TWI308594B - Method for producing l-amino acid - Google Patents

Description

1308594 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明關於產製L -胺基酸之方法及用於此方法之細 菌。更確實的說，本發明關於具改良之L一胺基酸產製能 力的細菌及利用此細菌以產製L 一胺基酸之方法。 【先前技術】 傳統上，L 一胺基酸（諸如L -麩胺酸）主耍係利用 屬於下列菌屬之稱爲棒形菌的細菌醱酵所製得：短桿菌屬 (Brevibacterium)、棒桿菌屬（Corynebacterium)或微 小菌屬（Microbacterium) ( ''Amino Acid Fermentation ” ，Gakki Shuppan Center，196—215 頁，1 9 8 6 ) 〇 再者 ，亦可利用下列菌屬之微生物來產製L一胺基酸：桿菌屬 (Bacillus )、鏈黴菌屬（Streptomyces)、青黴菌屬（ Penicillium )(美國專利3，2 2 0，9 2 9號）、假單孢菌屬（ Pseudomonas)、分節芽孢桿菌屬（Arthrobacter)、沙雷 氏菌屬（Serratia)、產氣桿菌屬（Aerobacter)、念珠菌 屬（Candida)(美國專利3,5 63,8 5 7號）、埃希氏菌屬（ Escherichia )(日本專利公開公報5 — 244970號），等。 還有，亦可利用下列菌屬之微生物來產製L -胺基酸（諸 如 L —麩胺酸）：腸桿菌屬（Enterobacter)( EP1078989A2)、克雷白桿菌屬（Klebsiella)、歐文氏菌 屬（Erwinia)或潘朵氏菌（Pentoea)(日本專利公開公 報 2000 — 106869 號）。 1308594 再者，現已揭露多種經由DN A重組技術來增強涉及 生物合成L一胺基酸之酶，藉以增加L-胺基酸之產製能 力的技術。例如，有一種已揭示之用於產製L -胺基酸之 方法係利用屬於腸桿菌屬或克雷白桿菌屬之細菌來進行， 在這些細菌中係引入一檸檬酸合成酶基因（EP0999282A2 )，還有另一種已揭示之方法係利用屬於腸桿菌屬之細菌 來進行，在這些細菌中係引入編碼檸檬酸合成酶、磷酸烯 醇丙酮酸羧基酶和麩胺酸脫氫酶的基因（EP 107898 9 A2) 〇 再者，亦已知經由引入編碼糖解酶，如：葡萄糖- 6 一磷酸異構酶（WO 0 1/02542 A1 )、果糖磷酸轉移酶（ WO 01/48146 A1)和烯醇酶（WO 01/02543 A1) 的基因 來增強L -胺基酸產製力的技術。 同時，許多革蘭氏-陰性菌（包括腸桿菌）均具有安 特納一道朵洛夫（Entner-Doudoroff)途徑以作爲葡萄糖 代謝途徑之一。此途徑涉及6 -磷酸葡萄糖酸脫水酶（以 下縮寫爲a EDD〃 ），其可從6-磷酸葡萄糖酸製造2 — 酮一 3 —去氧一 6-磷酸葡萄糖酸酯；此途徑還涉及2-酮 一 3 -去氧一 6 —磷酸葡萄糖酸醛縮酶（以下縮寫爲"EDA ")，其可切割2-酮一 3 -去氧一 6—磷酸葡萄糖酸酯以 製造甘油醛一 3-鱗酸酯和丙酮酸。編碼EDD和EDA之 基因已從大腸桿菌（Escherichia coli)、運動醱酵單胞菌 (Zymomonas mobilis)等菌中選殖出，且彼等之核苷酸 序列已有報告。編碼大腸桿菌之EDD的基因（edd )及編 1308594 碼EDA的基因（eda )的核苷酸序列在 編號爲L2〇879。還有，在資料庫中， eda基因的核苷酸序列在 GenBank X5 83 64，而其edd基因的核苷酸序列J 編號爲 M60615 M37982。 然而，介於安特納一道朵洛夫途徑 製力間的關係仍然未知。 發明槪述 本發明的目標係從與已知技術不同 用來改良細菌之L 一胺基酸的產製力的 本發明之發明者將其注意力集中在 具有之安特納-道朵洛夫途徑。在從醣 如：L -麩胺酸）的代謝途徑之間，藉 酸脫氫酶，從6-磷酸葡萄糖酸製造相 的反應會產生二氧化碳。尤其是，在有 酸酯途徑的細菌中，應該亦有大量二氧 出。因此’本發明之發明者認爲產製 一麩胺酸）的能力可藉由避免讓碳流進 來改良。 本發明者構想二種減少碳流進入戊 法： (1)排除或減少葡萄糖一 6 一憐酸 酸葡萄糖酸脫氫酶之活性；（2 )增強

GenBank所登記的 運動醱酵單胞菌之 所登記的編號爲 έ記在GenBank的 和L 一胺基酸之產 的觀點來提供一種 技術。 革蘭氏-陰性菌所 類到L 一胺基酸（ 由6—磷酸葡萄糖 I酮糖一 5 -磷酸酯 大量碳流入戊糖磷 化碳藉上述反應釋 L 一胺基酸（如：L 入戊糖磷酸酯途徑 糖磷酸酯途徑的方 酯脫氫酶或6-磷 安特納-道朵洛夫 -8- 1308594 途徑。這二種方法均可預期具有繞道 果。然而，在（2 )的情况中，考慮 途徑有關的碳分佈可經由調節EDD J ，亦可補充在戊糖憐酸酯途徑中之中 :核酸。再者，由不同檢查得到的結 產製L一胺基酸的能力可藉由增强安 來改良，因此完成本發明。 也就是說，本發明提供下列各項 (1 ) 一種用於產製L —胺基酸 基質中培養一種具產製L-胺基酸之 並在該基質中累積該L-胺基酸，及 胺基酸，其中該微生物係一具安特納 蘭氏-陰性菌，且其已經改質以增强 水酶活性或2—酮一 3 —去氧一 6-磷 性或該兩種酶之活性，且該L -胺基 丙酮酸作爲中間體之生物合成途徑所 選出。 (2 )如第（1 )項之方法，其中 〇 (3 )如第（2 )項之方法，其中 屬。 (4 )如第（1 )至（3 )項中之 6-磷酸葡萄糖酸脫水酶活性或2- 酸葡萄糖酸醛縮酶活性係藉由下述之 戊糖磷酸酯途徑的效 到由於與戊糖磷酸酯 I EDA來改變，因此 間物質的衍生物，如 果中，吾人發現細菌 特納-道朵洛夫途徑 之方法，其包含在一 能力的微生物以產製 從基質中收集該L一 -道朵洛夫途徑之革 6-磷酸葡萄糖酸脫 酸葡萄糖酸醛縮酶活 酸係從彼等經由利用 製造的L一胺基酸中 該細菌爲一種腸桿菌 該細菌係屬於腸桿菌 任一項的方法，其中 嗣—3 一去氧一 6 一憐 方式增强：增加編碼 -9- 1308594 6-磷酸葡萄糖酸脫水酶或2-酮—3 —去氧一 6 -磷酸葡 萄糖酸醛縮酶之基因的複本數，或修改該基因之表現調節 序列，以增强該基因在該細菌細胞中的表現。 (5)如第（1)項之方法，其中該L一胺基酸爲L 一 麩胺酸，或由一利用L 一麩胺酸作爲中間體或胺基供給者 之生物合成途徑所製造之L-胺基酸。 (6 )如第（1 )至（5 )項中之任一項的方法，其中 該L 一胺基酸係選自如下群體：L 一麩胺酸、L —精胺酸、 L —麩醯胺酸、L —脯胺酸、L 一白胺酸、L _異白胺酸、L —纈胺酸及L一丙胺酸。 (7)如第（6)項之方法，其中該L一胺基酸爲L — 麩胺酸。 根據本發明，藉由增加安特納-道朵洛夫途徑之活性 可改良具該途徑之微生物之產製L -胺基酸的能力。 【發明內容】 本發明將詳細說明於下。 < 1 >本發明之細菌 用於本發明之革蘭氏-陰性菌爲具有產製L-胺基酸 之能力及安特納-道朵洛夫途徑的革蘭氏一陰性菌。 本發明所使用之t產製L -胺基酸之能力〃一詞係指 當將本發明之細菌培養在基質中時，可在基質中累積L-胺基酸的能力。此產製L一胺基酸之能力可爲革蘭氏一陰 -10- 1308594 性菌之野生株的性質，或爲經由培育所授給或增強的性質 。可應用本發明之L一胺基酸爲那些經由利用丙酮酸作爲 中間體之生物合成途徑所製造的L -胺基酸。其特殊實例 包括：L 一麩胺酸、L一精胺酸、L一麩醯胺酸、L一脯胺 酸、L一白胺酸、L —異白胺酸、L一纈胺酸，L一丙胺酸 等。 如梢後說明之實例所顯示者，經由增加EDD和EDA 之活性而使其安特納-道朵洛夫途徑增强的細菌顯示出可 增加乙醯甲基甲醇和2,3 — 丁二醇之產量。由於2,3 — 丁 二醇係從乙醯甲基甲醇製出，而乙醯甲基甲醇係從丙酮酸 製出，因此乙醯甲基甲醇和2,3 —丁二醇之產量增加即表 示所供應之丙酮酸量增加。因此，可預期該具增强之安特 納-道朵洛夫途徑的細菌在經由一利用丙酮酸作爲中間體 之生物合成途徑來製造L -胺基酸方面的能力有所增加。 具安特納一道朵洛夫途徑之革蘭氏-陰性菌的特殊實 例包括屬於下列菌屬之細菌：腸桿菌屬、克雷白桿菌屬 、沙雷氏菌屬、歐文氏菌屬或潘朵氏菌屬、埃希氏菌屬、 假單孢菌屬、分節芽孢桿菌屬、及產氣桿菌屬等。細菌是 否具有安特納-道朵洛夫途徑可藉如下述之方法決定：將 細胞被打破之懸浮液與甘油醛- 3 -磷酸脫氫酶、6 -磷酸 葡萄糖酸和乙醯基吡啶腺嘌呤二核苷酸混合，並在365 nm下測量增加之吸收，以偵測從作爲受質之6 -磷酸葡 萄糖酸所製出之甘油醛- 3-磷酸酯。經證實可產製甘油 醛- 3-磷酸酯之細菌具有安特納-道朵洛夫途徑。 -11 - 1308594 本發明所使用之細菌可根據靶的L -胺基酸之類型做 適當地選擇。適合產製L -麩胺酸之細菌例示於下。然而 ’本發明之範圍並非侷限於此。 腸桿菌屬之特殊實例包括下列細菌： 團集性腸桿菌（Enterobacter agglomerans) 產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes) 安尼杰納腸桿菌（Enterobacter amnigenus) 歐斯布利腸桿菌（Enterobacter asburiae) 陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae) 溶解腸桿菌（Enterobacter dissolvens ) 白勾維腸桿菌（Enterobacter gergoviae) 霍馬其腸桿菌（Enterobacter hormaechei) 中間腸桿菌（Enterobacter intermedius) 尼普舒利腸桿菌（Enterobacter nimipressuralis) 阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii) 泰勒腸桿菌（Enterobacter taylorae) 下列菌株爲較佳者： 團集性腸桿菌ATCC 1 22 8 7 團集性腸桿菌 AJ 1 3 3 5 5 (或CCRC 910121 ) 團集性腸桿菌 AJ 13356 (或CCRC 910122) 團集性腸桿菌 AJ 1 3 60 1 (或CCRC 910157) 團集性腸桿菌AJ 1 3 3 5 5和AJ 1 3 3 5 6係於1 9 9 8年2 月1 9日存放在國家工業科學和技術局，生物科學和人類 技術協會（National Institute of Bioscience and Human — -12- 1308594

Technology, Agency of Industrial Science and Technology )(現爲，國家先進工業科學和技術協會，國際專利有機 體保管處，獨立管理公司 （independent administrative corporation, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，地址：Chuo Dai-6,1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi，Ibaraki-ken,日本，郵遞區號：305-5466 )，其 編號分別爲FERM P — 1 6644和FERM P — 1 6645。然後， 此受託物於1 999年1月1 1日，在布達佩斯條約的規定下 轉變爲國際受託物，其編號分別爲FERM BP — 66 1 4和 FERM BP — 6615，且亦於1999年3月17日寄存於台灣食 品工業發展硏究所，其編號分別爲CCRC 910121和CCRC 9 10122。團集性腸桿菌 AJ 1 3 60 1係於1 999年8月18曰 存放在國家工業科學和技術局，生物科學和人類技術協會 ，編號爲FERM P — 17516。然後，此受託物於2000年7 月6日，在布達佩斯條約的規定下轉變爲國際受託物，其 編號爲FERM BP — 7207，且於2000年8月9日寄存於台 灣食品工業發展硏究所，其編號爲C C R C 9 1 0 1 5 7。團集性 腸桿菌 ATCC 12287可由ATCC(美國典型培養收集處（ American Type Culture Collection) ，1 0 8 0 1 University Boulevard，Manassas，VA，美國）提供。 屬於克雷白氏菌屬之細菌實例包括下列細菌： 普蘭提可拉克雷白氏菌（Klebsiella planticola) 泰利吉納克雷白氏囷（Klebsiella terrigena) -13- 1308594 較佳的爲普蘭提可拉克雷白氏菌AJ13399。普蘭提可 拉克雷白氏菌係於1998年2月19日存放在國家工業科學 和技術局，生物科學和人類技術協會（現爲，國家先進工 業科學和技術協會，國際專利有機體保管處，獨立管理公 司），編號爲FERM P — 1 6646。然後，此受託物於1999 年1月1 1日，在布達佩斯條約的規定下轉變爲國際受託 物，其編號爲FERM BP — 6616。 普蘭提可拉克雷白氏菌AJ 1 3 3 99菌株係一種從北海道 札幌市內之土壤分離出的菌株。 本發明所使用之屬於沙雷氏菌屬的微生物實例包括下 列細囷： 液化沙雷氏菌（Serratia liquefacience) 嗜蟲沙雷氏菌（Serratiaentomophila) 費卡利沙雷氏菌（Serratia ficaria) 方提可拉沙雷氏菌（Serratia fonticola) 格利美西沙雷氏菌（Serratia grimessi) 普提馬庫蘭沙雷氏菌（Serratia proteamaculans) 芬芳沙雷氏菌（Serratia odorifera) 普利茅斯沙雷氏菌（Serratia plymuthica) 深紅色沙雷氏菌（Serratia rubidaea) 下列菌株爲較佳者： 液化沙雷氏菌ATCC 14460 液化沙雷氏菌ATCC 14460可由ATCC提供。 本發明所使用之屬於歐文氏菌屬的微生物實例包括下 -14- 1308594 列細菌： 草生歐文氏菌（現在被分類爲團集性潘朵氏菌（ Pantoea agglomerans )) 疲蘿歐文氏菌（Erwinia ananas) 滅仙人掌歐文氏菌（Erwiniacacticida) 菊歐文氏菌（Erwinia chrysanthemi ) 馬洛提瓦歐文氏菌（Erwiniamallotivora) 伯西納斯歐文氏菌（Erwinia persicinus) 西迪歐文氏菌（Erwiniapsidii) 櫟歐文氏菌（Erwinia quercina) 大黄歐文氏菌（Erwinia rhapontici) 生紅歐文氏菌（Erwinia rubrifaciens) 柳歐文氏菌（Erwinia salicis) 職夏孢歐文氏菌（Erwinia uredovora) 草生歐文氏菌 IAM 1 5 95 (團集性潘朵氏菌 AJ2666 )爲較佳之菌株。草生歐文氏菌 IAM1595可由東京大學 之分子和細胞生物科學協會提供。 在 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology， 第9版中並未提及草生歐文氏菌，而該曾被分類爲草生歐 文氏菌之微生物現在被分類爲團集性潘朵氏菌。因此，屬 於歐文氏菌屬的微生物與屬於潘朵氏菌屬的微生物彼此很 相近。所以，屬於潘朵氏菌屬的微生物可依屬於歐文氏菌 屬之微生物的類似方式使用。關於這類屬於潘朵氏菌屬的 微生物，可提出的有：團集性潘朵氏菌、分散潘朵氏菌（ -15- 1308594

Pantoea dispersa)、安納諾斯潘朵氏菌（pantoea ananas )。草生歐文氏菌IAM 1 595被命名爲團集性潘朵氏菌 AJ2666，其係存放在國家工業科學和技術局，生物科學和 人類技術協會（現爲，國家先進工業科學和技術協會， 國際專利有機體保管處），此受託物於1999年2月25日 ’在布達佩斯條約的規定下成爲國際受託物，其編號爲 FERM BP - 6660。 本發明所使用之屬於埃希氏菌屬的微生物實例包括大 腸埃希氏菌。 具纈胺酸抗性之大腸埃希氏菌爲較佳者，且其特殊實 例爲下列菌株： 大腸埃希氏菌 K— 12 ( ATCC 10798) 大腸埃希氏菌 W(ATCC 9637) 大腸埃希氏菌 K— 12 (ATCC 1 079 8 )，且大腸埃希 氏菌 W (ATCC 9637)可由ATCC提供。 本發明之革蘭氏一陰性菌爲一種具產製L -胺基酸之 能力及具前述之安特納一道朵洛夫途徑的革蘭氏一陰性菌 ’且其已經過修改，而使其EDD或EDA之活性或此二種 活性被增强。本發明之細菌宜爲已經過修改，而使其 EDD和EDA二種活性被增強之革蘭氏一陰性菌。 &經過修改，以增強EDD和EDA二種活性〃 一詞係 指每一細胞之EDD和EDA活性被修改爲較野生型細菌來 得高。例如，可提出的有：那些其中每一細胞內之EDD 或EDA分子數增加者，那些其中每一EDD或EDA分子 -16- 1308594 之EDD或EDA特殊活性增加者。再者，欲比較之野生型 細菌爲一種未曾進行過任何用於增强E D D及E D A之活性 的處理的細菌。 增強細菌中之EDD和/或EDA活性可經由增加編碼 EDD及/或EDA之基因的複本數目來達成。例如：重組 DNA可經由將編碼EDD及/或EdA之基因片段與可在靶 的細菌中發揮功能之載體連接來製得，此載體宜爲一種倍 數複本型式之載體’且該重組DNA可被引入細菌中，以 將細菌轉形。當欲將E D D和E D A二種活性均增強時，可 將編碼EDD之基因片段及編碼EDA之基因片段分別倂入 不同的載體中’但以倂入相同之載體中較佳。爲了取得轉 形株，可將重組DN A引入具L —胺基酸產製力之細菌中 ，或者’可將重組DN A引入野生型之細菌中，以取得一 轉形株’然後，將L 一胺基酸產製力加入轉形株中。 在編碼EDD之基因及編碼EDA之基因方面，可使用 任一種衍生自具安特納-道朵洛夫途徑之革蘭氏一陰性菌 的基因。具體地說，可使用衍生自埃希氏菌的基因。現已 有以衍生自大腸埃希氏菌之編碼EDD的基因（edd )及編 碼EDzA ( eda )的基因來形成一操縱子的報告（J. Bacteriol.，174 ( 14) : 4638 — 46，1992 年 7 月）。以下， 編碼EDD之基因稱爲edd，而編碼EDA之基因稱爲eda 。再者，亦已有關於醱酵單胞菌屬（Zymomonas )細菌之 基因的報告，且該edd基因和eda基因可利用以這些基因 之序列爲基礎所製得之引子，藉PCR (聚合酶鏈反應，參 -17- 1308594 考 White，T.J.等，Trends Genet.5,185 ( 1989))來取得， 或者，可利用以前述之基因序列爲基礎所製得的探針，藉 雜交法取得。例如：含大腸埃希氏菌之edd基因和eda基 因的操縱子片段可利用稍後說明之引子e d d - F ( S E Q ID NO: 1)和 eda— R(SEQ ID NO: 2)，藉 PCR 取得。其 他微生物之edd基因和eda基因亦可藉類似方法取得。雜 合條件之示範實例爲在相當於6 0。(：，1 X S S C，0.1 % S D S 的條件下，宜爲在6 0 °C，0 . 1 X S S C，0.1 % S D S的條件下 ，進行清洗。 再者，本發明所使用之edd基因和eda基因並不限於 野生型基因’且其可爲編碼如下述之基因產物的突變種或 經人工改良之基因：在一或多個部位處有一或多個胺基酸 被取代、缺失、插入、加入等情形，只要該編碼之EDD 和EDA的功能並未變質即可。雖然此處、數個〃胺基酸 所指的數目會根據蛋白質之三度空間構造中的胺基酸殘質 的位置或類型而有不同，但其可特定指2至60個，宜爲 2至40個’更佳爲2至20個胺基酸。再者，關於編碼實 質上與上述EDD和/或EDA相一致之蛋白質的DNA，可 提出的爲可與已知之edd或eda基因之核苷酸序列（如： GenBank 編號 L20897’ X58364， M60615 M37982)雜合 的DNA ’或爲可在嚴格條件下，從這些核苷酸序列產生 ’且可編碼具有類似於EDD或EDA所具之活性之蛋白質 的探針。此處’ ”嚴格條件，，係指在此條件下可形成稱爲特 異性雜種’且不形成非特異性雜種的條件。此條件很難利 -18- 1308594 用數字數値來清楚表示。然而’例如：嚴格條件包括在該 條件下’具高同質性之DNAs (如··具50%或更多同質性 之DNAs )可彼此雜合’但具較上述來得低之同質性的 DNAs彼此不雜合的條件。或者，嚴格條件之示範實例爲 在該條件下’ DNAs在相當於南方雜合反應之一般清洗條 件（也就是，60°C，lx SSC，〇.l%SDS，宜爲 O.lx SSC， 0 . 1 % S D S )下’彼此雜合的條件。 染色體DNA可藉，如：Saito和Miura之方法（參考 H.Saito 和 K_Miura，Biochem. Biophys. Acta，72，619 ( 1 963 ) ’Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp. 97-9 8，Baifukan，1 992 )或類似方法，從作爲DNA供給者 之細菌製得。 若重組DNA係經由將藉PCR放大之edd基因和eda 基因與可在大腸埃希氏菌等之細胞中自動複製的載體 DNA連接製得，並引入大腸埃希氏菌中，則接下去之操 作將變得較爲容易。可在大腸埃希氏菌之細胞中自動複製 的載體實例包括：pMW219、PSTV28、pUC19、pUC18、 pHSG299 > pHSG3 99、pHS G3 9 8、RSF1010、pBR3 22、 pACYC184，等。 爲了將依上述製得之重組DNA引入革蘭氏一陰性菌 中，可使用目前已報告之轉形方法。例如：可使用下列方 法：D.A.Morrison 的方法（Methods in Enzymology, 68, 326 ( 1 979))，以氯化鈉處理接受者細胞，以增加供〇ΝΑ -19- 1308594

進入之可透性的方法（Mandel，M_和Higa,A.，J·Mol· Biol.，53，1 59 ( 1 970))，電穿孔法（Miller J. H·， ''A

Short Course in Bacterial Genetics; Handbook 〃 ， Cold

Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., p.279,1 992 ) > 等。 亦可經由讓這些基因之倍數複本存在於細菌之染色體 DNA中來增加edd基因和/或eda基因之複本數。爲了將 edd基因和/或eda基因之倍數複本引入細菌之染色體 DNA中，可利用其倍數複本存在於染色體DNA中之序 列作爲靶的，來進行同源重組。在其倍數複本存在於染色 體DNA中之序列方面，可使用存在於可轉運要素之終端 的重複性D N A或反向重複段。再者，如日本專利公開公 報2 — 109985號中所揭示者，亦可將edd基因和/或eda 基因倂入轉因子中，並將其轉移以將這些基因之倍數複本 引入染色體DNA中。 除了根據前述之基因擴大法外，亦可以較强之表現調 節序列來取代原有者，如：染色體DNA或質體中之edd 基因和/或eda基因的啓動子，以達到增强活性的目標。 例如：已知lac啓動子、trp啓動子、trc啓動子等爲強啓 動子。如國際專利刊物W Ο 〇 〇 / 1 8 9 3 5號中所揭示者，將 δ午多核甘酸取代入edd基因和/或eda基因之啓動子區中 可改良啓動子’而使其成爲較强之啓動子。取代或改良這 些啓動子可增强edd基因和/或eda基因之表現，因此可 增加EDD和/或EDA之活性。改良這些表現調節序列， -20- 1308594 可與增加edd基因和/或eda基因之複本數合併進行。 EDD及EDA之活性是否增加可經由下述方法來確定 :將細胞被打破之懸浮液與甘油醛- 3 -磷酸脫氫酶和6 -磷酸葡萄糖酸混合，並測量從作爲受質之6-磷酸葡萄 糖酸所產生的甘油醛- 3 -磷酸酯。在此反應中，可藉由 定量在利用6 -磷酸葡萄糖酸脫氫酶進行反應後所剩餘之 6 -磷酸葡萄糖酸的量來測量EDD活性，或可藉由定量在 過量之2-酮一 3 —去氧一 6 -磷酸葡萄糖酸醛縮酶之存在 下’利用乳酸脫氫酶進行反應後，所產生之丙酮酸來測量 EDD活性。6-磷酸葡萄糖酸或丙酮酸可經由測量在脫氫 酶反應中所增加之NADH來定量。再者，亦可偵測以2 — 酮- 3 -去氧- 6 -磷酸葡萄糖酸酯作爲受質時，利用乳酸 脫氫酶進行反應後’所產生之丙酮酸的量來測量EDA活 性。 在本發明之革蘭氏-陰性菌中，可增强除了 EDD和 ED A外之用來催化生物合成l 一胺基酸的酶的活性，只要 EDD和EDA之活性增强效果並未變質。 例如：當紀的L -胺基酸爲l -麩胺酸時，這類酶之 實例包括：麩胺酸脫氫酶（以下亦稱爲、GDH 〃 )、麩醯 胺酸合成酶、鍵胺酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸水 合酶、檸檬酸合成酶（以下亦稱爲、、CS 〃）、磷酸烯醇 丙爾酸殘基酶（以下亦稱爲、pEpc〃 ）、磷酸烯醇丙酮 酸σ成酶、丙酮酸脫氫酶 '丙酮酸激酶、丙酮酸羧基酶、 烯醇酶、磷酸甘油變位酶、磷酸甘油激酶、甘油醛一 3 一 -21 - 1308594 磷酸脫氫酶、三醣磷酸異構轉化酶、果糖雙磷酸醛縮酶、 磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸異構轉化酶等。當用來產製L 一截胺酸之細菌爲一種腸桿菌時，在上述之酶中，CS、 PEPC和GDH這三種的其中一種爲較佳者。再者，宜將此 三種酶，CS、PEPC和GDH之活性全部增强。尤其是，醱 酵乳短桿菌（Brevibacterium lactofermentum)之 CS 爲較 佳者’因其不受α-酮戊二酸、L 一麩胺酸和NADH之抑 制。 在可作爲編碼CS之基因（gltA)、編碼PEPC之基 因（ppc )和編碼GDH之基因（gdhA )的供給來源之有機 體方面，可使用任何有機體，只要其具有CS、PEPC和 GDH之活性。尤其是，爲原核生物之細菌，例如：宜爲 屬於下列菌屬之細菌：腸桿菌屬、克雷白桿菌屬、歐文氏 菌屬或潘朵氏菌屬、沙雷氏菌屬、埃希氏菌屬、棒桿菌屬 、短桿菌屬或桿菌屬。其特殊實例包括：大腸埃希氏菌、 醱酵乳短桿菌等。gltA基因、ppc基因和gdhA基因可從 上述微生物之染色體DNA取得。 gltA基因、ppc基因和gdhA基因可藉下述方法取得 :使用缺少CS、PEPC或GDH活性之突變種，再從來自 上述微生物之可補助其營養缺陷性的染色體DNA中分離 出DNA片段。再者’由於這些大腸埃希氏菌之基因和棒 桿囷之基因的核昔酸序列己被闡明（Biochemistry, 22: 5243 -5249, 1 983 ,J.Biochem., 95:909-9 1 6, 1 984; Gene, 27: 193-199,1984;Microbiology, 140:1817-1828, 1994; -22- 1308594

Mol. Gen. Getet., 2 1 8,3 3 0-33 9; Molecular Microbio 6:317-326,1992)，因此，其可藉由下述方法取得： 相關之核苷酸序列來合成引子，並利用染色體DNA 模板，以進行PCR。將這些基因引入革蘭氏—陰性菌 :大腸埃希氏菌）的方法詳細說明於下列文獻中·· EP 0 670 370 A2，美國專利 6,197,559 號， EP 0 999 282A2，及 EP 1 078 989 A2。 CS、PEPC和GDH之活性，以及前述其他酶之活 以類似上述增強EDD和EDA之活性的方法增強。 再者，可將本發明之細菌中，該用來催化從靶的 胺基酸之生物合成途徑分支出之產製另一種化合物的 之酶的活性降低或排除，只要EDD和EDA之活性增 果並未變質。例如：當靶的L-胺基酸爲L_麩胺酸 這類酶之實例包括：α -酮戊二酸脫氫酶（以下亦稱 « KGDH")、異檸檬酸裂解酶、磷酸乙醯轉酯酶、 激酶、乙醯羥基酸合成酶、乙醯乳酸合成酶、甲酸乙 酯酶、乳酸脫氫酶、L 一麩胺酸脫羧基酶、1 一脯胺酸 酶等。 爲了降低或排除上述酶的活性，可藉下述方法進 以紫外線照射，或以用於一般之突變處理的致變劑， Ν—甲基—Ν1—硝基—Ν—亞硝基胍（NTG )或亞硝酸 理微生物’並選出其中靶的酶之活性已降低之突變種 可使用利用基因取代（此係以同源重組爲根據）之 裂法等來處理微生物。編碼aKGDH之基因的基因 1〇gy, 根據 作爲 (如 性可 L -反應 强效 時， 爲" 醋酸 酸轉 脫氫 行： 如： 來處 ，亦 因分 裂法 -23- 1308594 說明於美國專利5,977,3 3 1號中。 在建構本發明之細菌時，當引入除了 edd基因及eda 基因外之基因時，宜使用較少種類的載體。也就是，一種 載體通常具有一種標記基因，及必須加入基質中之相對應 於此標記基因的作用劑。因此，若使用多種載體時，則必 須在基質中加入大量的作用劑。這可能會使細菌生長不良 ，因此，通常以使用較少種類之載體較佳。宜使用二或更 少種，而以使用一種載體較佳。 再者，當使用二或多種各具不同之複本數的載體時， 宜根據欲引入之基因的種類來決定高複本數之載體和低複 本數之載體間的基因分佈。

在分離基因、將基因引入宿主細菌、基因破壞等操作 方面，可使用本領域之技術熟習人士所熟知的一般用於製 備染色體DNA、建構染色體DNA集合庫、雜合、PCR、 製備質體DNA、分解和連接DNA、轉形、設計作爲引子 之寡核苷酸，等的方法。這些方法說明於Sambrook J., Fritsch E.F.,和 Maniatis T., "Molecular Cloning A

Laboratory Manual, Second Edition",Cold Spring Harbor Laboratory Press, ( 1 989 )等中。 <2>利用本發明之細菌產製L-胺基酸的方法 L -胺基酸之產製方法係經由下述方法進行：將依上 述方法所取得之本發明的細菌培養在基質中以製造並在基 質中累積該L一胺基酸，再從該基質中收集該L-胺基酸 -24- 1308594 爲了利用本發明之細菌來產製L 一胺基酸，可以習知 方式，依需要來使用含有碳源、氮源、無機鹽類及有機微 量營養素，如：胺基酸和維生素的一般基質。基質中可使 用任何種類之碳源和氮源，只要其可被欲培養之細菌所利 用。 在碳源方面，可使用醣類，如：葡萄糖、甘油、果糖 、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、澱粉水解產物和糖蜜 。有機酸類，如：醋酸和檸檬酸，和醇類，如：乙醇，亦 可單獨使用，或與其它碳源組合使用。在這些之中，葡萄 糖和蔗糖爲較佳者。 在氮源方面，可使用氨、銨鹽，如：硫酸銨、碳酸銨 、氯化銨、磷酸銨和醋酸銨，硝酸鹽類，等。 在有機微量營養素方面，可使用胺基酸、維生素、脂 肪酸和核酸，以及蛋白腺、酪蛋白水解衍生之胺基酸（ casamino acid)、酵母萃取物和含這些物質之黃豆蛋白質 分解產物，等。當使用生長時需要胺基酸之類物質的營養 缺陷型變種時，宜供應這類所需之營養素。 在無機鹽類方面，可使用磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽 、錳鹽’等。 在培養方面，雖然係取決於所使用之細菌類型，但通 常係進行充氣培養，且一邊將醱酵温度控制在20至45 °C ，而pH則控制爲5 — 9。在培養期間，當pH値下降時’ 可加入碳酸鈣，或以鹼，如：氨氣來中和。以此種方式培 -25- 1308594 養約10至120小時後，在培養基中可累積大量的L-魅 胺酸。 在完成培養後，從培養基中收集L-胺基酸方面，可 使用已知之收集方法，如：利用離子交換樹脂、沈澱法等 來收集。 【實施方式】 實施例 以下，本發明將參考下列實施例做更具體的解說。 < 1 >選殖涉及安特納一道朵洛夫途徑之酶的基因 大腸埃希氏菌、運動醱酵單胞菌等菌中曾選殖出分別 編碼涉及安特納一道朵洛夫途徑之酶E D D和E D A的e d d 基因和eda基因。團集性腸桿菌在分類上屬於腸桿菌群， 並被認爲與大腸埃希氏菌密切相關。再者，已知大腸埃希 氏菌之基因可在團集性腸桿菌中表現。因此，本發明者決 定從大腸埃希氏菌選殖edd基因和eda基因。 此1種基因在大腸埃希氏菌中形成一操縱子（ J.Bacteriol.，1 74 (1 4): 4638-46，1992 年 7 月）。因此， 設計可同時放大此二種基因之 edd_F(SEQ ID NO: 1) 和eda - R(SEQ ID NO: 2)作爲引子，以藉PCR放大包 含此二種基因之DNA片段。PCR係利用 Pyrobest DNA 聚合酶（Takara Shuzo)及下列反應之組合來進行：在94 °C反應1分鐘後，再進行以下反應：9 4 °C下3 0秒、60 -26- 1308594 °C下3 0秒、7 2 °C下3分鐘，共重複3 〇回合。 接著’以限制酶Sail和Bam HI將所得之放大片段完 全切割’並將其與經限制酶Sail和BamHI完全切割的質 體pMW219連接’然後’以此將大腸埃希氏菌mi09(從 Takara Shuzo購得）轉形。從所得之轉形株中選出五種含 有具所需大小之片段的選殖菌株，並從這些菌株中萃取質 體。 藉電穿孔法將各質體引入團集性腸桿菌AJ 1 360 1菌 株中（Miller J.H., " A Short Course in Bacterial

Genetics;Handbook " , Cold Spring Harbor Labratory

Press，U_S.A” p.279 ,1992)，測量 EDD 和 EDA 之活性 以選出一其中表現出edd基因和eda基因的選殖株。 A J 1 3 60 1菌株係依下述方法所取得之菌株。將團集性 腸桿菌AJ 1 3 3 5 5菌株從土壤中分離出來，其在酸性環境下 顯示出對L 一麩胺酸具抗性。接著，從a J 1 3 3 5 5菌株中衍 生出低黏液-產製突變菌株，並將cxKGDH基因打破以取 得AJ13356菌株。由於aKGDH— E1次單位基因（sucA) 遭到破壞，因此，AJ13356菌株中缺少aKGDH活性。接 著，將具大腸埃希氏菌之檸檬酸合成酶基因（gltA )、磷 酸烯醇丙酮酸羧基酶基因（PPc)和麩胺酸脫氫酶基因（ gdhA )的質體RSFCPG和具存衍生自醱酵乳短桿菌之 gltA基因的質體pSTVCB引入AJ 1 3 3 5 6菌株中，以取得 SC17sucA/RSFCPG + pSTVCB菌株。從此菌株中，選出在 低pH環境下顯現出對L -麩胺酸具改良之抗性及具最佳 -27- 1308594 生長速率的AJ13601菌株（EP 1 078 989 A2) 。 將從轉形株（其中引入如上述之包括edd基因和eda 基因片段的質體）中任意選出之菌株在LBGM9液態基質 (此爲含下列物質之基質：1 0克/升之胰化蛋白脾、5克 /升之酵母萃取物、5克/升之NaCl和5克/升之葡萄 糖，並加入1/1〇體積之含四環素、氯黴素和卡那黴素（ 各含量爲12.5毫克/升、25毫克/升及25毫克/升）的 分開滅菌的 1〇xM9(128 克 / 升之 Na2HPO4.7H2O，30 克/升之KH2P〇4，5克/升之NaCl，10克/升之NH4C1 ))中培養1 5小時。經由離心從這些培養基中收集細胞 ，以 50mM Tris— HC1 緩衝液（ρΗ7·6)和 10mM MgCl2 清 洗二次，然後，將其懸浮在相同的緩衝液中。藉超音波將 細胞打破，並在1 5000rPm離心30分鐘，所得之上清液可 作爲粗製之酶溶液。 利用分光光度測定技術測量由此二種酶取得之反應產 物，以同時測量E D D和E D A之活性。也就是，將下列物 質混合：50mM Tris — HCl(pH 8.0) 、10mM MgCl2、

ImM EDTA、ImM APAD (乙醯吡啶腺嘌呤二核苷酸）、 5mM K2HP〇4、20單位之甘油醛一3-磷酸脫氫酶、6 —磷 酸葡萄糖酸和粗製之酶溶液，並在3 6 5nm下測量增加之 吸收，以測量從作爲受質之6 -磷酶葡萄糖酸所產生之甘 油醛- 3 -磷酸酯。對僅引入一種載體之菌株進行相同的 測量。結果顯示於表1中。 -28- 1308594 表1 菌株 —. 一_- _ 活性 (亀微莫耳/分/辜克蛋白質） 引入PMW2 1 9之菌株 —-—__ 1 〇 增強edd/eda之菌株1 -—__1 . y ----- 1 ^ ά 增強edd/eda之菌株2 ---〜·. 1 J . Ί-- -----11 ^ 增強edd/eda之菌株3 ---—- --------- -- 13 2 增強edd/eda之菌株4 ---- 5 0 增強edd/eda之菌株5 ----_ 10.9 結果可確定所有的菌株均具有增強之活性。在具最高 活性之菌株中，活性約增強7.2倍。此菌株之質體命名爲 pMW- EDDA。 < 2 >利用經增強安特納-道朵洛夫途徑之菌株來產製L -麩胺酸 接著’檢查增強安特納一道朵洛夫途徑對產製L 一麩 胺酸的影響。 上述章節中所使用之團集性腸桿菌A J 1 3 6 0 1菌株中含 有二種質體，而再進一步引入edd基因和eda基因時，菌 株中則含有三種質體。因此，其培養中必須加入三種作用 劑，這表示其生長將非常差，也就是，在L-麩胺酸產製 培養評估系統中幾乎無法觀察到生長。因此，經由將醱酵 乳短桿菌之檸檬酸合成酶（以下稱爲、、c S 〃 ） 基因， edd基因和eda基因引入一質體中，可僅使用到二種質體 〇 在用於建構含有醱酵乳短桿菌之 CS基因的質體 -29- 1308594 pSTVCB的載體pSTV28，以及用於選殖edd基因和eda 基因的載體pMW219中，前者顯現出具較高的複本數。因 此考慮到雖然在A J 1 3 6 0 1菌株中，醱酵乳短桿菌的C S基 因藉由PSTV28載體而增強，但必須增加其表現量，以利 用pMW219引入此基因。因此，建構一種以大腸埃希氏菌 之CS基因的啓動子區的基因來取代其CS基因中之啓動 子區的基因。 具體的說，利用引子 GLTES1 ( SEQ ID NO : 3 )和 GLTEBO (SEQ ID NO: 4)來放大CS基因中之啓動子區 ，並以大腸埃希氏菌W3 110菌株之染色體作爲模板。再 者，利用弓I 子 GLTBBO ( SEQ ID NO : 5 )和 GLTBA1 ( SEQ ID NO: 6)來放大含CS基因之ORF區的片段，並 以醱酵乳短桿菌225 6菌株的染色體作爲模板。利用此二 種片段作爲模板，以及引子GLTES2 ( SEQ ID NO : 7 )和 GLTBA2 ( SEQ ID NO : 8 )來進行交叉PCR以取得一靶的 片段。以限制酶Smal和Hindlll切割此片段，並將其引 入PSTV28之相同位置，以取得pSTV28 — CB ( * )。以 ΚρηΙ和Hind m切割此質體，並收集含有大腸埃希氏菌之 CS基因的啓動子及醱酵乳短桿菌之CS基因的編碼區的片 段，再以T4 DNA聚合酶做鈍端處理。將融合之基因片 段引入PMW219之Smal位置處，以取得pMW— CB ( * ) 。再者，以 BamHI處理 pMW— EDDA，並將其與上述之 融合的基因片段連接，再以T4 DNA聚合酶將終端處理 成鈍端，以取得pMW — CB ( * ) · ED。 -30- 1308594 接著，將AJ13601在LBGM9液態基質中，於31.5°C 下搖動一整夜，然後，將其適當地稀釋，以在每一培養皿 中取得100至200個群落，再將其鋪放在含12.5毫克/ 升之四環素的LBGM9培養皿上。讓出現之群落在含12.5 毫克/升之四環素和25毫克/升之氯黴素的LBGM9培養 皿上複製生長，收集對氯黴素敏感之菌株，並命名爲 G106S。G106S菌株僅含RSFCPG，且缺少pSTVCB。經由 將pMW— CB(*)或pMW— CB(*) · ED引入此菌株中， 可取得各命名爲G106S pMW— CB(*)及G106S pMW — CB ( * ) · ED之菌株。 爲了評估這些菌株之L-麩胺酸產製力，利用罐器醱 酵器對其進行培養評估。使用3 00毫升含下列物質之基質 :50克/升之蔗糖、0.4克/升之MgS04、0.1毫升/升之 GD - 1 1 3 (去泡沫試劑）、4克/升之（NH4)2S〇4、2克/ 升之KH2P04、4克/升之酵母萃取物、10毫克/升之

FeS04. 7H20、10 毫克 / 升之 MnS04. 4— 5H20、0.4 克 /升之L 一離胺酸、0.4克/升之DL-蛋胺酸、0.4克/ 升之二胺基庚二酸、12.5毫克/升之四環素和25毫克/ 升之氯黴素。在1300rpm及1/1 VVM之充氣條件下進行 培養，並以氨將pH値控制爲6·0，直到蔗糖被消耗完畢 。隨著時間的變化，在660nm下之吸收會有所改變’而 基質中L-麩胺酸之產量顯示在第1圖中。再者’L 一麩 胺酸之最終產量顯示在第2圖中。 -31 - 1308594 表2 0 D 6 2 0 n m (χ 1/101) 培養時間 (h) L-麩胺酸 (克/升）— G1 06S pMW-CB(*) 0.334 12 30.4 一 G 1 06S pMW-CB(*).ED 0.258 16 36.8 一 結果透露出L一麩胺酸之產製力可經由增強安特納-道朵洛夫途徑來改良，雖然該培養時間會較延遲。 < 3 >檢查由經增强安特納-道朵洛夫途徑之菌株所產製 之乙醯甲基甲醇和2,3 — 丁二醇 將前述 G106S pMW— CB(*)和 G106S pMW— CB(* )· ED的菌株以相同於< 2 >中用於評估L 一麩胺酸產製 力的方式進行培養，並在一段時間內，測量基質和細胞中 之乙醯甲基甲醇和2，3 —丁二醇的量。測量時係在下列條 件下，藉氣體色層分析（Shimadzu公司，GC — 1700A)進 行： 使用之管柱：VARIAN PORAPLOTQ PLOT FS25X3 2 ( 0.32 毫米 x25M ) 温度：蒸汽室：250°C ’ 管柱：240°C，FID : 250°C 管柱入口壓力：180 kPa 載體氣體之流速：1.6062毫升/分 結果顯示在第2A圖（基質中之乙醯甲基甲醇的量） 、第2B圖（基質中之2,3 - 丁二醇的量）和第2C圖（ 每單位細胞所產生之乙醯甲基甲醇和2，3 — 丁二醇的總量 -32- 1308594 )中。結果透露出乙醯甲基甲醇和2,3 —丁二醇的產量可 經由增強安特納-道朵洛夫途徑而增加。 【圖式簡單說明】 第1圖示爲其中edd基因及eda基因被增強之菌株的 生長情況（A )，及其所產製之L 一麩胺酸的量（B )。 第2圖示爲由其中edd基因及eda基因被增強之菌株 所產製之乙醯甲基甲醇和2,3 —丁二醇的量：（A)基質 中之乙醯甲基甲醇的量，（B)基質中之2,3— 丁二醇的 量，及（C )每單位之細菌細胞所產製之乙醯甲基甲醇和 2，3 - 丁二醇的總量（重量/單位乾燥細胞重量）。 -33- 1308594 序列表 〈110>味之素股份有限公司 <120〉產製L-胺基酸之方法 <140〉 092107210 <141〉 2003-03-27 <150> JP 2002-88668 <151〉 2002-03-27 <160> 8 <170> Patentln Yer. 2.0 <210〉 1 <211> 35 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：引子 <400> 1 cgciagtcga ccaattttta cactttcagg cctcg <210> 2 〈211〉 35 <212> DNA 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：引子 <400> 2 gggggggalc cagtcagaai gtcacgtttg ataat 1308594 <210〉 3 <211〉 28 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：引子 <400> 3 cccccgggtc tgttacctgc agacgtcg <210〉 4 <211> 42 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：引子 <400> 4 acgcacgata tccctttcaa acatttaagg tctccltagc gc <210> 5 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：引子 <400> 5 gtttgaaagg gatatcgigg ct <210> 6 <211> 27 <212) DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：引子 1308594 <400> 6 aaaagcltat cgacgctccc ctcccca 27 <210> 7 <211> 30 <212) DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：引子 <400> 7 cccccgggat ttcclicctc cggtctgctl 30 <210> 8 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：引子 <400> 8 taaagcttgg Icagggcgtt ggcgglggcg 30

Claims (1)

1308594 拾、申請專利範圍 K 一種產製L-胺基酸之方法，其包含在基質中培 養具產製L -胺基酸能力的微生物以產製並於該基質中累 積該L-胺基酸，及自該基質中收集該l-胺基酸， 其中該微生物係具安特納—道朵洛夫（Entner-Doudoroff)途徑之腸桿菌，且該微生物已經改質以增强6 一磷酸葡萄糖酸脫水酶活性或2_酮基一 3 —去氧一 6-磷 酸葡萄糖酸醛縮酶活性或該兩種酶之活性，且該L 一胺基 酸係選自L-麩胺酸、L_精胺酸、L_麩醯胺酸、l-脯胺酸、 L_白胺酸、L-異白胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、或藉由利 用L-麩胺酸作爲中間體或胺基供體之生物合成途徑所產 製之L -胺基酸。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該細菌屬於 腸桿菌屬（Enterobacter)或潘朵氏菌屬（Pantoea)。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該6 —磷酸 葡萄糖酸脫水酶活性或2—酮基一 3 —去氧一 6—磷酸葡萄 糖酸醛縮酶活性係藉由下述之方式增强：增加編碼6 -磷 酸葡萄糖酸脫水酶或2-酮基一 3 -去氧- 6-磷酸葡萄糖 酸醛縮酶之基因的複本數，或修改該基因之表現調節序列 ，以增强該基因在該細菌細胞中的表現。 4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其 中該L一胺基酸爲L一麩胺酸。 1308594 陸、（一）、本案指定代表圖為：第1圖 (二）、本代表圖之元件代表符號簡單說明：無 柒、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學 式：