CN110951665B

CN110951665B - 一种敲除克雷伯氏菌Zn转运蛋白提高1,3-丙二醇产量的方法

Info

Publication number: CN110951665B
Application number: CN201911379247.8A
Authority: CN
Inventors: 诸葛斌; 李玉石; 刘郁青; 陆信曜; 宗红; 宋健
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN110951665A

Abstract

本发明公开了一种敲除克雷伯氏菌Zn转运蛋白提高1,3‑丙二醇产量的方法，属于基因工程技术领域。本发明应用基因工程方法，将克雷伯氏菌来源的Zn转运蛋白基因ygiE进行敲除，从而降低其对Zn的转运能力，提高K.peneumoniae中1,3‑丙二醇的产量。重组菌经50mL摇瓶发酵，1,3‑丙二醇产量达20.34g/L。此发明成功改变了K.peneumoniae中对Zn的转运能力，可以减少培养基中盐离子的添加，同时可有效减少副产物，降低下游分离成本，提高1,3‑丙二醇产量，为选育1,3‑丙二醇高产菌株提供了崭新的思路。

Description

一种敲除克雷伯氏菌Zn转运蛋白提高1,3-丙二醇产量的方法

技术领域

本发明涉及一种敲除克雷伯氏菌Zn转运蛋白提高1,3-丙二醇产量的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

1,3-丙二醇在纺织、塑料及食品包装等方面具有广阔应用前景。1,3-丙二醇的主要应用是作为聚合材料聚对苯二甲酸丙二醇酯(PPT)的合成单体，作为一种新型聚合材料，PTT具有很强的延展性，良好的抗污染、防紫外线能力，不易褪色，且容易被生物降解等优点，主要应用于高档地毯、纺织纤维。随着PTT市场的扩大，1,3-丙二醇的生产也极具前景。

目前，1,3-丙二醇的生产方法中化学合成法占据主导地位，但存在诸多缺点：高温、高压、催化剂昂贵、污染环境。生物法合成工艺相对简单，反应条件温和，生产过程更为环保。同时，随着生物柴油产业发展，产生大量废弃甘油。目前，天然菌株中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae，以下简称为K.peneumoniae)可利用甘油作为碳源生产1,3-丙二醇，同时克雷伯氏菌具有相对完善的遗传背景和基因工程改造工具。但在生产过程中存在1,3-丙二醇产量较低、甘油转化率低、副产物多等缺点。现代基因工程技术在定向改造菌株提高其生产1,3-丙二醇方面发挥重要作用，主要涉及弱化副产物合成途径、强化关键酶基因表达，虽然取得一定效果，但仍存在培养基中盐离子较多、副产物无法完全消除、酶活的提高未提高1,3-丙二醇产量等问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌是敲除了编码Zn转运蛋白的基因ygiE的克雷伯氏菌。

在本发明的一种实施方式中，所述Zn转运蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述ygiE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述敲除是利用CRISPR-Cas9的方法进行的

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的制备方法是将pCas9质粒、pTargetF-PMB1-N20质粒、donor修补模板，转化入克雷伯氏菌中，得到敲除编码Zn转运蛋白的基因ygiE的克雷伯氏菌。所述pTargetF-PMB1-N20质粒是以sgRNA-ygiE-up和sgRNA-ygiE-down为引物，以pTargetF-PMB1质粒为模板，进行PCR得到的；所述donor修补模板是以克雷伯氏菌基因组为模板，克隆ygiE基因上游500-1000bp和下游500-1000bp，再将ygiE基因上游500-1000bp和下游500-1000bp进行融合PCR得到的。

本发明的第二个目的是提供一种合成1,3-丙二醇的方法，所述方法是利用上述基因工程菌为生产菌株进行发酵培养。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是在35-39℃，120-180rpm下进行。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的时间为30-50h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的培养基配方为葡萄糖10-15g/L，甘油40-45g/L，酵母粉6-10g/L，MgSO₄ 2-5g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-4g/L，KH₂PO₄ 7-8g/L，FeSO₄·7H₂O0.005-0.01g/L，VB12 5-6g/L，微量元素溶液100-110μL/L，初始pH 7-8；其中，微量元素溶液：ZnCl₂ 0.7-1g/L，MnCl₂·4H₂O 0.7-1g/L，H₃BO₃ 0.6-1g/L，CoCl₂·6H₂O 0.2-0.5g/L，CuCl₂ 0.2-0.5g/L，NiCl₂·6H₂O 0.25-0.5g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.35-0.5g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的培养基配方为葡萄糖10g/L，甘油40g/L，酵母粉6g/L，MgSO₄ 2g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 7.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.005g/L，VB12 5g/L，微量元素溶液100μL/L，初始pH 7.5；其中，微量元素溶液：ZnCl₂ 0.7g/L，MnCl₂·4H₂O0.7g/L，H₃BO₃ 0.6g/L，CoCl₂·6H₂O 0.2g/L，CuCl₂ 0.2g/L，NiCl₂·6H₂O 0.25g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.35g/L。

本发明的第三个目的是提供一种通过敲除Zn转运蛋白促进1,3-丙二醇合成的方法，所述方法是敲除了编码Zn转运蛋白的基因ygiE，所述Zn转运蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供上述基因工程菌在纺织、塑料或食品包装领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明利用ygiE基因来调节菌体的Zn转运能力，在克雷伯氏菌中敲除ygiE基因，克雷伯氏菌的生物量下降7％，1,3-丙二醇产量提高10％，达到20.34g/L，摩尔转化率0.6mol/mol，2,3-丁二醇产量下降20％，乙醇产量下降26％，乙酸产量上升12％。这些结果表明敲除ygiE基因有效地改善1,3-PDO的生产效率。

附图说明

图1是敲除ygiE基因的克雷伯氏菌基因工程菌在50mL发酵培养基中发酵结果，实验经过三次以上重复。

图2是野生型克雷伯氏菌基因工程菌在50mL发酵培养基中发酵结果，实验经过三次以上重复。

具体实施方式

(一)本发明中，大肠杆菌JM109感受态细胞购于上海生工，货号：B528410-0001；pTargetF-PMB1质粒购于爱迪基因，货号：62226；pCas9质粒购自爱迪基因，货号：62225；硫酸卡那霉素(以下简称kana)、壮观霉素(以下简称Spe)，购于上海生工。

(二)发酵培养基配方：葡萄糖10g/L，甘油40g/L，酵母粉6g/L，MgSO₄ 2g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 7.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.005g/L，VB12 5g/L，微量元素溶液100μL/L，初始pH 7.5；其中，微量元素溶液：ZnCl₂ 0.7g/L，MnCl₂·4H₂O 0.7g/L，H₃BO₃ 0.6g/L，CoCl₂·6H₂O 0.2g/L，CuCl₂ 0.2g/L，NiCl₂·6H₂O 0.25g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.35g/L。

(三)发酵产物的含量检测方法

生物量测定：细胞干重(DCW)根据分光光度计测量OD₆₀₀值与干重对应关系公式1OD₆₀₀＝0.36g/L。

产物测定：利用HPLC法检测发酵产物中1,3-PDO、2,3-BDO和乙酸的浓度，紫外与示差折光检测器检测，所用交换柱类型为有机酸离子交换柱，工作柱温：60℃；配制流动相浓度：5mmol/L H₂SO₄；设定检测流速：0.6mL/min。

以下实施例用于说明本发明。

实施例1在克雷伯氏菌中敲除ygiE基因

根据克雷伯氏菌基因组序列获得ygiE基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，敲除该片段。实验步骤如下。

1.pTargetF-PMB1+N20质粒构建过程如下：

1)使用sgRNACas9软件设计ygiE基因的引导序列片段，以此设计引物sgRNA-ygiE-up和sgRNA-ygiE-down(见表1)，以pTargetF-PMB1质粒为模板进行PCR，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，验证成功后纯化PCR产物；

2)将纯化的10μL PCR产物转入放置于4℃冰上的大肠杆菌JM109感受态细胞内30min，之后在55℃水浴锅中热激90s，加入1.5mL LB液体培养基，37℃，150rpm培养1h。6000rpm，离心2min，将菌体涂布到带有Spe抗性的LB平板上。37℃培养箱过夜培养，第二天长出单菌落进行菌落PCR验证和测序验证；

3)挑取验证成功的单菌落于10mL LB液体培养基中(带有Spe抗性)，37℃，150rpm培养7～8h提取质粒，得到pTargetF-PMB1+N20质粒。

表1引物

注：ygiE-2-up中小写字母表示同源臂序列；sgRNA引物中小写字母同时代表引导序列片段。

2.ygiE基因上下游融合donor修补模板构建过程如下：

1)以克雷伯氏菌基因组为模板，用高保真酶克隆ygiE目的基因上下游各500bp(所用引物见表1)，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，验证成功的PCR产物纯化；

2)上游500bp和下游500bp进行融合PCR连接，构建1000bp片段的donor修补模板。

3.含有pCas9质粒的野生菌克雷伯氏菌构建及感受态制备过程如下:

1)划线野生型克雷伯氏菌于无抗的LB平板上，待长出单菌落后，挑取单菌落于10mL试管中培养，之后取100μL培养液转接于10mL LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.4左右，制备野生型克雷伯氏菌感受态细胞；

2)将达到OD₆₀₀值的菌液倒于50mL灭菌的离心管中，置于冰上20-30min，同时预冷离心机；

3)3000rpm，8min，进行离心；

4)弃上清，用预冷的10％甘油清洗4次；

5)加入500-1000μL的10％预冷甘油，之后以100μL每支分装到预冷的1.5mL离心管中；

6)将pCas9质粒500ng加入野生型克雷伯氏菌感受态细胞中(质粒和片段总体积不能超过感受态细胞体积的1/10，轻轻混匀，置于冰上3min)；

7)准备好电转杯冰上预冷和电转仪提前预热，LB后培养液冰上预冷；

8)将电转仪程序设为5.9ms，2.49kV，电击一次立马加入LB后培养液1mL(事先吸好)轻轻混匀后吸出置于1.5mL离心管中进行培养；

9)30℃，150rpm后培养1.5h；

10)6000rpm，离心2min取200μL后培养液含kana的LB平板，30℃过夜培养。

挑取上述平板上长出的单菌落进行菌落PCR验证，验证成功的菌落即为含有pCas9质粒的野生菌克雷伯氏菌。挑取验证成功的菌落于10mL LB培养基(带有kana抗性)中，30℃，150rpm过夜培养，第二天以1:100的体积比例转接10mL LB培养基(带有kana抗性)中，培养到OD₆₀₀＝0.2左右时，加入终浓度为60mM的D-阿拉伯糖分别诱导至OD₆₀₀＝0.6左右。

制备电转感受态细胞，步骤如下：

1)将上述达到OD值的菌倒于50mL灭菌的离心管中，置于冰上20-30min，同时预冷离心机；

2)3000rpm，8min，进行离心；

3)弃上清，用预冷的10％甘油清洗4次；

4)加入500-1000μL的10％预冷甘油，之后以100μL每支分装到预冷的1.5mL离心管中。

4.将pTargetF-PMB1+N20质粒和donor修补模板电击转入感受态细胞中，步骤如下：

1)取出感受态细胞置于冰上融化5min，同时，pTargetF-PMB1+N20质粒和donor修补模板置于冰上；

2)将pTargetF-PMB1+N20质粒500ng，donor修补模板1μg加入感受态细胞中(质粒和片段总体积不能超过感受态细胞体积的1/10，轻轻混匀，置于冰上3min)；

3)准备好电转杯冰上预冷和电转仪提前预热，LB后培养液冰上预冷；

4)将电转仪程序设为5.9ms，2.49kv，电击一次立马加入后培养液(事先吸好)轻轻混匀后吸出置于1.5mL离心管中进行培养；

5)30℃后培养1.5h；

6)6000rpm，离心2min取200μL后培养液涂LB平板(带有kana和Spe抗性)后，30℃过夜培养。

挑取上述单菌落进行菌落PCR验证，确定基因是否被成功敲除，验证体系如下：

挑取上述单菌落于1.5mL离心管中培养，之后取100μL转接于10mL LB培养基(带有kana抗性)中培养至OD₆₀₀＝0.4时，加入0.5mM IPTG，30℃，150rpm过夜诱导12h；将诱导菌液划线LB平板(带有kana抗性)，30℃培养；将长出的单菌落点板于LB平板(带有Spe抗性)上，挑出在LB平板(带有Spe抗性)上不生长的菌落，于30mL LB(无抗)培养基中，42℃培养10h；将该菌液划线无抗板，长出的单菌落，分别点在带有kana抗性的LB平板、带有Spe抗性的LB平板、无抗LB平板上，只在无抗LB平板上生长的菌落即为成功敲除的菌落K.peneumoniae△ygiE。

实施例2K.peneumoniae△ygiE在生产1,3-丙二醇中的应用

挑取K.peneumoniae△ygiE单菌落于液体LB培养基，37℃，150rpm培养10-15h；以1-5％(v/v)的接种量转接到50mL未添加Co、Mn、Ni等离子的发酵培养基中发酵，37℃，150rpm，发酵48h，不定时取样通过分光光度计测OD₆₀₀及通过液相测发酵产物。

摇瓶发酵结果表明，在克雷伯氏菌中敲除ygiE基因，克雷伯氏菌的生物量下降7％，1,3-丙二醇产量提高10％，达到20.34g/L，摩尔转化率为0.6mol/mol，2,3-丁二醇产量下降20％，乙醇产量下降26％，乙酸产量上升12％(见图1和图2)。这些结果表明敲除ygiE基因有效地改善1,3-PDO的生产。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种敲除克雷伯氏菌Zn转运蛋白提高1,3-丙二醇产量的方法

<130> 233

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgacgctgt tagccggtag cgcaaccttc attggcgcca tattcggcgt gattggccag 60

aaaccctcta accgcctgct tggcttctcc ctcggctttg ccgccgggat tatgctattg 120

atttcgttga tggaaatgct gcctgccgcg ctggccgccg agggcatgtc gccgctgctc 180

ggctatggaa tgtttgttgt cggcctgctg ggctactttg gccttgaccg cctgctgccg 240

cacgcccacc cgcaggatct gatgactccc gccatgccgc gcccgcgcaa cttacgccgc 300

accgctattc ttttgacgct ggggatcagc ctgcataact ttccggaagg gatcgccacc 360

tatgtcacgg ccagcaacaa cctcgagctt ggcatgggcg tcgcccttgc cgtcgccctg 420

cacaatattc cggaaggact ggcggttgcc ggaccggtgt atgccgccac cggctcgcgc 480

agcaaagcgg tgctctgggc cgggctttcc ggcatggcgg aaattttggg cggcgtgctg 540

gcgtggttga ttctggggag cctggtctcg ccgctggtga tgggcgcgat catggctgcc 600

gtcgccggga ttatggtggc gctgtcggtc gatgaactga tgccgctggc gaaagagatc 660

gatccgcaaa gcaatccaag ctacggcgtc ctgtgcggga tgtcggtcat ggggctgagc 720

ctggtggtac tccagacgat gggcatcggt taa 753

<210> 2

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Leu Thr Leu Leu Ala Gly Ser Ala Thr Phe Ile Gly Ala Ile Phe Gly

1 5 10 15

Val Ile Gly Gln Lys Pro Ser Asn Arg Leu Leu Gly Phe Ser Leu Gly

20 25 30

Phe Ala Ala Gly Ile Met Leu Leu Ile Ser Leu Met Glu Met Leu Pro

35 40 45

Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly Met Ser Pro Leu Leu Gly Tyr Gly Met

50 55 60

Phe Val Val Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Gly Leu Asp Arg Leu Leu Pro

65 70 75 80

His Ala His Pro Gln Asp Leu Met Thr Pro Ala Met Pro Arg Pro Arg

85 90 95

Asn Leu Arg Arg Thr Ala Ile Leu Leu Thr Leu Gly Ile Ser Leu His

100 105 110

Asn Phe Pro Glu Gly Ile Ala Thr Tyr Val Thr Ala Ser Asn Asn Leu

115 120 125

Glu Leu Gly Met Gly Val Ala Leu Ala Val Ala Leu His Asn Ile Pro

130 135 140

Glu Gly Leu Ala Val Ala Gly Pro Val Tyr Ala Ala Thr Gly Ser Arg

145 150 155 160

Ser Lys Ala Val Leu Trp Ala Gly Leu Ser Gly Met Ala Glu Ile Leu

165 170 175

Gly Gly Val Leu Ala Trp Leu Ile Leu Gly Ser Leu Val Ser Pro Leu

180 185 190

Val Met Gly Ala Ile Met Ala Ala Val Ala Gly Ile Met Val Ala Leu

195 200 205

Ser Val Asp Glu Leu Met Pro Leu Ala Lys Glu Ile Asp Pro Gln Ser

210 215 220

Asn Pro Ser Tyr Gly Val Leu Cys Gly Met Ser Val Met Gly Leu Ser

225 230 235 240

Leu Val Val Leu Gln Thr Met Gly Ile Gly

245 250

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agggatcgcc acctatgtca gttttagagc tagaaatagc aagt 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgacataggt ggcgatccct actagtatta tacctaggac tgag 44

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

accggcgaga gcagctc 17

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgcctgagg atgcgcgtac 20

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtacgcgcat cctcaggcaa gtgctcgggc gtagcga 37

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaacgccgca aacagctgg 19

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是敲除了编码Zn转运蛋白的基因ygiE的克雷伯氏菌，所述Zn转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述ygiE的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述敲除是利用CRISPR-Cas9的方法进行的。

4.一种合成1,3-丙二醇的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-3任一所述的基因工程菌为生产菌株进行发酵培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵是在35-39℃，120-180 rpm下进行。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间为30-50 h。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基配方为葡萄糖10-15 g/L，甘油40-45 g/L，酵母粉6-10 g/L，MgSO₄ 2-5 g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-4 g/L，KH₂PO₄ 7-8 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.005-0.01 g/L，VB12 5-6 g/L，微量元素溶液100-110 μL/L，初始pH 7-8；其中，微量元素溶液：ZnCl₂ 0.7-1 g/L，MnCl₂·4H₂O 0.7-1 g/L，H₃BO₃ 0.6-1 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.2-0.5 g/L，CuCl₂ 0.2-0.5 g/L，NiCl₂·6H₂O 0.25-0.5 g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.35-0.5 g/L。

8.一种通过敲除Zn转运蛋白促进1,3-丙二醇合成的方法，其特征在于，所述方法是敲除了编码Zn转运蛋白的基因ygiE，所述Zn转运蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2所示。

9.权利要求1-3任一所述的基因工程菌在纺织、塑料或食品包装领域的应用。