KR20030078036A

KR20030078036A - Ｌ-아미노산의 생산 방법

Info

Publication number: KR20030078036A
Application number: KR10-2003-0019209A
Authority: KR
Inventors: 하라요시히코; 이즈이히로시; 아사노다카히로; 와타나베야스유키; 나카마쓰쓰요시
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2002-03-27
Filing date: 2003-03-27
Publication date: 2003-10-04
Also published as: KR100949048B1; EP1352966A2; MY130526A; EP1352966B1; CN1446920A; TW200306352A; AU2003202509B2; JP2003274988A; CN100529094C; DK1352966T3; PE20031014A1; JP3932945B2; BR0300978B1; EP1352966A3; BR0300978A; DE60301031T2; ES2243826T3; AU2003202509A1; US20030219882A1; RU2307165C2

Abstract

L-아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배지에서 배양하여 L-아미노산을 배지중에 생산 축적시켜 상기 배지로부터 L-아미노산을 수거하는 L-아미노산의 생산 방법에 있어서, 엔트너-도우도로프 경로를 갖고 6-포스포글루코네이트 데하이드라타제 활성 또는 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라제 활성, 또는 상기 활성 둘다가 증강되도록 변형된 그람-음성 세균을 당해 미생물로서 사용한다.

Description

Ｌ-아미노산의 생산 방법{Method for producing L-amino acid}

본 발명은 L-아미노산의 생산 방법 및 L-아미노산을 위해 사용되는 세균에 관한 것이다. 보다 확실하게는, 본 발명은 L-아미노산을 생산하는 개선된 능력을 갖는 세균 및 상기 세균을 사용하여 L-아미노산을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.

통상적으로, L-글루탐산과 같은 L-아미노산은 주로,브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 마이크로박테리움(Microbacterium) 속에 속하는 소위 코리네형 세균을 이용하여 발효시킴으로써 생산된다[참고문헌: "Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center, pp.195-215, 1986]. 추가로, 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 페니실리움(Penicillium)(미국 특허 제3,220,929호), 슈도모나스(Pseudomonas), 아트로박터(Arthrobacter), 세라티아(Serratia), 아에로박터(Aerobacter), 칸디다(Candida)(미국 특허 제3,563,857호), 에스케리키아(Escherichia)(일본 특허공개공보(kokai) 제5-244970호) 속등에 속하는 미생물이 L-아미노산 생산에 또한 사용될 수 있다. 추가로, 엔테로박터(Enterobacter)(EP1078989A2), 클렙시엘라(Klebsiella), 에르위니아(Erwinia) 또는 판토에아(Pantoea)(일본 특허공개공보 제2000-106869호) 속에 속하는 미생물이 L-글루탐산과 같은 L-아미노산의 생산에 또한 사용될 수 있다.

추가로, 재조합 DNA 기술에 의한 L-아미노산의 생합성에 관련된 효소를 증강시킴으로써 L-아미노산 생산 능력을 증가시키는 다양한 기술이 공개되어 있다. 예를 들면, 시트레이트 신타제 유전자가 도입된 엔테로박터 또는 클렙시엘라 속에 속하는 세균을 이용함으로써 L-글루탐산을 생산하는 방법(EP0999282A2), 및 시트레이트 신타제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 및 글루타메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자가 도입된 엔테로박터 속에 속하는 세균을 이용함으로써 L-글루탐산을 생산하는 방법(EP 1 078 989 A2)이 공개되어 있다.

추가로, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제(WO 01/02542 A1), 프럭토스 포스포트랜스퍼라제(WO 01/48146 A1) 및 에놀라제(WO 01/02543 A1)와 같은 해당 효소를 암호화하는 유전자를 도입함으로써 L-아미노산 생산 능력을 증강시키는 기술이 공지되어 있다.

한편, 장내세균을 포함하는 다수의 그람-음성 세균은 글루코스 대사 경로중 하나로서 엔트너-도우도로프 경로(Entner-Doudoroff pathway)를 갖는다. 이 경로는 6-포스포글루콘산으로부터 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트를 생산하는 반응을 촉매하는 6-포스포글루코네이트 데하이드라타제(약어 "EDD"로서 후술됨), 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트를 절단하여 글리세르알데하이드-3-포스페이트 및 피루브산을 생산하는 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알도라제(약어 "EDA"로서 후술됨)와 관련되어 있다. EDD 및 EDA를 암호화하는 유전자는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 등으로부터 클로닝되었고, 이들의 뉴클레오타이드 서열이 보고되었다. 에스케리키아 콜라이의 EDD를 암호화하는 유전자(edd) 및 EDA를 암호화하는 유전자(edd)의 뉴클레오타이드 서열은 진뱅크 수탁번호 L20897호로 등록되어 있다. 추가로, 지모모나스 모빌리스의 eda 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 진뱅크 수탁번호 X58364호로 등록되어 있고, 이의 edd 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 데이타베이스에서 진뱅크 수탁번호 M60615, M37982호로서 등록되어 있다.

그러나, 엔트너-도우도로프 경로 및 L-아미노산의 생산성 사이의 관계는 공지되어 있지 않다.

본 발명의 목적은 공지된 기술로부터 상이한 관점으로 세균내 L-아미노산의 생산성을 개선시키기 위한 기술을 제공하는 것이다.

본 발명의 발명자들은 그람-음성 세균이 갖는 엔트너-도우도로프 경로에 초점을 맞추었다. 사카라이드로부터 L-글루탐산과 같은 L-아미노산으로의 대사 경로 중에서, 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제에 의한 6-포스포글루콘산으로부터 리불로스-5-포스페이트의 생산 반응에 의해 이산화탄소가 생산된다. 펜토스 포스페이트 경로내로 다량의 탄소 유입을 갖는 세균성 균주에서, 특히, 다량의 이산화탄소가 또한 상기 언급된 반응에 의해 방출되어야 한다. 따라서, L-글루탐산과 같은 L-아미노산을 생산하는 능력은 펜토스 포스페이트 경로내로의 유입을 피함으로써 개선될 수 있는 것으로 간주하였다.

펜토스 포스페이트 경로내로의 탄소 유입을 감소시키기 위한 2가지 방법이 고려된다: (1) 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 또는 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제의 활성을 제거하거나 감소시키는 방법; 및 (2) 엔트너-도우도로프 경로를 증강시키는 방법. 이들 방법 둘다 펜토스 포스페이트 경로를 회피하는 효과를 가질 것으로 예상할 수 있다. 그러나, (2)의 경우에, 펜토스 포스페이트 경로와 관련된 탄소 분포가 EDD 및 EDA의 활성을 조절함으로써 변화될 수 있으므로, 핵산과 같은 펜토스 포스페이트 경로내 중간물질의 유도체가 또한 제공될 수 있는 것으로 간주된다. 추가로, 다양한 연구의 결과로서, 본 발명자들은 L-아미노산을 생산하는 세균의 능력이 엔트너-도우도로프 경로를 증강시킴으로써 개선될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

도 1은 edd 유전자 및 eda 유전자가 증강된 균주의 증식(A) 및 생산된 L-글루탐산의 양(B)을 나타낸다.

도 2는 edd 유전자 및 eda 유전자가 증강된 균주에 의해 생산되는 아세토인 및 2,3-부탄디올의 양을 나타낸다: (A) 배지내 아세토인의 양, (B) 배지내 2,3-부탄디올의 양, 및 (C) 단위 세균 세포당 생산된 아세토인 및 2,3-부탄디올의 총량(단위 건조 세포 중량당 중량).

즉, 본 발명은 하기를 제공한다.

(1) L-아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배지에서 배양하여 L-아미노산을 배지중에 생산 축적시켜 상기 배지로부터 L-아미노산을 수거함을 포함하는 L-아미노산의 생산 방법에 있어서, 상기 미생물은 엔트너-도우도로프 경로를 갖고 6-포스포글루코네이트 데하이드라타제 활성 또는 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라제 활성, 또는 상기 활성 둘다가 증강되도록 변형된 그람-음성 세균이고, 상기 L-아미노산은 피루브산을 중간물질로서 사용하는 생합성 경로에 의해 생산되는 L-아미노산으로부터 선택되는 L-아미노산의 생산 방법.

(2) 세균이 장내세균인, (1)에 따르는 방법.

(3) 세균이 엔테로박터 속에 속하는, (2)에 따르는 방법.

(4) 6-포스포글루코네이트 데하이드라타제 또는 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알도라제를 암호화하는 유전자의 복제수를 증가시키거나 당해 유전자의 발현 조절 서열을 변형시킴으로써 당해 유전자 발현이 세균의 세포에서 증가되도록 하는, 6-포스포글루코네이트 데하이드라타제 활성 또는 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알도라제 활성이 증강되는, (1) 내지 (3)의 어느 하나에 따르는 방법.

(5) L-아미노산이 L-글루탐산, 또는 중간물질 또는 아미노 그룹 공여자로서 L-글루탐산을 이용하는 생합성 경로에 의해 생산되는 L-아미노산인, (1)에 따르는 방법.

(6) L-아미노산이 L-글루탐산, L-아르기닌, L-글루타민, L-프롤린, L-루신, L-이소루신, L-발린 및 L-알라닌인, (1) 내지 (5)의 어느 하나에 따르는 방법.

(7) L-아미노산이 L-글루탐산인, (6)에 따르는 방법.

본 발명에 따라서, 엔트너-도우도로프 경로의 활성을 증가시킴으로써 L-아미노산을 생산하는 경로를 갖는 미생물의 능력을 개선시킬 수 있다.

하기, 본 발명은 상세하게 설명될 것이다.

<1> 본 발명의 세균

본 발명을 위해 사용된 그람-음성 세균은 L-아미노산을 생산하는 능력 및 엔트너-도우도로프 경로를 갖는 그람-음성 세균이다.

본 발명에서 사용된 용어 "L-아미노산을 생산하는 능력"은 본 발명의 세균이 배지에서 배양되는 경우, 배지에서 L-아미노산을 축적하는 능력을 의미한다. L-아미노산을 생산하는 이러한 능력은 그람-음성 세균의 야생 균주의 특성 또는 육종에 의해 첨가되거나 증강된 특성일 수 있다. 본 발명이 적용될 수 있는 L-아미노산은 중간물질로서 피루브산을 이용하는 생합성 경로에 의해 생산되는 L-아미노산이다. 이의 구체적 예로는 L-글루탐산, L-아르기닌, L-글루타민, L-프롤린, L-루신, L-이소루신, L-발린, L-알라닌 등을 포함한다.

하기 기재되는 실시예에서 제시된 바와 같이, EDD 및 EDA의 활성을 증가시킴으로써 증강된 엔트너-도우도로프 경로를 갖는 세균은 아세토인 및 2,3-부탄디올의 증가된 생산을 나타냈다. 2,3-부탄디올은 아세토인으로부터 생산되고, 아세토인은 피루브산으로부터 생산되므로, 아세토인 및 2,3-부탄디올의 생산에서의 증가는 제공된 피루브산의 양에서의 증가를 나타낸다. 따라서, 증강된 엔트너-도우도로프 경로를 갖는 세균은 중간물질로서 피루브산을 이용하는 생합성 경로에 의해 생산되는 L-아미노산을 생상하는 증가된 능력을 가질 것으로 예상된다.

엔트너-도우도로프 경로를 갖는 그람-음성 세균의 구체적 예로는 엔테로박터, 클렙시엘라, 세라티아, 에르위니아 또는 판토에아, 에스케리키아, 슈도모나스, 아트로박터, 및 아에로박터 속 등에 속하는 세균을 포함한다. 세균이 엔트너-도우도로프 경로를 갖는지의 여부는 예를 들어, 세포-파괴된 현탁액과 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 6-포스포글루콘산 및 아세틸피리딘 아데닌 디뉴클레오타이드를 혼합하고, 기질로서 6-포스포글루콘산으로부터 생산되는 글리세르알데하이드-3-포스페이트를 365nm에서 흡광도 증가를 측정하는 것에 의해 검출함으로써 결정될 수 있다. 글리세르알데하이드-3-포스페이트를 생산하는 것으로 확인된 세균은 엔트너-도우도로프 경로를 갖는다.

본 발명을 위해 사용되는 세균은 표적 L-아미노산의 형태에 따라 적절하게 선택될 수 있다. L-글루탐산의 생산에 적절한 세균은 하기 예시된다. 그러나, 본 발명의 범위는 이들 예들로 제한되는 것은 아니다.

엔테로박터 세균의 구체적 예로는 하기 세균을 포함한다.

엔테로박터 아글로머란스(Enterobacter agglomerans)

엔테로박터 아에로진스(Enterobacter aerogenes)

엔테로박터 암니제너스(Enterobacter amnigenus)

엔테로박터 아스부리에(Enterobacter asburiae)

엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae)

엔테로박터 디솔벤스(Enterobacter dissolvens)

엔테로박터 게르고비아에(Enterobacter gergoviae)

엔테로박터 호르마에케이(Enterobacter hormaechi)

엔테로박터 인터메디우스(Enterobacter intermedius)

엔테로박터 니미프레수랄리스(Enterobacter nimipressuralis)

엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii)

엔테로박터 타일로라에(Enterobacter taylorae)

보다 바람직하게는 하기 세균 균주이다.

엔테로박터 아글로머란스 ATCC 12287

엔테로박터 아글로머란스 AJ13355

엔테로박터 아글로머란스 AJ13356

엔테로박터 아글로머란스 AJ13601

엔테로박터 아글로머란스 AJ13355 및 AJ13556은 공업기술원 생명공학공업기술 연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 주소: 우편번호 305-5466 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반 1고 쵸다이 6)에 1998년 2월 19일 각각 수탁번호 FERM P-16644 및 FERM P-16645로서 기탁되었다. 이후 당해기탁은 1999년 1월 11일 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁으로 이관되어 수탁번호 FERM BP-6614 및 FERM BP-6615를 부여받았다. 엔테로박터 아글로머란스 AJ13601은 1999년 8월 18일 공업기술원 생명공학공업기술 연구소에 수탁번호 FERM P-17516로서 기탁된 후, 2000년 7월 6일 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁으로 이관되어 수탁번호 FERM BP-7207을 부여받았다. 엔테로박터 아글로머란스 ATCC 12287은 ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801)로부터 분양받을 수 있다.

클렙시엘라 속에 속하는 세균의 예로는 하기 세균을 포함한다.

클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola)

클렙시엘라 테리게나(Klebsiella terrigena)

보다 바람직하게는 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399이다. 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399는 공업기술원 생명공학공업기술 연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터)에 1998년 2월 19일 수탁번호 FERM P-16646로서 기탁된 후 1999년 1월 11일 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁으로 이관되어 수탁번호 FERM BP-6616를 부여받았다.

클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399 균주는 홋카이도 사포로시의 토양으로부터 분리된 균주이다.

본 발명을 위해 사용된 세라티아 속에 속하는 미생물의 예는 하기를 포함한다.

세라티아 리퀘팍시엔스(Serratia liquefacience)

세라티아 엔토모필라(Serratia entomophila)

세라티아 피카리아(Serratia ficaria)

세라티아 폰티콜라(Serratia fonticola)

세라티아 그리메시(Serratia grimesii)

세라티아 프로티마쿨란스(Serratia proteamaculans)

세라티아 오도리페라(Serratia odorifera)

세라티아 플리무티카(Serratia plymuthica)

세라티아 루비다에아(Serratia rubidaea)

보다 바람직하게는 하기 세균 균주이다.

세라티아 리퀘팍시엔스 ATCC 14460

세라티아 리퀘팍시엔스 ATCC 14460은 ATCC로부터 분양받을 수 있다.

본 발명을 위해 사용되는 에르위니아 종에 속하는 미생물의 예로는 하기를 포함한다.

에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola)(현재 판토에아 아글로머란스(Pantoea agglomerans)로서 분류됨)

에르위니아 아나나스(Erwinia ananas)

에르위니아 칵티시다(Erwinia cacticida)

에르위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi)

에르위니아 말로티보라(Erwinia mallotivora)

에르위니아 페르시시누스(Erwinia persicinus)

에르위니아 프시디(Erwinia psidii)

에르위니아 퀘르시나(Erwinia quercina)

에르위니아 라폰티시(Erwinia rhapontici)

에르위니아 루브리팍시엔스(Erwinia rubrifaciens)

에르위니아 살리시스(Erwinia salicis)

에르위니아 우레도보라(Erwinia uredovora)

보다 바람직하게는 에르위니아 헤르비콜라 IAM1595(판토에아 아글로머란스 AJ2666)이다. 에르위니아 헤르비콜라 IAM1595는 동경대학 분자세포생물학 연구소로부터 분양받을 수 있다.

에르위니아 헤르비콜라는 문헌[참고문헌: Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th Ed]에는 언급되지 않고, 에르위니아 헤르비콜라로서 분류되었던 미생물이 판토에아 아글로머란스로서 분류된다. 따라서, 에르위니아 속에 속하는 미생물 및 판토에아 속에 속하는 미생물은 서로 밀접하게 관련있다. 따라서, 판토에아 속에 속하는 미생물은 에르위니아 속에 속하는 미생물과 유사하게 사용될 수 있다. 판토에아 속에 속하는 이러한 미생물로서, 판토에아 아글로머란스, 판토에아 디스페르사(Pantoea dispersa) 및 판토에아 아나나스(Pantoea ananas)가 언급될 수 있다. 에르위니아 헤르비콜라 IAM1595는 판토에아 아글로머란스 AJ2666으로서 명명되며 1999년 2월 25일 공업기술원 생명공학공업기술 연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터)에 수탁번호 FERM BP-6660로서 부다페스트 조약에 근거하여 국제기탁되어 있다.

본 발명을 위해 사용된 에스케리키아 속에 속하는 미생물의 예로는 에스케리키아 콜라이를 포함한다.

보다 바람직하게는 발린 내성을 갖는 에스케리키아 콜라이이고, 구체적 예로는 하기 균주이다.

에스케리키아 콜라이 K-12 (ATCC 10798)

에스케리키아 콜라이 W (ATCC 9637)

에스케리키아 콜라이 K-12 (ATCC 10798) 및 에스케리키아 콜라이 W (ATCC 9637)는 ATCC로부터 분양받을 수 있다.

본 발명의 그람-음성 세균은 L-아미노산을 생산하는 능력 및 상기 언급된 엔트너-도우도로프 경로를 갖고, 변형되어 EDD 또는 EDA 활성 또는 이들 두개의 활성 모두가 증강된 그람-음성 세균이다. 본 발명의 세균은 바람직하게는 변형되어 EDD 및 EDA의 활성 모두가 증강된 그람-음성 세균이다.

표현 "EDD 또는 EDA 활성이 증강되도록 변형된"은 세포당 EDD 또는 EDA 활성이 야생형 세균의 활성보다 많이 만들어진다는 의미이다. 예를 들어, 세포당 EDD 또는 EDA 분자수가 증가되는 것, EDD 또는 EDA 분자당 EDD 또는 EDA의 특이적 활성이 증가되는 것등이 언급될 수 있다. 추가로, 비교되는 야생형 세균은 EDD 또는 EDA 활성을 증강시키기 위한 임의의 조작이 되지 않은 세균이다.

세균에서 EDD 및/또는 EDA 활성의 증강은 EDD 및/또는 EDA를 암호화하는 유전자의 복제수를 증가시킴으로써 이루어진다. 예를 들어, 재조합 DNA는 EDD 및/또는 EDA를 암호화하는 유전자 단편을 표적 세균내 작용하는 벡터, 바람직하게는 다중 복제형 벡터로 연결함으로써 제조될 수 있고, 세균내로 도입되어 형질전환시킬 수 있다. EDD 및 EDA의 활성 둘다가 증강되는 경우, EDD를 암호화하는 유전자 단편 및 EDA를 암호화하는 유전자 단편은 상이한 벡터내로 개별적으로 통합될 수 있거나, 바람직하게는 동일한 벡터내로 통합된다. 재조합 DNA는 L-아미노산 생산 능력을 갖는 세균내로 도입될 수 있고, 대안으로 재조합 DNA는 야생형 세균내로 도입되어, 형질전환 균주를 수득할 수 있고, 따라서 형질전환 균주는 L-아미노산 생산 능력이 부여될 수 있다.

EDD를 암호화하는 유전자 및 EDA를 암호화하는 유전자로서, 엔트너-도우도로프 경로를 갖는 그람-음성 세균으로부터 유도된 임의의 유전자가 사용될 수 있다.

특히, 에스케리키아 세균으로부터 유도된 유전자가 언급될 수 있다. 에스케리키아 콜라이로부터 유도된 EDD를 암호화하는 유전자(edd) 및 EDA를 암호화하는 유전자(edd)는 오페론을 형성한다[참고문헌: J. Bacteriol., 174(14): 4638-46, July 1992]. 이하, EDD를 암호화하는 유전자를 edd로서 언급하고, EDA를 암호화하는 유전자를 eda로서 언급한다. 추가로, 지모모나스 속의 세균 유전자가 또한 보고되었고, edd 유전자 및 eda 유전자를 상기 유전자의 서열을 근거로 하여 제조된 프라이머를 사용하는 PCR(Polymerase Chain Reaction, White, T. J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)) 또는 상기 언급된 유전자 서열을 근거로 하여 제조된 프로브를 사용한 하이브리드화에 의해 수득할 수 있었다. 예를 들면, 에스케리키아 콜라이의 edd 유전자 및 eda 유전자를 함유하는 오페론 단편을 후술되는 프라이머 edd-F(서열번호 1) 및 eda-R(서열번호 2)을 사용하는 PCR에 의해 수득할 수있다. 다른 미생물의 edd 유전자 및 eda 유전자가 유사하게 수득될 수 있다. 상기 하이브리드화 조건은 60℃로 1 ×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1 ×SSC, 0.1% SDS에 상응하는 염 농도로 세척을 수행하는 조건으로 예시된다.

추가로, 본 발명을 위해 사용되는 edd 유전자 및 eda 유전자는 야생형 유전자에 제한되지 않으며, 암호화된 EDD 및 EDA의 기능이 파괴되지 않는 한 하나 이상의 부위에서 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가를 포함하는 유전자 생성물을 암호화하는 돌연변이체 또는 인위적으로 변형된 유전자일 수 있다. 본원에 언급된 "수개의" 아미노산의 수가 단백질의 3차원 구조내 아미노산 잔기의 위치 또는 타입에 따라 상이하지만, 특히 2 내지 60, 바람직하게는 2 내지 40, 보다 바람직하게는 2 내지 20일 수 있다. 추가로, 상기 언급된 EDD 및/또는 EDA와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA로서, 공지된 edd 또는 eda 유전자(예를 들어, 진뱅크 수탁번호 L20897, X58364, M60615, M37982)의 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화할 수 있는 DNA 또는 엄격한 조건하에 이들 뉴클레오타이드 서열로부터 생산될 수 있고, EDD 또는 EDA의 활성과 유사한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 프로브가 언급될 수 있다. 본원에 언급된 "엄격한 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되고, 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건하이다. 수치를 사용함으로써 이러한 조건을 확실하게 표현하는 것은 곤란하다. 그러나, 예를 들어, 엄격한 조건은 높은 상동성을 갖는 DNA, 예를 들어, 50% 이상의 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화하지만, 그 미만의 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화하지 않는 조건을 포함한다. 대안으로, 엄격한 조건은 DNA가 서던 하이브리드화의 통상적인 세척 조건, 즉, 60℃에서 1 ×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1 ×SSC, 0.1% SDS에 상응하는 염 농도에서 서로 하이브리드화되는 조건으로 예시된다.

염색체 DNA는 예를 들면 Saito and Miura 방법[참고문헌: H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619(1963), Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp. 97-98, Baifukan, 1992] 등에 의해 DNA 공여체로서 세균으로부터 제조될 수 있다.

재조합 DNA가 PCR에 의해 증폭된 edd 유전자 및/또는 eda 유전자를 에스케리키아 콜라이 등의 세포내에서 자율적으로 복제가능한 벡터 DNA와 연결함으로써 제조되는 경우, 후속적 조작이 보다 용이하게 된다. 에스케리키아 콜라이 세포내 자율적으로 복제가능한 벡터의 예로는 pMW219, pSTV28, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184 등을 포함한다.

상기 언급된 바와 같이 제조된 재조합 DNA를 그람-음성 세균내로 도입하기 위해서, 지금까지 보고된 형질전환 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, D.A. Morrison[참고문헌: Methods in Enzymology, 68, 326(1979)] 방법, 수용체 세포를 DNA의 투과성을 증가시키기 위해 염화칼슘으로 처리하는 방법[참고문헌: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159(1970)], 전기천공 방법[참고문헌: Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., p. 279, 1992] 등이 언급될 수 있다.

또한, edd 유전자 및/또는 eda 유전자의 복제수는 이들 유전자의 다중 복제물이 세균의 염색체 DNA내 존재하도록 함으로써 증가될 수 있다. edd 유전자 및/또는 eda 유전자의 다중 복제물을 세균의 염색체 DNA내로 도입시키기 위해서, 표적으로서 염색체 DNA내 존재하는 다중 복제물의 서열을 사용함으로써 상동성 재조합을 수행한다. 염색체 DNA내 존재하는 다중 복제물의 서열로서, 반복 DNA 또는 전위 인자의 말단에 존재하는 역위반복체가 사용될 수 있다. 추가로, 일본 특허공개공보 제2-109985호에 기재된 바와 같이, edd 유전자 및/또는 eda 유전자를 트랜스포존내로 또한 혼입시킬 수 있고, 유전자의 다중 복제물을 염색체 DNA내로 도입하도록 전달할 수 있다.

EDD 및/또는 EDA 활성의 증강은 또한 상기 언급된 유전자 증폭을 근거로 한 것 이외에, 염색체 DNA내 edd 유전자 및/또는 eda 유전자의 프로모터와 같은 발현 조절 서열 또는 보다 강한 프로모터를 갖는 플라스미드를 치환시킴으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터 등이 강한 프로모터로서 공지되어 있다. 추가로, 국제 특허출원 공보 WO00/18935에 기재된 바와 같이, 수개의 뉴클레오타이드 치환을 edd 유전자 및/또는 eda 유전자의 프로모터 영역내 도입함으로써 상기 프로모터는 보다 강한 프로모터가 되기 위해 변형될 수 있다. 이들 프로모터의 치환 또는 변형은 edd 유전자 및/또는 eda 유전자의 발현을 증강시키고, 따라서 EDD 및/또는 EDA의 활성이 증강된다. 이들 발현 조절 서열의 변형은 edd 유전자 및/또는 eda 유전자의 복제수의 증가와 배합될 수 있다.

EDD 및 EDA 활성의 증강은 세포-파괴된 현탁액을 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 및 6-포스포글루콘산과 혼합하고, 기질로서 6-포스포글루콘산으로부터 생산된 글리세르알데하이드-3-포스페이트를 측정함으로써 확인할 수 있다. 상기 반응에서, EDD 활성은 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 사용하여 반응후 남아있는 6-포스포글루콘산을 정량하거나 락테이트 데하이드로게나제를 사용하여 과량의 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라제의 존재하에 생산되는 피루브산을 정량함으로써 측정할 수 있다. 6-포스포글루콘산 또는 피루브산은 데하이드로게나제 반응에서 NADH의 증가로서 정량할 수 있다. 추가로, EDA 활성은 또한 락테이트 데하이드로게나제를 사용하여 기질로서 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트로부터 생산되는 피루브산을 검출함으로써 측정할 수 있다.

본 발명의 그람-음성 세균에서, EDD 및 EDA 외에 L-아미노산 생합성을 촉매하는 효소의 활성은 EDD 및 EDA의 활성 증가 효과가 감소되지 않는 한 증가할 수 있다.

예를 들면, 표적 L-아미노산이 L-글루탐산인 경우, 이러한 효소의 예로는 글루타메이트 데하이드로게나제(또한 "GDH"로서 후술됨), 글루타민 신세타제, 글루타메이트 신타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니테이트 하이드라타제, 시트레이트 신타제(또한 "CS"로서 후술됨), 포스포에놀피루베이트 카복실라제(또한 "PEPC"로서 후술됨), 포스포에놀피루베이트 신타제, 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트 키나제, 피루베이트 카복실라제, 에놀라제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 트리오세 포스페이트 이소머라제, 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제, 포스포프럭토키나제, 플루코스 포스페이트 이소머라제 등을 포함한다. L-글루탐산의 생산을 위해 사용되는 세균이 엔테로박터 세균인 경우, CS, PEPC 및 GDH의 세 종류중의 하나가 상기 언급된 효소중에서 바람직하다. 추가로, 세 종류의 효소, CS, PEPC 및 GDH의 활성이 모두 증강되는 것이 바람직하다. 특히, 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum))의 CS는 α-케토글루타르산, L-글루탐산 및 NADH에 의한 억제로 문제되지 않으므로 바람직하다.

CS를 암호화하는 유전자(gltA), PEPC를 암호화하는 유전자(ppc) 및 GDH를 암호화하는 유전자(gdhA) 공급원을 제공할 수 있는 유기체로서, 임의의 유기체가 CS, PEPC 및 GDH의 활성을 갖는 한 사용될 수 있다. 특히, 원핵생물인 세균, 예를 들어, 엔테로박터, 클렙시엘라, 에르위니아, 판토에아, 세라티아, 에스케리키아, 코리네박테리움, 브레비박테리움 또는 바실러스 속에 속하는 세균이 바람직하다. 이의 구체적 예로는 에스케리키아 콜라이, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 등을 포함한다. gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자는 상기 언급된 미생물의 염색체 DNA로부터 수득될 수 있다.

gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자는 CS, PEPC 또는 GDH 활성이 결실된 돌연변이체를 사용하고, 상기 언급된 미생물의 염색체 DNA로부터 이의 영양요구성을 보충하는 DNA 단편을 분리시킴으로써 수득될 수 있다. 추가로, 에스케리키아 세균의 상기 유전자 및 코리네박테리움 세균의 상기 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 이미 밝혀졌으므로[참고문헌: Biochemistry, 22: 5243-5249, 1983; J. Biochem., 95: 909-916, 1984; Gene, 27: 193-199, 1984; Microbiology, 140:1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet., 218, 330-339, 1989; Molecular Microbiology, 6: 317-326, 1992], 상기 서열은 각각의 뉴클레오타이드 서열을 근거로 한 프라이머를 합성하고, 주형으로서 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행함으로써 수득될 수 있다. 상기 유전자의 엔테로박터 세균과 같은 그람-음성 세균내 도입은 EP 0 670 370 A2, 미국 특허 제6,197,559호, EP 0 999 282 A2 및 EP 1 078 989 A2에 상세하게 기재되어 있다.

CS, PEPC 및 GDH의 활성 뿐만 아니라 상기 언급된 바와 같은 다른 효소적 활성은 상기 언급된 EDD 및 EDA 활성의 증강과 같은 동일한 방법으로 증강될 수 있다.

추가로, 본 발명의 세균에서, 표적 L-아미노산의 생합성 경로로부터의 분지에 의한 또다른 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소적 활성이 EDD 및/또는 EDA 활성의 증강의 효과가 감소되지 않는 한 감소되거나 제거될 수 있다. 예를 들면, 표적 L-아미노산이 L-글루탐산인 경우, 이러한 효소의 예는 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(또한 "αKGDH"로서 후술됨), 이소시트레이트 리아제, 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, 아세테이트 키나제, 아세토하이드록시 산 신타제, 아세토락테이트 신타제, 포르메이트 아세틸트랜스퍼라제, 락테이트 데하이드로게나제, L-글루타메이트 데카복실라제, 1-피롤린 데하이드로게나제 등을 포함한다.

상기 언급된 효소의 활성을 감소하거나 제거하기 위해서, 미생물을 자외선 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 아질산과 같은 돌연변이유발 인자로 처리하는 방법 및 표적 효소적 활성이 감소된 돌연변이 균주를 선택하는 방법, 상동성 재조합을 근거로 한 유전자 치환을 사용하는 유전자 파괴 방법 등이 사용될 수 있다. αKGDH를 암호화하는 유전자의 유전자 파괴는 미국 특허 제5,977,331호에 기재되어 있다.

edd 유전자 및 eda 유전자 이외의 유전자가 본 발명의 세균의 작제중에 도입되는 경우, 보다 적은 종류의 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 벡터는 통상적으로 마커 유전자를 갖고, 마커 유전자 등에 상응하는 제제가 배지에 부가되어야 한다. 따라서, 다수의 종류의 벡터가 사용되는 경우, 다수의 제제가 배지에 부가되어야 한다. 이는 세균의 약한 증식을 야기할 수 있다. 따라서, 통상적으로 보다 적은 종류의 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 2개 이하의 종류, 보다 바람직하게는 1종류의 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

추가로, 상이한 복제수를 갖는 2개 종류 이상의 벡터 각각이 사용되는 경우, 도입되는 유전자의 종류에 따라 높은 복제수의 벡터와 낮은 복제수의 벡터 사이의 유전자 분포를 결정하는 것이 바람직하다.

유전자 분리, 숙주 세포내 유전자의 도입, 유전자 파괴 등의 조작에 있어서, 당해 분야 숙련가에게 공지된 통상의 방법이 염색체 DNA의 제조, 염색체 DNA 라이브러리의 작제, 하이브리드화, PCR, 플라스미드 DNA의 제조, DNA의 분해 및 연결, 형질전환, 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 디자인 등을 위한 방법으로서 사용될 수 있다. 이들 방법은 문헌[참고문헌: Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] 등에 기재되어 있다.

<2> 본 발명의 세균을 사용하는 L-아미노산의 생산

배지내 L-아미노산을 생산 및 축적시키기 위해서 배지내 상기 기재된 바와 같이 수득된 본 발명의 세균을 배양하고, 배지로부터 L-아미노산을 수거함으로써 L-아미노산을 생산할 수 있다.

본 발명의 세균을 사용함으로써 L-아미노산을 생산하기 위해, 탄소원, 질소원, 무기 염 및 통상적인 방법에서 필요로 하는 아미노산 및 비타민과 같은 미량의 유기 영양소를 함유하는 통상의 배지가 사용될 수 있다. 합성 배지 또는 천연 배지가 사용될 수 있다. 임의의 종류의 탄소원 및 질소원은 배양되는 세균성 균주에 의해 사용될 수 있는 한 배지내 사용될 수 있다.

탄소원으로서, 글루코스, 글리세롤, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 만노스, 갈락토스, 전분 가수분해물 및 당밀과 같은 사카라이드가 사용된다. 아세트산 및 시트르산과 같은 유기산 및 에탄올과 같은 알콜이 또한 단독 또는 다른 탄소원과 함께 사용된다. 이들 중에서, 글루코스 및 슈크로스가 바람직하다.

질소원으로서, 암모니아, 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 및 암모늄 아세테이트와 같은 암모늄 염, 질산염 등이 사용될 수 있다.

미량의 유기 영양소로서, 아미노산, 비타민, 지방산 및 핵산 뿐만 아니라 펩톤, 카사미노산, 효모 추출물 및 이들을 함유하는 대두 단백질 분해 생성물이 사용될 수 있다. 증식을 위한 아미노산 등을 필요로 하는 영양요구성 돌연변이가 사용되는 경우, 이러한 필요한 영양소를 보충하는 것이 바람직하다.

무기 염으로서, 인산염, 마그네슘 염, 칼슘 염, 철 염, 망감 염 등이 사용될 수 있다.

배양에 있어서, 사용되는 세균의 타입에 따라 다르다고 해도 통기 배양은 통상적으로 20 내지 45℃의 온도 및 5 내지 9의 pH로 발효를 조절하면서 수행된다. pH가 배양 동안 떨어지는 경우, 탄산칼슘이 부가되거나, 상기 배양물은 암모니아 가스와 같은 알칼리로 중화된다. 약 10 내지 120 시간 동안 상기 방법으로의 배양에 의해 현저한 양의 L-글루타민이 배양액에서 축적된다.

배양 완료후 배양액으로부터 L-아미노산의 수거 방법으로서, 공지된 방법, 예를 들어 이온 교환 수지, 침전 등을 이용하는 방법이 사용될 수 있다.

실시예

하기, 본 발명은 하기 실시예를 참조로 보다 구체적으로 설명될 것이다.

<1> 엔트너-도우도로프 경로와 관련된 효소의 유전자 클로닝

엔트너-도우도로프 경로와 관련된, 효소 EDD 및 EDA를 각각 암호화하는 edd 유전자 및 eda 유전자를 에스케리키아 콜라이, 지모모나스 모빌리스 등로부터 클로닝하였다. 엔테로박터 아글로머란스는 분류학적으로 장내세균 그룹에 속하고, 에스케리키아 콜라이와 밀접하게 관련된 것으로 간주된다. 추가로, 에스케리키아 콜라이 유전자는 엔테로박터 아글로머란스에서 발현될 수 있다. 따라서, 에스케리키아 콜라이로부터 edd 유전자 및 eda 유전자를 클로닝하기로 결정하였다.

이들 두가지 유전자는 에스케리키아 콜라이에서 오페론을 형성한다[참고문헌: J. Bacteriol., 174 (14): 4638-46, July 1992]. 따라서, edd-F(서열번호 1) 및 eda-R(서열번호 2)을 PCR에 의해 유전자 둘다를 포함하는 DNA 단편을 증폭시키기 위해 유전자 둘다를 동시에 증폭시킬 수 있는 프라이머로서 설계하였다. PCR을 Pyrobest DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 사용하여 수행하였고 94℃로 1분 동안 반응이 이루어진 후 94℃로 30초 동안, 60℃로 30초 동안 및 72℃로 3분 동안 30 주기를 반복하여 반응이 이루어졌다.

이어서, 수득된 증폭된 단편을 제한 효소 SalI 및 BamHI를 사용하여 완전하게 분해하고, 제한 효소 SalI 및 BamHI로 완전하게 분해된 플라스미드 pMW219와 연결하여 에스케리키아 콜라이 JM109(Takara Shuzo사로부터 구입)를 형질전환시켰다. 수득된 형질전환체로부터 목적하는 크기의 단편을 함유하는 클론의 5개 균주를 선택하고, 이들 균주로부터 플라스미드를 추출하였다.

각각의 플라스미드를 전기천공법[참고문헌: Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., p.279, 1992]에 의해 엔테로박터 아글로머란스 AJ13601내 도입하였고, EDD 및 EDA 활성을 측정하여 edd 유전자 및 eda 유전자가 발현된 클론을 선택하였다.

AJ13601 균주는 하기와 같이 수득된 세균성 균주이다. 산성 환경하에서 L-글루탐산에 대한 내성 및 우수한 증식 속도를 나타내는 균주로서 엔테로박터 아글로머란스 AJ13355 균주를 토양으로부터 분리하였다. 이어서, AJ13355 균주로부터 점액질 저생산성 돌연변이 균주를 유도하고, αKGDH 유전자를 파괴하여 AJ13356 균주를 수득하였다. AJ13356 균주는 αKGDH-E1 아단위 유전자(sucA)의 파괴 결과로서 αKGDH 활성이 결손되어 있다. 이어서, AJ13356 균주에 에스케리키아 콜라이의 시트레이트 신타제 유전자(gltA), 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자(ppc) 및 글루타메이트 데하이드로게나제(gdhA) 유전자를 갖는 플라스미드 RSFCPG 및 브레비박테리움 락토퍼멘텀으로부터 유도된 gltA 유전자를 갖는 플라스미드 pSTVCB를 도입하여 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 균주를 수득하였다. 상기 균주로부터, 낮은 pH 환경하에서 L-글루탐산에 대한 증가된 내성 및 최고의 증식 속도를 나타내는 세균성 균주로서 AJ13601 균주를 선택하였다(EP 1 078 989 A2).

상기 언급된 바와 같이 edd 및 eda 유전자 단편을 포함하는 플라스미드를 도입한 형질전환체로부터 무작위적으로 선택한 균주를 테트라사이클린, 클로람페니콜 및 카나마이신을 각각 12.5mg/L, 25mg/L 또는 25mg/L의 양으로 함유하는 LBGM9 액체 배지(10g/L의 트립톤, 5g/L의 효모 추출물, 5g/L의 NaCl 및 5g/L의 글루코스를 함유하는 배지, 별도로 살균한 10 × M9(128g/L의 Na₂HPO₄·7H₂O, 30g/L의 KH₂PO₄, 5g/L의 NaCl, 10g/L의 NH₄Cl)를 1/10 용적으로 부가)에서 15시간 동안 배양하였다. 이들 배양액으로부터 원심분리에 의해 집균하고, 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.6) 및 10mM MgCl₂로 2회 세척한 후, 동일한 완충액에서 현탁시켰다. 초음파로 세균을 파괴하고, 15000rpm으로 30분 동안 원심분리하여 상청액을 조효소 용액으로서 사용하였다.

EDD 및 EDA의 활성은 2개의 효소에 의해 수득된 반응 생성물을 분광 기술을사용하여 동시에 측정하였다. 즉, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM MgCl₂, 1mM EDTA, 1mM APAD(아세틸피리딘 아데닌 디뉴클레오타이드), 5mM K₂HPO₄, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 20 단위, 6-포스포글루콘산 및 조효소 용액을 혼합하고, 365nm 흡광도의 증가를 측정하여 기질로서 6-포스포글루콘산으로부터 생산된 글리세르알데하이드-3-포스페이트를 측정하였다. 벡터만을 도입한 균주에 있어서도 동일한 측정을 수행하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.

세균 균주	활성(nmol/분/mg 단백질)
PMW219 도입된 균주	1.9
edd/eda 증강된 균주 1	13.4
edd/eda 증강된 균주 2	11.5
edd/eda 증강된 균주 3	13.2
edd/eda 증강된 균주 4	5.0
edd/eda 증강된 균주 5	10.9

모든 균주가 활성이 증강된 것이 확인되었다. 최고의 활성을 갖는 균주에서, 활성은 약 7.2배 증강되었다. 상기 균주의 플라스미드를 pMW-EDDA라 명명했다.

<2> 엔트너-도우도로프 경로 증강된 균주를 사용하는 L-글루탐산의 생산

이어서, 엔트너-도우도로프 경로의 증강이 L-글루탐산 생산에 미치는 영향을 시험하였다.

상기에서 사용된 엔테로박터 아글로머란스 AJ13601 균주는 2종류의 플라스미드를 함유하였고, 추가로 edd 유전자 및 eda 유전자를 도입한 균주는 3종류의 플라스미드를 함유하였다. 따라서, 3종류의 제제를 배양에 부가하여야 하고, 따라서 증식은 매우 약화되고, 즉, L-글루탐산 생산 배양 평가계에서 거의 어떠한 증식도 관찰되지 않았다. 따라서, 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 시트레이트 신타제(또한 "CS"로서 후술됨) 유전자 및 edd 유전자와 eda 유전자를 하나의 플라스미드내 도입함으로써 오직 2종류의 플리스미드를 사용하였다.

브레비박테리움 락토퍼멘텀의 CS 유전자를 함유하는 플라스미드 pSTVCB의 작제에 사용되는 벡터 pSTV28 및 edd 유전자 및 eda 유전자의 클로닝에 사용되는 벡터 pMW219에서는, 전자가 보다 높은 복제수를 나타낸다. 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 CS 유전자가 AJ13601 균주에서 pSTV28 벡터에 의해 증강되지만, 상기 유전자를 pMW219를 사용하여 도입하는 발현량을 증가시킬 필요가 있는 것으로 간주되었다. 따라서, CS 유전자내 프로모터가 에스케리키아 콜라이의 CS 유전자의 프로모터와 치환된 유전자를 작제하였다.

구체적으로, 프라이머 GLTES1(서열번호 3) 및 GLTEB0(서열번호 4) 및 주형으로서 에스케리키아 콜라이 W3110 균주의 염색체를 사용하여 CS 유전자내 프로모터 영역을 증폭시켰다. 추가로, CS 유전자의 ORF 영역을 함유하는 단편을 프라이머 GLTBB0(서열번호 5) 및 GLTBA1(서열번호 6) 및 주형으로서 브레비박테리움 락토퍼멘텀 2256 균주의 염색체를 사용하여 증폭시켰다. 단편 둘다를 주형으로서 사용하고, 프라이머 GLTES2(서열번호 7) 및 GLTBA2(서열번호 8)를 사용하여 교차 PCR을 수행하여 표적 단편을 수득하였다. 상기 단편을 제한 효소 SmaI 및 HindIII으로분해하고, pSTV28의 동일한 부위에 도입하여 pSTV-C^B(^*)를 수득하였다. 상기 플라스미드를 kpnI 및 HindIII으로 분해하고, 에스케리키아 콜라이의 CS 유전자의 프로모터 및 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 CS 유전자의 암호화 영역을 함유하는 융합 유전자 단편을 회수하여 T4 DNA 폴리머라제로 말단 평활화하였다. 상기 융합 유전자 단편을 pMW219의 SmaI 부위내로 도입하여 pMW-C^B(^*)를 수득하였다. 추가로, pMW-EDDA를 BamHI로 처리하여 상기 융합 유전자 단편과 연결하고 연결 생성물을 T4 DNA 폴리머라제로 말단 평활화하여 pMW-C^B(^*)·ED를 수득하였다.

이어서, AJ13601을 LBGM9 액상 배지에서 31.5℃로 밤새 진탕하여 플레이트당 100 내지 200 콜로니가 수득되도록 적절하게 희석시키고, 12.5mg/L의 테트라사이클린을 함유하는 LBGM9 플레이트상에 도포하였다. 나타난 콜로니를 12.5mg/L의 테트라사이클린 및 25mg/L의 클로람페니콜을 함유하는 LBGM9 플레이트상에 복제시키고, 클로람페니콜 감수성인 균주를 수거하여 G106S라 하였다. G106S 균주는 RSFCPG만을 함유하였고, pSTVCB는 결실되었다. pMW-C^B(^*) 또는 pMW-C^B(^*)·ED를 상기 균주내 도입하여 수득된 균주를 각각 G106S pMW-C^B(^*) 및 G106S pMW-C^B(^*)·ED라 명명하였다.

상기 균주의 L-글루탐산 생산 능력을 평가하기 위해서, jar 발효기를 사용하여 배양 평가를 수행하였다. 사용된 배지는 50g/L의 슈크로스, 0.4g/L의 MgSO₄,0.1mL/L의 GD-113(소포제), 4g/L의 (NH₄)₂SO₄, 2g/L의 KH₂PO₄, 4g/L의 효모 추출물, 10mg/L의 FeSO₄·7H₂O, 10mg/L의 MnSO₄·4-5H₂O, 0.4g/L의 L-라이신, 0.4g/L의 DL-메티오닌, 0.4g/L의 디아미노피멜산, 12.5mg/L의 테트라사이클린 및 25mg/L의 클로람페니콜을 함유하는 300㎖의 배지였다. 배양을 통기 1/1 VVM, 교반 1300rpm 및 암모니아로 pH 6.0으로 조절하며 슈크로스가 소비될 때까지 수행하였다. 시간에 따른 배지중 660nm의 흡광도 및 L-글루탐산 생산량의 변화를 도 1에 도시한다. 추가로, L-글루탐산의 최종 생산량을 표 2에 나타낸다.

	OD 620nm(×1/101)	배양 시간(시간)	L-글루탐산(g/L)
G106S pMW-C^B(^*)	0.334	12	30.4
G106S pMW-C^B(^*)·ED	0.258	16	36.8

L-글루탐산 생산 능력은 배양이 지연되더라도 엔트너-도우도로프 경로를 증강시킴으로써 향상시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.

<3> 엔트너-도우도로프 경로 증강된 균주에 의한 아세토인 및 2,3-부탄디올 생산의 연구

상기 언급된 G106S pMW-C^B(^*) 및 G106S pMW-C^B(^*)·ED 균주를 <2>에서의 L-글루탐산 생산 능력에 대한 평가에서와 같이 동일한 방법으로 배양하고, 배지 및 세균내 아세토인 및 2,3-부탄디올의 양을 시간 경과에 따라 측정하였다. 측정을 하기 조건하에 기체 크로마토그래피(Shimadzu Corporation, GC-1700A)로 수행하였다.

사용된 칼럼: VARIAN PORAPLOTQ PLOT FS25X32(0.32mm ×25M)

온도: 기화실: 250℃, 칼럼: 240℃, FID: 250℃

칼럼 주입 압력: 180kPa

매개 가스 유속: 1.6062㎖/분

결과를 도 2A(배지내 아세토인 양), 도 2B(배지내 2,3-부탄디올 양) 및 도 2C(단위 세포당 생산된 아세토인 및 2,3-부탄디올의 총량)에 도시한다. 아세토인 및 2,3-부탄디올의 생산은 엔트너-도우도로프 경로를 증강시킴으로서 증가되었다는 것이 밝혀졌다.

엔트너-도우도로프 경로가 증강된 그람-음성 세균으로부터 L-아미노산 생산 능력을 향상시키는 기술을 제공한다.

Claims

L-아미노산 생산 능력을 갖는 미생물을 배지에서 배양하여 L-아미노산을 배지중에 생산 축적시켜 상기 배지로부터 L-아미노산을 수거함을 포함하는 L-아미노산의 생산 방법에 있어서, 미생물이 엔트너-도우도로프 경로(Entner-Doudoroff pathway)를 갖고, 6-포스포글루코네이트 데하이드라타제 활성 또는 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라제 활성, 또는 이들 활성 둘다가 증강되도록 변형된 그람-음성 세균이며, L-아미노산은 피루브산을 중간물질로서 사용하는 생합성 경로에 의해 생산되는 L-아미노산으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 세균이 장내세균인 방법.
제2항에 있어서, 세균이 엔테로박터 속에 속하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 6-포스포글루코네이트 데하이드라타제 활성 또는 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라제 활성이 6-포스포글루코네이트 데하이드라타제 또는 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라제를 암호화하는 유전자의 복제수를 증가시키거나, 상기 세균의 세포내에서 상기 유전자의 발현을 증강시키도록 상기 유전자의 발현 조절 서열을 변형시킴으로써 증강되는 방법.
제1항에 있어서, L-아미노산이 L-글루탐산, 또는 중간물질 또는 아미노 그룹 공여체로서 L-글루탐산을 이용하는 생합성 경로에 의해 생산되는 L-아미노산인 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, L-아미노산이 L-글루탐산, L-아르기닌, L-글루타민, L-프롤린, L-루신, L-이소루신, L-발린 및 L-알라닌으로부터 선택되는 방법.
제6항에 있어서, L-아미노산이 L-글루탐산인 방법.