KR20170017341A

KR20170017341A - 라이신 디카르복실라아제의 변이주 개발 방법 및 그의 응용

Info

Publication number: KR20170017341A
Application number: KR1020150111115A
Authority: KR
Inventors: 김병기; 홍은영
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2015-08-06
Publication date: 2017-02-15
Also published as: CN108138160B; CN108138160A; US10676732B2; WO2017022944A1; KR101791837B1; US20180291362A1

Abstract

본 발명은 라이신 탈탄산 효소의 변이주의 생성방법과 변이주의 특성, 상기 라이신 탈탄산 효소의 변이주를 암호화하는 유전자 및 이들을 이용한 카다버린의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명은 단백질 공학적 변이를 통해 개량된 대장균 유래의 라이신 탈탄산 효소를 제공한다. 또한 본 발명의 변이주 라이신 탈탄산 효소는 카다버린 생산 시 활성 증가 및 pH 안정성, 열안정성을 증가하여 수율 및 생산성 증대로 인한 생산 비용 절감을 제공한다.

Description

라이신 디카르복실라아제의 변이주 개발 방법 및 그의 응용{METHOD FOR PRODUCING LYSINE DECARBOXYLASE MUTANTS AND THEIR APPLICATIONS}

본 발명은 단백질 공학적 효소변이를 통한 라이신 탈탄산 효소의 변이주 개발 방법 및 생성된 변이주의의 특성 분석과, 상기 변이주 효소를 이용하여 생변환 반응을 하는 것에 관한 발명이다.

석유 자원이 계속적으로 고갈되는 시점에서 고분자 전구체를 석유자원이 아닌 바이오 물질에서부터 합성하는 연구가 최근 활발히 진행되고 있다. 특히 양 말단에 두 개의 아민기를 가지고 있으며 다섯 개의 탄소로 이루어진 카다버린 (cadaverine; 1,5-diaminopentane)은 고분자 전구체로의 이용뿐 아니라 화학 산업 분야에 많은 응용이 가능한 물질이다. 폴리 아마이드, 폴리우레탄, 킬레이트 시약 등이 그 예이다. 그 일환으로 최근 라이신으로부터 카다버린을 합성하는 연구나, 라이신보다 더 비용이 저렴한 포도당이나 녹말에서부터 미생물 세포의 생변환 기능을 이용해 카다버린을 대량으로 생산하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이렇듯 숙주의 유전자 변이를 통해 생변환 기술로 카다버린을 대량 생산하기 위한 여러 가지 방법들이 있겠지만, 시작 물질을 녹말 혹은 포도당으로 하여 여러 단계의 생변환 과정을 거쳐 라이신 합성이 가능하고, 이 라이신은 다양한 반응을 통해 다른 화합물로 변환이 가능하기에, 주요한 출발물질로 사용된다. 그의 일 예가 탈탄산반응이고 라이신 탈탄산효소 반응에 의해 카다버린을 합성할 수 있다. 미생물 내에서 포도당에서부터 라이신을 생산하는 기술은 이미 코리네박테리움 글루타미컴(corynebacterium glutamicum) 숙주에서 약 120 g/L 수준으로 생산이 가능하며 이는 상업적으로도 대량 생산이 되고 있는 실정이다. 따라서 이러한 고농도의 라이신을 기질로 세포 내에서 다양한 화합물로 변환시키거나, 시험관에서 한 단계(one-step) 반응으로 더 효율적으로 카다버린으로 전환시킬 수 있는 기술이 필요하다.

라이신 탈탄산효소의 경우 코리네박테리움 글루타미컴(corynebacterium glutamicum) 내에는 존재 하지 않지만, 다양한 유래의 미생물에서 이를 보유하고 있는 것으로 알려졌다. 그 중 특히 PLP (pyridoxal-5'-phosphate) 조효소를 이용하는 대장균(Escherichia coli) 유래의 라이신 탈탄산효소가 반응성이 높은 것으로 알려져 있다. 대장균에는 세포 성장시 계속적으로 발현이 되는 LdcC 라이신 탈탄산 효소와 약산성의 pH의 조건에서만 유도발현이 되는 LdcI 라이신 탈탄산 효소, 이렇게 두 가지 종류가 존재한다. 캐나다 토론토 대학의 Houry 연구팀에서는 대장균 유래의 LdcI 라이신 탈탄산 효소의 구조를 밝힌 바 있고 효소가 10개의 단위로 이루어진 데카머(decamer) 형태를 이루고 있다는 것을 밝혔다. 라이신 탈탄산 효소의 밝혀진 구조 및 아미노산 잔기들의 변이를 통해 효소 활성에 영향을 미치는 중요한 요소는 무엇인지, 또한 반응의 메커니즘이 어떤지 예측할 수 있게 되었다.

활성이 비교적 높은 대장균 유래의 라이신 탈탄산 효소 LdcI 의 경우 고농도의 산업적 반응에 이용되기에는 몇 가지 단점이 있다. 약산성의 조건 (pH5.6)일 때는 활성이 높지만 중성이나 염기성의 조건에는 활성을 급격하게 잃는다는 단점이 있기 때문에, 고농도 및 장시간의 반복적 반응을 수행하기 위해서는 LdcI 효소의 pH 및 열 안정 증대, 보다 높은 효소 활성이 요구된다. 이와 같은 이유로 효소의 구조적 연구를 통해 전반적인 pH에 걸친 효소 반응성을 향상시키고, 열 및 pH 안정성이 증대된 변이주를 개발하여 이들을 고농도 및 연속적인 라이신 생변환 반응에 응용할 필요성이 있다.

한국 특허 공개 10-2012-0021491 한국 특허 공개 10-2014-0012099

박테리아의 산성 스트레스와 그 반응: 유도가능한 라이신 탈탄산효소의 구조, EMBO J. 2011 Mar 2;30(5):931-44 pH 변화에 의한 N-말단 구조 관찰에 의한 에스케르케아 콜라이 유래의 글루타메이트 탈탄산 효소 B의 열안정성 증가, J Biotechnol. 2014 Mar 20;174:22-8

종래 기술의 경우, 라이신으로부터 카다버린을 생성하는 것에 있어서는 대장균 내에서 과발현이 가능하고, 활성이 높은 대장균 유래의 LdcI 라이신 탈탄산 효소를 이용하는 사례가 대부분이다. 또한 비록 활성은 낮지만 LdcC 도 LdcI 와 함께 발현하여 이를 카다버린 생산에 함께 이용하는 등의 연구가 진행되었다.

이전 특허와 연구들의 경우, 카다버린 생산을 증가시키기 위해 숙주 세포 내에서 효소의 발현을 조절하거나 라이신과 카다버린이 세포 밖으로 방출이 용이하도록 역수송체를 과발현 하거나 카다버린을 분해하는 경로를 차단하는 방법 등을 사용하여 효소 이외의 생산경로의 다른 부분들을 변화시켜 라이신으로부터 카다버린 생산을 극대화 하려는 간접적 유전자 변이를 진행하였다. 이런 연구들은 세포를 이용한 라이신 생변환에는 유용하게 이용될 수 있으나, 세포 외 시험관 내지는 반응기에서의 생변환 반응에 이용하기에는 한계가 있다. 이와 같이 세포 외 시험관 내지는 반응기에서의 생변환 반응에 이용하기 위해서는 직접적으로 라이신 탈탄산 효소의 안전성 및 효소 활성을 증대하는 방법이 효율적이다. 이를 위해서 반응의 메카니즘을 이해하고 활성에 중요한 잔기들의 변이를 통해 활성의 현저한 증감을 도모할 수 있는 연구가 진행 되었다. 하지만 아직까지 라이신 탈탄산 효소 자체에 직접적인 변이를 주어 대장균의 LdcI 및 LdcC 효소가 가지고 있는 구조적 및 안정성의 단점을 극복하고, 활성을 증가시켜 고농도 및 장시간 연속반응 등에 이용한 연구는 보고된 바가 없다.

라이신에서 카다버린으로 생변환하는 반응에 있어, 가장 먼저 고려해야 할 사항은 반응의 pH 이다. 반응의 메카니즘상, 라이신의 카르복실기가 떨어지면서 반응액의 수소이온을 소모하기 때문에, 반응액의 pH 는 반응이 진행 될수록 더욱 염기성으로 변하게 되므로, 효소가 pH 에 민감한 경우 많은 활성을 소실 하게 되고, 고농도 장시간 반응을 위해서는 넓은 pH 영역에 걸쳐 효소의 활성이 유지 되어야 한다.

대장균 라이신 탈탄산 효소의 경우 LdcC와 LdcI 두 개가 보고 되어 있는데 이들이 가지고 있는 특징이 다르다. LdcC의 경우는 LdcI 에 비하면 세포 성장시 항상 발현되는 효소로서 상대적인 활성 및 발현 정도가 낮은 편이나, 전반적으로 넓은 pH 영역에 걸쳐 그 활성을 유지한다. 그러나 LdcI 의 경우는 pH 5.6 근처에서 높은 활성을 보이고, 반응액이 pH 7.0 이상 일 때는 그 활성이 급격하게 감소하며 알칼리성 조건에서는 현저한 활성 감소가 관찰된다. 물론 LdcI 가 LdcC에 비해 비활성이 높은 편에 속하는 효소 이기 때문에 고농도 반응에는 유리하나, LdcI 가 산업적인 고농도 및 장시간 연속사용 반응을 진행하기 위하여서는 pH 안정성, 열 안정, 및 보다 높은 효소 활성이 요구된다.

본 발명은 라이신 탈탄산 효소의 단백질 공학적 변이를 통한 변이주 생성 방법과 생성된 변이주의 탐색 및 이들 변이주를 암호화하는 유전자 서열정보를 제공한다.

또한, 이들 변이주의 특성을 분석하고 이들을 이용하여 카다버린을 생성하는 것을 제공한다. 즉, 본 발명은 단백질 공학적 변이를 통해 개량된 대장균 유래의 라이신 탈탄산효소를 이용하여 카다버린 생산 반응에 적용하는 것이다.

또한, 본 발명은 라이신 탈탄산효소 변이주를 생성하기 위한 논리적 예측 방법을 제공함으로써 단백질의 목적이 되는 부분을 선택하고 단백질의 서열, 구조와 기능 및 컴퓨터 프로그램을 이용하여 특정 아미노산의 잔기를 선택하여 변이를 수행하는 것을 말한다.

또한, 본 발명은 라이신 탈탄산효소의 아미노산 잔기가 변화한 서열을 포함하는 라이신 탈탄산 효소 유전자 및 이를 포함하는 재조합 DNA 벡터, 그리고 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 촉매 기능이 향상된 라이신 탈탄산 효소의 변이주 사용을 통해 카다버린 생산성 및 생산 효율을 증대시켜, 생산 비용을 절감할 수 있다.

또한, pH 4 내지 10 에서의 효소 pH 안정성을 증대시키고, 20℃ 내지 70℃의 온도에서의 효소 열안정성을 증대시켜, 카다버린의 대량생산에 있어 라이신 탈탄산 효소의 재사용 가능성을 높이고 효소 생산 비용을 절감할 수 있다.

또한, 상기 카다버린의 대량생산을 통해 고분자 전구체, 식품, 화학 첨가제 등의 다양한 활용이 가능하며, 본 발명의 변이주 생성 방법을 통해 다른 탈탄산 효소, 특히 PLP 조효소를 사용하는 탈탄산효소에 적용할 수 있다.

도 1 은 본 발명에서 L-라이신을 기질로 하여 라이신 탈탄산 효소를 이용한 카다버린 합성 도식도를 나타낸다.
도 2 는 서열번호 15 로 나타낸 야생형(WT) 라이신 탈탄산 효소 LdcI 의 단일 아미노산과, 이의 변이주의 상대적인 고유 활성도 (relative specific activity)를 나타낸다.
도 3 은 본 발명에서 라이신 탈탄산 효소의 단일 아미노산의 변화 및 이들의 조합적 변이주의 단백질의 융점 온도 (Tm)를 나타낸다.
도 4 는 정제된 야생형 라이신 탈탄산 효소 LdcI 와 정제된 LdcI 의 14 번째의 페닐알라닌(phenylalanine)이 타이로신으로 치환된 변이주를 다양한 pH 용액 (pH 4.4, 5.6, 6.6, 7.6, 8.5 또는 9.6)에 담근 후, 그 활성이 얼마나 남아있는가를 비교한 도면이다. 모든 값은 상대적인 고유 활성도를 나타낸다.
도 5 는 정제된 야생형 라이신 탈탄산 효소 LdcI 와 정제된 LdcI 의 14 번째의 페닐알라닌이 타이로신으로 치환된 변이주를 55℃에 보관 후, 시간 마다 그 상대적인 활성이 얼마나 감소하였는가를 비교한 도면이다. 모든 값은 상대적인 고유 활성도를 나타낸다.
도 6 은 야생형 라이신 탈탄산 효소 LdcI 와 LdcI 의 14 번째의 페닐알라닌이 시스테인(cysteine)으로 치환되고, 44 번째의 라이신(lysine)이 시스테인으로 치환된 변이주에 환원력을 주었을 때와 주지 않았을 때 단백질 크기를 SDS PAGE로 확인하여 크기의 변화를 나타낸다.
도 7 은 정제된 야생형 라이신 탈탄산 효소 LdcI 와 정제된 LdcI 의 14 번째의 페닐알라닌이 시스테인으로 치환되고, 44 번째의 라이신이 시스테인으로 치환된 변이주를 염기성 pH 용액 (pH 8, 9 또는 10)에 담근 후, 그 활성이 얼마나 남아있는가를 비교한 도면이다. 모든 값은 상대적인 고유 활성도를 나타낸다.
도 8 은 정제된 야생형 라이신 탈탄산 효소 LdcI 와 정제된 LdcI 의 14 번째의 페닐알라닌이 시스테인으로 치환되고, 44 번째의 라이신이 시스테인으로 치환된 변이주를 60℃에 보관 후, 시간 마다 그 상대적인 활성이 얼마나 감소하였는가를 비교한 도면이다. 모든 값은 상대적인 고유 활성도를 나타낸다.
도 9 는 본 발명에서 이용한 에스케르치아 콜라이(대장균) 유래의 라이신 탈탄산효소의 야생형 LdcI 및 변이주의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 9 의 LdcI 는 야생형 LdcI 의 아미노산 서열이고 (서열 번호 15), (a)는 F14Y (서열번호 15 에서 14 번째의 페닐알라닌이 타이로신으로 치환)의 아미노산 서열이며 (서열번호 1), (b)는 L7M (서열번호 15 에서 7 번째의 루신이 메티오닌으로 치환)의 아미노산 서열이고 (서열번호 2), (c)는 N8G (서열번호 15 에서 8 번째의 아스파라긴이 글라이신으로 치환)의 아미노산 서열이며 (서열번호 3), (d)는 L7M (서열번호 15 에서 7 번째의 루신이 메티오닌으로 치환) 및 N8G (서열번호 15 에서 8 번째의 아스파라긴이 글라이신으로 치환) 의 조합적 아미노산 서열이고 (서열번호 4), (e)는 L7M (서열번호 15 에서 7 번째의 루신이 메티오닌으로 치환), N8G (서열번호 15 에서 8 번째의 아스파라긴이 글라이신으로 치환) 및 F14Y (서열번호 15 에서 14 번째의 페닐알라닌이 타이로신으로 치환)의 조합적 아미노산 서열이며 (서열번호 5), (f)는 F14C (서열번호 15 에서 14 번째의 페닐알라닌이 시스테인으로 치환) 및 K44C (서열번호 15 에서 44 번째의 라이신이 시스테인으로 치환)의 조합적 아미노산 서열이고 (서열번호 6), (g)는 L7M (서열번호 15 에서 7 번째의 루신이 메티오닌으로 치환), N8G (서열번호 15 에서 8 번째의 아스파라긴이 글라이신으로 치환), F14C (서열번호 15 에서 14 번째의 페닐알라닌이 시스테인으로 치환) 및 K44C (서열번호 15 에서 44 번째의 라이신이 시스테인으로 치환)의 조합적 아미노산 서열이다(서열번호 7).
도 10 은 서열번호 1 내지 7 의 아미노산 서열의 DNA 를 각각 나타낸 도이다. 구체적으로는, 도 10 의 (a) 는 서열번호 1 의 아미노산을 암호화 하는 DNA 서열이고(서열번호 8), (b) 는 서열번호 2 의 아미노산을 암호화 하는 DNA 서열이며(서열번호 9), (c) 는 서열번호 3 의 아미노산을 암호화 하는 DNA 서열이고(서열번호 10), (d) 는 서열번호 4 의 아미노산을 암호화 하는 DNA 서열이며(서열번호 11), (e) 는 서열번호 5 의 아미노산을 암호화 하는 DNA 서열이고(서열번호 12), (f) 는 서열번호 6 의 아미노산을 암호화 하는 DNA 서열이며(서열번호 13), (g) 는 서열번호 7 의 아미노산을 암호화 하는 DNA 서열이다(서열번호 14).

본 발명에서 사용되는 용어는 라이신과 관련한 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것으로, 당해 기술분야의 통상의 기술자라면 그 의미를 누구나 이해할 수 있을 것이나, 본 명세서에서 간략히 설명하면 다음과 같다:

(1) 라이신 탈탄산 효소는 라이신에서 카르복시기를 제거하는 효소를 의미한다.

(2) 라이신 탈탄산 효소 반응에 첨가되는 PLP (pyridoxal-5'-phosphate) 는 반응에 필수적으로 사용되는 효소의 조효소이다.

(3) 세포추출물은 라이신 탈탄산 효소가 발현된 본 발명의 미생물 추출물을 의미한다.

(4) 전세포 반응은 특정 효소를 포함하는 세포를 파쇄하여 세포 내용물을 이용하거나 또는 효소를 분리 정제하지 않고 온전한 세포 전체를 이용한 반응을 의미한다.

(5) 친수성 (hydrophilic) 아미노산은 물과 수소결합을 이룰 수 있는 전기음성도가 큰 원자 (산소, 질소, 황)를 기능기 (functional group)에 포함하고 있는 아미노산을 말하며, 세린 (serine), 트레오닌 (threonine), 시스테인 (cystein), 타이로신 (tyrosine), 아스파르트산 (aspartic acid), 글루탐산 (glutamic acid), 아스파라긴 (asparagine), 글루타민 (glutamine), 히스티딘 (histidine), 라이신 (lysine), 아르기닌 (arginine)을 포함한다.

(6) 소수성 (hydrophobic) 아미노산은 물과 수소결합을 이룰 수 있는 전기음성도가 큰 원자 (산소, 질소, 황)를 기능기 (functional group)에 포함하지 않고 있는 아미노산을 말하며, 발린 (valine), 루신 (leucine), 아이소루신 (isoleucine), 메티오닌 (methionine), 페닐알라닌 (phenylalanine)을 포함한다.

(7) PCR은 중합 효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)으로서, DNA의 어떤 영역을 특이적으로 증폭시키는 방법을 의미한다.

(8) 위치지정 돌연변이 (site directed mutagenesis)는 유전자의 지정된 위치에 지정된 염기배열의 변화를 도입하는 것을 말한다.

(9) 포화 변이 (saturation mutagenesis)는 유전자의 지정된 위치에 다양한 염기배열의 변화를 도입하는 것을 말한다. 포화 변이는 주형가닥에 결합하는 상보적인 서열의 프라이머 (primer)상에 변이시키고자 하는 서열대신 NNK 코돈 (codon)을 삽입하여 PCR을 통해 변이를 삽입시키는 것을 말한다. 이 때, NNK 코돈에서 N은 뉴클레오디드의 A, T, G, C를 의미하며 K는 T, G를 의미한다.

(10) 벡터는 단일가닥, 이중가닥, 원형 또는 초나선 DNA 또는 RNA로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 재조합 단백질을 생산할 수 있도록 적절한 거리에 작동적으로 연결되어 있는 구성요소들을 포함할 수 있다.

이러한 구성요소에는 복제 오리진, 프로모터, 인핸서, 5’mRNA 리더 서열, 리보솜 결합부위, 핵산 카세트, 종결 및 폴리아데닐화 부위, 또는 선별 가능한 표지 서식 등이 포함될 수 있으며, 상기 구성요소들은 특이적인 용도에 따라, 하나 또는 그 이상이 빠질 수도 있다. 핵산 카세트는 발현할 재조합 단백질의 삽입을 위한 제한효소 부위를 포함할 수 있다. 기능적 벡터에 있어서, 핵산 카세트는 번역 개시 및 종결 부위를 포함하는 발현될 핵산 서열을 함유하며, 필요에 따라 벡터에 내에 두 종류의 카세트를 삽입할 수 있는 벡터를 사용하기도 하며 상기 언급한 기능들이 부가적으로 서열화 될 수 있다.

재조합 벡터에 삽입된 유전자는 발현용 대장균 균주 BW25113(DE3), BL21(DE3) 등을 사용할 수 있으나, 삽입된 벡터의 종류에 따라 달라질 수 있다. 이러한 벡터 및 발현 균주는 본 기술분야의 통상의 기술자라면 용이하게 선택할 수 있다.

(11) 다이설파이드 결합(disulfide bond)은 두 개의 SH기가 산화(oxidation)되어 생성하는 -S-S- 형태의 황 원소 사이의 공유 결합이다.

(12) 환원성과 비환원성 SDS PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)는 단백질에 환원성을 주었을 때와 주지 않았을 때 단백질의 크기를 비교를 의미한다. 두 개의 SH기가 산화(oxidation)되어 생성하는 -S-S- 형태의 황 원소 사이의 공유 결합을 형성하는지 확인할 수 있다.

(13) pH 지시약 (pH indicator)은 적정을 하면서 중화점을 알기 위해, 혹은 수소이온의 농도를 알기 위해서 주로 사용되는 것을 말한다. 지시약은 수소이온 지수에 따라 산형 및 염기형으로 되어 색조가 다르며 이 영역을 변색영역이라 부른다. 분광광도법에 의해 흡광도에 따른 수소 이온의 농도를 측정할 수 있다.

(14) 고유 활성도 (specific activity)는 효소정제를 통해 불순물 및 다른 단백질을 제거한 순수한 단백질의 단위량당 활성을 나타내는 것으로 보통 1분간에 1 μmol의 기질 변화를 촉매하는 효소의 양을 1단위로 하여 1mg당 단위수로 표시한다.

(15) 상대적인 고유 활성도 (relative specific activity)는 고유 활성도의 상대적인 비교 값을 의미한다.

(16) 단백질의 융점 온도 (Tm)은 단백질의 열안정성을 나타내며 단백질의 구조가 풀리는 온도를 의미한다.

(17) 서열 정렬 (sequence alignment) 은 단백질의 서열을 다이내믹 프로그래밍 기반의 컴퓨터 스트링 정렬 알고리즘을 이용하여 배열하는 것을 말한다.

(18) 상동성이 다른 서열이란 서열이 다른 두 단백질을 비교하기 위하여 서열 정렬 하였을 때 서열이 일치 하지 않는 부분을 의미한다

본 발명에서는, 하기의 염기서열 중 어느 하나의 서열로 표시되는 라이신 탈탄산 효소의 변이체를 제공한다:

서열번호 15 (LdcI)의 아미노산 서열에서, 14 번째의 아미노산인 페닐알라닌이 타이로신으로 치환된 (F14Y), 서열번호 1 의 아미노산 서열;

서열번호 15 (LdcI)의 아미노산 서열에서, 7 번째의 아미노산인 루신이 메티오닌으로 치환되고, 8 번째의 아미노산인 아스파라긴이 글라이신으로 치환된 (L7M/N8G), 서열번호 4 의 아미노산 서열;

서열번호 15 (LdcI)의 아미노산 서열에서, 7 번째의 아미노산인 루신이 메티오닌으로 치환되고, 8 번째의 아미노산인 아스파라긴이 글라이신으로 치환되고, 14 번째의 아미노산인 페닐알라닌이 타이로신으로 치환된 (L7M/N8G/F14Y), 서열번호 5 의 아미노산 서열;

서열번호 15 (LdcI)의 아미노산 서열에서, 14 번째의 아미노산인 페닐알라닌이 시스테인으로 치환되고, 44번째의 라이신이 시스테인으로 치환된 (F14C/K44C), 서열번호 6 의 아미노산 서열;

서열번호 15 (LdcI)의 아미노산 서열에서, 7 번째의 아미노산인 루신이 메티오닌으로 치환되고, 8 번째의 아미노산인 아스파라긴이 글라이신으로 치환되고, 14 번째의 아미노산인 페닐알라닌이 시스테인으로 치환되고, 44번째의 라이신이 시스테인으로 치환된 (L7M/N8G/F14C/K44C), 서열번호 7 의 아미노산 서열.

상기 아미노산 서열은, 라이신 탈탄산 효소의 활성을 저하시키지 않는 범위에서 90% 이상의 상동성을 가질 수 있으며, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

본 발명은 본 발명의 라이신 탈탄산 효소의 변이체를 암호화하는 DNA를 제공한다.

상기 DNA는 본 발명에서 제공하는 아미노산을 암호화하는 DNA에 해당하면 제한 없이 사용될 수 있으며, 상기 DNA를 최적화 시켜 얻은 서열을 포함하고, 상기 DNA는 바람직하게는, 서열번호 8 및 11 내지 14 의 서열 중 어느 하나의 서열로 표시되는 DNA 서열일 수 있다.

상기 서열번호 8 의 DNA 서열은 서열번호 1 의 아미노산을 암호화하는 서열이고, 상기 서열번호 11 의 DNA 서열은 서열번호 4 의 아미노산을 암호화하는 서열이며, 상기 서열번호 12 의 DNA 서열은 서열번호 5 의 아미노산을 암호화하는 서열이고, 상기 서열번호 13 의 DNA 서열은 서열번호 6 의 아미노산을 암호화하는 서열이며, 상기 서열번호 14 의 DNA 서열은 서열번호 7 의 아미노산을 암호화하는 서열이다.

본 발명은 상기 DNA를 포함하는 재조합 DNA 벡터, 상기 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포, 및 숙주세포의 추출물을 제공한다.

상기 벡터, 숙주세포는 당업자가 용이하게 선택할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 라이신 탈탄산 효소는 pH 4 내지 10 에서의 pH 안정성이 증대되며, 특히 pH 4.4 내지 8.5 에서 현저하게 증대된 pH 안정성을 갖는다.

또한 본 발명의 라이신 탈탄산 효소는 20℃ 내지 70℃의 온도 안정성이 증대되며, 특히 35℃ 내지 70℃의 온도 안정성이 증대된다.

본 발명은 상기 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포의 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 생촉매로 사용한 카다버린의 생산 방법을 제공한다.

상기 생산 방법은, 녹말, 포도당 또는 라이신으로부터 카다버린을 생산할 수 있으며, 바람직하게는, 포도당 또는 라이신으로부터 카다버린을 생산할 수 있다. 녹말 또는 포도당으로부터 카다버린을 생산하는 경우, 녹말 또는 포도당을 여러 단계의 생변환 과정을 거쳐 라이신으로 합성할 수 있고, 합성된 라이신을 탈탄산반응을 수행하여 카다버린을 생산할 수 있다. 녹말 또는 포도당을 라이신으로 합성하는 방법은, 당업자가 용이하게 당업자가 용이하게 선택할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다.

또한, 상기 생산방법은 고농도의 라이신을 기질로 하여, 카다버린을 생산할 수 있다. 바람직한 라이신의 농도는, 1M 내지 6M 이고, 보다 바람직하게는 1M 내지 3 M 이다.

본 발명은 서열번호 15 (LdcI)의 7, 8, 14 또는 44 번째 아미노산 잔기의 단일 혹은 조합적으로 치환 혹은 치환한 라이신 탈탄산 효소 변이주의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 서열번호 15 (LdcI)의 데카머의 인터페이스에 다이설파이드 결합을 만들 수 있도록, 잔기의 서열을 조합적으로 치환한 라이신 탈탄산 효소 변이주의 제조방법을 제공한다.

상기 데카머의 인터페이스에서 인터페이스는, 10개의 단백질이 모여 데카머를 이룰 때 서로 맞닿는 표면을 의미한다.

본 발명은 서열번호 15 (LdcI) 의 데카머의 인터페이스 8 Å 내에 위치하는 잔기를 단일 혹은 조합적으로 치환한 라이신 탈탄산 효소 변이주의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은 구체적으로, 라이신 탈탄산 효소의 결정 구조의 데카머 인터페이스 부분인 서열 번호 7 번 내지 50 번으로부터 4 내지 6 Å 이내에서 선택된 잔기 중에서, 다수 서열을 통해 포화변이 혹은 다이설파이드 결합을 수행할 기능적 잔기를 변이하는 방법을 의미한다

본 발명에서, 라이신 탈탄산효소의 기능적 잔기에 대한 포화 변이 수행은, 라이신 탈탄산 효소의 선택된 기능적 잔기들에 대해 NNK 코돈을 사용하여 PCR 을 통해 포화 변이를 수행 하거나, 다이설파이드 결합을 위한 시스테인 코돈을 사용하여 PCR을 통해 위치지정 돌연변이를 수행하여 할 수 있다.

본 발명에서, 라이신 탈탄산효소의 변이주 탐색은, 변이주 라이브러리에 대해 pH 지시약을 이용한 비색법을 통해 스크리닝을 수행하여 할 수 있다. 1 차 스크리닝은 전세포 반응을 통해 진행될 수 있으며, 구체적으로는, 지시약이 묻어있는 종이를 준비한 후, 다양한 변이주 라이브러리 세포를 지시약이 묻어있는 종이와 접합시켜 색이 야생형과 비교해 비슷하거나 더 빠르게 변하는 변이주들을 가시적으로 선택할 수 있다. 바람직하게는, 보다 정확한 변이주 탐색을 위하여 2 차 스크리닝을 진행할 수 있으며, 2 차 스크리닝은, 1 차 스크리닝에서 선택된 변이주들에 대해 배양 부피를 증가시켜 배양한 이후, 세포 추출물을 이용하여 초기반응 속도를 야생형과 비교하여 더 빠른 흡광도 변화를 보이는 변이주들을 분광흡광도를 사용하여 선별할 수 있다.

[실시예]

본 발명의 구체적인 방법을 실시예로서 상세히 설명하나, 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

pH 지시약을 이용한 효소 활성 분석 방법

라이신 탈탄산 효소의 비색법(colorimetric method)을 통한 활성 측정은 라이신의 카르복시기가 떨어지면서 그 위치에 수소가 붙게 되는데 그 때 pH의 변화를 측정하는 방법으로서 카다버린의 생산성과 비례한다.

본 발명에서는 라이신 탈탄산 효소의 최적 활성 pH 에 의해 pH 지시약을 선정하여 사용하였다. 효소 활성 분석은 4 mM 라이신과 0.2 mM PLP, 0.02 mM pH 지시약을 5 mM 시트릭산(Sodium-Citrate) 완충용액에 섞어 총 200 uL 부피로 96-정(well) 플레이트에서 진행하였다. 반응은 30분간 진행하였으며, 크레졸 퍼플(Cresol purple)의 경우 보라색으로 변하는 590 nm 에서의 흡광도의 증가를 30초의 간격을 두고 스펙트럼 기계를 이용하여 분석하였다. 발생되는 수소이온의 농도는 수산화 나트륨(NaOH)의 농도에 따른 검정곡선에 의해 계산되었다. 효소 반응은 전체 반응 부피의 10% 의 효소를 이용하였으며, 효소에 기질 혼합물을 넣음과 함께 시작되었다. 효소 활성(Unit)은 상온에서 분당 탈탄산화 반응이 되는 동안 발생하는 1 umole의 수소가 소모되는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

포화 변이 수행 및 비색법을 이용한 변이주 탐색 방법

라이신 탈탄산 효소의 아미노산 위치 14 에 해당하는 서열을 무작위로 치환한 NNK 서열 (N은 A, C, G 또는 T이고, K는 G 또는 T인 서열)이 도입된 프라이머를 이용하여 벡터 전체를 PCR하여 라이브러리를 구축하였다. 본 발명의 라이신 탈탄산 효소는 첫 메티오닌 서열부터 헤아릴 경우 메티오닌이 1 번이 된다. 벡터 서열을 포함한 라이신 탈탄산 효소의 증폭된 유전자는 본래의 플라스미드(plasmid)를 제거하기 위해 DpnⅠ효소 처리 후, 대장균 DH5α에 형질전환을 시켰다. 발생된 모든 콜로니 (colony)로부터 변이 유전자를 추출하여 이를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환을 하였다. 형질전환된 각각의 콜로니를 96-정 상에서 카나마이신이 포함된 LB 배지 500 uL에 접종하여 30℃ 내지 37℃에서 18 내지 24시간 동안 진탕 배양 후, 배양액 일부를 100 ug mL^-1 카나마이신과 IPTG (Isopropyl β-D-a-thiogalactpyranoside)가 포함된 새로운 LB 배지 400 uL에 접종하여 18℃ 에서 20 시간을 배양하였다. 배양된 세포들은 원심분리 후, 세포를 10 mM 트리스 완충용액 10000 uL에 재부유 시킨 다음, 이 중 20 uL의 전세포를 변이주 탐색 반응에 사용하였다. 180 uL의 반응 용액은 4mM 라이신과 0.2 mM PLP, 0.02mM pH 지시약을 5mM 시트릭산(Sodium-Citrate) 완충용액을 포함하며, 라이신 탈탄산 전세포를 첨가함과 동시에 반응을 진행하여 30초의 간격을 두고 30분 변화를 관찰 하였다.

(실시예 1) 라이신 탈탄산 효소의 변이주들의 고유 활성 측정

라이신 탈탄산 효소의 치환 변이주의 상대적인 고유 활성도는 각각 동일한 양의 단백질을 사용하여 상기 언급한 pH 지시약을 이용한 효소 활성 분석 방법을 통해 분석하였고, 반응은 pH 5.6, 37℃ 에서 진행하여, 30분간 반응을 확인하였다. 이의 결과는 도 2 에 나타내었다.

도 2 에 나타낸 바와 같이, 대부분의 변이주가 야생형에 비해 활성이 높았지만, F14 의 변이주들 중 타이로신으로 아미노산이 치환된 변이주는 야생주와 비슷한 활성을 나타내었다. 라이신 탈탄산 LdcI 의 경우, F14 의 페닐알라닌은 인터페이스의 알파-힐릭스에 위치해 있으며, F14 와 K44 를 모두 시스테인으로 바꾼 인터페이스는 다이설파이드 결합이 형성되고 야생주와 비슷한 활성을 나타내었다. L7 와 N8 의 변이주는 단일 변이를 수행할 때는 야생주와 비슷한 활성을 나타내지만, L7M/N8G 변이주의 경우 활성이 56.8% 증가하였다. L7M/N8G/F14Y 변이주의 경우 24.4% 활성이 증가하였고, L7M/N8G/F14C/K44C 변이주의 경우 56.7% 활성이 증가하였다.

(실시예 2) 라이신 탈탄산 효소의 변이주들의 융점 (T _m value) 측정

단백질 정제를 마친 라이신 탈탄산 효소의 야생주와, 단일 아미노산의 변화 또는 조합적인 변이주의 열안정성을 확인 하기 위해, 단백질의 융점 온도(Tm)을 확인하였다. 0℃에서 100℃까지 점차적으로 온도를 높여 줄 때, 단백질의 구조가 풀리는 융점온도를 확인하였으며, 융점의 확인은 단백질 1mg 에 사이프로 오렌지 (sypro orange)를 넣어주어 형광의 변화로 확인하였다. 온도의 변화는 30분 에서 한시간 동안 점진적으로 수행하였으며, 분석은 상기 명시된 사이프로 오렌지 형광 변화에 따른 분석법으로 진행되었다. 이의 결과는 도 3 에 나타내었다.

도 3 에 나타낸 바와 같이, F14C/K44C 는 상대적으로 다양한 변이주들을 받아들일 수 있음을 알 수 있었으며, F14C/K44C와 L7M/N8G/F14C/K44C 변이주의 경우 Tm 값이 야생형에 비해 각각 10.6℃, 10.0℃ 증가하였음을 확인하였다.

(실시예 3) 라이신 탈탄산 효소 변이주(F14Y)의 pH 안정성 측정

변이주 F14Y 의 pH 안정성을 알아보기 위해, 단백질 정제를 마친 라이신 탈탄산 효소의 야생주와 변이주(F14Y)를 다양한 pH 용액 (pH 4.4, 5.6, 6.6, 7.6, 8.5 또는 9.6) 에 각각 담그고, 4℃ 에서 21일 동안 보관하였다. pH 완충용액은 pH 4.4, 5.6 의 경우 시트레이트 완충액(citric-sodium citrate buffer)을 사용하였고, pH 6.6, 7.6 의 경우 인산염 완충액 (potassium phosphate buffer)을 사용하였으며, pH 8.5, 9.6 의 경우 붕산염 완충액 (borate buffer)을 사용하였다. 21일 동안 보관한 후, 상대적인 고유 활성도를 측정하였고, 반응 pH 는 5.6, 온도는 37℃ 에서 진행하였다. 상기 명시된 HPLC 분석 방법을 통해 반응을 분석하였다. 또한 세 번의 실험의 평균값으로 구하였다. 이에 대한 결과를 도 4 에 나타내었다.

도 4 에 나타낸 바와 같이, pH 4.4 내지 pH 7.6 의 구간에서는 야생형과 변이주의 상대적인 고유 활성도에 많은 차이가 없었으며, 예를 들어, pH 5.6 에 담가 두었던 야생형과 변이주는 모두 약 40% 의 활성을 보존하고 있었다. 다만, pH 8.5 및 9.6 의 경우, 야생형은 모든 고유 활성을 잃어버린 반면, 변이주는 pH 8.5 에 넣어 두었던 것은 약 24.5%, pH 9.6 에 넣어 두었던 것은 약 23.2% 의 활성이 남아있는 것을 확인하였다. 이를 통해 변이주가 pH 에 대한 안정성이 더 높은 것을 확인하였다.

(실시예 4) 라이신 탈탄산 효소 변이주(F14Y)의 열안정성 측정

단백질 정제를 마친 라이신 탈탄산 효소의 야생주와 변이주 (F14Y)를 55℃에 계속적으로 보관 후, 초기 활성에 비해 시간에 따른 효소의 활성 감소가 어느 정도 인지를 확인하였다. 반응은 pH 5.6, 37℃ 에서 15분 내지 30분간 수행하였으며 분석은 상기 명시된 pH 지시약 분석법으로 진행되었다. 모든 결과는 세 번의 실험의 평균값으로 구하였으며, 이의 결과를 도 5 에 나타내었다.

도 5 에 나타낸 바와 같이, 야생형의 경우 48시간 이후에는 그 활성이 모두 사라졌다. 반면 F14Y 변이주의 경우 48시간 후에 활성이 약 61.4% 남아 있었다. 변이주의 경우 55℃ 에서 120시간동안 보관하더라도, 약 1% 정도의 활성이 남아있게 된다. 이로써 변이주가 열에 대한 안정성이 야생형에 비해 높은 것을 확인하였다.

(실시예 5) 라이신 탈탄산 효소 변이주의 다이설파이드 결합 확인

라이신 탈탄산 효소 변이주의 다이설파이드 결합을 확인하기 위해, 야생형 라이신 탈탄산 효소 LdcI (서열번호 15) 와 LdcI 의 14 번째의 페닐알라닌이 시스테인으로 치환되고, 44 번째의 라이신이 시스테인으로 치환된 변이주(F14C/K44C, 서열번호 6)에 환원력을 주었을 때와 주지 않았을 때 단백질 크기를 SDS PAGE 로 측정하였다. 이러한 측정을 통하여, 변이주에 첨가된 두개의 시스테인의 SH기가 산화(oxidation)되어 생성하는 -S-S- 형태의 황 원소 사이의 공유 결합 여부를 확인할 수 있다. 환원성 SDS PAGE에서는 야생형과 변이주 모두에게 환원력을 주어 결합이 가능한 모든 다이설파이드를 끊은 후 크기를 확인한 것이고, 비환원성 SDS PAGE에서는 다이설파이드 결합을 하는지를 확인하였다. 이의 결과를 도 6 에 나타내었다.

도 6 에 나타낸 바와 같이, 야생형은 비환원성과 환원성 SDS PAGE 크기를 통해 다이설파이드 결합을 하지 못하는 것을 확인하였다. 반면 F14C/K44C 변이주의 경우 비환원성 SDS에서 데카머 크기를 이루는 것을 확인하여 다이설파이드 결합을 안정적으로 하고 있음을 확인하였다.

(실시예 6) 라이신 탈탄산 효소 변이주(F14C/K44C)의 pH 안정성 측정

단백질 정제를 마친 라이신 탈탄산 효소의 야생주와 변이주(F14C/K44C)를 염기성 pH 용액(pH 8, 9 또는 10)에 각각 담근 후, 4℃ 에서 10 일간 보관하였다. pH 완충용액은 pH 8 과 9 의 경우 붕산염완충액을 사용하였고, pH 10은 카보네이트 완충액 (sodium carbonate buffer)을 사용하였다. 10 일간 각각의 pH 에 보관 후, 상대적인 고유 활성도를 측정하였고, 반응 pH 는 5.6, 온도는 37℃ 에서 진행하였다. 세 번의 실험의 평균값으로 구한 결과는 도 7 에 나타내었다.

도 7 에 나타낸 바와 같이, pH 8 에 담가 두었던 야생형은 약 50% 의 활성을 보존하고 있었다. 변이주는 약 75%의 황성을 보존하고 있었다. 두 효소의 pH 안정성의 차이는 pH 9.0 에서 확연히 구분이 되는데 염기성의 pH 에서 야생형은 42%의 활성이 남은 반면, 변이주는 pH 9.0 에 넣어 두었던 것은 약 78%의 활성이 남아있는 것을 확인하였다. 이를 통해 변이주가 pH 에 대한 안정성이 더 높은 것을 확인하였다.

(실시예 7) 라이신 탈탄산 효소 변이주(F14C/K44C)의 열안정성 측정

단백질 정제를 마친 라이신 탈탄산 효소의 야생주와 변이주 (F14C/K44C)를 60℃에 계속적으로 보관 후, 초기 활성에 비해 시간에 따른 효소의 활성 감소가 어느 정도 인지를 확인하였다. 반응은 pH 5.6, 37℃ 에서 15분 내지 30분간 수행하였으며 분석은 상기 명시된 pH 지시약 분석법으로 진행되었다. 모든 결과는 세 번의 실험의 평균값으로 구하였으며, 그 결과는 도 8 에 나타내었다.

도 8 에 나타낸 바와 같이, 야생형의 경우 10분만에 86%의 활성이 모두 사라진 반면, F14C/K44C 변이주의 경우 10시간 후에 활성이 약 50% 남아 있었다. 변이주의 경우 60℃ 에서 2600분 보관하게 되면 약 85% 정도의 활성이 사라지게 된다. 야생형과 변이주의 활성이 약 85% 사라지는데에 소요되는 시간을 비교해보면, 야생형은 10분에, 야생형은 2600분이 걸리므로, 야생형에 비하여 변이주의 열에 대한 안정성이 약 260배 높은 것을 확인하였다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> METHOD FOR PRODUCING LYSINE DECARBOXYLASE MUTANTS AND THEIR APPLICATIONS <130> Y14KP-039 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 715 <212> PRT <213> Lysine decarboxylase Mutant (F14Y) <400> 1 Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Tyr Lys Glu 1 5 10 15 Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln 20 25 30 Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn 35 40 45 Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu 50 55 60 Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp 100 105 110 Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile 115 120 125 Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys 130 135 140 Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met 165 170 175 Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp 180 185 190 His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe 195 200 205 Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn 210 215 220 Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp 245 250 255 Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg 275 280 285 Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys 305 310 315 320 Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr 325 330 335 Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly 340 345 350 Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu 355 360 365 Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val 370 375 380 Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met 405 410 415 Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala 420 425 430 Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly 435 440 445 Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys 450 455 460 Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp 465 470 475 480 Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro 485 490 495 Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser 500 505 510 Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr 530 535 540 Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe 545 550 555 560 Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn 580 585 590 Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg 595 600 605 Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe 610 615 620 Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met 625 630 635 640 Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val 660 665 670 Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly 675 680 685 Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr 690 695 700 Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys 705 710 715 <210> 2 <211> 715 <212> PRT <213> Lysine decarboxylase Mutant (L7M) <400> 2 Met Asn Val Ile Ala Ile Met Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu 1 5 10 15 Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln 20 25 30 Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn 35 40 45 Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp 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agtgatttac 1080 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa gggtaatgct 1260 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat 1380 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440 aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500 gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560 catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620 atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc 1680 gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740 tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct caaaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800 aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860 tatgctgcgt tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct 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atctgatatt 540 tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600 gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660 tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccgg caggcagcac cattctgatt 720 gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780 tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840 cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900 gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960 acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020 ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa gggtaatgct 1260 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat 1380 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440 aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500 gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560 catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620 atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc 1680 gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740 tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct caaaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800 aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860 tatgctgcgt tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920 gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtatccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980 ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040 gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100 gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148 <210> 10 <211> 2148 <212> DNA <213> A DNA encoding a amino acid sequences of SEQ ID NO. 3 <400> 10 atgaacgtta ttgcaatatt gggacacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60 gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120 gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180 aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240 gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300 agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360 actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420 cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480 agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540 tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600 gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660 tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccgg caggcagcac cattctgatt 720 gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780 tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840 cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900 gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960 acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020 ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa gggtaatgct 1260 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat 1380 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440 aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500 gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560 catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620 atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc 1680 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300 agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360 actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420 cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480 agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540 tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600 gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660 tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccgg caggcagcac cattctgatt 720 gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780 tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840 cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900 gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960 acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020 ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa gggtaatgct 1260 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat 1380 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440 aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500 gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560 catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620 atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc 1680 gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740 tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct caaaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800 aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860 tatgctgcgt tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920 gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtatccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980 ccgggtgaaa 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tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660 tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccgg caggcagcac cattctgatt 720 gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780 tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840 cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900 gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960 acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020 ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa gggtaatgct 1260 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat 1380 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440 aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500 gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560 catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620 atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc 1680 gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740 tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct caaaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800 aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860 tatgctgcgt tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920 gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtatccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980 ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040 gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100 gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148 <210> 13 <211> 2148 <212> DNA <213> A DNA encoding a amino acid sequences of SEQ ID NO. 6 <400> 13 atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt gtaaagaaga acccatccgt 60 gaacttcatc 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ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960 acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020 ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa gggtaatgct 1260 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat 1380 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440 aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500 gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560 catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620 atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc 1680 gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740 tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct caaaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800 aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860 tatgctgcgt tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920 gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtatccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980 ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040 gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100 gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148 <210> 14 <211> 2148 <212> DNA <213> A DNA encoding a amino acid sequences of SEQ ID NO. 7 <400> 14 atgaacgtta ttgcaataat gggacacatg ggggtttatt gtaaagaaga acccatccgt 60 gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120 gacttattat gtctgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180 aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240 gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300 agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360 actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420 cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480 agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540 tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600 gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660 tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccgg caggcagcac cattctgatt 720 gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780 tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840 cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900 gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960 acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020 ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa gggtaatgct 1260 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat 1380 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440 aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500 gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560 catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620 atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc 1680 gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740 tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct caaaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800 aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860 tatgctgcgt tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920 gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtatccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980 ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040 gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100 gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148 <210> 15 <211> 715 <212> PRT <213> Lysine decarboxylase (LdcI) <400> 15 Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu 1 5 10 15 Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln 20 25 30 Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn 35 40 45 Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu 50 55 60 Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp 100 105 110 Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile 115 120 125 Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys 130 135 140 Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met 165 170 175 Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp 180 185 190 His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe 195 200 205 Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn 210 215 220 Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp 245 250 255 Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg 275 280 285 Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys 305 310 315 320 Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr 325 330 335 Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly 340 345 350 Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu 355 360 365 Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val 370 375 380 Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met 405 410 415 Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala 420 425 430 Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly 435 440 445 Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys 450 455 460 Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp 465 470 475 480 Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro 485 490 495 Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser 500 505 510 Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr 530 535 540 Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe 545 550 555 560 Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn 580 585 590 Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg 595 600 605 Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe 610 615 620 Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met 625 630 635 640 Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val 660 665 670 Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly 675 680 685 Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr 690 695 700 Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys 705 710 715

Claims

하기의 염기서열 중 어느 하나의 서열로 표시되는 라이신 탈탄산 효소의 변이체:
서열번호 15 (LdcI)의 아미노산 서열에서, 14 번째의 아미노산인 페닐알라닌이 타이로신으로 치환된(F14Y), 서열번호 1 의 아미노산 서열;
서열번호 15 (LdcI)의 아미노산 서열에서, 7 번째의 아미노산인 루신이 메티오닌으로 치환되고, 8 번째의 아미노산인 아스파라긴이 글라이신으로 치환된 (L7M/N8G), 서열번호 4 의 아미노산 서열;
서열번호 15 (LdcI)의 아미노산 서열에서, 7 번째의 아미노산인 루신이 메티오닌으로 치환되고, 8 번째의 아미노산인 아스파라긴이 글라이신으로 치환되고, 14 번째의 아미노산인 페닐알라닌이 타이로신으로 치환된 (L7M/N8G/F14Y), 서열번호 5 의 아미노산 서열;
서열번호 15 (LdcI)의 아미노산 서열에서, 14 번째의 페닐알라닌이 시스테인으로 치환되고, 44 번째의 아미노산인 라이신이 시스테인으로 치환된 (F14C/K44C), 서열번호 6 의 아미노산 서열;
서열번호 15 (LdcI)의 아미노산 서열에서, 7 번째의 아미노산인 루신이 메티오닌으로 치환되고, 8 번째의 아미노산인 아스파라긴이 글라이신으로 치환되고, 14 번째의 페닐알라닌이 시스테인으로 치환되고, 44 번째의 아미노산인 라이신이 시스테인으로 치환된 (L7M/N8G/F14C/K44C), 서열번호 7 의 아미노산 서열.
서열번호 1 및 4 내지 7 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지는, 라이신 탈탄산 효소의 변이체.
제 1 항에 따른 라이신 탈탄산 효소의 변이체를 암호화하는 DNA.
제 3 항에 있어서,
상기 DNA 는 서열번호 8 및 11 내지 14 의 서열 중 어느 하나의 서열로 표시되는 DNA.
제 3 항 또는 제 4 항에 따른 DNA 를 포함하는 재조합 DNA 벡터.
제 5 항에 따른 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 5 항에 따른 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포의 추출물.
제 5 항에 따른 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포의 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 생촉매로 사용한, 카다버린의 생산 방법.
제 8 항에 있어서,
포도당으로부터 카다버린을 생산하는, 카다버린의 생산 방법.
제 8 항에 있어서,
1M 내지 6M 농도의 라이신을 기질로 사용하는, 카다버린의 생산 방법.
서열번호 15 (LdcI) 의 데카머의 인터페이스에 다이설파이드 결합을 만들 수 있도록, 잔기의 서열을 조합적으로 치환한 라이신 탈탄산 효소 변이주의 제조방법.
서열번호 15 (LdcI) 의 데카머의 인터페이스 8 Å 내에 위치하는 잔기를 단일 혹은 조합적으로 치환한 라이신 탈탄산 효소 변이주의 제조방법.