高效的催化L-谷氨酸（盐）生成α-酮戊二酸，同时也有助于节约碱液使用量，减少高浓度废水产生，提高产品的分离纯化效率。
附图说明
图1为谷氨酸棒杆菌抗酸底盘菌的筛选和构建测试；
图2为谷氨酸棒杆菌α-酮戊二酸生产菌构建示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1：抗酸功能元件的挖掘和测试
抗酸元件作为发挥作用的关键功能元件，在低酸胁迫情况下会响应环境信号输出，并且根据环境信号做出及时的反应，调控微生物菌株胞内pH 稳态，从而使微生物维持生长和代谢最适状态。为了进一步挖掘适用于谷氨酸棒杆菌的潜在抗酸功能元器件，利用穿梭载体pXMJ19分别过表达了来源于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicumATCC13032、大肠杆菌（Escherichia coliMG1655）、短乳杆菌（Lactobacillus brevisATCC367）、嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（AcidithiobacillusferrooxidansATCC 23270）和极端嗜热古菌（Thermococcus kodakarensisKOD1）中选取的多个潜在抗逆元件，并进行了菌株低酸胁迫耐受性初步测试。研究结果表明，过表达短乳杆菌来源Cfa[GenBank: ABJ65104.1]，谷氨酸棒杆菌来源的Dps [GenBank: CAF18940.1]，嗜酸性氧化亚铁硫杆菌来源的GroES[GenBank: ACK7797.1]和极端嗜热古菌来源TK2097[GenBank: BAD86286.1]元件，能够使菌株在低酸胁迫下的生物量分别提高7.5%，19.0%，23.1%和17.9%，提示上述筛选到的高效候选抗酸元件，有望用作后续抗逆基因线路中的基础功能元件资源。
实施例2：谷氨酸棒杆菌抗酸胁迫底盘菌的构建
微生物在长期进化过程中发展出了许多修复DNA损伤的方法或途径，例如尿嘧啶糖基修复酶系统和错配修复系统能纠正复制的错误，光复活修复系统、切除修复系统、重组修复系统和SOS修复系统等能修复环境因素和体内化学物质造成的DNA分子损伤。申请人前期专利申请CN115725631A提供了一种基于DNA损伤修复机制的可控高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌构建方法及其应用，利用该工程菌建立基因组水平连续突变提升工具，可以实现在给定环境胁迫条件下的“边突变边筛选”，达到具有优良抗逆表型的谷氨酸棒杆菌工程菌可控高效选育目标。在其中一个具体的实施例中，通过低酸耐受性进化实验，在一个相对较短的连续筛选周期内，可以快速获得对环境低酸胁迫具有更好鲁棒性和适应性的进化菌。以谷氨酸棒杆菌野生型ATCC 13032为出发菌，分别使用pH5.8、pH5.5、pH5.2低酸胁迫条件进行传代培养，经过三轮共计9天传代，能够快速筛选得到在低酸胁迫下具有较好生长特性的驯化菌，经过后续分离纯化后可以从100个单菌落中得到一株在pH6.0低酸环境条件下，菌体生物量提高30%以上的谷氨酸棒杆菌进化菌CgEVO。
酸碱特异性响应元件作为抗酸基因回路中控制模块的关键一环，其对不同 pH的响应性能，如精准性、广泛性以及灵敏性，直接关系到设计的基因线路是否按照预期有序运行。根据目前文献已报道的谷氨酸棒杆菌在不同pH条件下转录组数据，以及综合已有知识中关于模式菌中抗酸响应元件的研究成果，分析、筛选和测试了十余种基因启动子的pH响应特异性。通过将十余种候选基因启动子序列置于eGFP荧光蛋白编码基因前，测试相关响应元件在不同pH胁迫条件下的表达情况，研究证实来源于谷氨酸棒杆菌的Pcg2796是低酸高度特异性响应启动子，其表达水平随着外界酸性pH环境变化出现明显差异（图1中A）。上述所述Pcg2796启动子序列如SEQ IDNO.1 所示：ccatcctcatcctggctgagaacaacactattgattggaccttcagaaaatatgtgagctggagtcatagcccccgagtgtaatgaaaaatgtccatccggggcatggaatttggggtttggaatttggggtggaagcttccggaagacaaggtgcttaatgggaggattggcacacatttccaaccctcgacacacagataaccaaacactaacaaaaatcttttacacatagaagagttctatgacttgatccacaatgtgatgcaaatcattgaccctcaccccggaccaagcgcttaatgaaggcaagccaaacttaactagtagataggattgca。
基于上述鉴定的高效候选抗酸元件和pH特异型响应启动子，将相应生物元件进行有序组合后，导入筛选的谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032和进化菌CgEVO中，获得一系列的抗酸基因线路。其中将抗酸功能元件Dps [GenBank: CAF18940.1]、TK2097 [GenBank:BAD86286.1]和GroES[GenBank: ACK80015.1/ACK77997.1]置于低酸高度特异性响应启动子Pcg2796控制下所获得的抗酸基因线路，能够赋予菌株更加优良的低酸胁迫抵御能力，所述抗酸基因元件的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。采用目前常用的基于SacB蔗糖致死原理的同源重组技术在染色体水平上整合抗酸基因线路，详细步骤可见公开专利CN112375726B、CN103805552B等。具体为利用重叠延伸PCR的方法，获得含有靶基因启动子上下游~1 kb侧翼序列和抗酸基因线路的融合片段，亚克隆于pK18mobsacB或pCRD206等敲除载体，构建靶基因表达替换质粒。将该替换质粒分别电转化谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032、进化菌CgEVO后，经过两轮同源双交换过程后，筛选得到相应的谷氨酸棒杆菌抗酸基因线路菌CgAID1和CgAID2。
在pH6.0低酸胁迫环境条件下，测试谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032、进化菌CgEVO、抗酸基因线路菌CgAID1和CgAID2的生长情况。结果如图1所示，相比于野生型ATCC13032对照菌株，含有抗酸基因线路的底盘菌CgAID1和CgAID2在pH6.0低酸环境条件下的菌体生物量分别提高32%和41%（图1中B），提示抗酸基因线路菌具有改善的低酸胁迫耐受性能。
实施例3：生产α-酮戊二酸的谷氨酸棒杆菌基因工程菌构建
目前原核微生物生产α-酮戊二酸（α-KG）的报道相对较少，部分报道以大肠杆菌作为生产菌株，限制了其在食品及医药等行业的应用。在一个具体实施案例中，选用食品安全级谷氨酸棒杆菌ATCC 13032作为出发菌株，通过共表达谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶，以及底盘工程菌的系统代谢工程改造，实现α-KG的一步法合成（图2）。本发明一方面可以显著提高大宗发酵产品谷氨酸的附加值，另一方面生物催化法具有工艺周期短、转化效率高和副产物少等优点，无论在生产工艺还是安全性方面都具有较大优势。
利用谷氨酸棒杆菌成熟的遗传操作系统，基于穿梭表达载体pXMJ19异源共表达L-谷氨酸氧化酶突变体和大肠杆菌过氧化氢酶KatE，所述共表达重组质粒pXMJ19-tac-lgox-katE构建方法和步骤可见申请人前述专利CN 110283800 B等，在一个质粒中同时导入L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的编码基因。本发明中所述L-谷氨酸氧化酶突变体是指在来源于茂源链霉菌野生型L-谷氨酸氧化酶基础上，将其第280位氨基酸由丝氨酸S突变为苏氨酸T，或者第533位氨基酸由组氨酸H突变为亮氨酸L。所述重组工程菌是将上述双酶共表达载体转化或导入谷氨酸棒杆菌底盘宿主菌野生菌ATCC 13032及其衍生菌所得。
为了防止重组谷氨酸棒杆菌合成的α-KG被菌体利用或降解，采用代谢工程手段对底物摄取过程、α-KG降解途径和运输系统等进行改造。一个具体实施例中，在谷氨酸棒杆菌抗酸线路底盘菌CgAID1基础上，基于无痕基因敲除技术，敲除代谢途径下游α-酮戊二酸脱氢酶编码基因kgd[GenBank: CAF19835.1]、谷氨酸脱氢酶编码基因gdh[GenBank:CAF20415.1]和谷氨酸外排蛋白编码基因mscCG[GenBank: CAF19973.1]，提高胞内谷氨酸前体供给和胞内α-KG积累水平。本发明主要采用基于温度敏感和SacB蔗糖致死原理的同源重组技术进行靶基因的无痕敲除，详细步骤可见公开专利CN112375726B、CN103805552B等。利用重叠延伸PCR的方法，获得含有靶基因上下游~1 kb侧翼序列的融合片段，亚克隆于pCRD206或pK18mobsacB等谷氨酸棒杆菌常用敲除载体，构建靶基因敲除质粒。将敲除质粒电转化谷氨酸棒杆菌抗酸线路底盘菌CgAID1后，经过两轮同源双交换过程后，筛选得到原位靶基因缺失菌。
实施例4：生物法制备α-酮戊二酸等酸性生物基化学品工艺建立
本实施例用于提供一种在酸性环境下制备α-酮戊二酸等酸性生物基化学品的工艺方法。利用上述实施例3制备得到的原位靶基因缺失菌，按照申请人前述专利CN110283800 B中的记载方法，通过高密度发酵培养制备全细胞催化用菌泥，建立α-KG的生物制备工艺。所述α-KG的生产方法是利用发酵罐建立5 L全细胞催化体系，全细胞转化体系控制在酸性pH6.0或中性pH 7.5条件下进行，其中整个反应体系中包含L-谷氨酸（盐）底物浓度为270 g/L，催化菌泥浓度为15 g/L，控制整个反应体系中催化温度为35oC，搅拌转速为300 r/min，同时设置通气量为80 NL/min，待催化时间为24～40小时后，待反应结束后，利用液相色谱法（HPLC）对催化反应液中α-KG进行含量测定。
经液相色谱检测分析发现：在酸性催化环境条件下，催化反应进行26 h后，全细胞催化反应液中α-KG的含量可达190.2 g/L，生产强度为7.32g/h；而在中性催化环境条件下，催化反应进行30 h后，全细胞催化反应液中α-KG的含量可达185.2 g/L，生产强度为6.17g/h，提示酸性催化环境更有利于谷氨酸棒杆菌工程菌生产制备α-KG。此外，通过对全细胞催化反应液中α-KG产物的稳定性进行测试发现，酸性催化环境下全细胞催化反应液放置24h后，α-KG的含量降低到179.8 g/L，大约5.47%的产物出现降解；而中性催化环境下全细胞催化反应液放置24 h后，α-KG的含量降低到157.4 g/L，大约15.01%的产物出现降解，同样提示酸性催化环境有助于维持α-KG的稳定性，可大大节约生产成本和简化分离纯化流程，具有较好的技术应用前景。
Claims (11)
1.一种谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，其是将低酸高度特异性响应启动子控制下的抗酸基因元件导入谷氨酸棒杆菌出发菌中而获得。
2.如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，所述低酸高度特异性响应启动子是来源于谷氨酸棒杆菌的Pcg2796；所述抗酸基因元件来源于短乳杆菌Cfa ，其GenBank登录号为ABJ65104.1、谷氨酸棒杆菌Dps ，其GenBank登录号为CAF18940.1、嗜酸性氧化亚铁硫杆菌GroES，其GenBank登录号为ACK77997.1，极端嗜热古菌TK2097 ，其GenBank登录号为BAD86286.1。
3.如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，所述出发菌是谷氨酸棒杆菌将野生型谷氨酸棒杆菌，或者将其通过低酸环境下胁迫条件进行传代培养获得的驯化菌，其在低酸环境条件下的菌体生物量高于野生菌。
4.如权利要求1至 3任一项所述的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，在所述出发菌中共表达谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶获得的基因工程菌，以实现α-KG的一步法合成。
5.如权利要求4所述的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸氧化酶是L-谷氨酸氧化酶或其突变体，所述突变体是指在来源于茂源链霉菌野生型L-谷氨酸氧化酶基础上，将其第280位氨基酸由丝氨酸S突变为苏氨酸T，或者第533位氨基酸由组氨酸H突变为亮氨酸L；所述过氧化氢酶是大肠杆菌过氧化氢酶。
6.如权利要求4所述的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，进一步通过基于基因敲除方法，敲除出发菌中的代谢途径下游α-酮戊二酸脱氢酶编码基因kgd ，其GenBank登录号为CAF19835.1、谷氨酸脱氢酶编码基因gdh，其GenBank登录号为 CAF20415.1和谷氨酸外排蛋白编码基因mscCG，其GenBank登录号为 CAF19973.1，以提高胞内谷氨酸前体供给和胞内α-KG积累水平。
7.如权利要求6所述的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，所述α-酮戊二酸脱氢酶编码基因是GenBank登录号为CAF19835.1的kgd；所述谷氨酸脱氢酶编码基因是GenBank登录号为 CAF20415.1的gdh；所述谷氨酸外排蛋白编码基因GenBank登录号为CAF19973.1的mscCG。
8.如权利要求7所述的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，所述基因敲除方法是基于同源重组进行靶基因的无痕敲除。
9.一种生物法制备生产酸性生物基化学品的方法，其特征在于，其利用如权利要求1至8任一项所述谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌生产酸性生物基化学品。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，通过高密度发酵培养制备全细胞催化用菌泥，以L-谷氨酸或其盐为底物进行催化反应获得α-酮戊二酸。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述催化是在低酸性条件pH6.0，温度为35oC，搅拌转速为300 r/min，设置通气量为80 NL/min，催化时间为24～40小时。
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