EP1874946A2 - Verfahren zur fermentativen herstellung von l-valin, l-isoleucin oder l-lysin unter verwendung coryneformer bakterien mit verminderter oder ausgeschalteter alanin aminotransferase aktivität - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von l-valin, l-isoleucin oder l-lysin unter verwendung coryneformer bakterien mit verminderter oder ausgeschalteter alanin aminotransferase aktivität

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EP1874946A2
EP1874946A2 EP06722804A EP06722804A EP1874946A2 EP 1874946 A2 EP1874946 A2 EP 1874946A2 EP 06722804 A EP06722804 A EP 06722804A EP 06722804 A EP06722804 A EP 06722804A EP 1874946 A2 EP1874946 A2 EP 1874946A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
alanine transaminase
corynebacterium
alanine
atp synthase
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06722804A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jan Marienhagen
Lothar Eggeling
Hermann Sahm
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP1874946A2 publication Critical patent/EP1874946A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of L-amino acids.
  • L-amino acids are used in human medicine, in the pharmaceutical industry, in the food industry and in animal nutrition.
  • the recombinant DNA technique is additionally used to enhance the intrinsic properties of L-amino acid producing strains of Corynebacterium. It is thus described that amplification of the expression of the biosynthesis genes ilvBN, ilvC, ilvD are advantageously used for L-valin formation (EP 1155139B1, EP 0356739B1). It is also known that the attenuation or elimination of the threonine dehydratase gene ilvA and / or genes of pantothenate synthesis for L-valine formation can be used (EP 1155139B1).
  • L-isoleucine L-valine and L-lysine needed.
  • alanine may still be formed as an undesirable by-product, and relatively low yields of the target amino acid, e.g. B. L-valine reached.
  • L-amino acids which are preferably formed from pyruvate, which are associated with higher product yields.
  • the yield in the production of L-valine, L-isoleucine and L-lysine should be increased.
  • the object is achieved in that the alanine transaminase is weakened in its activity against the naturally occurring strain or completely eliminated, or that the Alaninpro- reduction is reduced. Furthermore, the object is achieved by identifying an alanine transaminase.
  • the alanine transaminase according to the invention is to be understood in particular as the L-alanine transaminase.
  • amino acids in particular L-valine, L-lysine and L-isoleucine.
  • Fig.2 Plasmid, which is used for the deletion of the alanine transaminase gene according to Example 4
  • Sequence Listing 1 A gene sequence coding for the alanine transaminase.
  • Sequence Listing 2 The amino acid sequence of alanine transaminase.
  • Sequence Listing No.1 codes from nucleotide 101 to 1414 for the alanine transaminase.
  • Sequence Listing 2 shows the sequence of the alanine transaminase encoded by nucleotides 101 to 1414 of Sequence Listing 1.
  • the elimination of the alanine transaminase gene can be effected by deletion or disruption.
  • the invention also includes gene structures which contain the sequence according to sequence listing 1. These can be chromosomes, plasmids, vectors, phages, viruses. Furthermore, the gene sequence or nucleotide sequence itself is encompassed by the invention.
  • sequence according to Sequence Listing 1 encodes the alanine transaminase and can therefore also be used for their preparation.
  • methods known to the person skilled in the art for example overexpression, amplification of promoters or start codons, can be used.
  • the organisms disclosed in this application can be used for the production of alanine transaminase.
  • any gene encoding the alanine transaminase can be deleted or subject to disruption.
  • Blocking the catalytic center of the alanine transaminase for example by adding substrates blocking this center or chemical see substitution, for example due to mutation.
  • Coryneform bacteria particularly preferably Corynebacterium glutamicum, are preferably used according to the invention.
  • the invention also provides a plasmid which is used for the deletion or inactivation of the gene coding for the alanine transaminase gene.
  • the plasmid contains internal sequences of the alanine transaminase gene, or adjacent sequences to the 3 'and 5 "ends of the alanine transaminase gene.
  • alanine transaminase gene or adjacent to the alanine transaminase gene, preferably the regions immediately adjacent to the 3 'and 5' ends of the gene, and ideally is the plasmid shown in FIG.
  • the amino acid L-valine is used in human medicine, in the pharmaceutical industry, in the food industry and in animal nutrition.
  • the invention also relates to a microorganism or a transformed cell or a recombinant cell, in which the production of alanine is reduced or completely eliminated or in which the alanine transaminase activity is reduced or completely eliminated.
  • strains used preferably produce L-valine or L-isoleucine or L-lysine before the deletion of the alanine transaminase gene. Preferred embodiments can be found in the claims.
  • modification in this context describes the reduction of the intracellular activity of one or more biosynthetic enzymes for the production of amino acids (proteins) in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example by using a weak promoter or a Gene or allele used, which codes for a corresponding enzyme with a reduced activity or expressed the corresponding gene (protein) expressed reduced and, where appropriate, combines these measures, or even completely deleted the gene.
  • the microorganisms which are the subject of the present invention can produce L-valine or else other L-amino acids which are formed from pyruvate, from glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose or from glycerol and ethanol.
  • L-valine or else other L-amino acids which are formed from pyruvate, from glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose or from glycerol and ethanol.
  • These are representatives of coryneform bacteria, in particular of the genus Corynebacterium.
  • the species Corynebacterium glutamicum is to be mentioned, which is known in the art for its ability to produce L-amino acids.
  • Suitable starting strains of the genus Corynebacterium, in particular of the species Corynebacterium glutamicum, are, for example, the known wild-type strains
  • thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 and Brevibacterium divaricatum ATCC14020
  • coryneform bacteria produce the L-amino acids valine, leucine and isoleucine in an improved manner after reduction or elimination of the gene coding for the alanine transaminase.
  • the nucleotide sequence of the alanine transaminase gene is inevitably known by the generation of the complete genome sequence of C. glutamicum (Kalinowski et al., 2003, J. Biotechnol., 104: 5-25; Ikeda M., and Nakagawa S. 2003 Appl Microbiol Biotechnol 62: 99-109), but without the assignment of an open reading frame to the
  • Alanine transaminase is known.
  • the open reading frame coding for alanine transaminase described and identified below in the example bears the number NCgl2747 and is deposited in the publicly accessible database of the "National Institutes of Health" (http://www.ncbi.nlm.nih .gov), as well as Cgl2844 in the publicly available "DNA Data Bank of Japan” (http://gib.genes.nig.ac.jp).
  • the alanine transaminase gene described under these numbers is preferably used as starting point of the invention. Furthermore, alleles of the alanine transaminase gene can be used, resulting for example from the degeneracy of the genetic code or by functionally neutral sense mutations (sense mutations) or by deletion or insertion of nucleotides. In order to achieve an attenuation, either the expression of the alanine transaminase gene or the catalytic properties of the enzyme protein can be reduced. Also, the catalytic property of the enzyme protein can be changed with regard to its substrate specificity. If necessary, both measures can be combined.
  • the attenuation of gene expression can be achieved by suitable culture guidance or by genetic modification (mutation) of the signal structures of gene expression.
  • Signaling structures of gene expression include repressor genes, activator genes, operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon, and terminators. Information on this is the expert z.
  • Boyd and Murphy J. Bacteriol 1988: 170: 5949
  • Voskuil and Chambliss Nucleic Acids Res. 1998 26: 3548, Jensen and Hammer (Biotechnol 58: 191)
  • Patek et al. Molecular biology
  • Mutations include transitions, transversions, insertions and deletions, as well as directed evolutionary methods. Instructions for the Generation of such mutations and proteins belong to the state of the art and can be known textbooks (R. Knippers "Molecular Genetics", 8th edition, 2001, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany), or review articles (N. Pokala 2001, J. Struct. Biol.
  • the attenuated expression of the genes or the mutated genes is carried out according to customary methods of gene exchange by replacing the native chromosomal gene by the mutated gene, as described, for example, in Morbach et al. (Microbiol Biotechnol 1996, 45: 612-620).
  • the deletion of the gene is carried out as in Scharzer and Pühler (Biotechnology 1990, 9: 84-87), as well as Schwarz et al. (Appl., Environ., Microbio., 1994, 60: 756-759).
  • the transformation of the desired strain with the vector for gene replacement or deletion is carried out by conjugation or electroporation of the parent strain.
  • the method of conjugation is described by Schwarz et al. (Appl., Environ., Microbio., 1994, 60: 756-759). Methods for transformation are, for example, in Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters (1994) 123: 343-347).
  • the alanine transaminase gene can be deleted or its allele exchanged into C. glutamicum.
  • L-valine Furthermore, it may be beneficial for the production of L-valine, in addition to mitigation or deletion. on the alanine transaminase activity of one or more of the genes selected from the group
  • the ilvBN genes encoding feedback-resistant acetohydroxy acid synthase
  • L-valine in addition to the reduction of alanine - transaminase activity, one or more of the genes selected from the group
  • panBCD genes coding for pantothenate synthesis
  • L-valine in addition to the attenuation of alanine transaminase, it may be advantageous for the production of L-valine to eliminate undesirable side reactions which lead to leucine, for example (Nakayama: “Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction). Duction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.) / Academic Press, London, UK, 1982).
  • microorganisms produced according to the invention can be cultivated continuously or discontinuously in the batch process (batch culturing) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) for the purpose of producing valine.
  • the culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective microorganisms. Descriptions of culture media of various microorganisms are given in the manual "Manual of Methods for
  • sugars and carbohydrates such as, for example, glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, masseclose, Starch and cellulose, oils and fats, such as, for example, soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids, such as, for example, palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols, such as, for example, glycerol and ethanol and organic acids, such as acetic acid, can be used the. These substances can be used individually or as a mixture.
  • the nitrogen source there may be used organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • As a source of phosphorus it is possible to use potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts.
  • the culture medium must also contain salts of metals, such as. As magnesium sulfate or iron sulfate, which are necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used in addition to the above-mentioned substances.
  • the said feedstocks can be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in a suitable manner during the cooling.
  • the medium may have suitable selective substances, eg. As antibiotics, are added.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such as. As air, registered in the culture.
  • the temperature of the culture is normally from 20 0 C to 45 ° C and preferably 25 ° C to 40 0 C. The culture is continued until a maxi- raura has formed to L-valine. This goal is usually reached within 10 to 160 hours.
  • the indicated primers were synthesized by MWG Biotech AG (Anzinger Str 7a, D-85560 Ebersberg) and the PCR reaction was carried out according to standard protocols (Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, 1990. Academic Press ). With the primers, a DNA fragment of about 1.3 kb was obtained, which codes for the alanine transaminase.
  • the primers contain the restriction enzyme Bsal site cleaved in the above nucleotide sequences.
  • the amplified DNA fragment of about 1.3 kb was identified in 0.8% agarose gel and isolated from the gel using existing methods (QIAquik Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden). The ligation of the fragment was carried out with the SureCloning Kit (Amersham, UK) in the expression vector pASK-IBA-3C (IBA, Gttingen). The ligation mixture was used to transform E. coli DH5 (Grant et al. , 1990. Proceedings of the United States of America of the United States of America, 87: 4645-4649). The selection for plasmid-containing strains was carried out by plating the transformation mixture to 25 mg per liter of chloramphenicol-containing LB plates.
  • the resulting plasmids were characterized by restriction digestion and gel electrophoretic analysis.
  • the resulting plasmid was named pASK-IBA-3Corf234. It is indicated in FIG.
  • E. coli DH5 with pASK-IBA 3Corf234 was performed at 30 0 C in 100 ml LB with 25 mg were grown to an optical density of 0.5 per liter of chloramphenicol. Then, 0.01 ml of an anhydrotetracycline solution containing 2 mg of anhydrotetracycline per milliliter of dimethylformamide was added. The culture was further incubated at 30 ° C. for 3 hours. The cells were then passed through 12 minutes at 4 0 C and 5000 revolutions per minute
  • StrepTactin affinity columns manufacturer IBA (IBA, Göttingen, Germany) were filled with 1 ml bed volume StrepTactin-Sepharose. After equilibration of the columns with washing buffer from the manufacturer IBA, 1 ml of the crude extract was added to the Sepharose. After passing through the extract, the affinity column was washed five times with 1 ml of washing buffer. Elution of the alanine transaminase protein was performed with elution buffer consisting of 100 mM Tris, 1 mM EDTA, 2.5 mM desthiobiotin, pH 8. The elution fractions were aliquoted, frozen at -20 0 C and used directly in the enzyme test.
  • IBA IBA, Göttingen, Germany
  • the reaction batch of the enzyme assay contained in a total volume of 1 ml: 0.2 ml 0.25 M Tris / HCl, pH 8, 0.005 ml alanine transaminase protein and 0.1 ml 2.5 mM pyridoxal phosphate, and 0.1 ml 40 mM pyruvate and 0.1 ml of 0.5 M L-glutamate, or 0.1 ml of 40 mM pyruvate and 0.1 ml of 0.5 M aspartate, or 0.1 ml of 40 mM pyruvate and 0.1 ml of 0.5 M ⁇ -amino-butyrate, or 0.1 ml of 40 mM pyruvate and 0.1 ml of 0.5 M L-glutamate without alanine transaminase protein.
  • the enzyme test was carried out at 30 ° C. in a thermocycler 5436 from Eppendorf (Hamburg). The reaction was started by adding the protein. By adding 30 ⁇ l of a stop reagent (6.7% (v / v) perchloric acid (70%), 40% (v / v) ethanol (95%) in water) to 50 ⁇ l each of the test mixture, the enzyme was zymtest stopped. In order to prepare the samples for the detection of the amino acids formed by reversed-phase HPLC, 20 ⁇ l of a neutralization buffer (20 mM Tris, 2.3 M di-potassium carbonate, pH 8) were added.
  • a neutralization buffer (20 mM Tris, 2.3 M di-potassium carbonate, pH 8) were added.
  • the precipitated by the neutralization of perchloric acid was centrifuged off (13000 rpm, 10 min) and the supernatant in different dilutions was used for the quantification by means of HPLC. This was done after automated derivatization with o-phthaldialdehyde as described (Hara et al., 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173). As shown in Table 1, the isolated protein catalyzes the L-glutamate, L-aspartate and ce-aminobutyrate-dependent amination of pyruvate to alanine.
  • the indicated primers were synthesized by MWG Biotech AG (Anzinger Str 7a, D-85560 Ebersberg) and the PCR reaction was carried out according to standard protocols (Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, 1990. Academic Press ). The primers were used to amplify two DNA fragments of about 400 bp flanking the alanine transaminase gene.
  • the primers Del234_1 and Del234_4 additionally contain the restriction enzyme BamHI site, which is indicated in brackets above in the nucleotide sequences.
  • the amplified DNA fragments of about 400 bp were identified in 0.8% agarose gel and isolated from the gel according to existing methods (QIAquik Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden). With the aid of a second PCR reaction in which the two previously amplified DNA fragments were used as template DNA (Link et al., 1997, J. Bacteriol 179: 6228-6237), An approximately 800 bp fragment was amplified. This fragment contains both the alanine transaminase flanking DNA regions. The amplified DNA fragment of about 800 bp was identified in 0.8% agarose gel and isolated from the gel using existing methods (QIAquik Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden).
  • the ligation of the fragment was carried out with the SureCloning Kit (Amersham, UK) into the deletion vector pK19mobsacB (Schäfer et al., 1994, Gene 145: 69-73).
  • the ligation reaction was used to transform E. coli DH5 (Grant et al., 1990. Proceedings of the United States of America of the United States of America, 87: 4645-4649).
  • the selection of plasmid-containing strains was carried out by plating the transformation mixture on LB plates containing 50 mg per liter kanamycin.
  • plasmids obtained were characterized by restriction digestion and gel electrophoretic analysis.
  • the resulting plasmid was named pkl9mobsacB orf234. It is indicated in FIG.
  • the plasmid pkl9mobsacB-orf234 was used to transform the strain 13032 ⁇ panBC to kanamycin resistance.
  • the strain is described in EP1155139B1, and the transformation technique in Kirchner et al. J. Biotechnol. 2003, 104: 287-99.
  • the deletion of the gene for alanine transaminase was carried out according to the protocol for the deletion of genes in Corynebacterium glutamicum according to Shufer et al. , 1994, Gene 145: 69-73, performed by two consecutive homologous recombinations. With the aid of the PCR reaction, the deletion of the gene for the alanine transaminase was confirmed.
  • the following primers were used:
  • the indicated primers were synthesized by MWG Biotech and the PCR reaction was carried out according to standard protocols (Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, 1990. Academic Press). Amplification of a 1 kb DNA fragment confirmed the deletion of the alanine transaminase gene.
  • the obtained strain was designated strain 13032 ⁇ panBC ⁇ alaT.
  • Example 5 Reduction of alanine formation and increase of L-valine formation by deletion of alanine transaminase
  • the strain 13032 ⁇ panBC ⁇ alaT and the control strain was 13032 ⁇ panBC in the medium CgIII (Menkel et al, 1989, Appl Environ Microbiol. 55: 684-8...) Grown at 3O 0 C.
  • the medium CGXII was inoculated with an optical density of 1.
  • the medium CGXII contains per liter: 20 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 5 g urea, 1 g KH 2 PO 4 ,

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren. Erfindungsgemäß wird die Aktivität der Alanin-Transaminase entweder reduziert oder ausgeschaltet, wodurch insbesondere die Aminosäuren L-VaI in, L-Lysin und L-Isoleucin mit erhöhter Ausbeute produziert werden. Weiterhin wurde die Nukleinsäure gemäß Seq. Nr. 1 von den Positionen 101 bis 1414 als die für das Alanin-Transaminase -Gen kodierende Sequenz identifiziert. Deren Verwendung ermöglicht die Herstellung von L-Alanin.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren.
L-Aminosäuren finden in der Humanmedizin, in der phar- mazeutischen Industrie, der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebac- terium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie z.B. die Zuckerkonzentration wäh- rend der Fermentation oder die Aufarbeitung zur Produktform durch z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mik- roorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet . Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L- Aminosäuren produzieren. So ist zum Beispiel in US Patent 5,521,074 ein Corynebacterium Stamm beschrieben, der resistent gegenüber L-Valin ist und sensitiv gegenüber Fluoropyruvat . Ferner ist in EP 0287123 beschrieben, dass Corynebacterien mit Resistenz gegenüber Mycophenolsäuren vorteilhaft zur L-Valin Gewinnung benutzt werden können. Auch ist bekannt, dass Mutanten mit mutierter Valyl-tRNA Synthetase in Kombination mit weiteren Mutationen für die L-VaIinbildüng herangezogen werden können (EP 0519113A1, US 5,658,766).
Die rekombinante DNA-Technik wird zusätzlich zur Verbesserung der intrinsischen Eigenschaften von L-Amino- säure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt. So ist beschrieben, dass Verstärkung der Expres- sion der Biosynthesegene ilvBN, ilvC, ilvD vorteilhaft zur L-VaIinbildung eingesetzt werden (EP 1155139B1, EP 0356739B1) . Bekannt ist ferner, dass die Abschwächung oder Ausschaltung des Threonin-Dehydratase Gens ilvA und/oder von Genen der Pantothenat Synthese zur L-Valinbildung herangezogen werden können (EP 1155139B1) .
Eine Verbesserung der Leistungseigenschaften wird auch durch die Verringerung der Nebenproduktbildung erreicht. Dies gelingt teilweise durch geeignete Fermen- tationsführung. Es ist auch bekannt, dass durch Expression spezieller Gene die Nebenproduktbildung verringert werden kann. So führt z. B. die Expression von avtA zu erhöhter L-Leucin Bildung und verringerter Bildung der Begleitaminosäure L-Valin (WO 00171021 Al) . Ferner ist bekannt, dass oftmals sich aus Pyruvat bildende Nebenprodukte bilden können, wie z. B. Laktat und Alanin, die beide direkt aus Pyruvat entstehen (Uy D. et al . , J. Biotechnol. 2003 Sept. 4; 104 (1-3) : 173-184) . Andererseits wird Pyruvat aber auch als Baustein von Amino- säuren, wie z. B. L-Isoleucin, L-Valin und L-Lysin benötigt . Bei den Verfahren nach, dem Stand der Technik kann es auf Grund der intrinsischen Eigenschaften der Mikroorganismen immer noch zur Bildung von Alanin als unerwünschtes Nebenprodukt kommen und es werden relativ niedrige Ausbeuten der Zielaminosäure, wie z. B. L-Valin, erreicht.
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Amino- säuren, die vorzugsweise aus Pyruvat entstehen, bereitzustellen, welche mit höheren Produktausbeuten einhergehen. Insbesondere soll die Ausbeute bei der Herstellung von L-Valin, L-Isoleucin und L-Lysin erhöht werden.
Überraschenderweise wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass die Alanin-Transaminase in ihrer Aktivität gegenüber dem natürlich vorkommenden Stamm geschwächt oder vollkommen ausgeschaltet wird oder, dass die Alaninpro- duktion vermindert wird. Weiterhin wird die Aufgabe da- durch gelöst, dass eine Alanin-Transaminase identifiziert wird.
Unter der erfindungsgemäßen Alanin-Transaminase ist insbesondere die L-Alanin-Transaminase zu verstehen.
Überraschenderweise kann die Ausbeute für die Produktion der Aminosäuren, insbesondere L-Valin, L-Lysin und L-Isoleucin, erheblich gesteigert werden.
Im Folgenden soll die Erfindung erläutert werden: Die Figuren zeigen Plasmide:
Fig.l. Plasmid zum Nachweis der Aktivität des Alanin- Transaminase-Gens gemäß Beispiel 3
Fig.2: Plasmid, welches für die Deletion des Alanin- Transaminase-Gens gemäß Beispiel 4 verwendet wird
Es zeigt weiterhin:
Sequenzprotokoll 1: Eine für die Alanin-Transaminase kodierende Gensequenz .
Sequenzprotokoll 2: Die Aminosäuresequenz der Alanin- Transaminase.
Sequenzprotokoll Nr.1 kodiert ab Nukleotid 101 bis 1414 für die Alanin-Transaminase.
Sequenzprotokoll 2 zeigt die Sequenz der Alanin- Transaminase, die durch die Nukleodide von 101 bis 1414 des Sequenzprotokolls 1 kodiert werden.
Erfindungsgemäß können beispielsweise folgende Maßnahmen ergriffen werden:
Die Ausschaltung des Alanin-Transaminase-Gens kann durch Deletion oder Disruption bewirkt werden.
Hierzu wurde überraschenderweise das in der öffentlich zugänglichen Datenbank des „National Institutes of Health" hinterlegte Gen mit der Nummer NCgl2747 als für die Alanin-Transaminase kodierend identifiziert, dessen Funktion bisher nicht bekannt war. Das Gen ist daher ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Die Sequenz ist im Sequenzprotokoll Nr. 1 angegeben (Nucleotid 101-1414) .
Von der Erfindung umfasst sind auch Genstrukturen, welche die Sequenz nach Sequenzprotokoll 1 enthalten. Diese können Chromosomen, Plasmide, Vektoren, Phagen, Viren sein. Weiterhin ist die Gensequenz beziehungsweise Nucleotidsequenz selber von der Erfindung umfasst.
Die Sequenz nach Sequenzprotokoll 1 (Nucleotid 101- 1414) kodiert für die Alanin-Transaminase und kann daher auch zu deren Herstellung verwendet werden. Hierzu können dem Fachmann bekannten Methoden, wie beispielsweise Überexpression, Verstärkung von Promotoren oder Startkodons, eingesetzt werden. Beispielhaft können die in dieser Anmeldung offenbarten Organismen für die Produktion der Alanin-Transaminase eingesetzt werden.
Weiterhin kann jedes für die Alanin-Transaminase kodierende Gen deletiert oder einer Disruption unterzogen werden .
Bei der Verringerung der Alanin-Transaminaseaktivität können beispielsweise folgende Methoden eingesetzt werden:
- Mutation des für die Alanin-Transaminase-Gen kodierende Sequenz, und/oder
- Verminderung der Expression von Alanin- Transaminase und/oder
- Abschwächung oder Ausschaltung des der Alanin- Transaminase vorgeschalteten Promotors und/oder
- Mutation oder Deletion des dem Alanin- Transaminase-Gen vorgeschalteten Startkodons und/oder
- Blockade des katalytischen Zentrums der Alanin- Transaminase beispielsweise durch Zugabe von dieses Zentrum blockierenden Substraten oder chemi- sehe Substitution, beispielsweise bedingt durch Mutation.
Erfindungsgemäß werden vorzugsweise coryneforme Bakterien, besonders bevorzugt Corynebakterium glutamicum, eingesetzt .
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Plasmid, welches zur Deletion oder Inaktivierung des für die Alanin- Transaminase kodierenden Gens eingesetzt wird. Das Plasmid enthält interne Sequenzen des Alanin-Transaminase-Gens, oder aber dem 3'- und 5"- Ende des Alanin-Transaminase-Gens benachbarte Sequenzen.
Es enthält zwingend Sequenzen des Alanin-Transaminase- Gens oder die dem Alanin-Transaminase-Gen benachbart sind, vorzugsweise die Bereiche, die dem 3'- und 5'- Ende des Gens unmittelbar benachbart sind und ist idealerweise das in Figur 2 dargestellte Plasmid.
Die Aminosäure L-Valin findet in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung .
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Mikroorganismus oder eine transformierte Zelle bzw. eine recombinante Zelle, bei dem die Produktion von Alanin gemindert oder vollständig ausgeschaltet ist oder bei dem die Alanin- Transaminaseaktivität vermindert oder vollkommen ausgeschaltet ist.
Die eingesetzten Stämme produzieren vorzugsweise be- reits vor der Deletion des Alanin-Transaminase-Gens L- Valin oder L-Isoleucin oder L-Lysin. Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.
Der Begriff „Modifikation" beschreibt in diesem Zusammenhang die Reduktion der intrazellulären Aktivität ei- nes oder mehrerer Biosynthese-Enzyme für die Herstellung von Aminosäuren (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechen- des Enzym mit einer reduzierten Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen (Protein) verringert exprimiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert, oder indem man das Gen sogar vollständig deletiert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Valin oder auch andere L- Aminosäuren die aus Pyruvat entstehen, aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebakterium. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Coryne- bacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Ausgangsstamme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte, L-Aminosäuren überproduzierende Mutanten bzw. Stämme, die erfindungsgemäß modifi- ziert worden sind.
Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Reduktion oder Ausschaltung des für die Alanin-Transaminase kodierenden Gens in verbesserter Weise die L- Aminosäuren Valin, Leucin und Isoleucin produzieren.
Die Nukleotidsequenz des Alanin-Transaminase-Gens ist zwangsläufig durch die Erstellung der kompletten Genomsequenz von C. glutamicum bekannt (Kalinowski et al . , 2003, J. Biotechnol., 104:5-25; Ikeda M., and Nakagawa S. 2003 Appl . Microbiol. Biotechnol. 62:99-109), ohne das aber die Zuordnung eines offenen Leserahmens zur
Alanin-Transaminase bekannt ist. Das wie nachfolgend im Beispiel beschriebene und identifizierte offene Leseraster, das für Alanin Transaminase kodiert, trägt die Nummer NCgl2747 und ist in der öffentlich zugängli- chen Datenbank des „National Institutes of Health" hinterlegt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), ebenso unter Cgl2844 in der öffentlich zugänglichen „DNA Data bank of Japan" (http://gib.genes.nig.ac.jp).
Das unter diesen Nummern beschriebene Alanin-Trans- aminase-Gen wird erfindungsgemäß bevorzugt als Ausgangspunkt der Erfindung eingesetzt. Weiterhin können Allele des Alanin-Transaminase-Gens verwendet werden, die sich beispielsweise aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmuta- tionen (sense mutations) oder durch Deletion oder Insertion von Nukleotiden ergeben. Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des Alanin-Transaminase-Gens oder die kata- lytischen Eigenschaften des Enzymproteins verringert werden. Ebenfalls kann die katalytische Eigenschaft des Enzymproteins hinsichtlich ihrer Substratspezifität verändert werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.
Die Abschwächung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Muta- tion) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (J. Bacteriol . 1988. 170: 5949), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Res . 1998 26: 3548, bei Jensen und Hammer (Biotechnol. Bioeng. 1998 58: 191), bei Pa- tek et al . (Microbiology 1996 142: 1297 und in bekann- ten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik",
8. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2001) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) .
Mutationen, die zu einer Veränderung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, insbesondere zu einer veränderten Substratspezifität , sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Yano et al . 1998 Proc . Natl . Acad. Sei. USA, 95:5511-5, Oue S. et al . J. Biol . Chem. 1999, 274:2344-
9. und Onuffer et al . Protein Sei. 1995 4:1750-7 genannt. Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht, sowie Methoden der gerichteten Evolution. Anleitungen zur Er- zeugung derartiger Mutationen und Proteine gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern (R. Knippers „Molekulare Genetik", 8. Auflage, 2001, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland) , oder Über- Sichtsartikeln (N. Pokala 2001, J. Struct . Biol .
134:269-81; A. Tramontano 2004, Angew. Chem. Int. Ed Engl. 43:3222-3; N. V. Dokholyan 2004, Proteins. 54:622-8; J. Pei 2003, Proc . Natl . Acad. Sei. USA. 100:11361-6; H. Lilie 2003, EMBO Rep . 4:346-51; R. Jae- nicke Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42:140-2) entnommen werden .
Die abgeschwächte Expression der Gene oder der mutierten Gene erfolgt nach gebräuchlichen Methoden des Gen- austauschs, indem das native chromosomale Gen durch das mutierte Gen ersetzt wird, wie es beispielsweise bei Morbach et al . beschrieben ist (Appl . Microbiol . Bio- technol . 1996, 45: 612-620). Die Deletion des Gens erfolgt wie bei Scharzer und Pühler (Biotechnology 1990, 9: 84-87), sowie bei Schäfer et al . (Appl. Environ. Microbio. 1994, 60: 756-759) beschrieben. Die Transformation des gewünschten Stammes mit dem Vektor zum Genaustausch oder zur Deletion erfolgt durch Konjugation oder Elektroporation des Ausgangsstammes . Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al . (Appl. Environ. Microbio. 1994, 60: 756-759) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Tauch et al . (FEMS Microbiological Letters (1994)123:343-347) beschrieben.
Auf diese Weise kann das Alanin Transaminase-Gen dele- tiert oder dessen Allel in C. glutamicum ausgetauscht werden .
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Valin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung oder Deleti- on der Alanin Transaminase-Aktivität eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
• die für die Acetohydroxysäuresynthase kodierenden iIvBN-Gene,
• das für die Isomeroreduktase kodierende ilvC-Gen,
• das für die Dehydratase kodierende ilvD-Gen,
• das für die Transaminase C kodierende ilvE Gen
zu verstärken insbesondere zu überexprimieren, oder Allele dieser Gene, insbesondere
• die für feedback-resistente Acetohydroxysäuresynthase kodierenden ilvBN-Gene,
zu verstärken oder zu überexprimieren,
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Valin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Reduktion der Alanin - Transaminase-Aktivität eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
• die für die Pantothenatsynthese kodierenden panBCD- Gene,
• die für die Liponsäuresynthese kodierenden lipAB- Gene ,
• die für die Pyruvatdehydrogenase kodierenden aceE-, aceF, lpD-Gene,
• die für die Gene der ATP Synthase A Untereinheit, ATP Synthase B Untereinheit, ATP Synthase C Unter- einheit, ATP Synthase alpha Untereinheit, ATP
Synthase gamma Untereinheit, ATP Synthase Untereinheit, ATP Synthase epsilon Untereinheit, ATP Synthase delta Untereinheit zu inaktivieren oder zu reduzieren.
Schließlich kann es für die Produktion von L-Valin vorteilhaft sein, neben der Abschwächung der Alanin Trans- aminase unerwünschte Nebenreaktionen, die beispielsweise zu Leucin führen, auszuschalten (Nakayama : „Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms,, , in: Overpro- duction of Microbial Products, Krumphanzl , Sikyta, Va- nek (eds.)/ Academic Press, London, UK, 1982) .
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetiti- ves Zulaufverfahren) zum Zwecke der Valin-Produktion kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte
Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Ein- richtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mik- roorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for
General Bacteriology" der American Society for Bacteri- ology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten. Als Koh- lenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Me- lasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Li- nolsäure, Alkohole, wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, verwendet wer- den. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische, stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle kön- nen Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogen- phosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzu gegeben oder in geeigneter Weise während der KuI- tivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwiσklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen auf- rechtzuerhalten werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie z. B. Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 200C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 400C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maxi- raura an L-Valin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 bis 160 Stunden erreicht.
Beispiele
Beispiel 1 : Klonierung der Alanin Transaminase
Mit Hilfe der PCR Reaktion wurde ein DNA-Fragment amplifiziert, das das Alanin Transaminase-Gen enthält. Es wurden die folgenden Primer benutzt:
orf234-for:
5'- ATGGTA(GGTCTC)AAATGACTACAGACAAGCGCAAAACCT -3"
orf234rev:
5'- ATGGTA(GGTCTC)AGCGCTCTGCTTGTAAGTGGACAGGAAG -3"
Die angegebenen Primer wurden durch MWG Biotech AG (An- zinger Str. 7a, D-85560 Ebersberg) synthetisiert, und die PCR Reaktion entsprechend Standard Protokollen durchgeführt (Innis et al . PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. 1990. Academic Press). Mit den Primern wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,3 kb erhalten, das für die Alanin-Transaminase kodiert. Die Primer enthalten zusätzlich die Schnittstelle des Restriktionsenzyms Bsal, die in obigen Nukleotidsequenzen in Klammer angegeben sind.
Das amplifizierte DNA-Fragment von etwa 1,3 kb wurde im 0.8%igen Agarosegel identifiziert und aus dem Gel nach bestehenden Methoden isoliert (QIAquik Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden) . Die Ligation des Fragments erfolgte mit dem SureCloning Kit (Amersham, UK) in den Expressionsvektor pASK-IBA-3C (IBA, Gδttingen) . Mit dem Ligationsansatz wurde E. coli DH5 transformiert (Grant et al . , 1990. Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 87:4645-4649) . Die Selektion auf Plasmid enthaltende Stämme erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf 25 mg pro Liter Chloramphenicol enthaltenden LB Platten.
Nach Plasmidisolation wurden die erhaltenen Plasmide durch Restriktionsverdau und gelelektrophoretische Analyse charakterisiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pASK- IBA-3Corf234 bezeichnet. Es ist in Figur 1 angege- ben.
Beispiel 2 : Isolierung der Alanin Transaminase
E. coli DH5 mit pASK-IBA-3Corf234 wurde bei 300C in 100 ml LB mit 25 mg pro Liter Chloramphenicol bis zu einer optischen Dichte von 0,5 angezogen. Dann wurden 0,01 ml einer Anhydrotetracyclinlösung zugefügt, die 2 mg Anhydrotetracyclin pro Milliliter Dimethylformamid enthielt. Die Kultur wurde weiter für 3 Stunden bei 30 0C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 12 Mi- nuten bei 40C und 5000 Umdrehungen pro Minute durch
Zentrifugation geerntet. Danach wurde das Zellpellet in Waschpuffer (100 mM Trihydroxymethylaminomethan, 1 mM Äthylenediaminetetraessigsäure, pH 8) resuspendiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Der Zellauf- Schluss erfolgte bei 0 0C durch einen Ultraschalldesintegrator (Branson Sonifier W-250, Branson Sonic Power Company, Danbury, USA; Beschalldauer 10 min, Pulslänge 20 %, Beschallintensität 2) . Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation (30 min, 13000 Upm, 4 0C) abgetrennt und Rohextrakt als Überstand erhalten. Zur Isolierung des Proteins wurden StrepTactin- Affinitätssäulen des Herstellers IBA (IBA, Göttingen, Deutschland) mit 1 ml Bettvolumen StrepTactin-Sepharose befüllt. Nach Äquilibrierung der Säulen mit Waschpuffer des Herstellers IBA wurde 1 ml des Rohextraktes auf die Sepharose gegeben. Nach Durchlauf des Extraktes wurde die Affinitätssäule fünfmal mit 1 ml Waschpuffer gewaschen. Die Elution des Alanin Transaminase-Proteins wurde mit Elutionspuffer, bestehend aus 100 mM Tris, 1 mM EDTA, 2 , 5 mM Desthiobiotin, pH 8, durchgeführt. Die Elutionsfraktionen wurden aliquotiert, bei -20 0C eingefroren und direkt im Enzymtest eingesetzt.
Beispiel 3 : Aktivitätsbestimmung der Alanin Transamina- se
Der Reaktionsansatz des Enzymtests enthielt in einem Gesamtvolumen von 1 ml: 0,2 ml 0,25 M Tris/HCl, pH 8, 0,005 ml Alanin Transaminase-Protein und 0,1 ml 2,5 mM Pyridoxalphosphat , sowie 0,1 ml 40 mM Pyruvat und 0,1 ml 0,5 M L-Glutamat, oder 0,1 ml 40 mM Pyruvat und 0,1 ml 0,5 M Aspartat, oder 0,1 ml 40 mM Pyruvat und 0,1 ml 0,5 M α-Amino-butyrat , oder 0,1 ml 40 mM Pyruvat und 0,1 ml 0,5 M L-Glutamat ohne Alanin Transaminase Protein. Der Enzymtest wurde bei 30 0C in einem Thermocycler 5436 der Firma Eppendorf (Hamburg) durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Proteins gestartet. Durch Zugabe von 30 μl eines Stoppreagenzes (6,7% (v/v) Perchlorsäure (70 %ig) , 40 % (v/v) Ethanol (95 %ig) in Wasser) zu jeweils 50 μl des Testansatzes wurde der En- zymtest gestoppt . Um die Proben für den Nachweis der gebildeten Aminosäuren über reversed phase HPLC vorzubereiten, wurden 20 μl eines Neutralisierunsgspuffers (20 mM Tris, 2,3 M Di-Kalium-carbonat , pH 8) zugegeben. Der durch die Neutralisierung der Perchlorsäure ausfal- lende Niederschlag wurde abzentrifugiert (13000 Upm, 10 min) und der Überstand in verschiedenen Verdünnungen für die Quantifizierung mittels HPLC eingesetzt. Diese erfolgte nach automatischer Derivatisierung mit o- Phthaldialdehyd wie beschrieben (Hara et al . 1985, Ana- lytica Chimica Acta 172:167-173). Wie Tabelle 1 zeigt, katalysiert das isolierte Protein die L-Glutamat, L- Aspartat und ce-Aminobutyrat abhängige Aminierung von Pyruvat zu Alanin.
TABELLE 1
Die spezifische Aktivität (spez. Aktivität) ist in Micromol Produkt pro Minute und Milligramm Alanin Transaminase Protein angegeben. Beispiel 4: Deletion des Alanin Transaminase-Gens
Mit Hilfe der PCR Reaktion wurden zwei DNA-Fragmente amplifiziert, die das Alanin Transaminase-Gen flankieren. Es wurden die folgenden Primer benutzt: Del234__l:
5 ' - CG (GGATCC) CATGCAACCGATCTGGTTTTGTG - 3 ' Del234_2 :
5 ' - CCCATCCACTAAACTTAAACAGCGCTTGTCTGTAGTCACCCG - 3 " Del234_3 :
S " - TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCGCCTGGGTAACTTCCTGTCC - 3 '
Del234_4 :
5"- CG(GGATCC)GATTGATCATGTCGAGGAAAGCC - 3'
Die angegebenen Primer wurden durch MWG Biotech AG (An- zinger Str. 7a , D-85560 Ebersberg) synthetisiert, und die PCR Reaktion entsprechend Standard Protokollen durchgeführt (Innis et al . PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. 1990. Academic Press) . Mit den Primern wurden zwei DNA-Fragmente von etwa 400 bp amplifiziert , die das Gen für die Alanin Transaminase flankieren. Die Primer Del234_l und Del234_4 enthalten zusätzlich die Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI , die in obigen Nukleotidsequenzen in Klammer an- gegeben ist. Die amplifizierten DNA-Fragmente von etwa 400 bp wurden im 0.8%igen Agarosegel identifiziert und aus dem Gel nach bestehenden Methoden isoliert (QIAquik Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden) . Mit Hilfe einer zweiten PCR Reaktion, in die die beiden zuvor amplifi- zierten DNA-Fragmente als template DNA eingesetzt wurden (Link et al . , 1997, J. Bacteriol . 179:6228-6237), wurde ein etwa 800 bp großes Fragment amplifiziert . Dieses Fragment enthält beide, die Alanin Transaminase flankierenden DNA-Bereiche. Das amplifizierte DNA- Fragment von etwa 800 bp wurde im 0.8%igen Agarosegel identifiziert und aus dem Gel mit bestehenden Methoden isoliert (QIAquik Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden) .
Die Ligation des Fragments erfolgte mit dem SureCloning Kit (Amersham, UK) in den Deletionsvektor pK19mobsacB (Schäfer et al . , 1994, Gene 145:69-73). Mit dem Ligati- onsansatz wurde E. coli DH5 transformiert (Grant et al . , 1990. Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 87:4645-4649). Die Selektion Plasmid enthaltender Stämme erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf 50 mg pro Liter Kanamycin enthaltenden LB Platten.
Nach Plasmidisolation wurden erhaltene Plasmide durch Restriktionsverdau und gelelektrophoretische Analyse charakterisiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pkl9mobsacB-orf234 bezeichnet. Es ist in Figur 2 ange- geben .
Das Plasmid pkl9mobsacB-orf234 wurde zur Transformation des Stammes 13032ΔpanBC auf Kanamycinresistenz benutzt. Der Stamm ist in EP1155139B1 beschrieben, und die Transformationstechnik bei Kirchner et al . J. Bio- technol. 2003, 104:287-99.
Die Deletion des Gens für die Alanin Transaminase wurde nach dem Protokoll zur Deletion von Genen in Corynebac- terium glutamicum nach Schäfer et al . , 1994, Gene 145:69-73, durch zwei aufeinanderfolgende homologe Re- kombinationen durchgeführt . Mit Hilfe der PCR Reaktion wurde die Deletion des Gens für die Alanin Transaminase bestätigt. Es wurden die folgenden Primer benutzt:
Ko_delorf234_for :
5'- CTGGGTATTCGCCACGGACGT - 3'
Ko_delorf234_rev: 5"- TCGGCGGTGTCAAAAGCATTGC - 3'
Die angegebenen Primer wurden durch MWG Biotech synthetisiert, und die PCR Reaktion entsprechend Standard Protokollen durchgeführt (Innis et al . PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. 1990. Academic Press) . Die Amplifikation eines 1 kB großen DNA- Fragmentes bestätigte die Deletion des Gens für die Alanin Transaminase. Der erhaltene Stamm wurde als Stamm 13032ΔpanBCΔalaT bezeichnet.
Beispiel 5 : Reduktion der Alanin Bildung und Steigerung der L-Valin Bildung durch Deletion der Alanin Transaminase
Der Stamm 13032ΔpanBCΔalaT sowie der Kontroll-Stamm 13032ΔpanBC wurde in dem Medium CGIII (Menkel et al . 1989, Appl. Environ. Microbiol . 55:684-8) bei 3O0C angezogen. Damit wurde das Medium CGXII mit einer optischen Dichte von 1 beimpft. Das Medium CGXII enthält pro Liter: 20 g (NH4) 2SO4, 5 g Harnstoff, 1 g KH2PO4,
1 g K2HPO4, 0,25 g Mg2O4*7 H2O, 42 g 3-Morpholinopropan- sulfonsäure, 10 mg CaCl2, 10 mg FeSO4*7 H2O, 10 mg MnSO4* H2O, 1 mg ZnSO4*7 H2O, 0,2 mg CuSO4, 0,02 mg NiCl2*6 H2O, 0,2 mg Biotin, 40 g Glukose, 0,5 μM Pan- tothenat und 0,03 mg Protokatechusäure. Die Kultur wur- de bei 3O0C und 120 Umdrehungen pro Minute inkubiert, und nach 56 Stunden wurde die Alanin- und L-Valin- akkumulation im Medium mittels HPLC bestimmt. Diese erfolgte mit o-Phthaldialdehyd wie beschrieben (Hara et al. 1985, Analytica Chimica Acta 172:167-173). Die bestimmten Alanin- und L-Valinkonzentrationen sind in Tabelle 2 gezeigt.
TABELLE 2

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L- Aminosäuren dadurch gekennzeichnet, dass die Alanin-Transaminase-Aktivität vermindert oder ausgeschaltet wird oder dass die Alaninproduk- tion vermindert oder ausgeschaltet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Alanin-Transaminase-Gen deletiert oder einer Disruption unterzogen wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die für die Alanin-Transaminase kodierende Se- quenz mutiert wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der Alanin-Transaminase vermindert oder ausgeschaltet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der dem Alanin-Transaminase-Gen vorgeschaltete Promotor abgeschwächt oder ausgeschaltet oder durch einen schwächeren Promotor ausgetauscht wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das dem Alanin-Transaminase-Gen vorgeschaltete Start-Kodon in seiner Aktivität vermindert oder ausgeschaltet oder durch ein schwächeres Startkodon ausgetauscht wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das katalytische Zentrum der Alanin- Transaminase blockiert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Komponente aus der Gruppe der Gene die für die Acetohydroxysäure Synthase kodierenden iIvBN-Gene, das für die Isomeroreduktase kodierende ilvC-Gen, das für die Dehydratase kodierende ilvD-Gen, das für die Transaminase C kodierende ilvE-Gen, die für feedback-resistente Acetohydroxysäure
Synthase kodierenden ilvBN-Gene, verstärkt oder überexprimiert werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Komponente aus der Gruppe bestehend aus
- die für die Pantothenatsynthese kodierenden panBCD-Gene, - die für die Liponsäuresynthese kodierenden lipAB- Gene,
- die für die Pyruvatdehydrogenase kodierenden a- ceE-, aceF, lpD-Gene,
- die für die Gene der ATP Synthase A Untereinheit, ATP Synthase B Untereinheit, ATP Synthase C Untereinheit, ATP Synthase alpha Untereinheit, ATP Synthase gamma Untereinheit, ATP Synthase Untereinheit, ATP Synthase epsilon Untereinheit, ATP Synthase delta Untereinheit inaktiviert oder in ihrer Aktivität vermindert werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass coryneforme Bakterien eingesetzt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Bakterien der Gattung Corynebakterium glutami- cum eingesetzt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Organismus aus der Gruppe
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020 eingesetzt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass L-Valin, L-Isoleucin oder L-Lysin hergestellt wird.
14. Nucleotidsequenz gemäß Sequenz Nr.1, Nukleotide 101 bis 1414.
15. Genstruktur umfassend ein Alanin-Transaminasegen gemäß Sequenz Nr.1, Nukleotide 101 bis 1414.
16. Genstruktur nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie mutiert ist.
17. Genstruktur nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Insertion und/oder Deletion und/oder Austausch von Nucleinsäuren mutiert ist .
18. Vektor enthaltend eine Genstruktur nach einem der
Ansprüche 15 bis 17 oder eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 14.
19. Vektor nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Plasmid, ein Phage oder ein Virus ist.
20. Chromosom enthaltend eine Genstruktur nach einem der Ansprüche 15 bis 17 oder die Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 14.
21. Chromosom mach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Alanin-Transaminase-Gen teilweise oder vollständig deletiert ist.
22. Recombinante Zelle umfassend eine Genstruktur nach einem der Ansprüche 15 bis 17 und/oder einen Vektor nach Anspruch 18 oder 19 und/oder ein Chromosom nach Anspruch 20 oder 21 oder die Nucleotidsequenz nach Anspruch 14.
23. Recombinante Zelle nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie bereits vor den Veränderungen nach einem der Ansprüche 16 und 17 L-Lysin, L-Valin oder L- Isoleucin produziert hat.
24. Recombinante Zelle nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Corynebakterium ist .
25. Recombinante Zelle nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Corynebakterium glutamicum ist.
26. Recombinante Zelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Organismus aus der Gruppe Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020 ist.
27. Verwendung der Genstruktur nach Anspruch 15 oder der Nucleotidsequenz nach Anspruch 14 zur Herstellung von Alanin.
28. Plasmid enthaltend interne Sequenzen des Alanin- Transaminase-Gens oder die dem 3"- und 5 '-Ende des Alanin-Transaminasegens benachbarte Sequenzen.
29. Alanintransaminase, gekennzeichnet, durch die Sequenz Nr.2
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