CN112695048A - L-赖氨酸脱羧酶与酶法合成1,5-戊二胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物化学技术领域，提供了一种L‑赖氨酸脱羧酶与酶法合成1,5‑戊二胺的方法，该L‑赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该酶法合成1,5‑戊二胺的方法包括以下步骤：将L‑赖氨酸盐酸盐与磷酸吡哆醛和L‑赖氨酸脱羧酶进行脱羧反应，得到所述1,5‑戊二胺。本发明所使用L‑赖氨酸脱羧酶能够适用于高浓度的L‑赖氨酸盐酸盐，具有高效的催化作用。并且，在所述酶法合成1,5‑戊二胺的方法中，湿菌体全细胞用量低，pH范围广，反应条件温和，反应中无需添加缓冲液，反应时无需使用盐酸进行中和，从而大大简化了采用化学工艺合成1,5‑戊二胺的繁琐步骤。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种L-赖氨酸脱羧酶与酶法合成1,5-戊二胺的方法。
背景技术
研究表明，全球每年需要消耗3000万吨的聚酰胺产品，且消耗量呈现逐年增加的趋势。目前，使用最广泛的聚酰胺产品是聚酰胺PA6和PA66。其中PA66是由已二酸和己二胺聚合而成，已二酸可以通过微生物法合成，而己二胺则依赖于传统的石油工业合成。人们发现与己二胺互为同系物的1,5-戊二胺与葵二酸合成的聚酰胺PA510，其性能与聚酰胺PA6、PA66相似，可替代其在工业中的应用；1,5-戊二胺与己二酸聚合成的聚酰胺PA56，经处理后得到的PA56纤维，与PA6相比，具有相同的染色性和耐磨性，且回潮率较高。由1,5-戊二胺单体聚合成的聚氨酯、螯合剂以及固化剂等高分子聚合物在工业中也都有很广泛的用途。
现有技术中，1,5-戊二胺化学合成法采用以不可再生资源石油作为原料，环境污染严重，无法实现可持续发展，同时将要面临石油资源匮乏，价格上涨等问题。
因此，利用生物酶法合成1,5-戊二胺，对于合成聚酰胺、聚氨酯等高分子聚合物具有十分重要的意义(生物酶法合成1,5-戊二胺的研究进展，期刊：广西科学，2017，24(1)：40-47，53)。
例如，德国学者Martin以C.glutamicun为出发菌株，经80h发酵后，最终获得1,5-戊二胺产量可达72g/L(文献来源：Martin Volkert,Ludwigshafen,Oskar Ze lder,et al,Method for fermentatively producing 1,5-diaminopentane:US,0292429[P].2019-01-23)。
又如，南京工业大学张凯等利用DNA改组技术对赖氨酸脱羧酶进行随机突变，菌株进行摇瓶发酵5h，目标产物1,5-戊二胺浓度达到63.9g/L(文献来源：期刊:生物加工过程，2015年9月，第13卷第5期)。
南京工业大学齐雁斌等利用大肠杆菌AST1以赖氨酸发酵液作为底物进行全细胞催化生产1,5-戊二胺。在最适条件下2.5g/L菌体浓度可以转化含有123.8g/L赖氨酸的发酵液，得到含有86.18g/L戊二胺的转化(文献来源：期刊：化工进展，2019年第36卷第5期)。
CN107338275A提供了利用副产物二氧化碳自控pH的全细胞催化生产1,5-戊二胺的方法，利用催化副产物CO2自调节全细胞催化液的pH且采用非曝气的方法控制全细胞催化生产戊二胺。CN104762336A披露了一种利用赖氨酸脱羧催化制备1,5-戊二胺的方法，然而其生成的1,5-戊二胺浓度过低。
由此可见，现有生物酶法技术的缺点在于生成的1,5-戊二胺浓度过低，生产成本高，效率低，不适合大规模生产，产量达到不到市场的需求量。
因此，需要开发一种资源可持续利用，对环境友好，污染小，成本低，可大规模生产的技术用于生产1,5-戊二胺。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种L-赖氨酸脱羧酶，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种L-赖氨酸脱羧酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明实施例的一种优选方案，所述L-赖氨酸脱羧酶用于酶催化合成1,5-戊二胺。
本发明实施例的另一目的在于提供一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其包括以下步骤：
将L-赖氨酸盐酸盐与磷酸吡哆醛和L-赖氨酸脱羧酶进行脱羧反应，得到所述1,5-戊二胺；其中，所述L-赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述方法的反应路线如下：
需要说明的是，磷酸吡哆醛(即PLP)作为辅酶，而所述L-赖氨酸脱羧酶可以是纯的游离状态的酶(例如以酶粉的形式使用)，也可以表达所述L-赖氨酸脱羧酶的细胞的形式使用(例如表达所述L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体)。当然，上述L-赖氨酸脱羧酶还可以本领域技术人员所已知的任何其它形式存在，例如表达所述L-赖氨酸脱羧酶的细胞破碎上清液。
作为本发明实施例的另一种优选方案，具体包括以下步骤：
将L-赖氨酸盐酸盐溶解于水中，得到底物溶液；
往底物溶液中添加含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体和磷酸吡哆醛进行脱羧反应，得到所述1,5-戊二胺。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，脱羧反应的温度为25～60℃。
具体的，还可以包括后处理步骤，其中，后处理步骤可包括：将反应液中加入100mL甲醇，加热灭活蛋白，在室温下冷却，然后使用盐酸将pH调到2-3；进行抽滤，得滤液；然后进行减压抽滤到液面有晶体析出时停止；将液体放于室温冷却，加入250mL乙醇，震荡后放于4℃存放过夜；最后进行抽滤去除乙醇和水，固体再用100mL乙醇冲洗，将固体放在50℃烘箱中烘干12h，即得1,5-戊二胺盐酸盐，再加入氢氧化钠水溶液进行游离，然后蒸馏分离出1,5-戊二胺。
进一步优选地，在上述酶法合成1,5-戊二胺的方法中，所述磷酸吡哆醛的浓度为0.1mM～1mM；并且，所述磷酸吡哆醛的浓度进一步优选为0.2mM。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体的制备方法包括以下步骤：
利用所述L-赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列构建重组表达载体；
将所述重组表达载体转化到宿主细胞中，得到重组菌株；
将重组菌株进行诱导表达，得到所述含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述宿主细胞为大肠杆菌；诱导表达的方法包括：
将重组菌株接种至含氯霉素的LB培养基中进行培养后，再接种至TB培养基进行培养，得到培养液；
当培养液的OD 600达到0.6-0.8时，加入诱导剂进行诱导培养，然后经离心，弃上清液，得到所述含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体。
所述含氯霉素的LB培养基的成分包括：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，氯化钠10g/L，氯霉素30μg/mL；并且，所述含氯霉素的LB培养基的pH值为7.0±0.2，其温度为25℃。
更进一步优选地，在上述酶法合成1,5-戊二胺的方法中，所述TB培养基的成分包括：胰蛋白胨12g/L，酵母浸出粉24g/L，磷酸氢二钠9.4g/L，磷酸氢二钾2.2g/L；并且，所述TB培养基的pH值为7.0±0.2，其温度为30℃。
具体的，宿主细胞为大肠杆菌BL21；诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体与磷酸吡哆醛的质量比为(100～1000):1。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体与L-赖氨酸盐酸盐的质量比为1:(40～100)。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述L-赖氨酸盐酸盐的浓度为300～600g/L
本发明实施例提供的一种L-赖氨酸脱羧酶，能够适用于高浓度的L-赖氨酸盐酸盐，L-赖氨酸盐酸盐浓度高达500g/L时，该L-赖氨酸脱羧酶仍然发挥出高效的催化作用。并且，在所述酶法合成1,5-戊二胺的方法中，湿菌体全细胞用量低，pH范围广，反应条件温和，反应中无需添加缓冲液，反应时无需使用盐酸进行PH控制，从而大大简化了采用化学工艺合成1,5-戊二胺的繁琐步骤。另外，本发明相比于现有技术还具有以下有益技术效果：
L-赖氨酸盐酸盐相比于L-赖氨酸，价格低90％。这样制备得到的1,5-戊二胺的成本会下降很多，非常适合大规模生产。同时L-赖氨酸盐酸盐年产量高达10万吨以上，可以保证充足的原料进行生产。
同时，由于该酶法合成1,5-戊二胺的方法所对用的L-赖氨酸盐酸盐浓度高，所生成的1,5-戊二胺浓度能高达280g/L，可知该酶法合成1,5-戊二胺的方法十分适用于大规模生产，所得产物的产率高，且生产效率高。
此外，在该酶法合成1,5-戊二胺的方法中，采用水作为溶剂，未使用有机溶剂，且没有引入其他离子，因此，产品纯化不会受到其他离子的影响，生产废水很少，生产过程绿色环保。其中，湿菌体全细胞用量低，这也很大程度降低了生产成本，为1,5-戊二胺连续生产夯实了基础。
综上所述，本发明所提供的L-赖氨酸脱羧酶和酶法合成1,5-戊二胺的方法适用于大规模工业化生产，生产成本低，效率高，产量大，能够满足市场的需求。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种物种来源于Aliivibrio salmonicida的L-赖氨酸脱羧酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该L-赖氨酸脱羧酶的制备方法包括以下步骤：
S1、利用如SEQ ID NO.1所示的L-赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列构建重组表达载体。
S2、将上述重组表达载体转化到大肠杆菌BL21菌株中，得到重组菌株。
S3、将上述重组菌株接种至装有50mL含氯霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0±0.2，25℃)的250mL锥形瓶中，并置于30℃，250rpm摇床振荡培养过夜，当OD 600达到2时，再按5％(v/v)的接种量接入装有250mL TB培养基(胰蛋白胨12g/L，酵母浸出粉24g/L，磷酸氢二钠9.4g/L，磷酸氢二钾2.2g/L，pH值7.0±0.2，30℃)的1000mL锥形瓶中，并置于30℃，250rpm摇床振摇培养，得到培养液。
S4、当培养液的OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG作为诱导剂，30℃诱导培养20h后，将诱导培养液进行离心处理(8000rpm，10分钟)；离心后弃上清液，收集细胞，即得含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体。
实施例2
该实施例提供了一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其包括以下步骤：
S1、将40gL-赖氨酸盐酸盐溶解于67mL的水中，得到底物溶液，并将底物溶液置于反应瓶中。
S2、称取0.5g上述实施例1制得的含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体于2mL离心管中，同时加入1.5mL水混匀，并用1mL水冲洗离心管后，再加入到上述反应瓶中，然后往反应瓶中加入2mL的10mM磷酸吡哆醛溶液进行脱羧反应，并控制脱羧反应的温度为35℃，以300rpm转速进行搅拌反应24h，得到反应液。
S3、往上述反应液中加入100mL甲醇，加热灭活蛋白，在室温下冷却，然后使用盐酸将pH调到2.5；进行抽滤，得滤液；然后进行减压抽滤到液面有晶体析出时停止；将液体放于室温冷却，加入250mL乙醇，震荡后放于4℃存放过夜；最后进行抽滤去除乙醇和水，固体再用100mL乙醇冲洗，将固体放在50℃烘箱中烘干12h，即得1,5-戊二胺盐酸盐，再加入氢氧化钠水溶液进行游离，然后蒸馏分离出1,5-戊二胺。
实施例3
该实施例提供了一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其包括以下步骤：
S1、将50gL-赖氨酸盐酸盐溶解于60mL的水中，得到底物溶液，并将底物溶液置于反应瓶中。
S2、称取0.5g上述实施例1制得的含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体于2mL离心管中，同时加入1.5mL水混匀，并用1mL水冲洗离心管后，再加入到上述反应瓶中，然后往反应瓶中加入2mL的10mM磷酸吡哆醛溶液进行脱羧反应，并控制脱羧反应的温度为35℃，以300rpm转速进行搅拌反应24h，得到反应液。
S3、往上述反应液中加入100mL甲醇，加热灭活蛋白，在室温下冷却，然后使用盐酸将pH调到2.5；进行抽滤，得滤液；然后进行减压抽滤到液面有晶体析出时停止；将液体放于室温冷却，加入250mL乙醇，震荡后放于4℃存放过夜；最后进行抽滤去除乙醇和水，固体再用100mL乙醇冲洗，将固体放在50℃烘箱中烘干12h，即得1,5-戊二胺盐酸盐，再加入氢氧化钠水溶液进行游离，然后蒸馏分离出1,5-戊二胺。
实施例4
该实施例提供了一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其包括以下步骤：
S1、将50gL-赖氨酸盐酸盐溶解于60mL的水中，得到底物溶液，并将底物溶液置于反应瓶中。
S2、称取0.5g上述实施例1制得的含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体于2mL离心管中，同时加入1.5mL水混匀，并用1mL水冲洗离心管后，再加入到上述反应瓶中，然后往反应瓶中加入2mL的10mM磷酸吡哆醛溶液进行脱羧反应，并控制脱羧反应的温度为50℃，以300rpm转速进行搅拌反应24h，得到反应液。
S3、往上述反应液中加入100mL甲醇，加热灭活蛋白，在室温下冷却，然后使用盐酸将pH调到2.5；进行抽滤，得滤液；然后进行减压抽滤到液面有晶体析出时停止；将液体放于室温冷却，加入250mL乙醇，震荡后放于4℃存放过夜；最后进行抽滤去除乙醇和水，固体再用100mL乙醇冲洗，将固体放在50℃烘箱中烘干12h，即得1,5-戊二胺盐酸盐，再加入氢氧化钠水溶液进行游离，然后蒸馏分离出1,5-戊二胺。
实施例5
该实施例提供了一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其包括以下步骤：
S1、将50gL-赖氨酸盐酸盐溶解于58mL的水中，得到底物溶液，并将底物溶液置于反应瓶中。
S2、称取1.25g上述实施例1制得的含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体于2mL离心管中，同时加入1.5mL水混匀，并用1mL水冲洗离心管后，再加入到上述反应瓶中，然后往反应瓶中加入4mL的10mM磷酸吡哆醛溶液进行脱羧反应，并控制脱羧反应的温度为35℃，以300rpm转速进行搅拌反应12h，得到反应液。
S3、往上述反应液中加入100mL甲醇，加热灭活蛋白，在室温下冷却，然后使用盐酸将pH调到2.5；进行抽滤，得滤液；然后进行减压抽滤到液面有晶体析出时停止；将液体放于室温冷却，加入250mL乙醇，震荡后放于4℃存放过夜；最后进行抽滤去除乙醇和水，固体再用100mL乙醇冲洗，将固体放在50℃烘箱中烘干12h，即得1,5-戊二胺盐酸盐，再加入氢氧化钠水溶液进行游离，然后蒸馏分离出1,5-戊二胺。
实施例6
该实施例提供了一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其包括以下步骤：
S1、将50gL-赖氨酸盐酸盐溶解于50mL的水中，得到底物溶液，并将底物溶液置于反应瓶中。
S2、称取2.5g上述实施例1制得的含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体于15mL离心管中，同时加入2.5mL水混匀，并用2mL水冲洗离心管后，再加入到上述反应瓶中，然后往反应瓶中加入8mL的10mM磷酸吡哆醛溶液进行脱羧反应，并控制脱羧反应的温度为35℃，以300rpm转速进行搅拌反应6h，得到反应液。
S3、往上述反应液中加入100mL甲醇，加热灭活蛋白，在室温下冷却，然后使用盐酸将pH调到2.5；进行抽滤，得滤液；然后进行减压抽滤到液面有晶体析出时停止；将液体放于室温冷却，加入250mL乙醇，震荡后放于4℃存放过夜；最后进行抽滤去除乙醇和水，固体再用100mL乙醇冲洗，将固体放在50℃烘箱中烘干12h，即得1,5-戊二胺盐酸盐，再加入氢氧化钠水溶液进行游离，然后蒸馏分离出1,5-戊二胺。
实施例7
该实施例提供了一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其包括以下步骤：
S1、将50gL-赖氨酸盐酸盐溶解于60mL的水中，得到底物溶液，并将底物溶液置于反应瓶中。
S2、称取0.25g上述实施例1制得的含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体于2mL离心管中，同时加入1.75mL水混匀，并用1mL水冲洗离心管后，再加入到上述反应瓶中，然后往反应瓶中加入1mL的10mM磷酸吡哆醛溶液进行脱羧反应，并控制脱羧反应的温度为35℃，以300rpm转速进行搅拌反应36h，得到反应液。
S3、往上述反应液中加入100mL甲醇，加热灭活蛋白，在室温下冷却，然后使用盐酸将pH调到3；进行抽滤，得滤液；然后进行减压抽滤到液面有晶体析出时停止；将液体放于室温冷却，加入250mL乙醇，震荡后放于4℃存放过夜；最后进行抽滤去除乙醇和水，固体再用100mL乙醇冲洗，将固体放在50℃烘箱中烘干12h，即得1,5-戊二胺盐酸盐，再加入氢氧化钠水溶液进行游离，然后蒸馏分离出1,5-戊二胺。
实施例8
该实施例提供了一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其包括以下步骤：
S1、将50gL-赖氨酸盐酸盐溶解于60mL的水中，得到底物溶液，并将底物溶液置于反应瓶中。
S2、称取0.5g上述实施例1制得的含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体于2mL离心管中，同时加入1.5mL水混匀，并用1mL水冲洗离心管后，再加入到上述反应瓶中，然后往反应瓶中加入2mL的10mM磷酸吡哆醛溶液进行脱羧反应，并控制脱羧反应的温度为25℃，以300rpm转速进行搅拌反应36h，得到反应液。
S3、往上述反应液中加入100mL甲醇，加热灭活蛋白，在室温下冷却，然后使用盐酸将pH调到2；进行抽滤，得滤液；然后进行减压抽滤到液面有晶体析出时停止；将液体放于室温冷却，加入250mL乙醇，震荡后放于4℃存放过夜；最后进行抽滤去除乙醇和水，固体再用100mL乙醇冲洗，将固体放在50℃烘箱中烘干12h，即得1,5-戊二胺盐酸盐，再加入氢氧化钠水溶液进行游离，然后蒸馏分离出1,5-戊二胺。
按照如下分析方法对上述实施例2～实施例8提供的方法的转化率进行测试，其测试结果如表1所示：色谱柱：Chirex 3126(D)-penicillamine，250*4.6mm；流动相：1mM硫酸铜；流速：1.2mL/min；柱温：45℃；检测波长：280nm；进样体积：10μL；L-赖氨酸出峰时间：2.1min；保留时间：5min。
表1
从表1可以看出，本发明实施例提供的L-赖氨酸脱羧酶，能够适用于高浓度的L-赖氨酸盐酸盐，L-赖氨酸盐酸盐浓度高达500g/L时，该L-赖氨酸脱羧酶仍然发挥出高效的催化作用，将其应用于1,5-戊二胺的合成中，可以提高反应转化率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 宁波酶赛生物工程有限公司
<120> L-赖氨酸脱羧酶与酶法合成1，5-戊二胺的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2139
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaacatct tcgccatcct gaaccacagt ggtgttttct ttaaggagga gccggtgcgt 60
gaactgcatg ctagtctgga aaaagccggt tataaggtgg tgtacccggt ggatgcccag 120
gatctttata aaatggtgga gatgaaccct cgtatctgcg gcgtgctgtt tgattgggat 180
aaatacagcc tggacctgtg taccgaaatc aatgtgctga acgagaagct gccgctgtat 240
gcatttgcaa atcagcatag caccctggat atcagcctga ccgatctgcg tctgaatctg 300
catttctttg agtacgccct gggtatggcc gatgatattg cactgaaaat caaccaggca 360
accgaggaat acatcgatca gattatgccg ccgttcacca aagcactgtt taaatacgtg 420
gaggagggca aatacacctt ctgtaccccg ggtcacatgg gcggtacagc atttcagaaa 480
agcccggccg gtagtatttt ctatgacttt tacggtccta acgcattcaa ggccgatgtt 540
agtatcagca tgccggaact gggtagtctg ctggatcata gcggtccgca taaagaagcc 600
gaagaatata tcgcccgcac ctttaatgcc gatagtagct atatcgtgac caacggtacc 660
agcaccagta ataagatcgt gggtatgttc agcgccccgg caggtagcac cgtgctggtg 720
gaccgtaatt gtcataaaag cctgacccac atgatgatga tgagcgatgt taccccgatc 780
tacttccgcc cgaccagaaa tgcatacggt attctgggtg gcatcccgca gagcgaattc 840
actcgtgaag tgattgaggc caaggttgct gcaaccccga atgcaaccat gccgggttat 900
gccgttatta ccaatagcac ctacgacggt ctgctgtata acacccagta tatcaaggag 960
accctggata ccaagttcat ccatttcgac agcgcatggg ttccgtatac caattttaac 1020
agcatctacg agggtaaatg cggcatgagt ggtgaagcaa tgccgggtaa agttttctac 1080
gagacccaga gtacccacaa actgctggca gcctttagtc aggccagtat gattcatgtg 1140
aagggcgaat tcgacaagga gagctttaac gaagcgttca tgatgcacac cagcaccagc 1200
cctcagtatg gtattgtggc cagcaccgaa attgcagccg ccatgatgcg cggtaatacc 1260
ggtaaaaaac tgatccagga cagcatcgac cgtgcaattc gctttcgtaa agagatcaag 1320
cgcctggaaa gcgaaagtga tagctggttt ttcgacgtgt ggcagccgga aaatatcgat 1380
accaccgaat gttggaagct ggatccgaaa gatacctggc atggttttaa ggacatcgac 1440
gatgaccaca tgtacctgga tccgattaag gttaccctgc tgaccccggg tatgaatgaa 1500
aatagtgaga tgagcgagac cggcattccg gcaagtattg tggccaaata tctggatgag 1560
cacggcattg ttgtggaaaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt tagtatcggt 1620
atcgacaaga gcaaggcgat gcagctgctg cgtgctttaa ccgattttaa gcgtggctac 1680
gacctgaatc tgaccgttaa aaacttcctg ccgagcctgt ataacgagga tccgagcttt 1740
tacgagggta tgcgtattca ggagctggca cagggcattc atgatctgac ccgtcagtat 1800
cgcctgccgg aattaatgtt taaggcgttt gacgtgctgc cggaactgaa agttaccccg 1860
catgcagcat ggcaggaaga actgcgtggc aatgttgaag aagtgaagct ggaagagatg 1920
gtgggtcgtg tgagtgcaaa tatgatcctg ccgtatccgc cgggcgttcc tttagttctg 1980
ccgggtgaaa tggttaccac cgaaagtcgc ccggttctgg attttctgga aatgctgtgc 2040
gcaatcggcg cccattatcc gggttttgaa accgatatcc acggcgttta cgcccagaaa 2100
gatggtagct ataccgtgaa agtgctgaag gaagactaa 2139
Claims (10)
1.一种L-赖氨酸脱羧酶，其特征在于，所述L-赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种L-赖氨酸脱羧酶，其特征在于，所述L-赖氨酸脱羧酶用于酶催化合成1,5-戊二胺。
3.一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将L-赖氨酸盐酸盐与磷酸吡哆醛和L-赖氨酸脱羧酶进行脱羧反应，得到所述1,5-戊二胺；其中，所述L-赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
将L-赖氨酸盐酸盐溶解于水中，得到底物溶液；
往底物溶液中添加含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体和磷酸吡哆醛进行脱羧反应，得到所述1,5-戊二胺。
5.根据权利要求4所述的一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述步骤中，脱羧反应的温度为25～60℃。
6.根据权利要求4所述的一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体的制备方法包括以下步骤：
利用所述L-赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列构建重组表达载体；
将所述重组表达载体转化到宿主细胞中，得到重组菌株；
将重组菌株进行诱导表达，得到所述含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体。
7.根据权利要求6所述的一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌；诱导表达的方法包括：
将重组菌株接种至含氯霉素的LB培养基中进行培养后，再接种至TB培养基进行培养，得到培养液；
当培养液的OD 600达到0.6-0.8时，加入诱导剂进行诱导培养，然后经离心，弃上清液，得到所述含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体。
8.根据权利要求4～7中任一项所述的一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体与磷酸吡哆醛的质量比为(100～1000):1。
9.根据权利要求4～7中任一项所述的一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述含有L-赖氨酸脱羧酶的湿菌体与L-赖氨酸盐酸盐的质量比为1:(40～200)。
10.根据权利要求9所述的一种酶法合成1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述L-赖氨酸盐酸盐的浓度为300～600g/L。
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