CN114686414B - 一种精准定量调控大肠杆菌全细胞催化的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种精准定量调控大肠杆菌全细胞催化的方法及应用，属于基因工程与生物催化领域。本发明通过构建色氨酸操纵子及温敏阻遏系统，可实现大肠杆菌生长前期稳定、正常生长，稳定期促进目的蛋白的表达；该系统还通过控制发酵温度，调节结构基因的表达水平，调控D,D‑羧肽酶实时表达量，增加了胞内可溶性肽聚糖，提高了重组大肠杆菌外膜的透性，有助于催化反应的底物及产物自由穿梭于细胞内外，更加有效的促进全细胞的高效催化。
Description
技术领域
本发明涉及一种精准定量调控大肠杆菌全细胞催化的方法及应用，属于基因工程与生物催化领域。
背景技术
大肠杆菌表达系统是目前基因工程中最常用的重组蛋白表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点。大肠杆菌在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。是常用的重组蛋白高效生产的宿主之一，但是在大肠杆菌的异源表达中，大部分重组蛋白在信号肽的引导下分泌到周质空间，会导致中间体大量积聚，对蛋白质的生产造成阻碍。
肽聚糖是由双糖单位，四肽尾还有肽桥聚合而成得多层网状大分子结构。肽聚糖层的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1,4糖苷键连接而成，糖链间由肽链交联，构成稳定的网状结构，这样构成了整个细菌表面的细胞壁。作为细胞壁的主要成分，肽聚糖的组成与细胞结构的完整性、外膜的通透性的维持、细菌的抗干燥能力和耐热性等均密切相关。
手性纯胺是当前药物生产中重要的前体物质，α-手性胺约占目前单一对映体商品化的旋光药物的40％。这些胺当前主要的生产方式是通过预先形成的N-取代亚胺等的不对称氢化而合成的。然而，这种策略缺乏效率，因为需要多个化学步骤。尽管近年来在有机金属催化(例如，使用铱、钌或钯催化剂)和有机催化中，含羰基化合物的不对称还原胺化已取得了重大进展，但许多酶促途径提供了更高效的原子效率方法，特别是用于合成对映体纯净形式的活性药物成分(API)。胺脱氢酶(AmDHs)能够催化酮的不对称还原胺化反应，且反应的副产物仅有水，无需担心痕量有毒重金属的存在，这使它在手性胺的酶催化合成中受到了广泛关注。大多数的野生型胺脱氢酶由于对酮类及羰基底物的还原胺化活性均不高，其酶结构并未得到测定。Ye等人以红球菌属的苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)为起点，根据对酶结构特点的研究，最终构建了两种具有高催化活性的胺脱氢酶，K66Q/N262C(DM_pheDH)以及K66Q/S149G/N262C(TM_pheDH)，该酶为当前酮的不对称还原胺化中一种催化活性较高的胺脱氢酶。(R)-1-甲基-3-苯丙胺是生产治疗高血压药物拉贝洛尔、地瓦洛尔等的中间体，是药物化学中重要的中间体成分。其当前主要的工业生产方式及实验室制备是通过水解酶进行动力学拆分或通过单胺氧化酶进行脱硝，使用外消旋体生产手性纯胺。但其理论上的最大产出率仅为50％。
胆汁酸是饱和羟基化的C-24环戊烷菲甾醇，在调节葡萄糖、脂质、能量代谢、肠道免疫和肠道炎症中发挥重要作用。7-氧代-石胆酸(7-oxolithocholic acid，7-oxo-LCA)是合成熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)的重要前体。熊去氧胆酸用于临床治疗人类胆固醇胆结石，也是FDA批准治疗原发性胆汁酸肝硬化的药物。UDCA的传统化学合成涉及酯化、氧化、脱保护等一系列化学过程，过程效率低、成本高、并伴随多种副产品产生，环境严重污染。因此，开发新型绿色高效制备UDCA及其前体的方法具有重要意义。羟基类固醇脱氢酶(HSDH)在胆汁酸类物质转化、甾体激素转化、胆固醇代谢、非甾体类醛、酮和醌羰基还原过程中发挥重要作用。7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH，EC1.1.1.159)是合成UDCA的前体7-oxo-LCA的主要酶之一。它是含有罗斯曼折叠NAD(P)H/NAD(P)+结合域的短链脱氢酶/还原酶。大多为同源二聚体或四聚体，在单体的N端和C端具有辅因子和底物结合催化区域。
发明内容
一种重组大肠杆菌胞，所述重组大肠杆菌在基因组上敲除了SEQ ID NO.1所示的色氨酸合成酶基因簇trpEDCBA，含有具有温度诱导和受色氨酸调控的重组质粒和表达目的蛋白的重组质粒；
所述具有温度诱导和受色氨酸调控的重组质粒含有SPP型启动子、低温诱导型启动子PR、高温诱导型启动子PL、色氨酸合成酶基因簇trpEDCBA、操纵区trpO、D,D-羧肽酶基因dacA和温敏阻遏蛋白CIts857；所述操纵区trpO具有可与由阻遏蛋白trpR和色氨酸形成的共价二聚体结合的结合位点；所述启动子PL上具有温敏阻遏蛋白CIts857的结合位点；所述启动子PL调控trpEDCBA的表达；所述启动子PR调控温敏阻遏蛋白CIts857的表达；所述SPP型启动子调控操纵区trpO的基因表达；所述操纵区trpO的下游具有dacA基因；所述启动子PL和启动子PR的转录方向相反；
所述表达目的蛋白的重组质粒上含有编码目的蛋白的基因。
在一种实施方式中，启动子PL的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；启动子PR的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；编码所述启动子SPP的核苷酸序列如SEQ ID No.7～11任一所示；操纵区trpO的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；编码所述温敏阻遏蛋白CIts857的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述D,D-羧肽酶基因dacA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在一种实施方式中，所述dacA基因的上游还含有trpL碱基序列；所述trpL碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述阻遏蛋白trpR由位于大肠杆菌基因组上的trpR基因编码；所述trpR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌可选自：E.coli BL21、E.coliJM109、E.coliDH5α、E.coli Rosetta、E.coli TOP10、E.coliM110、E.coliS110中的任一种。
在一种实施方式中，所述目的基因为羟基类固醇脱氢酶基因或胺脱氢酶基因。
在一种实施方式中，所述胺脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种调控大肠杆菌全细胞催化的方法，所述方法是以所述大肠杆菌作为全细胞催化剂，在发酵前12h控制发酵温度为36～38℃，抑制DacA蛋白表达，促进各类酶类在胞内积累；第13～36h控制温度为20～24℃，促进DacA蛋白表达，从而提高大肠杆菌细胞壁和细胞膜的通透性，促进全细胞催化；第37h加入底物，于30℃继续反应至少36h。
在一种实施方式中，所述全细胞催化方法是以所述大肠杆菌作为全细胞催化剂，在发酵前12h控制发酵温度为36～38℃，第13～36h控制温度为20～24℃，第37h加入底物苄基丙酮，于30℃继续反应至少36h生产α-手性胺。
在一种实施方式中，所述全细胞催化方法是以所述大肠杆菌作为全细胞催化剂，在发酵前12h控制发酵温度为36～38℃，第13～36h控制温度为20～24℃，第37h加入底物鹅去氧胆酸，于30℃继续反应至少36h生产7-氧代-石胆酸。
本发明还提供所述重组大肠杆菌在食品、生物领域全细胞催化生产生物产品中的应用。
有益效果：
本发明中构建的色氨酸操纵子及温敏阻遏系统可实现大肠杆菌生长前期能够稳定、正常生长，稳定期促进蛋白的表达；该系统还通过控制发酵温度，调节结构基因的表达水平，调控D,D-羧肽酶实时表达量，增加了胞内可溶性肽聚糖，提高了重组大肠杆菌外膜的透性，有助于催化反应的底物及产物自由穿梭于细胞内外，更加有效的促进全细胞的高效催化。
附图说明
图1：苯丙氨酸脱氢酶反应示意图。
图2：7-α-羟基类固醇脱氢酶反应示意图。
图3为色氨酸操纵子阻遏系统构建及应用效果；a，E.coli BL21(DE3)经λ-Red同源重组技术将色氨酸合成酶基因簇trpEDCBA获得E.coli G2菌株，在此基础上构建色氨酸操纵子；b，携带荧光蛋白基因的色氨酸操纵子阻遏系统构建，c，携带dacA基因的色氨酸操纵子阻遏系统的构建；SPP，稳定期启动子；trpO，色氨酸操纵区；T7，启动子；trpEDCBA，色氨酸合成酶基因簇；egfp，增强型绿色荧光蛋白；dacA，D,D-羧肽酶；d，在E.coli G2中构建色氨酸操纵子阻遏系统获得E.coli G21，通过外源分别补加高浓度3g/L trp和5g/L trp，探究色氨酸浓度对egfp表达水平的影响。
图4为温度诱导-色氨酸操纵子复合系统构建及应用效果；温度诱导-trp操纵子复合系统的构建，通过调控发酵温度实现细菌生长前期积累色氨酸合成酶的表达。
具体实施方式
LB固体培养基：15g/L琼脂，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取粉，10g/L NaCl，pH7.0。
LB液体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取粉，10g/L NaCl，pH 7.0。
TB液体培养基：12g/L胰蛋白胨，24g酵母提取粉，甘油4mL，2.31g KH2PO4，12.54gK2HPO4，pH 7.5，定容到1L。
生物量测定：测定600nm下的吸光光度值。
胺脱氢酶比酶活力的检测方法：将含有100mg/L胺脱氢酶、40mM NADH、4mM底物苄基丙酮的氯化铵/氢氧化铵缓冲液(500mM，pH9.6)于30℃、250rpm下反应15min后，加入等体积甲醇终止反应，充分震荡混匀后，12,000rpm离心30min去除蛋白。使用液相色谱对反应体系中对应的胺产物浓度进行检测。
C1：内标浓度，S1：内标峰面积，S2：产物峰面积，C3：底物浓度
7-α-羟基类固醇脱氢酶活测定方法：pH＝8.0的100mM磷酸钾缓冲液，10mM鹅去氧胆酸(CDCA)，3mMNADP+，加入粗酶液在30℃下使用酶标仪测定340nm处的吸光值。
反应产物的检测：反应转化率采用液相色谱法进行分析，使用C-18柱(250mm×4.6mm)，流动相为甲醇：水＝80:20，柱温30℃，流速1mL/min，检测波长210nm，分析时间选择25～30min。反应结束后，将催化剂分离除去后经处理可获得7-氧代石胆酸(7-oxo-LCA)。
实施例1重组大肠杆菌中色氨酸合成酶基因簇trpEDCBA的敲除
(1)以质粒pKD13为模板，设计引物并PCR扩增含有Kan抗性基因的用于替换trpEDCAB序列的同源片段，其中Kan抗性基因两侧含有FRT位点，得到trpEDCBA序列整合框片段。
(2)将pKD46质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得E.coli G0菌株，制备电转化感受态细胞，将步骤(1)制得的整合框片段电转化进入E.coli G0感受态中，转化液经过后培养后涂布含有卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素的LB固体培养基中培养，获得转化子BL21::kan，利用引物TrpA-pKD13-FW和TrpE-pKD13-RS通过菌落PCR扩增验证trpEDCBA序列是否成功编辑，筛选出含有卡那霉素抗性基因的阳性转化子E.coli G1。理论上，BL21::kan含有1680bp的同源片段，如图1所示，菌落PCR获得的片段大小与理论上同源片段的大小相符。
TrpA-pKD13-FW：TGCCGCCAGCGGAACTGGCGGCTGTGGGATTAACTGCGCGTCGCCGCTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC；
TrpE-pKD13-RS：CCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAATTAGAGAATAACAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC。
(3)将步骤(2)构建的E.coli G1接种到无抗性LB培养基培养，取菌液在无抗性LB平板上划线，将单菌落分别对应点在卡那霉素抗性平板和氨苄青霉素抗性平板上，在卡那霉素抗性平板上生长而氨苄青霉素抗性平板上不生长的菌株即为E.coli G1制备E.coliG1转感受态细胞，转化pCP20质粒，涂布于氨苄青霉素抗性、氯霉素抗性双抗性LB培养基平板上，获得含pCP20质粒的阳性转化子，将其接种到无抗性LB培养基中培养，消除pCP20质粒，获得E.coli G2重组大肠杆菌。其中，抗性基因消除后E.coli G2菌株中的同源片段理论上长483bp，菌落PCR扩增验证结果与理论值一致。E.coli G2菌株在Kan、氨苄青霉素(Amp)平板上均不生长，在无抗性LB平板上正常生长。
实施例2含色氨酸操纵子及温敏阻遏系统的重组质粒的构建
构建如图4所示质粒，具体步骤为：
(1)采用引物D-LACI-FW和D-LACI-RS，以pETDuet-1为模板构建获得pETDuet-1-△lacI质粒。基因TM为全基因合成，用限制性内切酶位点BamHΙ和HindⅢ连接至质粒pETDuet-1-△lacI，构建获得重组质粒pETDuet-1-△lacI-TM。基因hdhA为全基因合成，用限制性内切酶位点BamHΙ和HindⅢ连接至质粒pETDuet-1-△lacI，构建获得重组质粒pETDuet-1-△lacI-hdhA。采用引物Q-lacI-FW和Q-lacI-RS，以采用引物pRSFDuet-1为模板，构建获得pRSFDuet-1-△lacI质粒。采用引物Promoter-25-FW和Promoter-25-RS等SPP型启动子引物，以pRSFDuet-1-△lacI为模板构建获得含有SPP型的pRSFDuet-1-△lacI-P25质粒。采用引物TrpO-FW和TrpO-RS，以pRSFDuet-1-△lacI-P25为模板，构建获得pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO质粒。采用引物dacA-FW和dacA-RS，以E.coli基因组为模板，扩增基因dacA，用限制性内切酶位点NdeⅠ和XhoⅠ连接至质粒pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO，构建获得重组质粒pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO-dacA。采用引物TrpL-DacA-FW和TrpL-DacA-RS，以E.coli基因组为模板，扩增基因trpL-dacA，用限制性内切酶位点NdeⅠ和XhoⅠ连接至质粒pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO，构建获得重组质粒pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO-trpL-dacA。采用引物Trp-e-FW和Trp-a-RS，以E.coli基因组为模板，扩增基因簇trpEDCBA，用限制性内切酶位点PstⅠ和KpnⅠ分别与质粒pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO-dacA和pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO-trpL-dacA连接，分别构建获得重组质粒pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO-dacA-trpEDCBA和pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO-trpL-dacA-trpEDCBA。采用引物CI857-FW和CI857-RS,以pPL451质粒为模板，扩增基因Cits857，PL、PR启动子，利用一步连接方式分别连接至pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO-dacA-trpEDCBA和pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO-trpL-dacA-trpEDCBA，分别构建获得重组质粒pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA和pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA。
按照上述相同的策略构建含稳定期启动子P41的质粒pRSFDuet-1-△lacI-P41-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA、含稳定期启动子P53的质粒pRSFDuet-1-△lacI-P53-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA、含稳定期启动子P69的质粒pRSFDuet-1-△lacI-P69-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA、含稳定期启动子P84的质粒pRSFDuet-1-△lacI-P84-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA。
表1 启动子及序列
| 启动子 | 核苷酸序列 |
| P25 | TCTTGTCAAATTCTTAATTTGGTGCTATACTGGATCG |
| P41 | TCTTGTCAAATTTTTAATGTTGTGCTATACTGTATCG |
| P53 | TCTCGGCAGATACCATATTATCGGCTATACTGTATCG |
| P69 | TCTTGCCAAATTTGCAAATTTGTTCTATACTGTATTG |
| P84 | TTTTGCCAGATTCCCTGTGATCTGCTATACTTTAAAG |
| PL | TTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACT |
| PR | TTATCACCGCCAGAGGTAAAATAGTCAA |
(3)将步骤(1)构建的质粒载体转化至敲除了色氨酸合成酶基因簇trpEDCBA的大肠杆菌感受态细胞，转化后筛选出含有抗性基因的阳性转化子。
TrpO-FW：CGAACTAGTTAACTAGTACGCCCATCTTAGTATATTAGTTA；
TrpO-RS：GCGTACTAGTTAACTAGTTCGCCTATAGTGAGTCGTATTAA；
dacA-FW：GGAATTCCATATGATGAATACCATTTTTTCCGCTCG；
dacA-RS：CGGGGTACCTTAACCAAACCAGTGATG；
TrpL-DacA-FW：GGAATTCCATATGATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAAGGTTGGTGGCGCACTTCCTGAATGAATACCATTTTTTCCGCTC；
TrpL-DacA-RS：CGGGGTACCTTAACCAAACCAGTGATGGAACA；
Trp-e-FW：AACTGCAGAGAGAATAACAATGCAAACACAAAAACCGACTCTC；
Trp-a-RS：CGGGGTACCCGGGGTAAGCGAAACGGTAAAAAGATAAATATTAAATGA；
CI857-FW：GGTCGAGATCCCGGTGCCTAGTTTATTGAGCGCTTATCTT；
CI857-RS：GTGATACGAAACGAAGCATTTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGAGGAATTC。
Promoter-25-FW：AATTCTTAATTTGGTGCTATACTGGATCGCCCCATCTTAGTATA
Promoter-25-RS：ATAGCACCAAATTAAGAATTTGACAAGAATTTCCTAATGCAGGPromoter-41-FW：AATTTTTAATGTTGTGCTATACTGTATCGCCCCATCTTAGTATA
Promoter-41-RS：ATAGCACAACATTAAAAATTTGACAAGAATTTCCTAATGCAGG
Q-LAI-FW：CTTACATTAATTGCGTTGCGCGGGATCTCGACGCTCTCC
Q-LACI-RS：GGAGAGCGTCGAGATCCCGCGCAACGCAATTAATGTAAG
D-LACI-FW：ATACGACTCACTATAGGCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACT
D-LACI-RS：AATTATTTCTAGAGGCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCG
实施例3具有催化酮类化合物功能的重组菌的构建
将SEQ ID NO.6所示的苯丙氨酸脱氢酶基因TM核苷酸序列利用限制性酶切位点BamHΙ和HindⅢ连接至实施例1构建的质粒pETDuet-1-△lacI，获得pETDuet-1-△lacI-TM。向E.coliG2感受态细胞中，转入构建获得的质粒pETDuet-1-△lacI-TM，获得菌株E.coliM18，向菌株E.coli M18的感受态细胞中分别转入质粒pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA、pRSFDuet-1-△lacI-P41-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA、pRSFDuet-1-△lacI-P53-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA、pRSFDuet-1-△lacI-P69-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA或pRSFDuet-1-△lacI-P84-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA，获得菌株分别命名为E.coliM20～E.coli M24。
实施例4重组菌E.coli M20～E.coli M24全细胞催化生产α-手性胺
将实施例3构建的E.coli M20～E.coli M24分别在LB培养基中，于37℃、200rpm下培养10h的种子液以转接终浓度为OD600＝0.05的接种量转入TB培养基，于37℃、200rpm条件下培养12h，再于22℃、200rpm条件下培养至36h。发酵结束后收集菌体，按终浓度计，以菌浓1.87g/L，底物苄基丙酮浓度20mmol/L于30℃，250rpm反应36h后，加入与反应体系体积比(1：1)甲醇终止反应。经HPLC检测如表2所示，对照菌株E.coli M18的转化率为零，说明未表达DacA的情况下无法实现细胞内的全细胞催化。其中发酵36h菌株E.coliM22的平均高达转化率为87.9％，说明调控表达DacA可实现无需破壁条件下底物和产物能自由出入细胞，从而达到全细胞催化的效果。
表2 TM与底物反应36h的部分胺脱氢酶转化率
实施例5具有催化胆汁酸关键酶的重组菌的构建
将如Genbank登录号946151所示的7-α-羟基类固醇脱氢酶基因hdhA利用限制性酶切位点BamHΙ和HindⅢ连接至质粒pETDuet-1-PL-△lacI获得质粒pETDuet-1-△lacI-hdhA，向E.coli G2感受态细胞中，转入构建获得的质粒pETDuet-1-△lacI-hdhA，构建获得E.coli M19。向E.coli M19感受态细胞中分别转入含有不同强度SPP启动子的质粒pRSFDuet-1-△lacI-P25-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA、pRSFDuet-1-△lacI-P41-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA、pRSFDuet-1-△lacI-P53-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA、pRSFDuet-1-△lacI-P69-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA或pRSFDuet-1-△lacI-P84-trpO-trpL-dacA-Cits857-PR-PL-trpEDCBA，构建获得的重组菌分别命名为E.coli M25～E.coli M29。
实施例6重组菌全细胞催化生产7-氧代-石胆酸
将实施例5构建的重组菌E.coli M25～E.coli M29分别于37℃、200rpm下培养10h，获得种子液，将种子液以终浓度为OD600＝0.05的接种量转接至发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养12h，再于25℃、200rpm条件下培养至36h，。发酵结束后收集菌体按终浓度计，以菌浓1.87g/L，鹅去氧胆酸20mmol/L计，于30℃，250rpm反应36h后，于沸水浴10min灭活终止反应再加入与反应体系体积比(1：1)乙酸乙酯萃取，利用氮吹仪析出样品后加入与反应体系体积比为(1：1)的甲醇复溶，制备样品。。HPLC检测7-α-羟基类固醇脱氢酶转化鹅去氧胆酸的能力，其中E.coli M25，E.coli M28等菌株在胞内生产的7-α-羟基类固醇脱氢酶，利用鹅去氧胆酸在辅因子NAD+作用下生产7-氧代-石胆酸。其平均转化率分别为39.1％；52.2％。如表3所示。
表3 部分7-α-羟基类固醇脱氢酶的转化率
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种精准定量调控大肠杆菌全细胞催化的方法及应用
<130> BAA220306A
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 6648
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagaataac aatgcaaaca caaaaaccga ctctcgaact gctaacctgc gaaggcgctt 60
atcgcgacaa tcccaccgcg ctttttcacc agttgtgtgg ggatcgtccg gcaacgctgc 120
tgctggaatc cgcagatatc gacagcaaag atgatttaaa aagcctgctg ctggtagaca 180
gtgcgctgcg cattacagct ttaggtgaca ctgtcacaat ccaggcactt tccggcaacg 240
gcgaagccct cctggcacta ctggataacg ccctgcctgc gggtgtggaa agtgaacaat 300
caccaaactg ccgtgtgctg cgcttccccc ctgtcagtcc actgctggat gaagacgccc 360
gcttatgctc cctttcggtt tttgacgctt tccgtttatt gcagaatctg ttgaatgtac 420
cgaaggaaga acgagaagcc atgttcttcg gcggcctgtt ctcttatgac cttgtggcgg 480
gatttgaaga tttaccgcaa ctgtcagcgg aaaataactg ccctgatttc tgtttttatc 540
tcgctgaaac gctgatggtg attgaccatc agaaaaaaag cacccgtatt caggccagcc 600
tgtttgctcc gaatgaagaa gaaaaacaac gtctcactgc tcgcctgaac gaactacgtc 660
agcaactgac cgaagccgcg ccgccgctgc cagtggtttc cgtgccgcat atgcgttgtg 720
aatgtaatca gagcgatgaa gagttcggtg gcgtagtgcg tttgttgcaa aaagcgattc 780
gcgctggaga aattttccag gtggtgccat ctcgccgttt ctctctgccc tgcccgtcac 840
cgctggcggc ctattacgtg ctgaaaaaga gtaatcccag cccgtacatg ttttttatgc 900
aggataatga tttcacccta tttggcgcgt cgccggaaag ctcgctcaag tatgatgcca 960
ccagccgcca gattgagatc tacccgattg ccggaacacg cccacgcggt cgtcgcgccg 1020
atggttcact ggacagagat ctcgacagcc gtattgaact ggaaatgcgt accgatcata 1080
aagagctgtc tgaacatctg atgctggttg atctcgcccg taatgatctg gcacgcattt 1140
gcacccccgg cagccgctac gtcgccgatc tcaccaaagt tgaccgttat tcctatgtga 1200
tgcacctcgt ctctcgcgta gtcggcgaac tgcgtcacga tcttgacgcc ctgcacgctt 1260
atcgcgcctg tatgaatatg gggacgttaa gcggtgcgcc gaaagtacgc gctatgcagt 1320
taattgccga ggcggaaggt cgtcgccgcg gcagctacgg cggcgcggta ggttatttca 1380
ccgcgcatgg cgatctcgac acctgcattg tgatccgctc ggcgctggtg gaaaacggta 1440
tcgccaccgt gcaagcgggt gctggtgtag tccttgattc tgttccgcag tcggaagccg 1500
acgaaacccg taacaaagcc cgcgctgtac tgcgcgctat tgccaccgcg catcatgcac 1560
aggagacttt ctgatggctg acattctgct gctcgataat atcgactctt ttacgtacaa 1620
cctggcagat cagttgcgca gcaatgggca taacgtggtg atttaccgca accatattcc 1680
ggcgcaaacc ttaattgaac gcctggcgac catgagcaat ccggtgctga tgctttctcc 1740
tggccccggt gtgccgagcg aagccggttg tatgccggaa ctcctcaccc gcttgcgtgg 1800
caagctgccc attattggca tttgcctcgg acatcaggcg attgtcgaag cttacggggg 1860
ctatgtcggt caggcgggcg aaattctcca cggtaaagcc tccagcattg aacatgacgg 1920
tcaggcgatg tttgccggat taacaaaccc gctgccggtg gcgcgttatc actcgctggt 1980
tggcagtaac attccggccg gtttaaccat caacgcccat tttaatggca tggtgatggc 2040
agtacgtcac gatgcggatc gcgtttgtgg attccagttc catccggaat ccattctcac 2100
cacccagggc gctcgcctgc tggaacaaac gctggcctgg gcgcagcaga aactagagcc 2160
agccaacacg ctgcaaccga ttctggaaaa actgtatcag gcgcagacgc ttagccaaca 2220
agaaagccac cagctgtttt cagcggtggt gcgtggcgag ctgaagccgg aacaactggc 2280
ggcggcgctg gtgagcatga aaattcgcgg tgagcacccg aacgagatcg ccggggcagc 2340
aaccgcgcta ctggaaaacg cagcgccgtt cccgcgcccg gattatctgt ttgctgatat 2400
cgtcggtact ggcggtgacg gcagcaacag tatcaatatt tctaccgcca gtgcgtttgt 2460
cgccgcggcc tgtgggctga aagtggcgaa acacggcaac cgtagcgtct ccagtaaatc 2520
tggttcgtcc gatctgctgg cggcgttcgg tattaatctt gatatgaacg ccgataaatc 2580
gcgccaggcg ctggatgagt taggtgtatg tttcctcttt gcgccgaagt atcacaccgg 2640
attccgccac gcgatgccgg ttcgccagca actgaaaacc cgcaccctgt tcaatgtgct 2700
ggggccattg attaacccgg cgcatccgcc gctggcgtta attggtgttt atagtccgga 2760
actggtgctg ccgattgccg aaaccttgcg cgtgctgggg tatcaacgcg cggcggtggt 2820
gcacagcggc gggatggatg aagtttcatt acacgcgccg acaatcgttg ccgaactgca 2880
tgacggcgaa attaaaagct atcagctcac cgcagaagac tttggcctga caccctacca 2940
ccaggagcaa ctggcaggcg gaacaccgga agaaaaccgt gacattttaa cacgtttgtt 3000
acaaggtaaa ggcgacgccg cccatgaagc agccgtcgct gcgaacgtcg ccatgttaat 3060
gcgcctgcat ggccatgaag atctgcaagc caatgcgcaa accgttcttg aggtactgcg 3120
cagtggttcc gcttacgaca gagtcaccgc actggcggca cgagggtaaa tgatgcaaac 3180
cgttttagcg aaaatcgtcg cagacaaggc gatttgggta gaagcccgca aacagcagca 3240
accgctggcc agttttcaga atgaggttca gccgagcacg cgacattttt atgatgcgct 3300
acagggtgcg cgcacggcgt ttattctgga gtgcaagaaa gcgtcgccgt caaaaggcgt 3360
gatccgtgat gatttcgatc cagcacgcat tgccgccatt tataaacatt acgcttcggc 3420
aatttcggtg ctgactgatg agaaatattt tcaggggagc tttaatttcc tccccatcgt 3480
cagccaaatc gccccgcagc cgattttatg taaagacttc attatcgacc cttaccagat 3540
ctatctggcg cgctattacc aggccgatgc ctgcttatta atgctttcag tactggatga 3600
cgaccaatat cgccagcttg ccgccgtcgc tcacagtctg gagatggggg tgctgaccga 3660
agtcagtaat gaagaggaac aggagcgcgc cattgcattg ggagcaaagg tcgttggcat 3720
caacaaccgc gatctgcgtg atttgtcgat tgatctcaac cgtacccgcg agcttgcgcc 3780
gaaactgggg cacaacgtga cggtaatcag cgaatccggc atcaatactt acgctcaggt 3840
gcgcgagtta agccacttcg ctaacggttt tctgattggt tcggcgttga tggcccatga 3900
cgatttgcac gccgccgtgc gccgggtgtt gctgggtgag aataaagtat gtggcctgac 3960
gcgtgggcaa gatgctaaag cagcttatga cgcgggcgcg atttacggtg ggttgatttt 4020
tgttgcgaca tcaccgcgtt gcgtcaacgt tgaacaggcg caggaagtga tggctgcggc 4080
accgttgcag tatgttggcg tgttccgcaa tcacgatatt gccgatgtgg tggacaaagc 4140
taaggtgtta tcgctggcgg cagtgcaact gcatggtaat gaagaacagc tgtatatcga 4200
tacgctgcgt gaagctctgc cagcacatgt tgccatctgg aaagcattaa gcgtcggtga 4260
aaccctgccc gcccgcgagt ttcagcacgt tgataaatat gttttagaca acggccaggg 4320
tggaagcggg caacgttttg actggtcact attaaatggt caatcgcttg gcaacgttct 4380
gctggcgggg ggcttaggcg cagataactg cgtggaagcg gcacaaaccg gctgcgccgg 4440
acttgatttt aattctgctg tagagtcgca accgggcatc aaagacgcac gtcttttggc 4500
ctcggttttc cagacgctgc gcgcatatta aggaaaggaa caatgacaac attacttaac 4560
ccctattttg gtgagtttgg cggcatgtac gtgccacaaa tcctgatgcc tgctctgcgc 4620
cagctggaag aagcttttgt cagtgcgcaa aaagatcctg aatttcaggc tcagttcaac 4680
gacctgctga aaaactatgc cgggcgtcca accgcgctga ccaaatgcca gaacattaca 4740
gccgggacga acaccacgct gtatctcaag cgtgaagatt tgctgcacgg cggcgcgcat 4800
aaaactaacc aggtgctggg gcaggcgttg ctggcgaagc ggatgggtaa aaccgaaatc 4860
atcgccgaaa ccggtgccgg tcagcatggc gtggcgtcgg cccttgccag cgccctgctc 4920
ggcctgaaat gccgtattta tatgggtgcc aaagacgttg aacgccagtc gcctaacgtt 4980
tttcgtatgc gcttaatggg tgcggaagtg atcccggtgc atagcggttc cgcgacgctg 5040
aaagatgcct gtaacgaggc gctgcgcgac tggtccggta gttacgaaac cgcgcactat 5100
atgctgggca ccgcagctgg cccgcatcct tatccgacca ttgtgcgtga gtttcagcgg 5160
atgattggcg aagaaaccaa agcgcagatt ctggaaagag aaggtcgcct gccggatgcc 5220
gttatcgcct gtgttggcgg cggttcgaat gccatcggca tgtttgctga tttcatcaat 5280
gaaaccaacg tcggcctgat tggtgtggag ccaggtggtc acggtatcga aactggcgag 5340
cacggcgcac cgctaaaaca tggtcgcgtg ggtatctatt tcggtatgaa agcgccgatg 5400
atgcaaaccg aagacgggca gattgaagaa tcttactcca tctccgccgg actggatttc 5460
ccgtctgtcg gcccacaaca cgcgtatctt aacagcactg gacgcgctga ttacgtgtct 5520
attaccgatg atgaagccct tgaagccttc aaaacgctgt gcctgcacga agggatcatc 5580
ccggcgctgg aatcctccca cgccctggcc catgcgttga aaatgatgcg cgaaaacccg 5640
gataaagagc agctactggt ggttaacctt tccggtcgcg gcgataaaga catcttcacc 5700
gttcacgata ttttgaaagc acgaggggaa atctgatgga acgctacgaa tctctgtttg 5760
cccagttgaa ggagcgcaaa gaaggcgcat tcgttccttt cgtcacgctc ggtgatccgg 5820
gcattgagca gtcattgaaa attatcgata cgctaattga agccggtgct gacgcgctgg 5880
agttaggtat ccccttctcc gacccactgg cggatggccc gacgattcaa aacgccactc 5940
tgcgcgcctt tgcggcaggt gtgactccgg cacaatgttt tgaaatgctg gcactgattc 6000
gccagaaaca cccgaccatt cccattggcc tgttgatgta tgccaatctg gtgtttaaca 6060
aaggcattga tgagttttat gcccagtgcg aaaaagtcgg cgtcgattcg gtgctggttg 6120
ccgatgtgcc agttgaagag tccgcgccct tccgccaggc cgcgttgcgt cataatgtcg 6180
cacctatctt catctgcccg ccaaatgccg atgacgacct gctgcgccag atagcctctt 6240
acggtcgtgg ttacacctat ttgctgtcac gagcaggcgt gaccggcgca gaaaaccgcg 6300
ccgcgttacc cctcaatcat ctggttgcga agctgaaaga gtacaacgct gcacctccat 6360
tgcagggatt tggtatttcc gccccggatc aggtaaaagc agcgattgat gcaggagctg 6420
cgggcgcgat ttctggttcg gccattgtta aaatcatcga gcaacatatt aatgagccag 6480
agaaaatgct ggcggcactg aaagtttttg tacaaccgat gaaagcggcg acgcgcagtt 6540
aatcccacag ccgccagttc cgctggcggc attttaactt tctttaatga agccggaaaa 6600
atcctaaatt catttaatat ttatcttttt accgtttcgc ttaccccg 6648
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaaagcaa ttttcgtact gaaaggttgg tggcgcactt cctga 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgaactagtt aactagtacg c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttgacataaa taccactggc ggtgatact 29
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<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgagcacaa aaaagaaacc attaacacaa gagcagcttg aggacgcacg tcgccttaaa 60
gcaatttatg aaaaaaagaa aaatgaactt ggcttatccc aggaatctgt cgcagacaag 120
atggggatgg ggcagtcagg cgttggtgct ttatttaatg gcatcaatgc attaaatgct 180
tataacgccg cattgcttac aaaaattctc aaagttagcg ttgaagaatt tagcccttca 240
atcgccagag aaatctacga gatgtatgaa gcggttagta tgcagccgtc acttagaagt 300
gagtatgagt accctgtttt ttctcatgtt caggcaggga tgttctcacc taagcttaga 360
acctttacca aaggtgatgc ggagagatgg gtaagcacaa ccaaaaaagc cagtgattct 420
gcattctggc ttgaggttga aggtaattcc atgaccgcac caacaggctc caagccaagc 480
tttcctgacg gaatgttaat tctcgttgac cctgagcagg ctgttgagcc aggtgatttc 540
tgcatagcca gacttggggg tgatgagttt accttcaaga aactgatcag ggatagcggt 600
caggtgtttt tacaaccact aaacccacag tacccaatga tcccatgcaa tgagagttgt 660
tccgttgtgg ggaaagttat cgctagtcag tggcctgaag agacgtttgg ctga 714
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<212> DNA
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<400> 6
atgagtattg actcggcact gaactgggat ggtgaaatga ccgtgacccg ttttgacagc 60
atgaccggcg cacactttgt tattcgtctg gatagcacgc agctgggtcc ggcagccggc 120
ggtacccgtg cagctcaata ttctaacctg gcggatgccc tgacggacgc cggtaaactg 180
gcaggcgcta tgaccctgca gatggccgtt agtaatctgc cgatgggcgg tggcaaatcc 240
gtcattgccc tgccggcacc gcgccattca atcgatccgt cgacctgggc gcgtattctg 300
cgcatccacg ccgaaaacat cgataaactg agcggtaact actggacggg cccggacgtg 360
aacaccaatt cggccgatat ggacaccctg aacgatacca cggaatttgt tttcggtcgt 420
agcctggaac gcggtggcgc aggttctggt gcttttacca cggcggttgg cgtcttcgaa 480
gctatgaaag cgacggttgc ccatcgtggt ctgggcagtc tggatggcct gaccgtgctg 540
gttcagggtc tgggtgcagt cggtggcagt ctggcatccc tggcagcaga agcaggtgca 600
caactgctgg ttgcggatac ggacaccgaa cgtgtcgcac atgctgtggc actgggtcac 660
acggcagtgg cactggaaga tgttctgagc accccgtgcg acgtgtttgc accgtgtgct 720
atgggtggcg tcattaccac ggaagtggcc cgtaccctgg attgcagtgt ggttgcaggt 780
gcagcttgta acgttatcgc ggatgaagca gcatccgaca ttctgcacgc tcgcggcatc 840
ctgtatgcac cggactttgt ggctaatgcg ggtggcgcga tccatctggt tggtcgtgaa 900
gtcctgggct ggagcgaatc tgtcgtgcac gaacgcgccg ttgcaattgg tgataccctg 960
aaccaagtct tcgaaatctc tgataatgac ggtgtgacgc cggacgaagc agctcgtacc 1020
ctggcaggcc gtcgcgcgcg cgaagccagc accacgaccg ctaccgcgta a 1071
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcttgtcaaa ttcttaattt ggtgctatac tggatcg 37
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcttgtcaaa tttttaatgt tgtgctatac tgtatcg 37
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tctcggcaga taccatatta tcggctatac tgtatcg 37
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcttgccaaa tttgcaaatt tgttctatac tgtattg 37
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttttgccaga ttccctgtga tctgctatac tttaaag 37
<210> 12
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atggcccaac aatcacccta ttcagcagcg atggcagaac agcgtcacca ggagtggtta 60
cgttttgtcg acctgcttaa gaatgcctac caaaacgatc tccatttacc gttgttaaac 120
ctgatgctga cgccagatga gcgcgaagcg ttggggactc gcgtgcgtat tgtcgaagag 180
ctgttgcgcg gcgaaatgag ccagcgtgag ttaaaaaatg aactcggcgc aggcatcgcg 240
acgattacgc gtggatctaa cagcctgaaa gccgcgcccg tcgagctgcg ccagtggctg 300
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<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttatcaccgc cagaggtaaa atagtcaa 28
<210> 14
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atgaatacca ttttttccgc tcgtatcatg aagcgcctgg cgctcaccac ggctctttgc 60
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tacgttatcg gccaggcaat gaaagccggt aaatttaaag aaactgattt agtcactatc 300
ggcaacgacg catgggccac cggtaacccg gtgtttaaag gttcttcgct gatgttcctc 360
aaaccgggca tgcaggttcc ggtttctcag ctgatccgcg gtattaacct gcaatcgggt 420
aacgatgctt gtgtcgccat ggctgatttt gccgctggta gccaggacgc ttttgttggc 480
ttgatgaaca gctacgttaa cgccctgggc ctgaaaaaca cccacttcca gacggtacat 540
ggtctggatg ctgatggtca gtacagctcc gcgcgcgata tggcgctgat cggccaggcg 600
ttgatccgtg acgtaccgaa tgaatactcg atctataaag aaaaagaatt tacgtttaac 660
ggtattcgcc agctgaaccg taacggcctg ttatgggata acagcctgaa tgtcgacggc 720
atcaaaaccg gacacactga caaagcaggt tacaaccttg ttgcttctgc gactgaaggc 780
cagatgcgct tgatctctgc ggtgatgggc ggacgtactt ttaaaggccg tgaagccgaa 840
agtaaaaaac tgctgacctg gggcttccgt ttcttcgaaa ccgttaaccc actgaaagta 900
ggtaaagagt tcgcctctga accggtttgg tttggtgatt ctgatcgcgc ttcgttaggg 960
gttgataaag acgtgtacct gaccattccg cgtggccgca tgaaagatct gaaagccagc 1020
tatgtgctga acagcagtga attgcatgcg ccgctgcaaa agaatcaggt cgtcggtact 1080
atcaacttcc agcttgatgg caaaacgatc gaacaacgcc cgttggttgt actgcaagaa 1140
atcccggaag gtaacttctt cggcaaaatc attgattaca ttaaattaat gttccatcac 1200
tggtttggtt aa 1212
Claims (5)
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌BL21为出发菌株，在基因组上敲除了色氨酸合成酶基因簇trpEDCBA，含有具有温度诱导和受色氨酸调控的重组质粒和表达目的蛋白的重组质粒；
所述具有温度诱导和受色氨酸调控的重组质粒含有SPP型启动子、低温诱导型启动子PR、高温诱导型启动子PL、色氨酸合成酶基因簇trpEDCBA、操纵区trpO、D,D-羧肽酶基因dacA和温敏阻遏蛋白CIts857；所述操纵区trpO具有可与由阻遏蛋白trpR和色氨酸形成的共价二聚体结合的结合位点；所述启动子PL上具有温敏阻遏蛋白CIts857的结合位点；所述启动子PL调控trpEDCBA的表达；所述启动子PR调控温敏阻遏蛋白CIts857的表达；所述SPP型启动子调控操纵区trpO的基因表达；所述操纵区trpO的下游具有dacA基因；所述启动子PL和启动子PR的转录方向相反；
所述表达目的蛋白的重组质粒上含有编码目的蛋白的基因；启动子PL的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；启动子PR的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；编码所述启动子SPP的核苷酸序列如SEQ ID No.7~11任一所示；操纵区trpO的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；编码所述温敏阻遏蛋白CIts857的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述D,D-羧肽酶基因dacA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；所述dacA基因的上游还含有trpL碱基序列；所述trpL碱基序列如SEQ ID NO.2所示；所述目的基因为羟基类固醇脱氢酶基因或胺脱氢酶基因；所述目的基因为SEQ ID NO.6所示的苯丙氨酸脱氢酶基因 TM，或Genbank 登录号：946151所示的 7-α-羟基类固醇脱氢酶基因hdhA。
2.一种调控大肠杆菌全细胞催化的方法，其特征在于，以权利要求1所述的重组大肠杆菌作为全细胞催化剂，在发酵前12 h控制发酵温度为36~38℃，抑制DacA蛋白表达，促进各类酶类在胞内积累；第13~36 h控制温度为20~24℃，促进DacA蛋白表达，从而提高大肠杆菌细胞壁和细胞膜的通透性，促进全细胞催化；第37 h加入底物，于28~32℃继续反应至少36h。
3.一种全细胞生产α-手性胺的方法，其特征在于，以权利要求1所述的重组大肠杆菌作为全细胞催化剂，在发酵前12 h控制发酵温度为36~38℃，第13~36 h控制温度为20~24℃，第37 h加入底物苄基丙酮，于28~32℃继续反应至少36 h生产α-手性胺。
4.一种全细胞生产7-氧代-石胆酸的方法，其特征在于，以权利要求1所述大肠杆菌作为全细胞催化剂，在发酵前12 h控制发酵温度为36~38℃，第13~36 h控制温度为20~24℃，第37 h加入底物鹅去氧胆酸，于28~32℃继续反应至少36 h生产7-氧代-石胆酸。
5.权利要求1所述重组大肠杆菌在食品、生物领域全细胞催化生产生物产品中的应用。
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| CN113061563A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-02 | 台州学院 | 一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成l-苹果酸的方法 |
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2022
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| CN113061563A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-02 | 台州学院 | 一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成l-苹果酸的方法 |
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