CN108138160B - 赖氨酸脱羧酶的突变型开发方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及赖氨酸脱羧酶的突变型的生成方法和突变型的特性、对上述赖氨酸脱羧酶的突变型进行编码的基因及利用这些的尸胺的生产方法。本发明提供通过蛋白质工程变异的改善的大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶。并且，本发明的突变型赖氨酸脱羧酶在生产尸胺时，增加活性及pH稳定性、热稳定性来提供因收率及生产性增加而带来的生产费用的降低。

Description

赖氨酸脱羧酶的突变型开发方法及其应用

技术领域

本发明涉及通过蛋白质工程酶变异的赖氨酸脱羧酶的突变型开发方法及所生成的突变型的特性分析、利用上述突变型酶进行的生物转化反应。

背景技术

近来，在石油资源不断被耗尽时，正在积极进行利用非石油资源的生物材料合成高分子前体的研究。尤其，两个末端具有两个胺基，并且由五个碳组成的尸胺(cadaverine；1，5-diaminopentane)不仅可用作高分子前体，而且可广泛用于化学工业领域。例如，聚酰胺、聚氨酯、螯合剂等。近年来，正在积极进行利用赖氨酸合成尸胺的研究，或者利用与赖氨酸相比费用低廉的葡萄糖或淀粉中的微生物细胞的生物转化功能大量生产尸胺的研究。像这样，以生物转化技术通过宿主的基因突变来大量生产尸胺的方法很多，但是赖氨酸可通过使用如淀粉或葡萄糖等起始材料的生物转化过程的多个步骤来合成，这种赖氨酸可通过多种反应转化为其他化合物，因此被用作主要的起始材料。其一个例子为脱羧反应，并且可通过赖氨酸脱羧酶反应来合成尸胺。在微生物中利用葡萄糖生产赖氨酸的技术可在谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)宿主中以约120g/L的水平生产，并且正在进行商业化大量生产。因此，需要一种能够可将这种高浓度的赖氨酸作为基质来转化为细胞中的多种化合物的技术，或者在试管中能够以一步(one-step)反应更有效地转化为尸胺的技术。

众所周知，谷氨酸棒状杆菌中不包含赖氨酸脱羧酶，但是在多种来源的微生物中包含赖氨酸脱羧酶。其中，尤其，利用磷酸吡哆醛(PLP，pyridoxal-5'-phosphate)辅酶的大肠杆菌(Escherichia coli)来源的赖氨酸脱羧酶的反应性高。在大肠杆菌中，存在两种赖氨酸脱羧酶，上述赖氨酸脱羧酶包含在细胞生长过程中连续表达的LdcC赖氨酸脱羧酶和仅在弱酸性的pH的条件下诱导表达的LdcI赖氨酸脱羧酶。加拿大多伦多大学的Houry研究小组已经揭示了大肠杆菌来源的LdcI赖氨酸脱羧酶的结构，发现上述酶呈现由10个单位组成的十聚体(decamer)形态。可通过赖氨酸脱羧酶所显示的结构及多个氨基酸残基的变异来预测影响酶活性的重要的要素及反应的机制。

在活性比较高的大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶LdcI的情况下，当利用于高浓度的工业反应时，存在几个缺点。在弱酸性的条件(pH5.6)下的活性高，但是在中性或碱性条件下，存在快速丧失活性的缺点，因此为了进行高浓度及长时间的重复反应，需要增加LdcI酶的pH及热稳定性，并且需要更高的酶活性。基于这种理由，通过酶的结构性研究来提高整个pH的酶反应性，通过开发热稳定性及pH稳定性得到改善的突变型来应用于高浓度及连续的赖氨酸生物转化反应中。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：韩国公开专利10-2012-0021491

专利文献2：韩国公开专利10-2014-0012099

非专利文献

非专利文献：细菌的酸性压力及其反应：可诱导的赖氨酸脱羧酶的结构，EMBOJ.2011Mar 2；30(5)：931-44

非专利文献：通过pH变化观察N-末端结构来提高大肠杆菌来源的谷氨酸脱羧酶B的热稳定性，J Biotechnol.2014 Mar20；174：22-8

发明内容

技术问题

在现有技术的情况下，在利用赖氨酸生成尸胺的过程中，可在大肠杆菌中过表达，在大多数情况下，使用高活性的大肠杆菌来源的LdcI赖氨酸脱羧酶。并且，已经进行了如下的研究，即，虽然活性低，但是LdcC也与LdcI一同表达，从而将其一同用于生产尸胺等。

在先前的专利和研究中，为了增加尸胺的生产，在宿主细胞中使用调节酶的表达或者过表达反向转运体，使赖氨酸和尸胺易于释放到细胞外，或者阻断分解尸胺的途径的方法等改变除酶以外的生产途径的其他部分，从而进行了使利用赖氨酸生产的尸胺最大化的间接基因突变。这些研究可对利用细胞的赖氨酸生物转化有用，但是利用于细胞外的试管或反应器中的生物转化反应是有限的。为了利用于如上所述的细胞外的试管或反应器中的生物转化反应，直接提高赖氨酸脱羧酶的稳定性及酶活性的方法有效。为此，进行了以理解反应的机制并通过对活性重要的多个残基的变异的方式显著提高活性的研究。然而，迄今为止，尚未报道通过向赖氨酸脱羧酶自身提供直接的变异来克服大肠杆菌的LdcI及LdcC酶具有的结构及稳定性的缺点，从而增加活性并利用于高浓度及长时间连续反应等的研究。

在将赖氨酸生物转化为尸胺的反应中，首先要考虑反应的pH。在反应的机制中，由于去除赖氨酸的羧基并消耗反应液的氢离子，随着反应的进行，反应液的pH变得更碱性，因此当酶对pH敏感时，失去很多活性，并且为了进行高浓度和长时间反应，酶的活性应保持在宽的pH区域内。

在大肠杆菌赖氨酸脱羧酶的情况下，已经报道了两种具有不同特征的LdcC和LdcI。与LdcI相比，LdcC为在细胞生长过程中始终表达的酶，具有相对较低的活性及表达程度，但在整个宽的pH区域内保持其活性。然而，LdcI在pH5.6附近呈现高活性，当反应液的pH为7.0以上时，其活性急剧降低并且在碱性条件下观察到活性显著地降低。当然，与LdcC相比，由于LdcI属于非活性高的酶，因此有利于高浓度反应，但是为了进行工业高浓度及长时间连续使用反应，LdcI需要pH稳定性、热稳定性及更高的酶活性。

解决问题的方案

本发明提供通过赖氨酸脱羧酶的蛋白质工程变异的突变型生成方法、所生成的突变型的检索及对这些突变型进行编码的基因序列信息。

并且，本发明提供分析这些突变型的特性并利用这些生成尸胺的方法。即，本发明使用通过蛋白质工程变异被改善的大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶来适用于尸胺生产反应。

并且，本发明提供用于生成赖氨酸脱羧酶突变型的逻辑预测方法，从而选择作为蛋白质的目的的部分，利用蛋白质的序列、结构、功能及计算机程序选择特定氨基酸的残基来进行变异。

并且，本发明提供包含改变的赖氨酸脱羧酶的氨基酸残基的序列的赖氨酸脱羧酶基因、包含其的重组DNA载体及利用重组DNA载体转化的宿主细胞。

发明的效果

本发明可通过使用催化功能得到提高的赖氨酸脱羧酶的突变型来增加尸胺生产性及生产效率，从而降低生产成本。

并且，本发明增加在pH4至pH10下的酶的pH稳定性及在20℃至70℃的温度下的酶的热稳定性，以便提高在尸胺的大量生产中的赖氨酸脱羧酶的可再利用性并降低酶的生产成本。

并且，通过大量生产上述尸胺来用作各种高分子前体、食品、化学添加剂等，可通过本发明的突变型生成方法来适用于其他脱羧酶，尤其适用于使用磷酸吡哆醛(PLP)辅酶的脱羧酶。

附图说明

图1示出通过使用本发明的L-赖氨酸作为基质来利用赖氨酸脱羧酶的尸胺合成示意图。

图2示出由序列15表示的野生型(WT)赖氨酸脱羧酶LdcI的单个氨基酸及其突变型的相对比活度(relative specific activity)。

图3示出本发明的赖氨酸脱羧酶的单个氨基酸的变化及这些的组合突变型的蛋白质的熔点温度(Tm)。

图4为将被纯化的野生型赖氨酸脱羧酶LdcI和被纯化的LdcI的第14位的苯丙氨酸(phenylalanine)被酪氨酸取代的突变型浸渍于多种pH溶液(pH4.4、5.6、6.6、7.6、8.5或9.6)后对还存在多少活性进行比较的图。所有的值表示相对比活度。

图5为将被纯化的野生型赖氨酸脱羧酶LdcI和被纯化的LdcI的第14位的苯丙氨酸被酪氨酸取代的突变型在55℃的温度下储存后对其相对活性每小时降低多少进行比较的图。所有的值表示相对比活度。

图6示出利用SDSPAGE确认向野生型赖氨酸脱羧酶LdcI和LdcI的第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代(cysteine)、第44位的赖氨酸(lysine)被半胱氨酸取代的突变型提供复原力时及未提供复原力时的蛋白质大小的变化。

图7为将被纯化的野生型赖氨酸脱羧酶LdcI和被纯化的LdcI的第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代、第44位的赖氨酸被半胱氨酸取代的突变型浸渍于碱性pH溶液(pH8、9或10)后对还存在多少活性进行比较的图。所有的值表示相对比活度。

图8为将被纯化的野生型赖氨酸脱羧酶LdcI和被纯化的LdcI的第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代、第44位的赖氨酸被半胱氨酸取代的突变型在60℃的温度下储存后，对其相对活性每小时降低多少进行比较的图。所有的值表示相对比活度。

图9示出本发明中所使用的大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶的野生型LdcI及突变型的氨基酸序列。具体地，图9的LdcI为野生型LdcI的氨基酸序列(序列15)，(a)部分为F14Y(序列15中的第14位的苯丙氨酸被酪氨酸取代)的氨基酸序列(序列1)，(b)部分为L7M(序列15中的第7位的亮氨酸被蛋氨酸取代)的氨基酸序列(序列2)，(c)部分为N8G(序列15中的第8位的天冬酰胺被甘氨酸取代)的氨基酸序列(序列3)，(d)部分为L7M(序列15中的第7位的亮氨酸被蛋氨酸取代)及N8G(序列15中的第8位的天冬酰胺被甘氨酸取代)的组合氨基酸序列(序列4)，(e)部分为L7M(序列15中的第7位的亮氨酸被蛋氨酸取代)、N8G(序列15中的第8位的天冬酰胺被甘氨酸取代)及F14Y(序列15中的第14位的苯丙氨酸被酪氨酸取代)的组合氨基酸序列(序列5)，(f)部分为F14C(序列15中的第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代)及K44C(序列15中的第44位的赖氨酸被半胱氨酸取代)组合氨基酸序列(序列6)，(g)部分为L7M(序列15中的第7位的亮氨酸被蛋氨酸取代)、N8G(序列15中的第8位的天冬酰胺被甘氨酸取代)、F14C(序列15中的第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代)及K44C(序列15中的第44位的赖氨酸被半胱氨酸取代)的组合氨基酸序列(序列7)。

图10为分别示出序列1至7的氨基酸序列的DNA的图。具体地，图10的(a)部分为对序列1的氨基酸进行编码的DNA序列(序列8)，(b)部分为对序列2的氨基酸进行编码的DNA序列(序列9)，(c)部分为对序列3的氨基酸进行编码的DNA序列(序列10)，(d)部分为对序列4的氨基酸进行编码的DNA序列(序列11)，(e)部分为对序列5的氨基酸进行编码的DNA序列(序列12)，(f)部分为对序列6的氨基酸进行编码的DNA序列(序列13)，(g)部分为对序列7的氨基酸进行编码的DNA序列(序列14)。

具体实施方式

本发明中所使用的术语通常用于与赖氨酸相关的技术领域，本领域技术人员可理解其含义，但是在本说明书中简单地说明如下。

(1)赖氨酸脱羧酶是指从赖氨酸去除羧基的酶。

(2)添加到赖氨酸脱羧酶反应中的磷酸吡哆醛(PLP，pyridoxal-5'-phosphate)为反应中必需使用的酶的辅酶。

(3)细胞提取物是指赖氨酸脱羧酶被表达的本发明的微生物提取物。

(4)全细胞反应是指通过破坏包含特定酶的细胞来利用细胞内容物或者使用未对酶进行分离且纯化的完整的整个细胞的反应。

(5)亲水性(hydrophilic)氨基酸是指在官能团(functional group)中包含可以与水形成氢键的高电负性原子(氧、氮、硫)的氨基酸，包括丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)、半胱氨酸(cystein)、酪氨酸(tyrosine)、天门冬氨酸(aspartic acid)、谷氨酸(glutamic acid)、天冬酰胺(asparagine)、谷氨酰胺(glutamine)、组氨酸(histidine)、赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)。

(6)疏水性(hydrophobic)氨基酸是指在官能团中不包含可以与水形成氢键的高电负性原子(氧、氮、硫)的氨基酸，包括缬氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)、异亮氨酸(isoleucine)、蛋氨酸(methionine)、苯丙氨酸(phenylalanine)。

(7)PCR为聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，是指特异性扩增DNA的某些区域的方法。

(8)定点突变(site directed mutagenesis)是指在基因的指定的位置导入指定的碱基序列的变化。

(9)饱和诱变(saturation mutagenesis)是指在基因的指定的位置导入多种碱基序列的变化。饱和诱变是指插入NNK密码子(codon)来代替与模板链相结合的互补序列的引物(primer)上所要变异的序列，从而通过聚合酶链式反应来插入变异。此时，在NNK密码子中，N是指核苷酸的A、T、G、C，K是指核苷酸的T、G。

(10)载体是指由单链、双链、环状或超螺旋DNA或RNA组成的多聚核苷酸，并且可包含通过有效地连接在合适的距离来生产重组蛋白质的多个结构要素。

这些结构要素可包括复制起点、启动子、增强子、5’mRNA前导序列、核糖体结合位点、核酸盒、终止及聚腺苷酸化位点、或可选择的标记形式等，根据特异性用途，可缺失一个或多个上述多个结构要素。核酸盒可包括用于插入所要表达的重组蛋白质的限制酶位点。在功能性载体中，核酸盒含有包含翻译起始位点及终止位点的所要表达的核酸序列，可根据需要使用能够将两种盒插入到载体中的载体，并且能够以附加的方式对上述提及的多个功能进行序列化。

插入于重组载体的基因可使用表达用大肠杆菌菌株BW25113(DE3)、BL21(DE3)等，但是可根据被插入的载体的种类而发生变化。本领域普通技术人员可容易选择这些载体及表达菌株。

(11)二硫键(disulfide bond)为两个SH基团被氧化(oxidation)而生成的-S-S-型的硫元素之间的共价键。

(12)还原性和非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE，sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis)是指比较向蛋白质提供还原性和未向蛋白质提供还原性时的蛋白质的大小。可确认是否形成两个SH基团被氧化(oxidation)而生成的-S-S-型的硫元素之间的共价键。

(13)pH指示剂(pH indicator)主要用于滴定时测定中和点或测定氢离子浓度。根据氢离子指数，指示剂分为酸性及碱性，并且色调不同，将该区域称为变色区域。可通过分光光度法来测定根据吸光度的氢离子的浓度。

(14)比活度(specific activity)是指通过酶纯化去除杂质及其他蛋白质的纯蛋白质的单位量的活性，通常，将每分钟催化1μmol的基质变化的酶的量以每单位1mg的单位表示。

(15)相对比活度(relative specific activity)是指比活度的相对比较值。

(16)蛋白质的熔点温度(Tm)是指表示蛋白质的热稳定性并释放蛋白质的结构的温度。

(17)序列比对(sequence alignment)是指利用基于动态编程的计算机串比对算法排列蛋白质的序列。

(18)同源性不同的序列是指用于比较两种序列不同的蛋白质而进行序列比对时的序列不一致的部分。

在本发明中，提供一种赖氨酸脱羧酶的变异体，由下述碱基序列中的一种序列表示。

序列1的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，作为第14位的氨基酸的苯丙氨酸被酪氨酸取代(F14Y)；

序列4的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，作为第7位的氨基酸的亮氨酸被蛋氨酸取代，作为第8位的氨基酸的天冬酰胺被甘氨酸取代(L7M/N8G)；

序列5的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，作为第7位的氨基酸的亮氨酸被蛋氨酸取代，作为第8位的氨基酸的天冬酰胺被甘氨酸取代，作为第14位的氨基酸的苯丙氨酸被酪氨酸取代(L7M/N8G/F14Y)；

序列6的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代，作为第44位的氨基酸的赖氨酸被半胱氨酸取代(F14C/K44C)；

序列7的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，作为第7位的氨基酸的亮氨酸被蛋氨酸取代，作为第8位的氨基酸的天冬酰胺被甘氨酸取代，第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代，作为第44位的氨基酸的赖氨酸被半胱氨酸取代(L7M/N8G/F14C/K44C)。

在不降低赖氨酸脱羧酶的活性的范围内，上述氨基酸序列可具有90％以上的同源性，优选地，具有95％以上的同源性，更优选地具有99％以上的同源性。

本发明提供对本发明的赖氨酸脱羧酶的变异体进行编码的DNA。

若上述DNA相当于对本发明中所提供的氨基酸进行编码的DNA，则可以无限制地使用上述DNA，并且包含通过优化上述DNA获得的序列，优选地，上述DNA可以为由序列8及序列11至序列14的序列中的一种序列表示的DNA序列。

上述序列8为对序列1的氨基酸进行编码的DNA序列，上述序列11为对序列4的氨基酸进行编码的DNA序列，上述序列12的DNA序列为对序列5的氨基酸进行编码的DNA序列，上述序列13为对序列6的氨基酸进行编码的DNA序列，上述序列14为对序列7的氨基酸进行编码的DNA序列。

本发明提供包含上述DNA的重组DNA载体、利用上述重组DNA载体转化的宿主细胞及宿主细胞的提取物。

若本领域技术人员容易选择，则可无限制地使用上述载体、宿主细胞。

本发明的赖氨酸脱羧酶在pH4至pH10下的pH稳定性增加，尤其在pH4.4至pH8.5下具有显著增加的pH稳定性。

并且，本发明的赖氨酸脱羧酶在20℃至70℃的温度下的热稳定性增加，尤其在35℃至70℃的温度下的热稳定性增加。

本发明提供将选自由利用上述重组DNA载体转化的宿主细胞及上述宿主细胞的提取物组成的组中的一种用作生物催化剂的尸胺的生产方法。

在上述生产方法中，可以由淀粉、葡萄糖或赖氨酸生产尸胺，优选地，可以由葡萄糖或赖氨酸生产尸胺。在利用淀粉或葡萄糖生产尸胺的情况下，淀粉或葡萄糖可通过多个步骤的生物转化过程来合成赖氨酸，并且可对合成的赖氨酸进行脱羧反应来生产尸胺。只要本领域技术人员容易选择，则可无限制地使用利用淀粉或葡萄糖合成赖氨酸的方法。

并且，在上述生产方法中，可使用高浓度的赖氨酸作为基质来生产尸胺。优选的赖氨酸的浓度为1M至6M，更优选为1M至3M。

本发明提供以单独或组合的方式取代序列15(LdcI)的7、8、14或44位的氨基酸残基或取代的赖氨酸脱羧酶突变型的制备方法。

本发明提供以组合的方式取代残基的序列，以便可在序列15(LdcI)的十聚体的界面中形成二硫键的赖氨酸脱羧酶突变型的制备方法。

上述十聚体的界面是指10个蛋白质形成十聚体时的相接触的表面。

本发明提供以单独或组合的方式取代位于序列15(LdcI)的十聚体的界面

内的残基的赖氨酸脱羧酶突变型的制备方法。

具体地，上述制备方法是指，在作为赖氨酸脱羧酶的结晶结构的十聚体界面的序列7至序列50中的选自

至

以内的残基中，对通过多个序列进行饱和诱变或二硫键的功能性残基进行变异的方法。

在本发明中，在进行与赖氨酸脱羧酶的功能性残基有关的饱和诱变中，可通过使用对于选择的赖氨酸脱羧酶的功能性残基的NNK密码子并通过聚合酶链式反应来进行饱和诱变，或者通过使用用于二硫键的半胱氨酸密码子并通过聚合酶链式反应来进行定点突变。

在本发明中，在检索赖氨酸脱羧酶的突变型中，可通过使用pH指示剂的比色法筛选突变型文库。可通过全细胞反应进行第一次筛选，具体地，准备沾有指示剂的纸后，将多种突变型文库细胞与沾有指示剂的纸进行接合并与野生型进行颜色比较，从而能够以可视的方式选择相似或变化更快的多个突变型。优选地，为了更准确的突变型检索，可进行第二次筛选，在第二次筛选中，通过增加培养体积来培养第一次筛选中选择的多个突变型后，利用细胞提取物，将初期反应速度与野生型进行比较，从而使用分光吸光度来筛选呈现出更快的吸光度变化的多个突变型。

实施例

通过实施例详细说明本发明的具体方法，但是本发明的技术范围不限于这些实施例。

利用pH指示剂的酶活性分析方法

在通过赖氨酸脱羧酶的比色法(colorimetric method)的活性测定中，去除赖氨酸的羧基的同时氢粘附在其位置，此时，作为测定此时的pH的变化的方法，与尸胺的生产性成比例。

在本发明中，根据赖氨酸脱羧酶的最优活性pH选择并使用pH指示剂。通过在5mM的柠檬酸钠(Sodium-Citrate)缓冲溶液中加入4mM的赖氨酸、0.2mM的磷酸吡哆醛、0.02mM的pH指示剂来分析酶活性。反应进行30分钟，在甲酚紫(Cresol purple)的情况下，使用光谱仪以30秒的间隔分析在变为紫色的590nm处的吸光度的增加。通过氢氧化钠(NaOH)的浓度的校正曲线计算产生的氢离子的浓度。酶反应使用总反应体积的10％的酶，并且在酶中加入基质混合物的同时开始反应。酶活性(单位(Unit))被定义为在室温下每分钟进行脱羧化反应时消耗1微摩尔的氢所需的酶的量。

利用饱和诱变及比色法的突变型检索方法

使用导入有随机取代相当于赖氨酸脱羧酶的氨基酸位置14的序列的NNK序列(N为A、C、G或T的序列，K为G或T的序列)的引物，对整个载体进行聚合酶链式反应来建立文库。在本发明的赖氨酸脱羧酶中，当从第一个蛋氨酸序列开始计数时蛋氨酸变为第一。为了去除原始质粒(plasmid)，对包含载体序列的赖氨酸脱羧酶中的扩增的基因进行DpnⅠ酶处理后，转化到大肠杆菌DH5α中。从所有产生的菌落(colony)中提取变异基因并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将各个转化的菌落接种于在96孔中含有卡那霉素的500uL的LB培养基中，在30℃至37℃的温度下震荡培养18小时至24小时后，将一部分培养液接种于包含100ug/mL^-1的卡那霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropylβ-D-a-thiogalactpyranoside)的新的400uL的LB培养基中，在18℃的温度下培养20小时。对培养的多个细胞进行离心分离后，将细胞再悬浮于10000uL的10mM的三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲溶液后，在突变型检索反应中使用20uL的全细胞。180uL的反应溶液包含4mM的赖氨酸、0.2mM的磷酸吡哆醛、0.02mM的pH指示剂及5mM的柠檬酸钠缓冲溶液，加入赖氨酸脱羧全细胞的同时进行反应，并以30秒的间隔观察30分钟变化。

实施例1：测定赖氨酸脱羧酶的多个突变型的比活度

通过分别使用相同的量的蛋白质以利用上述提及的pH指示剂的酶活性分析方法来分析赖氨酸脱羧酶的取代突变型的相对比活度，在pH5.6下，在37℃的温度下进行反应30分钟。其结果在图2中示出。

如图2所示，大部分的突变型的活性比野生型高，但是在F14的突变型中，氨基酸被酪氨酸取代的突变型呈现出与野生株相似的活性。在赖氨酸脱羧LdcI的情况下，F14的苯丙氨酸位于界面的α-螺旋中，F14和K44全部被半胱氨酸取代的界面形成二硫键并呈现出与野生株相似的活性。当L7和N8的突变型进行单突变时，呈现出与野生株相似的活性，但在L7M/N8G的突变型的情况下，活性增加56.8％。在L7M/N8G/F14Y突变型的情况下，增加24.4％的活性，在L7M/N8G/F14C/K44C突变型的情况下，增加56.7％的活性。

实施例2：测定赖氨酸脱羧酶的多个突变型的熔点(Tm value)

确认蛋白质的熔点温度(Tm)，以便确认完成蛋白质纯化的赖氨酸脱羧酶的野生株及单一氨基酸的变化或组合突变型的热稳定性。当温度从0℃逐渐升高至100℃时，确认释放蛋白质的结构的熔点温度，通过向1mg的蛋白质中加入铜染及橙染(sypro orange)来改变荧光来确认熔点。温度的变化从30分钟逐渐进行到1小时，以上述指定的铜染及橙染荧光变化的分析法进行分析。其结果在图3中示出。

如图3所示，可知F14C/K44C可接受相对多种的突变型，在F14C/K44C及L7M/N8G/F14C/K44C突变型的情况下，与野生型相比，熔点值分别增加10.6℃、10.0℃。

实施例3：测定赖氨酸脱羧酶突变型(F14Y)的pH稳定性

为了测定突变型F14Y的pH稳定性，将完成蛋白质纯化的赖氨酸脱羧酶的野生株和突变型(F14Y)分别浸渍于多种pH溶液(pH4.4、5.6、6.6、7.6、8.5或9.6)中，在4℃的温度下储存21日。对于pH缓冲溶液，在pH4.4、5.6的情况下，使用柠檬酸钠缓冲溶液(citric-sodium citrate buffer)，在pH6.6、7.6的情况下，使用磷酸盐缓冲溶液(potassiumphosphate buffer)，在pH8.5、9.6的情况下，使用硼酸盐缓冲溶液(borate buffer)。储存21日后，测定相对比活度，在pH5.6下，在37℃的温度下进行反应。通过上述指定的高效液相色谱法(HPLC)分析方法分析反应。并且，通过三次实验的平均值得到的结果在图4中示出。

如图4所示，在pH4.4至pH7.6的区间中，野生型和突变型的相对比活度不存在太大差异，例如，在pH5.6下浸渍的野生型和突变型均保持约40％的活性。然而，在pH8.5及pH9.6的情况下，野生型丧失其全部的比活度，相反，在pH8.5下浸渍的突变型保留约24.5％的活性，在pH9.6下浸渍的突变型保留约23.2％的活性。这证明突变型对pH的稳定性更高。

实施例4：测定赖氨酸脱羧酶突变型(F14Y)的热稳定性

将完成蛋白质纯化的赖氨酸脱羧酶的野生株和突变型(F14Y)在55℃的温度下继续储存后，与初期活性相比，确认随时间降低的酶的活性。在pH5.6下，在37℃的温度下进行反应15分钟至30分钟，通过上述指定的pH指示剂分析法进行分析。通过三次实验的平均值得到所有结果，并且将其结果在图5中示出。

如图5所示，在野生型的情况下，在48小时后，其活性全部消失。相反，在F14Y突变型的情况下，在48小时后，保留约61.4％的活性。在突变型的情况下，即使在55℃的温度下储存120小时，也保留约1％左右的活性。从而确认突变型与野生型相比具有更高的热稳定性。

实施例5：确认赖氨酸脱羧酶突变型的二硫键

为了确认赖氨酸脱羧酶突变型的二硫键，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确认向野生型赖氨酸脱羧酶LdcI(序列15)和LdcI的第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代，第44位的赖氨酸被半胱氨酸取代的突变型(F14C/K44C，序列6)提供复原力时及未提供复原力时的蛋白质大小。通过这些测定，可确认通过加入到突变型的两个半胱氨酸的SH基团被氧化而生成的-S-S-型的硫元素之间的共价键。在还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中，通过均向野生型和突变型提供复原力来破坏可结合的所有二硫键后，确认大小，在非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中，确认是否形成二硫键。将其结果在图6中示出。

如图6所示，野生型无法通过非还原性和还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳大小来形成二硫键。相反，在F14C/K44C突变型的情况下，在非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中形成十聚体大小，从而二硫键稳定。

实施例6：测定赖氨酸脱羧酶突变型(F14C/K44C)的pH稳定性

将完成蛋白质纯化的赖氨酸脱羧酶的野生株和突变型(F14C/K44C)分别浸渍于碱性pH溶液(pH8、9或10)中，在4℃的温度下储存10日。在pH8和pH9的情况下，所用的pH缓冲溶液为硼酸盐缓冲溶液，在pH10的情况下，使用碳酸钠缓冲溶液(sodium carbonatebuffer)。在各自的pH下储存10日后，测定相对比活度，在pH5.6下，在37℃的温度下进行反应。通过三次实验的平均值得到的结果在图7中示出。

如图7所示，浸渍于pH8的野生型保留约50％的活性。突变型保留约75％的活性。两个酶的pH稳定性的差异在pH9.0时明显不同，在碱性pH下，野生型保留42％的活性，相反，浸渍于pH9.0的突变型保留约78％的活性。由此确认，突变型对pH的稳定性更高。

实施例7：测定赖氨酸脱羧酶突变型(F14C/K44C)的热稳定性

将完成蛋白质纯化的赖氨酸脱羧酶的野生株和突变型(F14C/K44C)在60℃的温度下储存后，与初期活性相比，确认酶的活性随时间降低的程度。在pH5.6下，在37℃的温度下进行反应15分钟至30分钟，以上述指定的pH指示剂分析法进行分析。所有结果在三次实验中取平均值，结果在图8中示出。

如图8所示，在野生型的情况下，10分钟内86％的活性全部消失，相反，在F14C/K44C突变型的情况下，10小时后保留约50％的活性。在突变型的情况下，当在60℃储存2600分钟时，活性大约消失85％左右。对野生型和突变型的活性消失约85％时所需的时间进行比较，野生型需要10分钟，野生型需要2600分钟，因此与野生型相比，与突变型的热有关的稳定性约高260倍。

产业上的可利用性

本发明通过使用催化功能得到提高的赖氨酸脱羧酶的突变型来提高尸胺(cadaverine；1，5-diaminopentane)的生产性及生产效率，从而尸胺不仅可用作高分子前体，而且可广泛用于化学工业领域。

序列目录自由文本

序列1为野生型LdcI的氨基酸序列的第14位的苯丙氨酸被酪氨酸取代的氨基酸序列，

序列2为野生型LdcI的氨基酸序列的第7位的亮氨酸被蛋氨酸取代的氨基酸序列，

序列3为野生型LdcI的氨基酸序列的第8位的天冬酰胺被甘氨酸取代的氨基酸序列，

序列4为野生型LdcI的氨基酸序列的第7位的亮氨酸被蛋氨酸取代且第8位的天冬酰胺被甘氨酸取代的氨基酸序列，

序列5为野生型LdcI的氨基酸序列的第7位的亮氨酸被蛋氨酸取代、第8位的天冬酰胺被甘氨酸取代及第14位的苯丙氨酸被酪氨酸取代的氨基酸序列，

序列6为野生型LdcI的氨基酸序列的14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代且第44位的赖氨酸被半胱氨酸取代的氨基酸序列，

序列7为野生型LdcI的氨基酸序列的第7位的亮氨酸被蛋氨酸取代、第8位的天冬酰胺被甘氨酸取代、第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代、第44位的赖氨酸被半胱氨酸取代的氨基酸序列，

序列8为对序列1的氨基酸进行编码的DNA序列，

序列9为对序列2的氨基酸进行编码的DNA序列，

序列10为对序列3的氨基酸进行编码的DNA序列，

序列11为对序列4的氨基酸进行编码的DNA序列，

序列12为对序列5的氨基酸进行编码的DNA序列，

序列13为对序列6的氨基酸进行编码的DNA序列，

序列14为对序列7的氨基酸进行编码的DNA序列，

序列15为野生型LdcI的氨基酸序列。

Claims (11)

1.一种赖氨酸脱羧酶的变异体，其特征在于，由下述氨基酸序列中的一种序列表示：

序列4的氨基酸序列，在序列15的氨基酸序列中，作为第7位的氨基酸的亮氨酸被蛋氨酸取代，作为第8位的氨基酸的天冬酰胺被甘氨酸取代；

序列5的氨基酸序列，在序列15的氨基酸序列中，作为第7位的氨基酸的亮氨酸被蛋氨酸取代，作为第8位的氨基酸的天冬酰胺被甘氨酸取代，作为第14位的氨基酸的苯丙氨酸被酪氨酸取代；

序列6的氨基酸序列，在序列15的氨基酸序列中，第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代，作为第44位的氨基酸的赖氨酸被半胱氨酸取代；

序列7的氨基酸序列，在序列15的氨基酸序列中，作为第7位的氨基酸的亮氨酸被蛋氨酸取代，作为第8位的氨基酸的天冬酰胺被甘氨酸取代，第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代，作为第44位的氨基酸的赖氨酸被半胱氨酸取代。

2.一种DNA，其特征在于，对权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶的变异体进行编码。

3.根据权利要求2所述的DNA，其特征在于，上述DNA由序列11至序列14的序列中的一种序列表示。

4.一种重组DNA载体，其特征在于，包含根据权利要求2或3所述的DNA。

5.一种宿主细胞，其特征在于，由权利要求4所述的重组DNA载体转化而成，其中所述宿主细胞不是植物或动物品种。

6.一种宿主细胞的提取物，其特征在于，上述宿主细胞由权利要求4所述的重组DNA载体转化而成，其中所述提取物包含权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶的变异体。

7.一种尸胺的生产方法，其特征在于，将选自由权利要求4所述的重组DNA载体转化而成的宿主细胞及上述宿主细胞的提取物组成的组中的一种用作生物催化剂。

8.根据权利要求7所述的尸胺的生产方法，其特征在于，利用葡萄糖生产尸胺。

9.根据权利要求7所述的尸胺的生产方法，其特征在于，使用1M至6M的浓度的赖氨酸作为基质。

10.一种权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶的变异体的制备方法，其特征在于，以组合的方式取代残基，以便在序列15的十聚体的界面中形成二硫键。

11.一种权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶的变异体的制备方法，其特征在于，以单独或组合的方式取代位于序列15的十聚体的界面8Å内的残基。

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