JP5961635B2 - １、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法 - Google Patents

１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、１，５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、１，５−ペンタメチレンジイソシアネートの製造方法およびポリイソシアネート組成物の製造方法に関するものである。
１，５−ペンタメチレンジアミンは、アミノ酸のリジンが脱炭酸することによって生成することが知られているジアミンであり、近年、バイオマス由来のポリマー原料、農薬、医薬の中間体として注目が集まりつつある。
１，５−ペンタメチレンジアミンの製造法としてはアミノ酸のリジンに大腸菌由来のリジン脱炭酸酵素を反応させて製造する方法が知られている（例えば、下記特許文献１参照。）。
本文献によれば使用する酵素量に制限はないが、適量は、精製酵素で２５ｍｇ／Ｌから７０ｍｇ／Ｌ、触媒休止菌体ならば５ｇ／Ｌから１５ｇ／Ｌの酵素が必要とされている。また、実施例からは５０ｍｇ／Ｌの精製酵素を用いて４５℃、４８時間の反応でアジピン酸で中和された１Ｍのリジンから０．９７Ｍの１，５−ペンタメチレンジアミンが得られることが示されている。しかし、一般的に精製酵素の製造には多大な費用がかかるため、ポリマー原料製造には触媒休止菌体を触媒として利用できることが好ましい。また、本文献によれば１０ｇ／Ｌのリジンを含む発酵液からは５０ｍｇ／Ｌの精製酵素を用いて４５℃、２４時間の反応で６．６ｇ／Ｌの１，５−ペンタメチレンジアミンが得られることが示されている。
また、Ｓａｂｏらによれば精製した大腸菌由来のリジン脱炭酸酵素の比活性は酵素１ｍｇあたり９００から１１００μｍｏｌ／ｍｉｎと示されている（例えば、下記非特許文献１参照。）。
また、ＴＡＫＡＴＳＵＫＡらによればセレノモナス ルミナンティウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）由来のリジン脱炭酸酵素の比活性は１ｋｇの酵素あたり１秒間に０．１９８ｍｏｌの１，５−ペンタメチレンジアミンを生成することが示されている（例えば、下記非特許文献２参照。）。
これは酵素１ｍｇあたり１分間に１１．８８μｍｏｌの１，５−ペンタメチレンジアミンを生成する活性であり、酵素あたりのリジン脱炭酸酵素としての活性は、大腸菌のものと比較すると１／１００程度の活性であった。
また、セレノモナス ルミナンティウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）由来のリジン脱炭酸酵素遺伝子の改変により活性向上する方法が知られている（例えば、下記非特許文献３参照。）。
本文献によれば２箇所のアミノ酸の変更によりＫｃａｔが１．３倍となることが示されている。
特開２００９−２０７４９５
Ｓａｂｏ， Ｄ． Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３（１９７４）ｐｐ．６６２-６７０． ＴＡＫＡＴＳＵＫＡら、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ６３ （１９９９） ， Ｎｏ． ６ ｐｐ．１０６３−１０６９ ＴＡＫＡＴＳＵＫＡら、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ６３ （１９９９） ， Ｎｏ． １０ ｐｐ．１８４３−１８４６
安価な１，５−ペンタメチレンジアミン製造のためには、より少ない酵素、または触媒休止菌体量、またはその処理物量で、より高濃度の１，５−ペンタメチレンジアミン蓄積量を短時間で実現することが必要であることは自明である。しかしながらリジンから１，５−ペンタメチレンジアミンを生成する反応において精製酵素、または触媒休止菌体量、またはその処理物量を削減していくと反応時間を延長しても反応が進まなくなる現象が見出された。
すなわち、本発明の課題は少ない精製酵素、触媒休止菌体または触媒死菌体量のとき反応が進まなくなる現象を解決し、高濃度の１，５−ペンタメチレンジアミンを短時間に製造する方法を提供することである。
また、本発明の別の課題はより少ない酵素、または触媒休止菌体量、またはその処理物量で、より高濃度の１，５−ペンタメチレンジアミン蓄積量を短時間で実現する触媒を提供し、また、その触媒を用いて高濃度の１，５−ペンタメチレンジアミンを短時間に製造する方法を提供することである。
さらに、本発明の別の課題は、効率的に１，５−ペンタメチレンジイソシアネートおよびポリイソシアネート組成物を製造する方法を提供することにある。
上記問題点を解決するために、本発明者らは、１，５−ペンタメチレンジアミンの製造方法について鋭意研究を行った結果、Ｌ−リジン水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させる際にリジン脱炭酸反応の失活を防ぐ物質を含む反応液で１，５−ペンタメチレンジアミンを製造することにより１，５−ペンタメチレンジアミンを効率的に得られることを見出した。
また、本発明者らは鋭意検討したところ、リジン脱炭酸酵素の特定部位に変異を導入することで、顕著に効率よく、１，５−ペンタメチレンジアミンを製造する変異型リジン脱炭酸酵素、もしくは該酵素を発現する菌体を見出した。さらに該リジン脱炭酸酵素を利用することで、工業的に有利な１，５−ペンタメチレンジアミン製造法を見出した。
すなわち本発明は、
［１］リジン脱炭酸反応の減速または停止を防ぐ物質の存在下において、Ｌ−リジン及び／またはその塩を、リジン脱炭酸酵素及び／または変異型リジン脱炭酸酵素によって、リジン脱炭酸反応させることを特徴とする、１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［２］リジン脱炭酸酵素及び／または変異型リジン脱炭酸酵素をリジン１ｇ当たり５ｕｎｉｔから１６５ｕｎｉｔ使用する、または、リジン１ｇあたり精製酵素換算で５μｇから１６５μｇ使用することを特徴とする、［１］に記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［３］リジン脱炭酸反応の減速または停止を防ぐ物質が、微生物の発酵液またはその処理物またはそれらに含まれる成分であることを特徴とする、［１］または［２］に記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［４］リジン脱炭酸反応の減速または停止を防ぐ物質が、リジン生産時の発酵液、またはその処理物に含まれる成分であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかに記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［５］リジン脱炭酸反応の減速または停止を防ぐ物質が、微生物を培養した培養液に含まれる成分であることを特徴とする、［１］〜［４］のいずれかに記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［６］リジン脱炭酸反応の減速または停止を防ぐ物質が、微生物または微生物処理物であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［７］微生物が、原核生物および／または真核生物であることを特徴とする、［５］または［６］に記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［８］微生物がリジン生産菌であることを特徴とする、［５］〜［７］のいずれかに記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［９］リジン脱炭酸反応の減速または停止を防ぐ物質が、微生物が炭素源としうる化合物であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［１０］微生物が炭素源としうる化合物が、コーンスティープリカー、廃糖蜜、糖類およびアミノ酸類からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、［９］に記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［１１］反応の減速または停止を防ぐ物質が、微生物と、微生物が炭素源としうる化合物との混合物であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［１２］変異型リジン脱炭酸酵素が、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、前記アミノ酸配列中のアミノ酸の少なくとも１つが、活性が上昇する他のアミノ酸に置換されている変異型リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする、［１］〜［１１］のいずれかに記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［１３］他のアミノ酸に置換される前記アミノ酸が、１０量体形成ドメインおよび／または活性領域ドメインに存在することを特徴とする、［１２］に記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［１４］前記１０量体形成ドメインが、ウィングドメインおよび／またはリンカードメインであり、前記活性領域ドメインが、ピリドキサールリン酸酵素共通ドメインおよび／または基質出入口であることを特徴とする、［１３］に記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［１５］配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、前記１０量体形成ドメインに存在する前記アミノ酸が、１４、２８、３９、６４、６７、７０、７５、７９、８３、８４、８５、８８、８９、９４、９５、９８、９９、１０４、１１２、１１９、１３７、１３８、１３９、１４３、１４５、１４８、１８２番目のアミノ酸であり、前記活性領域ドメインに存在する前記アミノ酸が、１８４、２５３、２６２、２８６、２９０、２９５、３０３、３１７、３３５、３５２、３５３、３８６、４３０、４４３、４４６、４６０、４６６、４７１、４７５、５０６、５２４、５３９、５４４、５４６、５５３、６２３、６２６、６３６、６４６、６４８、７１１番目のアミノ酸であることを特徴とする、［１３］または［１４］に記載の１，５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［１６］配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、前記ウィングドメインに存在する前記アミノ酸が、１４、２８、３９、６４、６７、７０、７５、７９、８３、８４、８５、８８、８９、９４、９５、９８、９９、１０４、１１２、１１９番目のアミノ酸であり、前記リンカードメインに存在する前記アミノ酸が、１３７、１３８、１３９、１４３、１４５、１４８、１８２番目のアミノ酸であり、前記ピリドキサールリン酸酵素共通ドメインに存在する前記アミノ酸が、１８４、２５３、２６２、２８６、２９０、２９５、３０３、３１７、３３５、３５２、３５３、３８６番目のアミノ酸であり、前記基質出入口に存在する前記アミノ酸が、４３０、４４３、４４６、４６０、４６６、４７１、４７５、５０６、５２４、５３９、５４４、５４６、５５３、６２３、６２６、６３６、６４６、６４８、７１１番目のアミノ酸であることを特徴とする、［１４］または［１５］に記載の１，５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［１７］配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１０量体形成ドメインに存在するアミノ酸のうち14番目のアミノ酸をPheからGlnに変更したもの、28番目のアミノ酸をArgからIleに変更したもの、39番目のアミノ酸をArgからIleに変更したもの、39番目のアミノ酸をArgからValに変更したもの、64番目のアミノ酸をLeuからLysに変更したもの、67番目のアミノ酸をCysからThrに変更したもの、67番目のアミノ酸をCysからLeuに変更したもの、70番目のアミノ酸をIleからLeuに変更したもの、70番目のアミノ酸をIleからProに変更したもの、75番目のアミノ酸をGluからProに変更したもの、75番目のアミノ酸をGluからHisに変更したもの、79番目のアミノ酸をLeuからIleに変更したもの、83番目のアミノ酸をAlaからLeuに変更したもの、84番目のアミノ酸をAsnからAspに変更したもの、84番目のアミノ酸をAsnからThrに変更したもの、85番目のアミノ酸をThrからProに変更したもの、88番目のアミノ酸をThrからLysに変更したもの、88番目のアミノ酸をThrからArgに変更したもの、88番目のアミノ酸をThrからAsnに変更したもの、89番目のアミノ酸をLeuからPheに変更したもの、94番目のアミノ酸をAsnからIleに変更したもの、95番目のアミノ酸をAspからProに変更したもの、98番目のアミノ酸をLeuからIleに変更したもの、99番目のアミノ酸をGlnからThrに変更したもの、104番目のアミノ酸をGluからAsnに変更したもの、104番目のアミノ酸をGluからLysに変更したもの、112番目のアミノ酸をAspからGluに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからAsnに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからIleに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからThrに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからSerに変更したもの、137番目のアミノ酸をPheからValに変更したもの、138番目のアミノ酸をLysからIleに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからValに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからCysに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからThrに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからSerに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからAsnに変更したもの、143番目のアミノ酸をGlyからGluに変更したもの、145番目のアミノ酸をTyrからArgに変更したもの、148番目のアミノ酸をCysからSerに変更したもの、148番目のアミノ酸をCysからAlaに変更したもの、182番目のアミノ酸をIleからMetに変更したもの、活性領域ドメインに存在するアミノ酸のうち184番目のアミノ酸をValからAlaに変更したもの、253番目のアミノ酸をMetからLeuに変更したもの、262番目のアミノ酸をPheからTyrに変更したもの、286番目のアミノ酸をAlaからAspに変更したもの、290番目のアミノ酸をLysからHisに変更したもの、295番目のアミノ酸をAlaからSerに変更したもの、303番目のアミノ酸をIleからThrに変更したもの、317番目のアミノ酸をPheからGlnに変更したもの、335番目のアミノ酸をProからAlaに変更したもの、352番目のアミノ酸をGlyからAlaに変更したもの、353番目のアミノ酸をArgからHisに変更したもの、386番目のアミノ酸をGluからSerに変更したもの、430番目のアミノ酸をGluからPheに変更したもの、443番目のアミノ酸をArgからMetに変更したもの、446番目のアミノ酸をSerからTyrに変更したもの、446番目のアミノ酸をSerからGlnに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからIleに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからAsnに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからCysに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからGlnに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからProに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからSerに変更したもの、466番目のアミノ酸をProからAsnに変更したもの、466番目のアミノ酸をProからGlyに変更したもの、466番目のアミノ酸をProからSerに変更したもの、471番目のアミノ酸をSerからTyrに変更したもの、475番目のアミノ酸をGlyからAsnに変更したもの、506番目のアミノ酸をAspからProに変更したもの、524番目のアミノ酸をValからLeuに変更したもの、524番目のアミノ酸をValからLeuに変更したもの、539番目のアミノ酸をIleからCysに変更したもの、539番目のアミノ酸をIleからLeuに変更したもの、544番目のアミノ酸をThrからAlaに変更したもの、544番目のアミノ酸をThrからSerに変更したもの、544番目のアミノ酸をThrからProに変更したもの、546番目のアミノ酸をAlaからSerに変更したもの、553番目のアミノ酸をLeuからValに変更したもの、623番目のアミノ酸をAlaからCysに変更したもの、623番目のアミノ酸をAlaからPheに変更したもの、623番目のアミノ酸をAlaからGlnに変更したもの、626番目のアミノ酸をLysからValに変更したもの、636番目のアミノ酸をTyrからCysに変更したもの、636番目のアミノ酸をTyrからProに変更したもの、646番目のアミノ酸をAlaからLeuに変更したもの、646番目のアミノ酸をAlaからIleに変更したもの、648番目のアミノ酸をMetからSerに変更したもの、710番目のアミノ酸をLysからThrに変更したもの、711番目のアミノ酸をGluからAspに変更したものに少なくとも１箇所以上置換されている変異型リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする、［１５］または［１６］に記載の１，５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［１８］配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、ウィングドメインに存在するアミノ酸のうち14番目のアミノ酸をPheからGlnに変更したもの、28番目のアミノ酸をArgからIleに変更したもの、39番目のアミノ酸をArgからIleに変更したもの、39番目のアミノ酸をArgからValに変更したもの、64番目のアミノ酸をLeuからLysに変更したもの、67番目のアミノ酸をCysからThrに変更したもの、67番目のアミノ酸をCysからLeuに変更したもの、70番目のアミノ酸をIleからLeuに変更したもの、70番目のアミノ酸をIleからProに変更したもの、75番目のアミノ酸をGluからProに変更したもの、75番目のアミノ酸をGluからHisに変更したもの、79番目のアミノ酸をLeuからIleに変更したもの、83番目のアミノ酸をAlaからLeuに変更したもの、84番目のアミノ酸をAsnからAspに変更したもの、84番目のアミノ酸をAsnからThrに変更したもの、85番目のアミノ酸をThrからProに変更したもの、88番目のアミノ酸をThrからLysに変更したもの、88番目のアミノ酸をThrからArgに変更したもの、88番目のアミノ酸をThrからAsnに変更したもの、89番目のアミノ酸をLeuからPheに変更したもの、94番目のアミノ酸をAsnからIleに変更したもの、95番目のアミノ酸をAspからProに変更したもの、98番目のアミノ酸をLeuからIleに変更したもの、99番目のアミノ酸をGlnからThrに変更したもの、104番目のアミノ酸をGluからAsnに変更したもの、104番目のアミノ酸をGluからLysに変更したもの、112番目のアミノ酸をAspからGluに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからAsnに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからIleに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからThrに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからSerに変更したもの、リンカードメインに存在するアミノ酸のうち137番目のアミノ酸をPheからValに変更したもの、138番目のアミノ酸をLysからIleに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからValに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからCysに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからThrに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからSerに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからAsnに変更したもの、143番目のアミノ酸をGlyからGluに変更したもの、145番目のアミノ酸をTyrからArgに変更したもの、148番目のアミノ酸をCysからSerに変更したもの、148番目のアミノ酸をCysからAlaに変更したもの、182番目のアミノ酸をIleからMetに変更したもの、ピリドキサールリン酸酵素共通ドメインに存在するアミノ酸のうち184番目のアミノ酸をValからAlaに変更したもの、253番目のアミノ酸をMetからLeuに変更したもの、262番目のアミノ酸をPheからTyrに変更したもの、286番目のアミノ酸をAlaからAspに変更したもの、290番目のアミノ酸をLysからHisに変更したもの、295番目のアミノ酸をAlaからSerに変更したもの、303番目のアミノ酸をIleからThrに変更したもの、317番目のアミノ酸をPheからGlnに変更したもの、335番目のアミノ酸をProからAlaに変更したもの、352番目のアミノ酸をGlyからAlaに変更したもの、353番目のアミノ酸をArgからHisに変更したもの、386番目のアミノ酸をGluからSerに変更したもの、基質出入口に存在するアミノ酸のうち430番目のアミノ酸をGluからPheに変更したもの、443番目のアミノ酸をArgからMetに変更したもの、446番目のアミノ酸をSerからTyrに変更したもの、446番目のアミノ酸をSerからGlnに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからIleに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからAsnに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからCysに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからGlnに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからProに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからSerに変更したもの、466番目のアミノ酸をProからAsnに変更したもの、466番目のアミノ酸をProからGlyに変更したもの、466番目のアミノ酸をProからSerに変更したもの、471番目のアミノ酸をSerからTyrに変更したもの、475番目のアミノ酸をGlyからAsnに変更したもの、506番目のアミノ酸をAspからProに変更したもの、524番目のアミノ酸をValからLeuに変更したもの、524番目のアミノ酸をValからLeuに変更したもの、539番目のアミノ酸をIleからCysに変更したもの、539番目のアミノ酸をIleからLeuに変更したもの、544番目のアミノ酸をThrからAlaに変更したもの、544番目のアミノ酸をThrからSerに変更したもの、544番目のアミノ酸をThrからProに変更したもの、546番目のアミノ酸をAlaからSerに変更したもの、553番目のアミノ酸をLeuからValに変更したもの、623番目のアミノ酸をAlaからCysに変更したもの、623番目のアミノ酸をAlaからPheに変更したもの、623番目のアミノ酸をAlaからGlnに変更したもの、626番目のアミノ酸をLysからValに変更したもの、636番目のアミノ酸をTyrからCysに変更したもの、636番目のアミノ酸をTyrからProに変更したもの、646番目のアミノ酸をAlaからLeuに変更したもの、646番目のアミノ酸をAlaからIleに変更したもの、648番目のアミノ酸をMetからSerに変更したもの、710番目のアミノ酸をLysからThrに変更したもの、711番目のアミノ酸をGluからAspに変更したものに少なくとも１箇所以上置換されている変異型リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする、［１６］または［１７］に記載の１，５−ペンタメチレンジアミンの製造方法。
［１９］変異型リジン脱炭酸酵素が、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、２９０、３３５、４７５および７１１番目のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されている変異型リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする、［１２］〜［１８］のいずれかに記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［２０］変異型リジン脱炭酸酵素が、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、２８６、２９０、３３５、４７５および７１１番目のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されている変異型リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする、［１２］〜［１８］のいずれかに記載の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法、
［２１］［１］〜［２０］のいずれかに記載の方法により得られた１、５−ペンタメチレンジアミンまたはその塩を、イソシアネート化することを特徴とする、１、５−ペンタメチレンジイソシアネートの製造方法、
［２２］［２１］に記載の方法により得られた１、５−ペンタメチレンジイソシアネートを、下記（ａ）〜（ｅ）の官能基を少なくとも１種含有するように変性することを特徴とする、ポリイソシアネート組成物の製造方法。
（ａ）イソシアヌレート基
（ｂ）アロファネート基
（ｃ）ビウレット基
（ｄ）ウレタン基
（ｅ）ウレア基
である。
本発明によれば、従来より少ない精製酵素、触媒休止菌体または触媒死菌体量のとき反応が進まなくなる現象を解決し、反応速度を向上し、高濃度の１，５−ペンタメチレンジアミンを短時間に製造する方法を提供することができ、さらに、そのような１，５−ペンタメチレンジアミンを用いることにより、効率的に１，５−ペンタメチレンジイソシアネートおよびポリイソシアネート組成物を製造することができる。
図１は、イオン交換水中におけるリジンの脱炭酸酵素反応の反応効率を示すグラフである。 図２は、発酵液Ａ中におけるリジンの脱炭酸酵素反応の反応効率を示すグラフである。 図３は、発酵液Ｂ中におけるリジンの脱炭酸酵素反応の反応効率を示すグラフである。
発明の実施形態
以下に本発明を詳しく説明する。
（１）リジン脱炭酸酵素
本発明におけるリジン脱炭酸酵素とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号ＥＣ４．１．１．１８に分類され、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）を補酵素として要求し、Ｌ−リジン（リジンとも記載する）から１，５−ペンタメチレンジアミン（ペンタン１，５―ジアミン、１，５―ペンタメチレンジアミンとも記載する）及び炭酸を生成する反応を触媒する酵素、及びこの酵素を遺伝子組み換え等の技術で高生産している菌体、及びその処理物を指す。本発明のリジン脱炭酸酵素はその由来は特に限定されるものではなく、例えば、公知の生物に由来するものが挙げられる。リジン脱炭酸酵素として、より具体的には、例えば、バシラス・ハロドゥランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）、ナイセリア・メニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）またはコリネバクテリウム・グルタミカス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの微生物に由来するものが挙げられる。安全性の観点から、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来するものが挙げられる。
発現する遺伝子は同様な効果を示せば特に制限はないが大腸菌由来のｃａｄＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００９０４８）が好適である。
（２）リジン脱炭酸酵素活性
本発明において、リジン脱炭酸酵素活性とは、リジンを脱炭酸して１，５−ペンタメチレンジアミンへと変換する反応を触媒する活性を意味する。本発明においてはリジンからの１，５−ペンタメチレンジアミンの生成量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定することにより、算出することができる。
活性の単位は、１分間に１μｍｏｌの１，５−ペンタメチレンジアミンを製造する活性を１ｕｎｉｔ（Ｕ）とし、菌体活性は、乾燥菌体換算重量１ｍｇ当たりの酵素活性（Ｕ／ｍｇ ｄｒｙ ｃｅｌｌｓ）で表示する。乾燥菌体換算重量とは乾燥して水分を含まない重量を表わし、例えば、菌体を含む液（菌体液）から遠心分離やろ過などの方法で菌体を分離し、重量が一定になるまで乾燥し、その重量を測定することで乾燥菌体換算重量を求めることができる。測定はSaboらの方法に従い測定することができる。
（３）反応の減速または停止を防ぐ物質
本発明における反応の減速または停止を防ぐ物質とは、Ｌ−リジン、ＰＬＰ、リジン脱炭酸酵素、水、ｐＨを調製するために使用される無機の酸類、塩基類およびジカルボン酸類を除く反応液中の物質であり、Ｌ−リジン水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させる際にリジン脱炭酸反応の反応速度の急激な低下、または停止する現象を防ぐ効果がある物質、言い換えると、当該反応系において、リジン脱炭酸反応を促進する物質である。例えば、微生物を培養した培養液、微生物、微生物が利用しうる炭素源、及びリジン発酵液等が例示できる。
すなわち、後述するように、培養された微生物を用いて、グルコースなどを発酵させることにより、リジンを生産する場合、そのリジン生産時の発酵液（リジン発酵液）は、微生物を培養した培養液を含有しており、また、その培養液は、微生物および微生物が利用しうる炭素源を含有している。
本発明における菌体とは複数の種類に分けられる。誤解を避けるため本発明においては以下のように定める。リジン脱炭酸酵素を高生産し、野生株より高いリジン脱炭酸活性を有する菌体を「触媒菌体」とする。さらに生きている触媒菌体を「触媒生菌体」、生育を休止している触媒菌体を「触媒休止菌体」、増殖能を消失している触媒菌体を「触媒死菌体」とする。また、グルコースからリジンを１０ｇ／Ｌ以上培養液中に生産する菌体を「リジン生産菌」とする。
本発明における微生物とは、触媒菌体以外の一般の菌体を「微生物」とし、リジン生産菌は微生物に含まれるものとする。微生物の種類は特に限定されないが、好適なものとして酵母、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、大腸菌などが例示できる。特にコリネバクテリウムは効果が高い。好適な濃度は反応液の組成により変化するが、例えば水、ＰＬＰ、酵素、リジン塩酸塩のみの組成では大腸菌であれば生菌数で１×１０＾８個／ｍｌ以上の濃度が好適である。また、酵母であれば生菌数で１×１０＾７個／ｍｌ以上の濃度が好適である。また、コリネバクテリウムであれば生菌数で１×１０＾６個／ｍｌ以上の濃度が好適である。上限は基質であるリジンが溶解し、反応液に流動性があれば特に制限はないが、一般には菌体湿重量で５００ｇ／Ｌ以下である。また、反応液中に微生物が炭素源としうる添加物がある場合は混合する微生物の濃度を下げることが可能であり、例えば糖蜜やコーンスティープリカー（ＣＳＬ）を０．５ｇ／Ｌ混合すればコリネバクテリウムであれば生菌数で１×１０＾３個／ｍｌ以上の濃度が好適となる。さらに反応液が発酵液の遠心分離上静を含む場合、または発酵液の遠心分離上静そのものである場合は５０個／ｍｌ以上の濃度が好適となる。ただし、発酵液を使用する場合は遠心分離前のリジン生産菌が残っている状態で反応を行い、反応終了後にリジン生産菌と共に触媒菌体を遠心分離等により除菌するのが効率が良い。また、反応開始はリジン発酵終了前に開始することも出来る。
本発明における微生物処理物とは、例えばドライイーストやアルコール発酵スターター、凍結保存菌体のように生育可能な状態になれば生育を開始する休止状態の微生物を指す。
本発明における微生物が炭素源としうる化合物とは、特に微生物が増殖に利用できる炭素源ならば限定はされないが、好適なものとしてはコーンスティープリカー、酵母エキス、糖蜜、糖類、ポリペプトン、アミノ酸類が例示でき、特にコーンスティープリカー及び酵母エキスは効果が高い。好適な濃度としては酵母エキス、及びコーンスティープリカーであれば１ｇ／Ｌ以上、ポリペプトンならば５ｇ／Ｌ以上、糖蜜ならば１０ｇ／Ｌ以上で効果がみられる。これらはコリネバクテリウムと共に混合すればさらに低濃度で効果を示し、例えば生菌数で１×１０＾３個／ｍｌ以上のコリネバクテリウムを混合すればそれぞれ０．５ｇ／Ｌで効果を示すことが出来る。
本発明におけるリジン生産時の発酵液とは培養液にリジン生産菌を植菌し、一定時間培養した液のことであり、少なくとも１０ｇ／Ｌ以上のリジンとリジン生産菌を含む液である。
本発明におけるリジン生産時の発酵液の処理物とはリジン生産時の発酵液の濃縮、または希釈した液、またはリジン生産時の発酵液からリジン生産菌を遠心分離等で除去した発酵液上清およびその濃縮、希釈物を指す。
本発明におけるリジン生産時の発酵液またはその処理物を反応液に添加する際は、少なくとも反応液の５％容量好ましくは２０％容量さらに好ましくは５０％容量以上である。
本発明におけるリジン生産時の発酵液に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることができる。培養は、振とう培養、通気撹拌培養等による好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
本発明におけるリジン生産時の発酵液に用いる微生物は、Ｌ−リジンを生成する能力を有する微生物であれば、野生株であってもよいし、該野生株から人工的に育種された育種株であってもよい。
例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物等をあげることができるが、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属する微生物が好ましい。
（４）変異型リジン脱炭酸酵素
本発明における変異型リジン脱炭酸酵素とは、主に遺伝子組換え技術を利用して野生型リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異を有し、かつ、リジン脱炭酸酵素自体の酵素活性が向上したことを特徴とするリジン脱炭酸酵素と定義される。変異型リジン脱炭酸酵素は、本発明の範囲に含まれる。
なお、アミノ酸配列中のアミノ酸は、リジン脱炭酸酵素中のアミノ酸残基に対応しており、それらは互いに対応関係にある。以下において、アミノ酸と称する場合には、アミノ酸配列として表記されるアミノ酸を示し、アミノ酸残基と称する場合には、リジン脱炭酸酵素中に含まれるアミノ酸残基を示す。
本発明において、変異型リジン脱炭酸酵素遺伝子の調製を行う方法は、変異を導入する既知の如何なる方法でもよく、通常は公知の方法で行うことができる。例えば、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ． ａｎｄ ｆｒｉｔａ，Ｈ．Ｊ．、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８７年、第１５４巻，第３５０頁）、リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）、特定の部分の核酸を化学合成する方法、遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法、遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、または、ニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法などが挙げられる。
このような変異を導入する方法のなかでは、好ましくは、部位特異的変異法が挙げられる。具体的には、野生型リジン脱炭酸酵素遺伝子を基に、市販のキットを利用して、部位特異的な置換を生じさせる方法である。
アミノ酸残基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、リジン脱炭酸活性を消失させなければどの様な位置であっても構わない。挿入、欠失又は置換したアミノ酸残基の数としては１アミノ酸残基又は２アミノ酸残基以上が挙げられ、例えば１アミノ酸残基〜１０アミノ酸残基、好ましくは１アミノ酸残基〜５アミノ酸残基が挙げられる。
本発明において、変異型リジン脱炭酸酵素をコードするアミノ酸配列及び塩基配列、又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列について、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列として、明細書全体を読み替えるものとする。
具体的には、本発明において、変異型リジン脱炭酸酵素は、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、そのアミノ酸配列中のアミノ酸の少なくとも１つが、活性が上昇する他のアミノ酸に置換されている。
配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列より生成されるタンパク質のアミノ酸配列であって、そのＮ末端のメチオニンを１番目のアミノ酸として、１〜１２９番目のアミノ酸がウィングドメインであり、１３０〜１８３番目のアミノ酸がリンカードメインであり、これら１〜１８３番目のアミノ酸が１０量体形成ドメインを形成している。また、１８４〜４１７番目のアミノ酸がピリドキサールリン酸酵素（ＰＬＰ酵素）共通ドメインであり、４１８〜７１５番目のアミノ酸が基質出入口であり、これら１８４〜７１５番目のアミノ酸が活性領域ドメインを形成している。
そして、本発明における変異型リジン脱炭酸酵素では、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１０量体形成ドメインおよび／または活性領域ドメインに存在するアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されており、詳しくは、１０量体形成ドメイン中のウィングドメインおよび／またはリンカードメインに存在するアミノ酸、および／または、活性領域ドメイン中のピリドキサールリン酸酵素共通ドメインおよび／または基質出入口に存在するアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されている。
つまり、変異型リジン脱炭酸酵素において、上記のアミノ酸配列中のアミノ酸に対応するアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されている。
変異型リジン脱炭酸酵素として、好ましくは、少なくとも１３７、１３８、２８６、２９０、２９５、３０３、３１７、３３５、３５２、３５３、３８６、４４３、４６６、４７５、５５３、７１１番目のアミノ酸残基及び１４、２８、３９、６４、６７、７０、７５、７９、８３、８４、８５、８８、８９、９４、９５、９８、９９、１０４、１１２、１１９、１３９、１４３、１４５、１４８、１８２、１８４、２５３、２６２、４３０、４４６、４６０、４７１、５０６、５２４、５３９、５４４、５４６、６２３、６２６、６３６、６４６、６４８番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に１つ以上置換した変異型酵素が挙げられる。
本発明における少なくとも１３７、１３８、２８６、２９０、２９５、３０３、３１７、３３５、３５２、３５３、３８６、４４３、４６６、４７５、５５３、７１１番目のアミノ酸残基及び１４、２８、３９、６４、６７、７０、７５、７９、８３、８４、８５、８８、８９、９４、９５、９８、９９、１０４、１１２、１１９、１３９、１４３、１４５、１４８、１８２、１８４、２５３、２６２、４３０、４４６、４６０、４７１、５０６、５２４、５３９、５４４、５４６、６２３、６２６、６３６、６４６、６４８番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に１つ以上置換した変異型酵素とは、配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列より生成されるタンパク質のアミノ酸配列（配列表の配列番号４）のＮ末端のメチオニンを１番目のアミノ酸として１３７、１３８、２８６、２９０、２９５、３０３、３１７、３３５、３５２、３５３、３８６、４４３、４６６、４７５、５５３、７１１番目のアミノ酸及び１４、２８、３９、６４、６７、７０、７５、７９、８３、８４、８５、８８、８９、９４、９５、９８、９９、１０４、１１２、１１９、１３９、１４３、１４５、１４８、１８２、１８４、２５３、２６２、４３０、４４６、４６０、４７１、５０６、５２４、５３９、５４４、５４６、６２３、６２６、６３６、６４６、６４８番目のアミノ酸を少なくとも１つ以上、元のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換した配列の変異型酵素を指す。ただし８９番目のアミノ酸をアルギニンに変更したものは除く。変更後のアミノ酸配列は変更前よりも良い性質、例えば比活性の向上、反応中のｐＨ変化に強い性質、反応生成物に対する耐性、阻害の緩和等、があれば特に制限はないが、表１〜６に記載の配列により生成されるアミノ酸配列は特に好ましい。
好ましい変異型リジン脱炭酸酵素として、より具体的には、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１０量体形成ドメインに存在するアミノ酸のうち14番目のアミノ酸をPheからGlnに変更したもの、28番目のアミノ酸をArgからIleに変更したもの、39番目のアミノ酸をArgからIleに変更したもの、39番目のアミノ酸をArgからValに変更したもの、64番目のアミノ酸をLeuからLysに変更したもの、67番目のアミノ酸をCysからThrに変更したもの、67番目のアミノ酸をCysからLeuに変更したもの、70番目のアミノ酸をIleからLeuに変更したもの、70番目のアミノ酸をIleからProに変更したもの、75番目のアミノ酸をGluからProに変更したもの、75番目のアミノ酸をGluからHisに変更したもの、79番目のアミノ酸をLeuからIleに変更したもの、83番目のアミノ酸をAlaからLeuに変更したもの、84番目のアミノ酸をAsnからAspに変更したもの、84番目のアミノ酸をAsnからThrに変更したもの、85番目のアミノ酸をThrからProに変更したもの、88番目のアミノ酸をThrからLysに変更したもの、88番目のアミノ酸をThrからArgに変更したもの、88番目のアミノ酸をThrからAsnに変更したもの、89番目のアミノ酸をLeuからPheに変更したもの、94番目のアミノ酸をAsnからIleに変更したもの、95番目のアミノ酸をAspからProに変更したもの、98番目のアミノ酸をLeuからIleに変更したもの、99番目のアミノ酸をGlnからThrに変更したもの、104番目のアミノ酸をGluからAsnに変更したもの、104番目のアミノ酸をGluからLysに変更したもの、112番目のアミノ酸をAspからGluに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからAsnに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからIleに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからThrに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからSerに変更したもの、137番目のアミノ酸をPheからValに変更したもの、138番目のアミノ酸をLysからIleに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからValに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからCysに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからThrに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからSerに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからAsnに変更したもの、143番目のアミノ酸をGlyからGluに変更したもの、145番目のアミノ酸をTyrからArgに変更したもの、148番目のアミノ酸をCysからSerに変更したもの、148番目のアミノ酸をCysからAlaに変更したもの、182番目のアミノ酸をIleからMetに変更したもの、活性領域ドメインに存在するアミノ酸のうち184番目のアミノ酸をValからAlaに変更したもの、253番目のアミノ酸をMetからLeuに変更したもの、262番目のアミノ酸をPheからTyrに変更したもの、286番目のアミノ酸をAlaからAspに変更したもの、290番目のアミノ酸をLysからHisに変更したもの、295番目のアミノ酸をAlaからSerに変更したもの、303番目のアミノ酸をIleからThrに変更したもの、317番目のアミノ酸をPheからGlnに変更したもの、335番目のアミノ酸をProからAlaに変更したもの、352番目のアミノ酸をGlyからAlaに変更したもの、353番目のアミノ酸をArgからHisに変更したもの、386番目のアミノ酸をGluからSerに変更したもの、430番目のアミノ酸をGluからPheに変更したもの、443番目のアミノ酸をArgからMetに変更したもの、446番目のアミノ酸をSerからTyrに変更したもの、446番目のアミノ酸をSerからGlnに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからIleに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからAsnに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからCysに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからGlnに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからProに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからSerに変更したもの、466番目のアミノ酸をProからAsnに変更したもの、466番目のアミノ酸をProからGlyに変更したもの、466番目のアミノ酸をProからSerに変更したもの、471番目のアミノ酸をSerからTyrに変更したもの、475番目のアミノ酸をGlyからAsnに変更したもの、506番目のアミノ酸をAspからProに変更したもの、524番目のアミノ酸をValからLeuに変更したもの、524番目のアミノ酸をValからLeuに変更したもの、539番目のアミノ酸をIleからCysに変更したもの、539番目のアミノ酸をIleからLeuに変更したもの、544番目のアミノ酸をThrからAlaに変更したもの、544番目のアミノ酸をThrからSerに変更したもの、544番目のアミノ酸をThrからProに変更したもの、546番目のアミノ酸をAlaからSerに変更したもの、553番目のアミノ酸をLeuからValに変更したもの、623番目のアミノ酸をAlaからCysに変更したもの、623番目のアミノ酸をAlaからPheに変更したもの、623番目のアミノ酸をAlaからGlnに変更したもの、626番目のアミノ酸をLysからValに変更したもの、636番目のアミノ酸をTyrからCysに変更したもの、636番目のアミノ酸をTyrからProに変更したもの、646番目のアミノ酸をAlaからLeuに変更したもの、646番目のアミノ酸をAlaからIleに変更したもの、648番目のアミノ酸をMetからSerに変更したもの、710番目のアミノ酸をLysからThrに変更したもの、711番目のアミノ酸をGluからAspに変更したものに少なくとも１箇所以上置換されている変異型リジン脱炭酸酵素が挙げられる。
より具体的には、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、ウィングドメインに存在するアミノ酸のうち14番目のアミノ酸をPheからGlnに変更したもの、28番目のアミノ酸をArgからIleに変更したもの、39番目のアミノ酸をArgからIleに変更したもの、39番目のアミノ酸をArgからValに変更したもの、64番目のアミノ酸をLeuからLysに変更したもの、67番目のアミノ酸をCysからThrに変更したもの、67番目のアミノ酸をCysからLeuに変更したもの、70番目のアミノ酸をIleからLeuに変更したもの、70番目のアミノ酸をIleからProに変更したもの、75番目のアミノ酸をGluからProに変更したもの、75番目のアミノ酸をGluからHisに変更したもの、79番目のアミノ酸をLeuからIleに変更したもの、83番目のアミノ酸をAlaからLeuに変更したもの、84番目のアミノ酸をAsnからAspに変更したもの、84番目のアミノ酸をAsnからThrに変更したもの、85番目のアミノ酸をThrからProに変更したもの、88番目のアミノ酸をThrからLysに変更したもの、88番目のアミノ酸をThrからArgに変更したもの、88番目のアミノ酸をThrからAsnに変更したもの、89番目のアミノ酸をLeuからPheに変更したもの、94番目のアミノ酸をAsnからIleに変更したもの、95番目のアミノ酸をAspからProに変更したもの、98番目のアミノ酸をLeuからIleに変更したもの、99番目のアミノ酸をGlnからThrに変更したもの、104番目のアミノ酸をGluからAsnに変更したもの、104番目のアミノ酸をGluからLysに変更したもの、112番目のアミノ酸をAspからGluに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからAsnに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからIleに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからThrに変更したもの、119番目のアミノ酸をGlnからSerに変更したもの、リンカードメインに存在するアミノ酸のうち137番目のアミノ酸をPheからValに変更したもの、138番目のアミノ酸をLysからIleに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからValに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからCysに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからThrに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからSerに変更したもの、139番目のアミノ酸をTyrからAsnに変更したもの、143番目のアミノ酸をGlyからGluに変更したもの、145番目のアミノ酸をTyrからArgに変更したもの、148番目のアミノ酸をCysからSerに変更したもの、148番目のアミノ酸をCysからAlaに変更したもの、182番目のアミノ酸をIleからMetに変更したもの、ピリドキサールリン酸酵素共通ドメインに存在するアミノ酸のうち184番目のアミノ酸をValからAlaに変更したもの、253番目のアミノ酸をMetからLeuに変更したもの、262番目のアミノ酸をPheからTyrに変更したもの、286番目のアミノ酸をAlaからAspに変更したもの、290番目のアミノ酸をLysからHisに変更したもの、295番目のアミノ酸をAlaからSerに変更したもの、303番目のアミノ酸をIleからThrに変更したもの、317番目のアミノ酸をPheからGlnに変更したもの、335番目のアミノ酸をProからAlaに変更したもの、352番目のアミノ酸をGlyからAlaに変更したもの、353番目のアミノ酸をArgからHisに変更したもの、386番目のアミノ酸をGluからSerに変更したもの、基質出入口に存在するアミノ酸のうち430番目のアミノ酸をGluからPheに変更したもの、443番目のアミノ酸をArgからMetに変更したもの、446番目のアミノ酸をSerからTyrに変更したもの、446番目のアミノ酸をSerからGlnに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからIleに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからAsnに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからCysに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからGlnに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからProに変更したもの、460番目のアミノ酸をAspからSerに変更したもの、466番目のアミノ酸をProからAsnに変更したもの、466番目のアミノ酸をProからGlyに変更したもの、466番目のアミノ酸をProからSerに変更したもの、471番目のアミノ酸をSerからTyrに変更したもの、475番目のアミノ酸をGlyからAsnに変更したもの、506番目のアミノ酸をAspからProに変更したもの、524番目のアミノ酸をValからLeuに変更したもの、524番目のアミノ酸をValからLeuに変更したもの、539番目のアミノ酸をIleからCysに変更したもの、539番目のアミノ酸をIleからLeuに変更したもの、544番目のアミノ酸をThrからAlaに変更したもの、544番目のアミノ酸をThrからSerに変更したもの、544番目のアミノ酸をThrからProに変更したもの、546番目のアミノ酸をAlaからSerに変更したもの、553番目のアミノ酸をLeuからValに変更したもの、623番目のアミノ酸をAlaからCysに変更したもの、623番目のアミノ酸をAlaからPheに変更したもの、623番目のアミノ酸をAlaからGlnに変更したもの、626番目のアミノ酸をLysからValに変更したもの、636番目のアミノ酸をTyrからCysに変更したもの、636番目のアミノ酸をTyrからProに変更したもの、646番目のアミノ酸をAlaからLeuに変更したもの、646番目のアミノ酸をAlaからIleに変更したもの、648番目のアミノ酸をMetからSerに変更したもの、710番目のアミノ酸をLysからThrに変更したもの、711番目のアミノ酸をGluからAspに変更したものに少なくとも１箇所以上置換されている変異型リジン脱炭酸酵素が挙げられる。
また、好ましい変異型リジン脱炭酸酵素としては、活性領域ドメイン、具体的には、２９０、３３５、４７５、７１１番目のアミノ酸残基、２８６、２９０、３３５、４７５、７１１番目のアミノ酸残基、１４８、６４６番目のアミノ酸残基、４７１、６２６番目のアミノ酸残基、６２６、６４６番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異型酵素が挙げられる。
本発明における２９０、３３５、４７５、７１１番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異型酵素とは配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列より生成されるタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端のメチオニンを１番目のアミノ酸として２９０、３３５、４７５、７１１番目の4箇所のアミノ酸を元のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換した配列の変異型酵素を指す。
本発明における２８６、２９０、３３５、４７５、７１１番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異型酵素とは配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列より生成されるタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端のメチオニンを１番目のアミノ酸として２８６、２９０、３３５、４７５、７１１番目の５箇所のアミノ酸を元のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換した配列の変異型酵素を指す。
本発明における１４８、６４６番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異型酵素とは配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列より生成されるタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端のメチオニンを１番目のアミノ酸として１４８、６４６番目の２箇所のアミノ酸を元のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換した配列の変異型酵素を指す。
本発明における４７１、６２６番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異型酵素とは配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列より生成されるタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端のメチオニンを１番目のアミノ酸として４７１、６２６番目の２箇所のアミノ酸を元のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換した配列の変異型酵素を指す。
本発明における６２６、６４６番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異型酵素とは配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列より生成されるタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端のメチオニンを１番目のアミノ酸として６２６、６４６番目の２箇所のアミノ酸を元のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換した配列の変異型酵素を指す。
変更後のアミノ酸配列は元の配列の酵素よりも良い性質があれば特に制限はないが、それぞれ表１〜６に記載の配列により生成されるアミノ酸配列は特に好ましい。
また、上記では、変更変異型リジン脱炭酸酵素が、アミノ酸配列のアミノ酸を変更したものとして示したが、変更変異型リジン脱炭酸酵素は、アミノ酸をコードする塩基配列を変更したものとして示すこともできる。
そのような変異型リジン脱炭酸酵素としては、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１０量体形成ドメインに存在するアミノ酸のうち14番目のアミノ酸であるPheをコードする塩基配列がTTTからGlnをコードする塩基配列であるCAAに変更したもの、22番目のアミノ酸であるLeuをコードする塩基配列がCTTからLeuをコードする塩基配列であるTTGに変更したもの、28番目のアミノ酸であるArgをコードする塩基配列がCGTからIleをコードする塩基配列であるATTに変更したもの、39番目のアミノ酸であるArgをコードする塩基配列がCGTからIleをコードする塩基配列であるATAに変更したもの、39番目のアミノ酸であるArgをコードする塩基配列がCGTからIleをコードする塩基配列であるATCに変更したもの、39番目のアミノ酸であるArgをコードする塩基配列がCGTからValをコードする塩基配列であるGTGに変更したもの、64番目のアミノ酸であるLeuをコードする塩基配列がCTCからLysをコードする塩基配列であるAAAに変更したもの、67番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGCからThrをコードする塩基配列であるACCに変更したもの、67番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGCからLeuをコードする塩基配列であるTTAに変更したもの、70番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATTからLeuをコードする塩基配列であるTTGに変更したもの、70番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATTからLeuをコードする塩基配列であるCTGに変更したもの、70番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATTからProをコードする塩基配列であるCCGに変更したもの、75番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAGからProをコードする塩基配列であるCCCに変更したもの、75番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAGからHisをコードする塩基配列であるCACに変更したもの、79番目のアミノ酸であるLeuをコードする塩基配列がTTGからIleをコードする塩基配列であるATAに変更したもの、83番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCTからLeuをコードする塩基配列であるCTGに変更したもの、83番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCTからLeuをコードする塩基配列であるCTAに変更したもの、83番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCTからLeuをコードする塩基配列であるCTTに変更したもの、83番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCTからAlaをコードする塩基配列であるATAに変更したもの、83番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCTからAlaをコードする塩基配列であるGCCに変更したもの、84番目のアミノ酸であるAsnをコードする塩基配列がAATからAspをコードする塩基配列であるGACに変更したもの、84番目のアミノ酸であるAsnをコードする塩基配列がAATからThrをコードする塩基配列であるACAに変更したもの、85番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACGからProをコードする塩基配列であるCCAに変更したもの、88番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACTからLysをコードする塩基配列であるAAAに変更したもの、88番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACTからLysをコードする塩基配列であるAAGに変更したもの、88番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACTからArgをコードする塩基配列であるAGAに変更したもの、88番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACTからAsnをコードする塩基配列であるAATに変更したもの、89番目のアミノ酸であるLeuをコードする塩基配列がCTCからPheをコードする塩基配列であるTTTに変更したもの、94番目のアミノ酸であるAsnをコードする塩基配列がAATからIleをコードする塩基配列であるATCに変更したもの、95番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGACからProをコードする塩基配列であるCCGに変更したもの、98番目のアミノ酸であるLeuをコードする塩基配列がTTAからIleをコードする塩基配列であるATAに変更したもの、99番目のアミノ酸であるGlnをコードする塩基配列がCAGからThrをコードする塩基配列であるACTに変更したもの、104番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAAからAsnをコードする塩基配列であるAATに変更したもの、104番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAAからLysをコードする塩基配列であるAAAに変更したもの、112番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからGluをコードする塩基配列であるGAGに変更したもの、119番目のアミノ酸であるGlnをコードする塩基配列がCAGからAsnをコードする塩基配列であるAACに変更したもの、119番目のアミノ酸であるGlnをコードする塩基配列がCAGからAsnをコードする塩基配列であるAATに変更したもの、119番目のアミノ酸であるGlnをコードする塩基配列がCAGからIleをコードする塩基配列であるATTに変更したもの、119番目のアミノ酸であるGlnをコードする塩基配列がCAGからThrをコードする塩基配列であるACCに変更したもの、119番目のアミノ酸であるGlnをコードする塩基配列がCAGからSerをコードする塩基配列であるAGTに変更したもの、137番目のアミノ酸であるPheをコードする塩基配列がTTTからValをコードする塩基配列であるGTCに変更したもの、138番目のアミノ酸であるLysをコードする塩基配列がAAAからIleをコードする塩基配列であるATCに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからValをコードする塩基配列であるGTAに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからValをコードする塩基配列であるGTGに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからCysをコードする塩基配列であるTGCに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからThrをコードする塩基配列であるACAに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからSerをコードする塩基配列であるTCTに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからSerをコードする塩基配列であるAGTに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからAsnをコードする塩基配列であるAACに変更したもの、143番目のアミノ酸であるGlyをコードする塩基配列がGGTからGluをコードする塩基配列であるGAAに変更したもの、145番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからArgをコードする塩基配列であるCGTに変更したもの、145番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからArgをコードする塩基配列であるAGAに変更したもの、148番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGTからSerをコードする塩基配列であるAGTに変更したもの、148番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGTからSerをコードする塩基配列であるTCTに変更したもの、148番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGTからSerをコードする塩基配列であるTCCに変更したもの、148番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGTからSerをコードする塩基配列であるTCAに変更したもの、148番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGTからAlaをコードする塩基配列であるGCGに変更したもの、148番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGTからAlaをコードする塩基配列であるGCAに変更したもの、182番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATTからMetをコードする塩基配列であるATGに変更したもの、活性領域ドメインに存在するアミノ酸のうち184番目のアミノ酸であるValをコードする塩基配列がGTAからAlaをコードする塩基配列であるGCCに変更したもの、184番目のアミノ酸であるValをコードする塩基配列がGTAからAlaをコードする塩基配列であるGCAに変更したもの、253番目のアミノ酸であるMetをコードする塩基配列がATGからLeuをコードする塩基配列であるCTAに変更したもの、262番目のアミノ酸であるPheをコードする塩基配列がTTCからTyrをコードする塩基配列であるTATに変更したもの、286番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCTからAspをコードする塩基配列であるGACに変更したもの、290番目のアミノ酸であるLysをコードする塩基配列がAAAからHisをコードする塩基配列であるCACに変更したもの、295番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCA からSerをコードする塩基配列であるTCAに変更したもの、303番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATTからThrをコードする塩基配列であるACAに変更したもの、317番目のアミノ酸であるPheをコードする塩基配列がTTCからGlnをコードする塩基配列であるCAGに変更したもの、335番目のアミノ酸であるProをコードする塩基配列がCCTからAlaをコードする塩基配列であるGCTに変更したもの、352番目のアミノ酸であるGlyをコードする塩基配列がGGCからAlaをコードする塩基配列であるGCAに変更したもの、353番目のアミノ酸であるArgをコードする塩基配列がCGTからHisをコードする塩基配列であるCATに変更したもの、386番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAAからSerをコードする塩基配列であるTCCに変更したもの、430番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAAからPheをコードする塩基配列であるTTCに変更したもの、443番目のアミノ酸であるArgをコードする塩基配列がAGAからMetをコードする塩基配列であるATGに変更したもの、446番目のアミノ酸であるSerをコードする塩基配列がTCTからTyrをコードする塩基配列であるTACに変更したもの、446番目のアミノ酸であるSerをコードする塩基配列がTCTからGlnをコードする塩基配列であるCAAに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからIleをコードする塩基配列であるATTに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからAsnをコードする塩基配列であるAATに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからCysをコードする塩基配列であるTGTに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからGlnをコードする塩基配列であるCAGに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからProをコードする塩基配列であるCCCに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからProをコードする塩基配列であるCCTに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからProをコードする塩基配列であるCCGに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからSerをコードする塩基配列であるTCAに変更したもの、466番目のアミノ酸であるProをコードする塩基配列がCCGからAsnをコードする塩基配列であるAACに変更したもの、466番目のアミノ酸であるProをコードする塩基配列がCCGからGlyをコードする塩基配列であるGGCに変更したもの、466番目のアミノ酸であるProをコードする塩基配列がCCGからSerをコードする塩基配列であるTCTに変更したもの、471番目のアミノ酸であるSerをコードする塩基配列がAGCからTyrをコードする塩基配列であるTATに変更したもの、475番目のアミノ酸であるGlyをコードする塩基配列がGGCからAsnをコードする塩基配列であるAATに変更したもの、506番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGACからProをコードする塩基配列であるCCAに変更したもの、524番目のアミノ酸であるValをコードする塩基配列がGTTからLeuをコードする塩基配列であるTTAに変更したもの、524番目のアミノ酸であるValをコードする塩基配列がGTTからLeuをコードする塩基配列であるCTGに変更したもの、539番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATCからCysをコードする塩基配列であるTGCに変更したもの、539番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATCからLeuをコードする塩基配列であるCTTに変更したもの、539番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATCからLeuをコードする塩基配列であるCTAに変更したもの、544番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACCからAlaをコードする塩基配列であるGCGに変更したもの、544番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACCからAlaをコードする塩基配列であるGCTに変更したもの、544番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACCからSerをコードする塩基配列であるTCTに変更したもの、54
4番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACCからSerをコードする塩基配列であるTCCに変更したもの、544番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACCからProをコードする塩基配列であるCCTに変更したもの、544番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACCからProをコードする塩基配列であるCCGに変更したもの、546番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCAからSerをコードする塩基配列であるAGCに変更したもの、553番目のアミノ酸であるLeuをコードする塩基配列がCTGからValをコードする塩基配列であるGTAに変更したもの、623番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCAからCysをコードする塩基配列であるTGTに変更したもの、623番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCAからPheをコードする塩基配列であるTTTに変更したもの、623番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCAからPheをコードする塩基配列であるTTCに変更したもの、623番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCAからGlnをコードする塩基配列であるCAGに変更したもの、626番目のアミノ酸であるLysをコードする塩基配列がAAAからValをコードする塩基配列であるGTGに変更したもの、636番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTACからCysをコードする塩基配列であるTGTに変更したもの、636番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTACからProをコードする塩基配列であるCCCに変更したもの、646番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCCからLeuをコードする塩基配列であるTTGに変更したもの、646番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCCからIleをコードする塩基配列であるATCに変更したもの、648番目のアミノ酸であるMetをコードする塩基配列がATGからSerをコードする塩基配列であるTCTに変更したもの、648番目のアミノ酸であるMetをコードする塩基配列がATGからSerをコードする塩基配列であるTCCに変更したもの、710番目のアミノ酸であるLysをコードする塩基配列がAAAからThrをコードする塩基配列であるACGに変更したもの、711番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAAからAspをコードする塩基配列であるGACに変更したものに少なくとも１箇所以上置換されている変異型リジン脱炭酸酵素が挙げられる。
より具体的には、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、ウィングドメインに存在するアミノ酸のうち14番目のアミノ酸であるPheをコードする塩基配列がTTTからGlnをコードする塩基配列であるCAAに変更したもの、22番目のアミノ酸であるLeuをコードする塩基配列がCTTからLeuをコードする塩基配列であるTTGに変更したもの、28番目のアミノ酸であるArgをコードする塩基配列がCGTからIleをコードする塩基配列であるATTに変更したもの、39番目のアミノ酸であるArgをコードする塩基配列がCGTからIleをコードする塩基配列であるATAに変更したもの、39番目のアミノ酸であるArgをコードする塩基配列がCGTからIleをコードする塩基配列であるATCに変更したもの、39番目のアミノ酸であるArgをコードする塩基配列がCGTからValをコードする塩基配列であるGTGに変更したもの、64番目のアミノ酸であるLeuをコードする塩基配列がCTCからLysをコードする塩基配列であるAAAに変更したもの、67番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGCからThrをコードする塩基配列であるACCに変更したもの、67番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGCからLeuをコードする塩基配列であるTTAに変更したもの、70番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATTからLeuをコードする塩基配列であるTTGに変更したもの、70番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATTからLeuをコードする塩基配列であるCTGに変更したもの、70番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATTからProをコードする塩基配列であるCCGに変更したもの、75番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAGからProをコードする塩基配列であるCCCに変更したもの、75番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAGからHisをコードする塩基配列であるCACに変更したもの、79番目のアミノ酸であるLeuをコードする塩基配列がTTGからIleをコードする塩基配列であるATAに変更したもの、83番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCTからLeuをコードする塩基配列であるCTGに変更したもの、83番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCTからLeuをコードする塩基配列であるCTAに変更したもの、83番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCTからLeuをコードする塩基配列であるCTTに変更したもの、83番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCTからAlaをコードする塩基配列であるATAに変更したもの、83番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCTからAlaをコードする塩基配列であるGCCに変更したもの、84番目のアミノ酸であるAsnをコードする塩基配列がAATからAspをコードする塩基配列であるGACに変更したもの、84番目のアミノ酸であるAsnをコードする塩基配列がAATからThrをコードする塩基配列であるACAに変更したもの、85番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACGからProをコードする塩基配列であるCCAに変更したもの、88番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACTからLysをコードする塩基配列であるAAAに変更したもの、88番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACTからLysをコードする塩基配列であるAAGに変更したもの、88番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACTからArgをコードする塩基配列であるAGAに変更したもの、88番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACTからAsnをコードする塩基配列であるAATに変更したもの、89番目のアミノ酸であるLeuをコードする塩基配列がCTCからPheをコードする塩基配列であるTTTに変更したもの、94番目のアミノ酸であるAsnをコードする塩基配列がAATからIleをコードする塩基配列であるATCに変更したもの、95番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGACからProをコードする塩基配列であるCCGに変更したもの、98番目のアミノ酸であるLeuをコードする塩基配列がTTAからIleをコードする塩基配列であるATAに変更したもの、99番目のアミノ酸であるGlnをコードする塩基配列がCAGからThrをコードする塩基配列であるACTに変更したもの、104番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAAからAsnをコードする塩基配列であるAATに変更したもの、104番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAAからLysをコードする塩基配列であるAAAに変更したもの、112番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからGluをコードする塩基配列であるGAGに変更したもの、119番目のアミノ酸であるGlnをコードする塩基配列がCAGからAsnをコードする塩基配列であるAACに変更したもの、119番目のアミノ酸であるGlnをコードする塩基配列がCAGからAsnをコードする塩基配列であるAATに変更したもの、119番目のアミノ酸であるGlnをコードする塩基配列がCAGからIleをコードする塩基配列であるATTに変更したもの、119番目のアミノ酸であるGlnをコードする塩基配列がCAGからThrをコードする塩基配列であるACCに変更したもの、119番目のアミノ酸であるGlnをコードする塩基配列がCAGからSerをコードする塩基配列であるAGTに変更したもの、リンカードメインに存在するアミノ酸のうち137番目のアミノ酸であるPheをコードする塩基配列がTTTからValをコードする塩基配列であるGTCに変更したもの、138番目のアミノ酸であるLysをコードする塩基配列がAAAからIleをコードする塩基配列であるATCに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからValをコードする塩基配列であるGTAに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからValをコードする塩基配列であるGTGに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからCysをコードする塩基配列であるTGCに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからThrをコードする塩基配列であるACAに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからSerをコードする塩基配列であるTCTに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからSerをコードする塩基配列であるAGTに変更したもの、139番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからAsnをコードする塩基配列であるAACに変更したもの、143番目のアミノ酸であるGlyをコードする塩基配列がGGTからGluをコードする塩基配列であるGAAに変更したもの、145番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからArgをコードする塩基配列であるCGTに変更したもの、145番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTATからArgをコードする塩基配列であるAGAに変更したもの、148番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGTからSerをコードする塩基配列であるAGTに変更したもの、148番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGTからSerをコードする塩基配列であるTCTに変更したもの、148番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGTからSerをコードする塩基配列であるTCCに変更したもの、148番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGTからSerをコードする塩基配列であるTCAに変更したもの、148番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGTからAlaをコードする塩基配列であるGCGに変更したもの、148番目のアミノ酸であるCysをコードする塩基配列がTGTからAlaをコードする塩基配列であるGCAに変更したもの、182番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATTからMetをコードする塩基配列であるATGに変更したもの、ピリドキサールリン酸酵素共通ドメインに存在するアミノ酸のうち184番目のアミノ酸であるValをコードする塩基配列がGTAからAlaをコードする塩基配列であるGCCに変更したもの、184番目のアミノ酸であるValをコードする塩基配列がGTAからAlaをコードする塩基配列であるGCAに変更したもの、253番目のアミノ酸であるMetをコードする塩基配列がATGからLeuをコードする塩基配列であるCTAに変更したもの、262番目のアミノ酸であるPheをコードする塩基配列がTTCからTyrをコードする塩基配列であるTATに変更したもの、286番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCTからAspをコードする塩基配列であるGACに変更したもの、290番目のアミノ酸であるLysをコードする塩基配列がAAAからHisをコードする塩基配列であるCACに変更したもの、295番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCA からSerをコードする塩基配列であるTCAに変更したもの、303番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATTからThrをコードする塩基配列であるACAに変更したもの、317番目のアミノ酸であるPheをコードする塩基配列がTTCからGlnをコードする塩基配列であるCAGに変更したもの、335番目のアミノ酸であるProをコードする塩基配列がCCTからAlaをコードする塩基配列であるGCTに変更したもの、352番目のアミノ酸であるGlyをコードする塩基配列がGGCからAlaをコードする塩基配列であるGCAに変更したもの、353番目のアミノ酸であるArgをコードする塩基配列がCGTからHisをコードする塩基配列であるCATに変更したもの、386番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAAからSerをコードする塩基配列であるTCCに変更したもの、基質出入口に存在するアミノ酸のうち430番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAAからPheをコードする塩基配列であるTTCに変更したもの、443番目のアミノ酸であるArgをコードする塩基配列がAGAからMetをコードする塩基配列であるATGに変更したもの、446番目のアミノ酸であるSerをコードする塩基配列がTCTからTyrをコードする塩基配列であるTACに変更したもの、446番目のアミノ酸であるSerをコードする塩基配列がTCTからGlnをコードする塩基配列であるCAAに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからIleをコードする塩基配列であるATTに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからAsnをコードする塩基配列であるAATに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからCysをコードする塩基配列であるTGTに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからGlnをコードする塩基配列であるCAGに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからProをコードする塩基配列であるCCCに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからProをコードする塩基配列であるCCTに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからProをコードする塩基配列であるCCGに変更したもの、460番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGATからSerをコードする塩基配列であるTCAに変更したもの、466番目のアミノ酸であるProをコードする塩基配列がCCGからAsnをコードする塩基配列であるAACに変更したもの、466番目のアミノ酸であるProをコードする塩基配列がCCGからGlyをコードする塩基配列であるGGCに変更したもの、466番目のアミノ酸であるProをコードする塩基配列がCCGからSerをコードする塩基配列であるTCTに変更したもの、471番目のアミノ酸であるSerをコードする塩基配列がAGCからTyrをコードする塩基配列であるTATに変更したもの、475番目のアミノ酸であるGlyをコードする塩基配列がGGCからAsnをコードする塩基配列であるAATに変更したもの、506番目のアミノ酸であるAspをコードする塩基配列がGACからProをコードする塩基配列であるCCAに変更したもの、524番目のアミノ酸であるValをコードする塩基配列がGTTからLeuをコードする塩基配列であるTTAに変更したもの、524番目のアミノ酸であるValをコードする塩基配列がGTTからLeuをコードする塩基配列であるCTGに変更したもの、539番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATCからCysをコードする塩基配列であるTGCに変更したもの、539番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATCからLeuをコードする塩基配列であるCTTに変更したもの、539番目のアミノ酸であるIleをコードする塩基配列がATCからLeuをコードする塩基配列であるCTAに変更したもの、544番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACCからAlaをコードする塩基配列であるGCGに変更したもの、544番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACCからAlaをコードする塩基配列であるGCTに変更したもの、544番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基
配列がACCからSerをコードする塩基配列であるTCTに変更したもの、544番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACCからSerをコードする塩基配列であるTCCに変更したもの、544番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACCからProをコードする塩基配列であるCCTに変更したもの、544番目のアミノ酸であるThrをコードする塩基配列がACCからProをコードする塩基配列であるCCGに変更したもの、546番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCAからSerをコードする塩基配列であるAGCに変更したもの、553番目のアミノ酸であるLeuをコードする塩基配列がCTGからValをコードする塩基配列であるGTAに変更したもの、623番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCAからCysをコードする塩基配列であるTGTに変更したもの、623番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCAからPheをコードする塩基配列であるTTTに変更したもの、623番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCAからPheをコードする塩基配列であるTTCに変更したもの、623番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCAからGlnをコードする塩基配列であるCAGに変更したもの、626番目のアミノ酸であるLysをコードする塩基配列がAAAからValをコードする塩基配列であるGTGに変更したもの、636番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTACからCysをコードする塩基配列であるTGTに変更したもの、636番目のアミノ酸であるTyrをコードする塩基配列がTACからProをコードする塩基配列であるCCCに変更したもの、646番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCCからLeuをコードする塩基配列であるTTGに変更したもの、646番目のアミノ酸であるAlaをコードする塩基配列がGCCからIleをコードする塩基配列であるATCに変更したもの、648番目のアミノ酸であるMetをコードする塩基配列がATGからSerをコードする塩基配列であるTCTに変更したもの、648番目のアミノ酸であるMetをコードする塩基配列がATGからSerをコードする塩基配列であるTCCに変更したもの、710番目のアミノ酸であるLysをコードする塩基配列がAAAからThrをコードする塩基配列であるACGに変更したもの、711番目のアミノ酸であるGluをコードする塩基配列がGAAからAspをコードする塩基配列であるGACに変更したものに少なくとも１箇所以上置換されている変異型リジン脱炭酸酵素が挙げられる。
変更後の塩基配列は元の配列の酵素よりも良い性質があれば特に制限はないが、それぞれ表１〜６に記載の配列により生成される塩基配列は特に好ましい。
（５）変異型リジン脱炭酸酵素の製造方法
本発明にかかる前記変異型リジン脱炭酸酵素の製造方法（以下、単に「製造方法」とも言う。）は、形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び該形質転換体の培養物のうち少なくともいずれか一方から、前記変異型リジン脱炭酸酵素を回収するものである。
ここで形質転換体とは、前記変異型リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターで形質転換されたものを示す。
本発明にかかる前記変異型リジン脱炭酸酵素の製造方法は、前記変異型リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養することにより前記変異型リジン脱炭酸酵素を製造するものである。当該製造方法により、酵素が失活しやすい厳しい条件下においても、安定した活性を示すとともに、対応する野生型リジン脱炭酸酵素と比較しても反応の初速度が大きく低下することのない野生型もしくは前記変異型リジン脱炭酸酵素を、低コストで製造することができる。
以下に、製造方法に含まれうる各工程を説明するが、本発明にかかる前記変異型リジン脱炭酸酵素の製造方法は、前記変異型リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養する工程（宿主細胞培養工程）、及び培養された形質転換体及び該形質転換体の培養物のうち少なくともいずれか一方から、前記変異型リジン脱炭酸酵素を回収する工程（変異型リジン脱炭酸酵素回収工程）を含んでいればよく、必要に応じてさらに他の工程を含んでいてもよい。
（６）形質転換体培養工程
形質転換体培養工程は、野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養する工程である。
〔形質転換体〕
本発明にかかる製造方法において、形質転換体とは野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含む発現ベクターで形質転換されたものであれば特に限定されない。
前記形質転換体は、例えば、細菌、酵母、放線菌、糸状菌等由来の細胞を宿主細胞とするものが挙げられ、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌由来の細胞を宿主細胞とするものが好ましい。
〔核酸〕
前記核酸は、野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される。
前記変異型リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、対応する野生型リジン脱炭酸酵素をコードする塩基配列に変異点を導入する方法などにより、合成することができる。
〔発現ベクター〕
前記発現ベクターは、野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列で示される核酸を含むものであれば特に限定されるものではないが、形質転換効率や翻訳効率を向上させるなどの観点より、以下に示すような構成を示すプラスミドベクターやファージベクターであることがより好ましい。
〔発現ベクターの基本構成〕
発現ベクターは、野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素をコードする塩基配列を含み、前記宿主細胞を形質転換しうるものであれば特に限定されない。必要に応じて、該塩基配列の他に、他の領域を構成する塩基配列（以下、単に「他の領域」とも言う。）を含んでいてもよい。
他の領域としては、例えば、前記形質転換体が、野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素を産生するために必要とする制御領域や、自律複製に必要な領域などが挙げられる。
また、前記形質転換体の選択を容易にするという観点より、選択マーカーとなりうる選択遺伝子をコードする塩基配列をさらに含んでいてもよい。
野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素を産生するために必要となる制御領域としては、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む。）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、転写終結配列等を挙げることができる。
〔原核生物を宿主細胞とした場合の発現ベクター〕
原核生物を宿主細胞とする場合、発現ベクターは、野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素をコードする塩基配列の他に、野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素の産生効率の観点より、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。また、プロモーター配列の他にリボゾーム結合配列や転写終結配列等を含んでいてもよい。
プロモーター配列の例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。
また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変又は設計されたプロモーター配列も利用できる。
リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主細胞内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。
前記リボゾーム結合配列としては、例えば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列のうち、４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成した配列などが挙げられる。
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。
これら制御領域の発現ベクター上での配列順序は、特に制限されるものではないが、転写効率を考慮すると５’末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、目的蛋白質をコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
ここでいう発現ベクターの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等を発現ベクターとして利用することができる。
また、２種類以上の宿主内での自律複製が可能な発現ベクターの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等を発現ベクターとして利用することができる。
〔形質転換体の作製方法〕
本発明にかかる形質転換体は、公知の方法により作製することができる。例えば、本発明にかかる野生型および変異型リジン脱炭酸酵素をコードする塩基配列と、必要に応じて前記他の領域とを含む前記発現ベクターを構築し、該発現ベクターを所望の宿主細胞に形質転換する方法等が挙げられる。具体的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、ｅｔ．ａｌ．、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（２００１）等に記載されている分子生物学、生物工学及び遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用することができる。
また、相同組換えを利用した染色体への導入方法を用いることもできる。
本発明にかかる形質転換体は、前記宿主細胞に前記発現ベクターを組み込むだけではなく、必要に応じて前記宿主細胞での使用頻度の低いコドンを、使用頻度の高いコドンにするように、サイレント変異を導入すること等を併せて行い作製することもできる。
これにより、発現ベクターに組み込んだ野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素由来のタンパク質の生産量を増加させることができる可能性がある。
サイレント変異の導入方法は、宿主細胞でのコドン使用頻度に発現ベクターのコドンを合わせるものであれば、その手法、変異点、変更する塩基の種類等は特に制限されない。
〔形質転換体の培養方法〕
本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、例えば、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、例えば、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、例えば、グルコン酸、フマル酸、クエン酸やコハク酸などの有機酸類などが挙げられる。
このような炭素源は、単独で使用してもよく、あるいは、併用することもできる。
窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、例えば、大豆加水分解物などの有機窒素、例えば、アンモニアガス、アンモニア水などが挙げられる。
このような窒素源は、単独で使用してもよく、あるいは、併用することもできる。
無機イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、塩素イオン、マンガンイオン、鉄イオン、リン酸イオン、硫酸イオンなどが挙げられる。
このような無機イオンは、単独で使用してもよく、あるいは、併用することもできる。
また、培地には、必要に応じて、その他の有機成分（有機微量栄養素）を添加することもでき、そのような有機成分としては、例えば、各種アミノ酸、例えば、ビタミンＢ１などのビタミン類、例えば、ＲＮＡなどの核酸類などの要求物質、さらには、例えば、酵母エキスなどが挙げられる。
このような培地としては、例えば、ＬＢ培地、ＹＴ培地、Ｍ９培地が挙げられる。
このような培地のなかでは、好ましくは、ＬＢ培地が挙げられる。
形質転換体の培養条件は、前記形質転換体、培地、培養方法の種類により適宜選択すればよく、形質転換体が生育し、本発明にかかる野生型リジン脱炭酸酵素および変異型リジン脱炭酸酵素を産生できる条件であれば特に制限はないが、例えば、大腸菌を培養する場合には、好気条件下において、培養温度が、例えば、２０〜４５℃、好ましくは、２５〜４０℃であり、培養ｐＨが、例えば、５．０〜８．５、好ましくは、６．５〜８．０であり、培養期間は１日間〜７日間の範囲で目的の変異型リジン脱炭酸酵素活性を有する蛋白質の含量が最大になるまで培養すればよい。
例えば、１２〜７２時間、好ましくは、１４〜４８時間である。なお、ｐＨの調整には、例えば、無機または有機の酸性またはアルカリ性物質や、アンモニアガスなどを用いることができる。
培養は前記培地を含有する液体培地中で、前記形質転換体を振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なうことが出来る。
リジン脱炭酸酵素回収工程は、培養された形質転換体及び該形質転換体の培養物のうち少なくともいずれか一方から、野生型リジン脱炭酸酵素および前記変異型リジン脱炭酸酵素を回収する工程である。
形質転換した形質転換体を培養した後、本発明にかかる野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素を回収する方法は、この分野で慣用されている方法を使用することができる。
本発明にかかる野生型リジン脱炭酸酵素および前記変異型リジン脱炭酸酵素が形質転換した形質転換体外に分泌される場合は、該形質転換体の培養物を遠心分離、ろ過等を行うことで粗酵素液を容易に得ることができる。また、本発明にかかる野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素が形質転換した形質転換体内に蓄積される場合は、培養した該形質転換体を遠心分離等の手段により回収し、回収した該形質転換体を水、もしくは緩衝液に懸濁し、リゾチーム処理、凍結融解、超音波破砕などの公知の方法に従い該形質転換体の細胞膜を破壊することにより、粗酵素液を回収すればよい。
前記粗酵素液を、限外ろ過法などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素として利用することが可能である。また、濃縮した後、スプレードライ法などによって野生型および前記変異型リジン脱炭酸酵素の粉末酵素を得ることもできる。
回収されたリジン脱炭酸酵素活性を有する粗酵素液について、分離精製を必要とする場合は、例えば、硫酸アンモニウムなどによる塩析、アルコールなどによる有機溶媒沈殿法、透析及び限外ろ過などによる膜分離法、あるいはイオン交換体クロマトグラフィー、逆相高速クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知のクロマト分離法を適宜組み合わせて行うことができる。
以上のようにして得られた変異型リジン脱炭酸酵素は本発明の範囲に含まれる。
（７）１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法
上述のように製造された野生型および変異型リジン脱炭酸酵素は酵素触媒として物質生産に利用することができる。例えばリジンに上述の野生型および変異型リジン脱炭酸酵素を接触させることにより、１、５−ペンタメチレンジアミンを製造することができる。すなわち、リジンと、野生型および変異型リジン脱炭酸酵素、野生型および変異型リジン脱炭酸酵素を発現する形質転換体、形質転換体の処理物、形質転換体およびその処理物の固定化物からなる群から選択された少なくとも１種と、反応溶媒とを混合し、反応溶媒中でリジン脱炭酸酵素と、リジンを接触させて、リジンの脱炭酸酵素反応により、１、５−ペンタメチレンジアミンを製造する。
本発明で原料として用いられるリジンは、その塩であってもよい。リジンの塩としては、例えば、塩酸塩、酢酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、もしくは硝酸塩などが挙げられる。
このようなリジンの塩の中で、好ましくは、リジンの塩酸塩が挙げられる。
反応溶媒中におけるリジンの濃度は、特に制限されないが、例えば、１〜７０質量％、好ましくは、２〜５０質量％である。
本発明における反応の減速または停止を防ぐ物質の存在下であれば、野生型および変異型リジン脱炭酸酵素の必要量は、反応溶媒中におけるリジン濃度が１０質量％以下であればリジン塩酸塩１ｇ当たり５Ｕ以上１６５Ｕ以下、さらに好ましくは２０Ｕ以上８２．５Ｕ以下である。また、精製酵素に換算すると野生型および変異型リジン脱炭酸酵素の必要量は、反応溶媒中におけるリジン濃度が１０質量％以下であればリジン塩酸塩１ｇ当たり５μｇ以上１６５μｇ以下、さらに好ましくは２０μｇ以上８２．５μｇ以下である。
また、触媒休止菌体または触媒死菌体量に換算すると反応溶媒中におけるリジン濃度が１０質量％以下であればリジン塩酸塩１００ｇ当たり５ｍｇ以上１６１ｍｇ以下、さらに好ましくは５．４ｍｇ以上８０ｍｇ以下が好ましい。
また、リジン濃度が１０質量％を超過し４５質量％未満であれば、野生型および変異型リジン脱炭酸酵素の必要量は、リジン塩酸塩１ｇあたり５Ｕ以上１６５Ｕ以下、より好ましくは２０Ｕ以上１１０Ｕ以下であり、また、精製酵素に換算すると、野生型および変異型リジン脱炭酸酵素の必要量は、リジン塩酸塩１ｇ当たり５μｇ以上１６５μｇ以下、さらに好ましくは２０μｇ以上１１０μｇ以下である。
また、リジン濃度４５質量％以上であればリジン塩酸塩１ｇあたり５Ｕ以上１６５Ｕ以下であり、より好ましくは１００Ｕ以上１６５Ｕ以下であり、また、精製酵素に換算すると、野生型および変異型リジン脱炭酸酵素の必要量は、リジン塩酸塩１ｇ当たり５μｇ以上１６５μｇ以下、さらに好ましくは１００μｇ以上１６５μｇ以下である。
反応溶媒としては、例えば、水、水性媒体、有機溶媒、水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液が挙げられる。
水性媒体としては、例えば、リン酸緩衝液などの緩衝液が挙げられる。
有機溶媒としては、反応を阻害しないものであればいずれでもよい。
リジンの脱炭酸酵素反応の条件としては、温度が、例えば、２８〜５５℃、好ましくは、３５〜４５℃、時間が、例えば、０．１〜７２時間、好ましくは、１〜７２時間、より好ましくは、１２〜３６時間である。また、反応ｐＨが、例えば、５．０〜９．０、好ましくは、５．５〜８．５である。
反応は振盪、攪拌または静置条件下で行なうことができる。
これにより、リジンが脱炭酸され、１、５−ペンタメチレンジアミンへと変換し、１、５−ペンタメチレンジアミンが製造される。
本発明で製造される１、５−ペンタメチレンジアミンは、その塩であってもよい。
１、５−ペンタメチレンジアミンの塩としては、例えば、１、５−ペンタメチレンジアミンの塩酸塩、酢酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩もしくは硝酸塩などが挙げられる。
このような１、５−ペンタメチレンジアミンの塩のなかでは、好ましくは、塩酸塩が挙げられる。
なお、この反応では、得られる１、５−ペンタメチレンジアミンがアルカリ性であるため、リジンが１、５−ペンタメチレンジアミンに変換されるに伴って反応液のｐＨが増加する場合がある。このような場合には、必要により、酸性物質（例えば、有機酸、例えば、塩酸などの無機酸など）などを添加し、ｐＨを調整することができる。
また、この反応では、必要により、例えば、ビタミンＢ６および／またはその誘導体を反応液中に添加することもできる。
ビタミンＢ６および／またはその誘導体としては、例えば、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール、ピリドキサールリン酸などが挙げられる。
このようなビタミンＢ６および／またはその誘導体は、単独で使用してもよく、あるいは、併用することもできる。
ビタミンＢ６および／またはその誘導体のなかでは、好ましくは、ピリドキサールリン酸が挙げられる。
ビタミンＢ６および／またはその誘導体を添加することにより、１、５−ペンタメチレンジアミンの生産速度および反応収率を向上することができる。
また、この方法では、得られたペンタメチレンジアミン水溶液から、必要により、水の一部を留去させることができる。
より具体的には、例えば、連続多段蒸留塔、回分多段蒸留塔などを備えた蒸留装置などにより、０．１ｋＰａ〜常圧下、ペンタメチレンジアミン水溶液を加熱（熱処理）し、蒸留することにより、水の一部が留去されたペンタメチレンジアミン水溶液を得ることができる。
加熱温度としては、例えば、２５℃以上、９０℃未満、好ましくは、２５℃以上、８５℃以下、より好ましくは、２５℃以上、８０℃未満、さらに好ましくは、３０℃以上、７０℃以下である。
ペンタメチレンジアミン水溶液を、９０℃以上で加熱（熱処理）すると、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）の抽出率が低下する場合がある。
（８）１、５−ペンタメチレンジイソシアネートの製造方法
また、ペンタメチレンジアミン水溶液を、９０℃以上で加熱（熱処理）すると、その水溶液から得られたペンタメチレンジアミンを用いてペンタメチレンジイソシアネートを製造し、さらに、そのペンタメチレンジイソシアネートからイソシアネート変性体（後述）を製造する場合に、反応速度が低い場合や、得られるイソシアネート変性体（後述）の貯蔵安定性が低い場合がある。
そのため、好ましくは、ペンタメチレンジアミン水溶液を、９０℃以上で加熱（熱処理）することなく、より好ましくは、８０℃以上で加熱することなく、さらに好ましくは、ペンタメチレンジアミン水溶液を加熱（熱処理）することなく、後述するように、その水溶液からそのままペンタメチレンジアミン（またはその塩）を抽出する。
そして、この方法では、好ましくは、上記により得られたペンタメチレンジアミン水溶液から、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）を抽出する。抽出では、例えば、液−液抽出法が採用される。
液−液抽出法では、例えば、（１）回分的、半連続的または連続的にペンタメチレンジアミン水溶液に、抽出溶媒（後述）を接触させ、混合および撹拌することにより、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）を抽出溶媒（後述）へと抽出（分配）し、その抽出溶媒（後述）からペンタメチレンジアミン（またはその塩）を分離する方法、（２）多孔板を備えた塔（スプレー塔、段型抽出塔）や、充填物、ノズル、オリフィス板、バッフル、インジェクターおよび／またはスタティックミキサーを備えた塔（向流微分型抽出塔、非撹拌式段型抽出塔：改訂五版 化学工学便覧、ｐ５６６から５６９、化学工学会編、丸善（１９８８））に、ペンタメチレンジアミン水溶液と抽出溶媒（後述）とを、向流で連続的に供給し、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）を、抽出溶媒（後述）へと抽出（分配）した後、抽出溶媒（後述）を連続的に流出させ、その抽出溶媒（後述）から、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）を分離する方法、（３）邪魔板および撹拌羽根を備えた塔（撹拌式段型抽出塔：改訂五版 化学工学便覧 ｐ５６９から５７４、化学工学会編、丸善（１９８８））に、ペンタメチレンジアミン水溶液と抽出溶媒（後述）とを、向流で連続的に供給し、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）を、抽出溶媒（後述）へと抽出（分配）した後、抽出溶媒（後述）を連続的に流出させ、その抽出溶媒（後述）から、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）を分離する方法、（４）ミキサーセトラー抽出器、または、遠心式抽出機（改訂五版 化学工学便覧 ｐ５６３から５６６、ｐ５７４、化学工学会編、丸善（１９８８））を用いて、ペンタメチレンジアミン水溶液に、抽出溶媒（後述）を接触させ、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）を抽出溶媒（後述）へと抽出（分配）し、その抽出溶媒（後述）からペンタメチレンジアミン（またはその塩）を分離する方法などが採用される。
これら液−液抽出法としては、単独使用または２種類以上併用することができる。
液−液抽出法として、生産効率の観点から、好ましくは、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）を、抽出溶媒（後述）へと連続的に抽出（分配）する方法、より具体的には、例えば、上記（１）〜（３）の方法が挙げられる。
液−液抽出におけるペンタメチレンジアミン水溶液と抽出溶媒（後述）との配合割合は、ペンタメチレンジアミン水溶液（抽出が連続的である場合は、単位時間あたりの供給量。以下同様。）１００質量部に対して、抽出溶媒（後述）が、例えば、３０〜３００質量部であり、経済性および生産性の観点から、好ましくは、５０〜２００質量部、より好ましくは５０〜１５０質量、とりわけ好ましくは、８０〜１２０質量部である。
また、液−液抽出では、ペンタメチレンジアミン水溶液と抽出溶媒（後述）とを、例えば、常圧（大気圧）下、例えば、５〜６０℃、好ましくは、１０〜６０℃、より好ましくは、１５〜５０℃、さらに好ましくは、１５〜４０℃において、例えば、撹拌羽根などにより、例えば、１〜１２０分間、好ましくは、５〜９０分間、好ましくは、５〜６０分間混合する。
撹拌羽根としては、特に限定されないが、例えば、プロペラ、平羽根、角度付平羽根、ピッチ付平羽根、平羽根ディスクタービン、傾斜付羽根ディスクタービン、湾曲羽根、ファウドラー型、ブルーマージン型、ディゾルバー、アンカーなどが挙げられる。
また、混合における回転数としては、例えば、５〜３０００ｒｐｍ、好ましくは、１０〜２０００ｒｐｍ、より好ましくは、２０〜１０００ｒｐｍである。
これにより、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）を、抽出溶媒（後述）中へと抽出する。
次いで、この方法では、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）と抽出溶媒（後述）との混合物を、例えば、５〜３００分間、好ましくは、１０〜２４０分間、より好ましくは、２０〜１８０分間静置し、その後、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）が抽出された抽出溶媒（ペンタメチレンジアミン抽出液、すなわち、抽出溶媒（後述）とペンタメチレンジアミン（またはその塩）との混合物）を、公知の方法により取り出す。
なお、１回の液−液抽出によりペンタメチレンジアミン（またはその塩）を十分に抽出できない場合には、複数回（例えば、２〜５回）繰り返し液−液抽出することもできる。
これにより、ペンタメチレンジアミン水溶液中のペンタメチレンジアミン（またはその塩）を、抽出溶媒（後述）に抽出することができる。
このようにして得られる抽出溶媒（抽出溶媒（後述）とペンタメチレンジアミン（またはその塩）との混合物）において、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）の濃度は、例えば、０．２〜４０質量％、好ましくは、０．３〜３５質量％、より好ましくは、０．４〜３０質量％、とりわけ好ましくは、０．８〜２５質量％である。
また、抽出後におけるペンタメチレンジアミン（またはその塩）の収率（抽出率）は、リシン（またはその塩）を基準として、例えば、６５〜１００モル％、好ましくは、７０〜１００モル％、より好ましくは、８０〜１００モル％、とりわけ好ましくは、９０〜１００モル％である。
なお、この方法では、必要により、得られた抽出溶媒（後述）とペンタメチレンジアミン（またはその塩）との混合物から、例えば、ペンタメチレンジアミン（またはその塩）を単離することもできる。ペンタメチレンジアミン（またはその塩）の単離では、特に制限されないが、例えば、連続多段蒸留塔、回分多段蒸留塔などを備えた蒸留装置などにより、例えば、５０〜１８２℃、０．１ｋＰａ〜常圧下、抽出溶媒（後述）とペンタメチレンジアミン（またはその塩）との混合物を蒸留し、抽出溶媒（後述）を除去する。
そして、このような抽出において、抽出溶媒としては、例えば、非ハロゲン系有機溶剤が挙げられる。
非ハロゲン系有機溶剤は、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を分子中に含有しない有機溶剤であって、例えば、非ハロゲン脂肪族系有機溶剤、非ハロゲン脂環族系有機溶剤、非ハロゲン芳香族系有機溶剤などが挙げられる。
非ハロゲン脂肪族系有機溶剤としては、例えば、直鎖状の非ハロゲン脂肪族系有機溶剤、分岐状の非ハロゲン脂肪族系有機溶剤などが挙げられる。
直鎖状の非ハロゲン脂肪族系有機溶剤としては、例えば、直鎖状の非ハロゲン脂肪族炭化水素類、直鎖状の非ハロゲン脂肪族エーテル類、直鎖状の非ハロゲン脂肪族アルコール類などが挙げられる。
直鎖状の非ハロゲン脂肪族炭化水素類としては、例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−ノナン、ｎ−デカン、ｎ−ドデカンなどが挙げられる。
直鎖状の非ハロゲン脂肪族エーテル類としては、例えば、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテルなどが挙げられる。
直鎖状の非ハロゲン脂肪族アルコール類としては、例えば、直鎖状の炭素数１〜３の１価アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールなど）、直鎖状の炭素数４〜７の１価アルコール（例えば、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノール、ｎ−ヘプタノールなど）、直鎖状の炭素数８以上の１価アルコール（例えば、ｎ−オクタノール、ｎ−ノナノール、ｎ−デカノール、ｎ−ウンデカノール、ｎ−ドデカノールなど）などが挙げられる。
分岐状の非ハロゲン脂肪族系有機溶剤としては、例えば、分岐状の非ハロゲン脂肪族炭化水素類、分岐状の非ハロゲン脂肪族エーテル類、分岐状の非ハロゲン脂肪族１価アルコール類、分岐状の非ハロゲン脂肪族多価アルコール類などが挙げられる。
分岐状の非ハロゲン脂肪族炭化水素類としては、例えば、２−メチルペンタン、２、２−ジメチルブタン、２、３−ジメチルブタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２、３−ジメチルペンタン、２、４−ジメチルペンタン、ｎ−オクタン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン、４−メチルヘプタン、３−エチルへキサン、２、２−ジメチルへキサン、２、３−ジメチルへキサン、２、４−ジメチルへキサン、２、５−ジメチルへキサン、３、３−ジメチルへキサン、３、４−ジメチルへキサン、２−メチル−３−エチルペンタン、３−メチル−３−エチルペンタン、２、３、３−トリメチルペンタン、２、３、４−トリメチルペンタン、２、２、３、３−テトラメチルブタン、２、２、５−トリメチルヘキサンなどが挙げられる。
分岐状の非ハロゲン脂肪族エーテル類としては、例えば、ジイソプロピルエーテル、ジイソブチルエーテルなどが挙げられる。
分岐状の非ハロゲン脂肪族１価アルコール類としては、例えば、分岐状の炭素数４〜７の１価アルコール（例えば、２−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、イソペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、２−メチル−３−ブタノール、２、２−ジメチル−１−プロパノール、ｔｅｒｔ−ペンタノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、イソヘキサノール、２−メチル−２−ペンタノール、２−メチル−１−ペンタノール、３−メチル−１−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、３、３−ジメチル−１−ブタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、４−ヘプタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、４−メチル−１−ヘキサノール、３−メチル−１−ヘキサノール、２−エチル−２−メチル−１−ブタノールなど）、分岐状の炭素数８以上の１価アルコール（例えば、イソオクタノール、イソノナノール、イソデカノール、５−エチル−２−ノナノール、トリメチルノニルアルコール、２−ヘキシルデカノール、３、９−ジエチル−６−トリデカノール、２−イソヘプチルイソウンデカノール、２−オクチルドデカノールなど）が挙げられる。
分岐状の非ハロゲン脂肪族多価アルコール類としては、例えば、２−エチル−１、３−ヘキサンジオールなどが挙げられる。
これら非ハロゲン脂肪族系有機溶剤は、単独使用または２種類以上併用することができる。
非ハロゲン脂肪族系有機溶剤として、好ましくは、直鎖状の非ハロゲン脂肪族系有機溶剤、より好ましくは、直鎖状の非ハロゲン脂肪族アルコール類が挙げられる。
直鎖状の非ハロゲン脂肪族アルコール類を用いると、ペンタメチレンジアミンを、高収率で抽出することができる。
また、非ハロゲン脂肪族系有機溶剤として、好ましくは、炭素数４〜７の１価アルコール（直鎖状の炭素数４〜７の１価アルコール、分岐状の炭素数４〜７の１価アルコール）が挙げられる。
炭素数４〜７の１価アルコールを用いると、ペンタメチレンジアミンまたはその塩を効率良く抽出することができ、さらには、ペンタメチレンジアミンまたはその塩の不純物の含有割合を、低減することができる。
非ハロゲン脂環族系有機溶剤としては、例えば、非ハロゲン脂環族炭化水素類（例えば、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン、ビシクロヘキシルなど）が挙げられる。
これら非ハロゲン脂環族系有機溶剤は、単独使用または２種類以上併用することができる。
非ハロゲン芳香族系有機溶剤としては、例えば、非ハロゲン芳香族炭化水素類（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、イソプロピルベンゼン、１、３、５−トリメチルベンゼン、１、２、３、４−テトラヒドロナフタレン、ｎ−ブチルベンゼン、ｓｅｃ−ブチルベンゼン、ｔｅｒｔ−ブチルベンゼン、エチルベンゼンなど）、フェノール類（例えば、フェノール、クレゾールなど）などが挙げられる。
これら非ハロゲン芳香族系有機溶剤は、単独使用または２種類以上併用することができる。
また、非ハロゲン系有機溶剤としては、例えば、脂肪族炭化水素類と芳香族炭化水素類との混合物なども挙げられ、そのような混合物としては、例えば、石油エーテル、石油ベンジンなどが挙げられる。
これら非ハロゲン系有機溶剤は、単独使用または２種類以上併用することができる。
なお、抽出溶媒としては、本発明の優れた効果を阻害しない範囲において、例えば、ハロゲン系有機溶剤（ハロゲン原子を分子中に含有する有機溶剤）を用いることもできる。
ハロゲン系有機溶剤としては、例えば、ハロゲン系脂肪族炭化水素類（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素、テトラクロロエチレンなど）、ハロゲン系芳香族炭化水素類（例えば、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、クロロトルエンなど）などが挙げられる。
これらハロゲン系有機溶剤は、単独使用または２種類以上併用することができる。
一方、抽出溶媒として、ハロゲン系有機溶剤を用いると、得られるペンタメチレンジアミンまたはその塩を用いてペンタメチレンジイソシアネート（後述）を製造し、さらに、そのペンタメチレンジイソシアネート（後述）を反応させて、イソシアネート変性体（後述）や、ポリウレタン樹脂（後述）を製造する場合において、イソシアネート変性体（後述）の生産性や物性（例えば、耐黄変性など）に劣る場合がある。
また、そのようなペンタメチレンジイソシアネート（後述）やイソシアネート変性体（後述）と、活性水素化合物（後述）とを反応させ、ポリウレタン樹脂を製造する場合にも、やはり、得られるポリウレタン樹脂の物性（例えば、機械強度、耐薬品性など）に劣る場合がある。
そのため、抽出溶媒として、好ましくは、非ハロゲン系有機溶剤、より好ましくは、非ハロゲン脂肪族系有機溶剤が挙げられる。
ペンタメチレンジアミンまたはその塩を、非ハロゲン脂肪族系有機溶剤により抽出する場合には、得られるペンタメチレンジアミンまたはその塩を用いて、ペンタメチレンジイソシアネートを製造する場合に、優れた性質を備えるイソシアネート変性体や、優れた性質を備えるポリウレタン樹脂を効率良く製造することができるペンタメチレンジイソシアネートを、製造することができる。
また、本発明において、抽出溶媒の沸点は、例えば、６０〜２５０℃、好ましくは、８０〜２００℃、より好ましくは、９０〜１５０℃である。
抽出溶媒の沸点が、上記下限未満であると、ペンタメチレンジアミン水溶液から抽出により、ペンタメチレンジアミンまたはその塩を得る際に、抽出溶媒との分離が困難となる場合がある。
一方、抽出溶媒の沸点が、上記上限を超過すると、抽出溶媒とペンタメチレンジアミンまたはその塩との混合物からペンタメチレンジアミンまたはその塩を得る際に、分離工程での消費エネルギーが増大する場合がある。
また、ペンタメチレンジアミン水溶液からペンタメチレンジアミンまたはその塩を得る方法としては、上記の抽出に限定されず、例えば、蒸留など、公知の単離精製方法を採用することもできる。
このようにして得られたペンタメチレンジアミンからはアミド、イミド、エポキシなどを誘導することができる。
また、本発明は、このようにして得られた１、５−ペンタメチレンジアミン（またはその塩）から製造される１、５−ペンタメチレンジイソシアネート（以下、単にペンタメチレンジイソシアネートと称する場合がある。）を含んでいる。
１、５−ペンタメチレンジイソシアネートを合成する方法としては、例えば、１、５−ペンタメチレンジアミン（またはその塩）をホスゲン化する方法（以下、ホスゲン化法と称する場合がある。）や、１、５−ペンタメチレンジアミン（（またはその塩））をカルバメート化し、その後、熱分解する方法（以下、カルバメート化法と称する場合がある。）などが挙げられる。
ホスゲン化法として、より具体的には、例えば、ペンタメチレンジアミンを直接ホスゲンと反応させる方法（以下、冷熱二段ホスゲン化法と称する場合がある。）や、ペンタメチレンジアミンの塩酸塩を不活性溶媒（後述）中に懸濁させてホスゲンと反応させる方法（以下、アミン塩酸塩のホスゲン化法と称する場合がある。）などが挙げられる。
冷熱二段ホスゲン化法では、例えば、まず、撹拌可能とされ、かつ、ホスゲン導入管を備えた反応器に、不活性溶媒を装入し、反応系内の圧力を、例えば、常圧〜１．０ＭＰａ、好ましくは、常圧〜０．５ＭＰａとし、また、温度を、例えば、０〜８０℃、好ましくは、０〜６０℃とする。
不活性溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼンなどの芳香族炭化水素類、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸アミルなどの脂肪酸エステル類、例えば、サリチル酸メチル、フタル酸ジメチル、フタル酸ジブチル、安息香酸メチルなどの芳香族カルボン酸エステル類、例えば、モノジクロロベンゼン、オルトジクロロベンゼン、トリクロロベンゼンなどの塩素化芳香族炭化水素類、例えば、クロロホルム、四塩化炭素などの塩素化炭化水素類などが挙げられる。
これら不活性溶媒は、単独使用または２種類以上併用することができる。
不活性溶媒の配合量（総量）は、原料であるペンタメチレンジアミン１００質量部に対して、例えば、４００〜３０００質量部、好ましくは、５００〜２０００質量部である。
次いで、この方法では、ホスゲンを、ペンタメチレンジアミンのアミノ基１つに対して、例えば、１〜１０倍モル、好ましくは、１〜６倍モル導入し、上記の不活性溶媒に溶解したペンタメチレンジアミンを添加する。また、この間、反応液を、例えば、０〜８０℃、好ましくは、０〜６０℃に維持するとともに、発生する塩化水素を、還流冷却器を通じて反応系外に放出する（冷ホスゲン化反応）。これにより、反応器の内容物をスラリー状とする。
そして、この冷ホスゲン化反応では、ペンタメチレンジカルバモイルクロリドおよびアミン塩酸塩が生成される。
次いで、この方法では、反応系内の圧力を、例えば、常圧〜１．０ＭＰａ、好ましくは、０．０５〜０．５ＭＰａとし、例えば、３０分〜５時間で、例えば、８０〜１８０℃の温度範囲に昇温する。昇温後、例えば、３０分〜８時間反応を継続して、スラリー液を完全に溶解させる（熱ホスゲン化反応）。
なお、熱ホスゲン化反応において、昇温時および高温反応時には、溶解ホスゲンが気化して還流冷却器を通じて反応系外に逃げるため、還流冷却器からの還流量が確認できるまでホスゲンを適宜導入する。
なお、熱ホスゲン化反応終了後、反応系内を、例えば、８０〜１８０℃、好ましくは、９０〜１６０℃において、窒素ガスなどの不活性ガスを導入し、溶解している過剰のホスゲンおよび塩化水素をパージする。
この熱ホスゲン化反応では、冷ホスゲン化反応で生成したペンタメチレンジカルバモイルクロリドが熱分解され、ペンタメチレンジイソシアネートが生成され、さらに、ペンタメチレンジアミンのアミン塩酸塩がホスゲン化され、ペンタメチレンジイソシアネートが生成される。
一方、アミン塩酸塩のホスゲン化法では、ペンタメチレンジアミンの塩酸塩を十分に乾燥し、微粉砕した後、上記の冷熱二段ホスゲン化法と同様の反応器内で、ペンタメチレンジアミンの塩酸塩を、上記の不活性溶媒中で撹拌し、分散させて、スラリーとする。
次いで、この方法では、反応温度を、例えば、８０〜１８０℃、好ましくは、９０〜１６０℃、反応圧力を、例えば、常圧〜１．０ＭＰａ、好ましくは、０．０５〜０．５ＭＰａに維持し、ホスゲンを１〜１０時間かけて、ホスゲン総量が化学量論の１〜１０倍になるように導入する。
これにより、ペンタメチレンジイソシアネートを合成することができる。
なお、反応の進行は、発生する塩化水素ガスの量と、上記の不活性溶媒に不溶のスラリーが消失し、反応液が澄明均一になることより推測できる。また、発生する塩化水素は、例えば、還流冷却器を通じて反応系外に放出する。また、反応の終了時には、上記の方法で溶解している過剰のホスゲンおよび塩化水素をパージする。その後、冷却し、減圧下において、不活性溶媒を留去する。
ペンタメチレンジイソシアネートは、加水分解性塩素の濃度（ＨＣ）が上昇しやすい傾向にあるため、ホスゲン化法を採用する場合において、ＨＣを低減する必要がある場合には、例えば、ホスゲン化反応させ、脱溶剤させた後、留去させたペンタメチレンジイソシアネートを、例えば、窒素などの不活性ガスを通気しながら、例えば、１５０℃〜２００℃、好ましくは、１６０〜１９０℃で、例えば、１〜８時間、好ましくは、３〜６時間加熱処理する。その後、精留処理することによって、ペンタメチレンジイソシアネートのＨＣを著しく低減することができる。
本発明において、ペンタメチレンジイソシアネートの加水分解性塩素の濃度は、例えば、１００ｐｐｍ以下、好ましくは、８０ｐｐｍ以下、より好ましくは、６０ｐｐｍ以下、さらに好ましくは、５０ｐｐｍ以下である。
なお、加水分解性塩素の濃度は、例えば、ＪＩＳ Ｋ−１５５６（２０００）の附属書３に記載されている加水分解性塩素の試験方法に準拠して測定することができる。
加水分解性塩素の濃度が１００ｐｐｍを超過すると、トリマー化（後述）の反応速度が低下し、多量のトリマー化触媒（後述）を必要とする場合があり、トリマー化触媒（後述）を多量に用いると、得られるポリイソシアネート組成物（後述）の黄変度が高くなる場合や、数平均分子量が高くなり、粘度が高くなる場合がある。
また、加水分解性塩素の濃度が１００ｐｐｍを超過すると、ポリイソシアネート組成物（後述）の貯蔵工程、および、ポリウレタン樹脂（後述）の製造工程において、粘度、色相が大きく変化する場合がある。
カルバメート化法としては、例えば、尿素法などが挙げられる。
尿素法では、例えば、まず、ペンタメチレンジアミンをカルバメート化し、ペンタメチレンジカルバメート（ＰＤＣ）を生成させる。
より具体的には、反応原料として、ペンタメチレンジアミンと、尿素および／またはＮ−無置換カルバミン酸エステルと、アルコールとを反応させる。
Ｎ−無置換カルバミン酸エステルとしては、例えば、Ｎ−無置換カルバミン酸脂肪族エステル類（例えば、カルバミン酸メチル、カルバミン酸エチル、カルバミン酸プロピル、カルバミン酸ｉｓｏ−プロピル、カルバミン酸ブチル、カルバミン酸ｉｓｏ−ブチル、カルバミン酸ｓｅｃ−ブチル、カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル、カルバミン酸ペンチル、カルバミン酸ｉｓｏ−ペンチル、カルバミン酸ｓｅｃ−ペンチル、カルバミン酸ヘキシル、カルバミン酸ヘプチル、カルバミン酸オクチル、カルバミン酸２−エチルヘキシル、カルバミン酸ノニル、カルバミン酸デシル、カルバミン酸イソデシル、カルバミン酸ドデシル、カルバミン酸テトラデシル、カルバミン酸ヘキサデシルなど）、Ｎ−無置換カルバミン酸芳香族エステル類（例えば、カルバミン酸フェニル、カルバミン酸トリル、カルバミン酸キシリル、カルバミン酸ビフェニル、カルバミン酸ナフチル、カルバミン酸アントリル、カルバミン酸フェナントリルなど）などが挙げられる。
これらＮ−無置換カルバミン酸エステルは、単独使用または２種類以上併用することができる。
Ｎ−無置換カルバミン酸エステルとして、好ましくは、Ｎ−無置換カルバミン酸脂肪族エステル類が挙げられる。
アルコールとしては、例えば、１〜３級の１価のアルコールが挙げられ、より具体的には、例えば、脂肪族アルコール類、芳香族アルコール類などが挙げられる。
脂肪族アルコール類としては、例えば、直鎖状の脂肪族アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール（１−ブタノール）、ｎ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノール、ｎ−ヘプタノール、ｎ−オクタノール（１−オクタノール）、ｎ−ノナノール、ｎ−デカノール、ｎ−ドデカノール、ｎ−テトラデカノール、ｎ−ヘキサデカノールなど）、分岐状の脂肪族アルコール類（例えば、ｉｓｏ−プロパノール、ｉｓｏ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｉｓｏ−ペンタノール、ｓｅｃ−ペンタノール、２−エチルヘキサノール、ｉｓｏ−デカノールなど）などが挙げられる。
芳香族アルコール類としては、例えば、フェノール、ヒドロキシトルエン、ヒドロキシキシレン、ビフェニルアルコール、ナフタレノール、アントラセノール、フェナントレノールなどが挙げられる。
これらアルコールは、単独使用または２種類以上併用することができる。
アルコールとして、好ましくは、脂肪族アルコール類、より好ましくは、直鎖状の脂肪族アルコール類が挙げられる。
また、アルコールとして、好ましくは、上記した炭素数４〜７の１価アルコール（直鎖状の炭素数４〜７の１価アルコール、分岐状の炭素数４〜７の１価アルコール）が挙げられる。
さらには、上記した抽出において抽出溶媒としてアルコール（炭素数４〜７の１価アルコールなど）が用いられる場合には、好ましくは、そのアルコールを、反応原料アルコールとして用いる。
そして、この方法では、ペンタメチレンジアミンと、尿素および／またはＮ−無置換カルバミン酸エステルと、アルコールとを配合し、好ましくは、液相で反応させる。
ペンタメチレンジアミンと、尿素および／またはＮ−無置換カルバミン酸エステルと、アルコールとの配合割合は、特に制限はなく、比較的広範囲において適宜選択することができる。
通常は、尿素およびＮ−無置換カルバミン酸エステルの配合量、および、アルコールの配合量が、ペンタメチレンジアミンのアミノ基に対して等モル以上あればよく、そのため、尿素および／または上記したＮ−無置換カルバミン酸エステルや、アルコールそのものを、この反応における反応溶媒として用いることもできる。
また、上記した抽出において抽出溶媒としてアルコール（炭素数４〜７の１価アルコールなど）が用いられる場合には、好ましくは、そのアルコールをそのまま、反応原料および反応溶媒として用いる。
なお、尿素および／または上記したＮ−無置換カルバミン酸エステルや、アルコールを反応溶媒として兼用する場合には、必要に応じて過剰量の尿素および／または上記したＮ−無置換カルバミン酸エステルやアルコールが用いられるが、過剰量が多いと、反応後の分離工程での消費エネルギーが増大するので、工業生産上、不適となる。
そのため、尿素および／または上記したＮ−無置換カルバミン酸エステルの配合量は、カルバメートの収率を向上させる観点から、ペンタメチレンジアミンのアミノ基１つに対して、０．５〜２０倍モル、好ましくは、１〜１０倍モル、さらに好ましくは、１〜５倍モルであり、アルコールの配合量は、ペンタメチレンジアミンのアミノ基１つに対して、０．５〜１００倍モル、好ましくは、１〜２０倍モル、さらに好ましくは、１〜１０倍モルである。
また、この方法においては、触媒を用いることもできる。
触媒としては、特に制限されないが、例えば、周期律表第１族（ＩＵＰＡＣ Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ｔａｂｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ｖｅｒｓｉｏｎ ｄａｔｅ ２２ Ｊｕｎｅ ２００７）に従う。以下同じ。）金属化合物（例えば、リチウムメタノラート、リチウムエタノラート、リチウムプロパノラート、リチウムブタノラート、ナトリウムメタノラート、カリウム−ｔｅｒｔ−ブタノラートなど）、第２族金属化合物（例えば、マグネシウムメタノラート、カルシウムメタノラートなど）、第３族金属化合物（例えば、酸化セリウム（ＩＶ）、酢酸ウラニルなど）、第４族金属化合物（チタンテトライソプロパノラート、チタンテトラブタノラート、四塩化チタン、チタンテトラフェノラート、ナフテン酸チタンなど）、第５族金属化合物（例えば、塩化バナジウム（ＩＩＩ）、バナジウムアセチルアセトナートなど）、第６族金属化合物（例えば、塩化クロム（ＩＩＩ）、酸化モリブデン（ＶＩ）、モリブデンアセチルアセトナート、酸化タングステン（ＶＩ）など）、第７族金属化合物（例えば、塩化マンガン（ＩＩ）、酢酸マンガン（ＩＩ）、酢酸マンガン（ＩＩＩ）など）、第８族金属化合物（例えば、酢酸鉄（ＩＩ）、酢酸鉄（ＩＩＩ）、リン酸鉄、シュウ酸鉄、塩化鉄（ＩＩＩ）、臭化鉄（ＩＩＩ）など）、第９族金属化合物（例えば、酢酸コバルト、塩化コバルト、硫酸コバルト、ナフテン酸コバルトなど）、第１０族金属化合物（例えば、塩化ニッケル、酢酸ニッケル、ナフテン酸ニッケルなど）、第１１族金属化合物（例えば、酢酸銅（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）、硝酸銅（ＩＩ）、ビス−（トリフェニル−ホスフィンオキシド）−塩化銅（ＩＩ）、モリブデン酸銅、酢酸銀、酢酸金など）、第１２族金属化合物（例えば、酸化亜鉛、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、亜鉛アセトニルアセタート、オクタン酸亜鉛、シュウ酸亜鉛、ヘキシル酸亜鉛、安息香酸亜鉛、ウンデシル酸亜鉛など）、第１３族金属化合物（例えば、アルミニウムアセチルアセトナート、アルミニウム−イソブチラート、三塩化アルミニウムなど）、第１４族金属化合物（例えば、塩化スズ（ＩＩ）、塩化スズ（ＩＶ）、酢酸鉛、リン酸鉛など）、第１５族金属化合物（例えば、塩化アンチモン（ＩＩＩ）、塩化アンチモン（Ｖ）、塩化ビスマス（ＩＩＩ）など）などが挙げられる。
さらに、触媒としては、例えば、Ｚｎ（ＯＳＯ２ＣＦ３）２（別表記：Ｚｎ（ＯＴｆ）２、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛）、Ｚｎ（ＯＳＯ２Ｃ２Ｆ５）２、Ｚｎ（ＯＳＯ２Ｃ３Ｆ７）２、Ｚｎ（ＯＳＯ２Ｃ４Ｆ９）２、Ｚｎ（ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３）２（ｐ−トルエンスルホン酸亜鉛）、Ｚｎ（ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ５）２、Ｚｎ（ＢＦ４）２、Ｚｎ（ＰＦ６）２、Ｈｆ（ＯＴｆ）４（トリフルオロメタンスルホン酸ハフニウム）、Ｓｎ（ＯＴｆ）２、Ａｌ（ＯＴｆ）３、Ｃｕ（ＯＴｆ）２なども挙げられる。
これら触媒は、単独使用または２種類以上併用することができる。
また、触媒の配合量は、ペンタメチレンジアミン１モルに対して、例えば、０．０００００１〜０．１モル、好ましくは、０．００００５〜０．０５モルである。触媒の配合量がこれより多くても、それ以上の顕著な反応促進効果が見られない反面、配合量の増大によりコストが上昇する場合がある。一方、配合量がこれより少ないと、反応促進効果が得られない場合がある。
なお、触媒の添加方法は、一括添加、連続添加および複数回の断続分割添加のいずれの添加方法でも、反応活性に影響を与えることがなく、特に制限されることはない。
また、この反応において、反応溶媒は必ずしも必要ではないが、例えば、反応原料が固体の場合や反応生成物が析出する場合には、溶媒を配合することにより操作性を向上させることができる。
溶媒としては、反応原料であるペンタメチレンジアミン、尿素および／またはＮ−無置換カルバミン酸エステル、および、アルコールと、反応生成物であるウレタン化合物などに対して不活性であるか反応性に乏しいものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、脂肪族炭化水素類（例えば、ヘキサン、ペンタン、石油エーテル、リグロイン、シクロドデカン、デカリン類など）、芳香族炭化水素類（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、イソプロピルベンゼン、ブチルベンゼン、シクロヘキシルベンゼン、テトラリン、クロロベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼン、メチルナフタレン、クロロナフタレン、ジベンジルトルエン、トリフェニルメタン、フェニルナフタレン、ビフェニル、ジエチルビフェニル、トリエチルビフェニルなど）、エーテル類（例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、アニソール、ジフェニルエーテル、テトラヒドロフラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテルなど）、カーボネート類（例えば、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、ジプロピルカーボネート、ジブチルカーボネートなど）、ニトリル類（例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、アジポニトリル、ベンゾニトリルなど）、脂肪族ハロゲン化炭化水素類（例えば、塩化メチレン、クロロホルム、１、２−ジクロロエタン、１、２−ジクロロプロパン、１、４−ジクロロブタンなど）、アミド類（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなど）、ニトロ化合物類（例えば、ニトロメタン、ニトロベンゼンなど）や、Ｎ−メチルピロリジノン、Ｎ、Ｎ−ジメチルイミダゾリジノン、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。
さらに、反応溶媒として、例えば、上記した抽出における抽出溶媒も挙げられる。
これら反応溶媒のなかでは、経済性、操作性などを考慮すると、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類が好ましく用いられる。
また、反応溶媒として、好ましくは、上記した抽出における抽出溶媒が挙げられる。
抽出溶媒を反応溶媒として用いることにより、抽出されたペンタメチレンジイソシアネートをそのままカルバメート化反応に供することができ、操作性の向上を図ることができる。
また、このような反応溶媒は、単独もしくは２種以上を組み合わせて用いることができる。
また、反応溶媒の配合量は、目的生成物のペンタメチレンジカルバメートが溶解する程度の量であれば特に制限されないが、工業的には、反応液から反応溶媒を回収する必要があるため、その回収に消費されるエネルギーをできる限り低減し、かつ、配合量が多いと、反応基質濃度が低下して反応速度が遅くなるため、できるだけ少ない方が好ましい。より具体的には、ペンタメチレンジアミン１質量部に対して、通常、０．１〜５００質量部、好ましくは、１〜１００質量部の範囲で用いられる。
また、この反応においては、反応温度は、例えば、１００〜３５０℃、好ましくは、１５０〜３００℃の範囲において適宜選択される。反応温度がこれより低いと、反応速度が低下する場合があり、一方、これより高いと、副反応が増大して目的生成物であるペンタメチレンジカルバメートの収率が低下する場合がある。
また、反応圧力は、通常、大気圧であるが、反応液中の成分の沸点が反応温度よりも低い場合には加圧してもよく、さらには、必要により減圧してもよい。
また、反応時間は、例えば、０．１〜２０時間、好ましくは、０．５〜１０時間である。反応時間がこれより短いと、目的生成物であるペンタメチレンジカルバメートの収率が低下する場合がある。一方、これより長いと、工業生産上、不適となる。
そして、この反応は、上記した条件で、例えば、反応容器内に、ペンタメチレンジアミン、尿素および／またはＮ−無置換カルバミン酸エステル、アルコール、および、必要により触媒、反応溶媒を仕込み、攪拌あるいは混合すればよい。そうすると、温和な条件下において、短時間、低コストかつ高収率で、ペンタメチレンジカルバメートが生成する。
なお、得られるペンタメチレンジカルバメートは、通常、原料成分として用いられる上記のペンタメチレンジアミンに対応し、より具体的には、１、５−ペンタメチレンジカルバメートが得られる。
また、この反応においては、アンモニアが副生される。
また、この反応において、Ｎ−無置換カルバミン酸エステルを配合する場合には、そのエステルに対応するアルコールが副生される。
なお、この反応において、反応型式としては、回分式、連続式いずれの型式も採用することができる。
また、この反応は、好ましくは、副生するアンモニアを系外に流出させながら反応させる。さらには、Ｎ−無置換カルバミン酸エステルを配合する場合には、副生するアルコールを系外に留出させながら反応させる。
これにより、目的生成物であるペンタメチレンジカルバメートの生成を促進し、その収率を、より一層向上することができる。
また、得られたペンタメチレンジカルバメートを単離する場合には、例えば、過剰（未反応）の尿素および／またはＮ−無置換カルバミン酸エステル、過剰（未反応）のアルコール、触媒、ペンタメチレンジカルバメート、反応溶媒、副生するアンモニア、場合により副生するアルコールなどを含む反応液から、公知の分離精製方法によって、ペンタメチレンジカルバメートを分離すればよい。
次いで、このペンタメチレンジイソシアネートの製造方法では、得られたペンタメチレンジカルバメートを熱分解して、ペンタメチレンジイソシアネートを製造する。
すなわち、このようなイソシアネートの製造方法では、上記によって得られたペンタメチレンジカルバメートを熱分解し、ペンタメチレンジイソシアネート、および、副生物であるアルコールを生成させる。
なお、得られるペンタメチレンジイソシアネートは、通常、原料成分として用いられる上記のペンタメチレンジアミンに対応し、より具体的には、１、５−ペンタメチレンジイソシアネートが得られる。
また、アルコールとしては、通常、原料成分として用いられるアルコールと同種のアルコールが、副生する。
この熱分解は、特に限定されず、例えば、液相法、気相法などの公知の分解法を用いることができる。
気相法では、熱分解により生成するペンタメチレンジイソシアネートおよびアルコールは、気体状の生成混合物から、分別凝縮によって分離することができる。また、液相法では、熱分解により生成するペンタメチレンジイソシアネートおよびアルコールは、例えば、蒸留や、担持物質としての溶剤および／または不活性ガスを用いて、分離することができる。
熱分解として、好ましくは、作業性の観点から、液相法が挙げられる。
液相法におけるペンタメチレンジカルバメートの熱分解反応は、可逆反応であるため、好ましくは、熱分解反応の逆反応（ペンタメチレンジイソシアネートとアルコールとのウレタン化反応）を抑制するため、ペンタメチレンジカルバメートを熱分解するとともに、反応混合物からペンタメチレンジイソシアネート、および／または、副生するアルコールを、例えば、気体として抜き出し、それらを分離する。
熱分解反応の反応条件として、好ましくは、ペンタメチレンジカルバメートを良好に熱分解できるとともに、熱分解において生成したペンタメチレンジイソシアネートおよびアルコールが蒸発し、これによりペンタメチレンジカルバメートとペンタメチレンジイソシアネートとが平衡状態とならず、さらには、ペンタメチレンジイソシアネートの重合などの副反応が抑制される条件が挙げられる。
このような反応条件として、より具体的には、熱分解温度は、通常、３５０℃以下であり、好ましくは、８０〜３５０℃、より好ましくは、１００〜３００℃である。８０℃よりも低いと、実用的な反応速度が得られない場合があり、また、３５０℃を超えると、ペンタメチレンジイソシアネートの重合など、好ましくない副反応を生じる場合がある。また、熱分解反応時の圧力は、上記の熱分解反応温度に対して、生成するアルコールが気化し得る圧力であることが好ましく、設備面および用役面から実用的には、０．１３３〜９０ｋＰａであることが好ましい。
また、この熱分解に用いられるペンタメチレンジカルバメートは、精製したものでもよいが、上記反応（すなわち、ペンタメチレンジアミンと、尿素および／またはＮ−無置換カルバミン酸エステルと、アルコールとの反応）の終了後に、過剰（未反応）の尿素および／またはＮ−無置換カルバミン酸エステル、過剰（未反応）のアルコール、触媒、反応溶媒、副生するアンモニア、場合により副生するアルコールを回収して分離されたペンタメチレンジカルバメートの粗原料を用いて、引き続き熱分解してもよい。
さらに、必要により、触媒および不活性溶媒を添加してもよい。これら触媒および不活性溶媒は、それらの種類により異なるが、上記反応時、反応後の蒸留分離の前後、ペンタメチレンジカルバメートの分離の前後の、いずれかに添加すればよい。
熱分解に用いられる触媒としては、イソシアネートと水酸基とのウレタン化反応に用いられる、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｐｂ、Ｍｏ、Ｍｎなどから選ばれる１種以上の金属単体またはその酸化物、ハロゲン化物、カルボン酸塩、リン酸塩、有機金属化合物などの金属化合物が用いられる。これらのうち、この熱分解においては、Ｆｅ、Ｓｎ、Ｃｏ、Ｓｂ、Ｍｎが副生成物を生じにくくする効果を発現するため、好ましく用いられる。
Ｓｎの金属触媒としては、例えば、酸化スズ、塩化スズ、臭化スズ、ヨウ化スズ、ギ酸スズ、酢酸スズ、シュウ酸スズ、オクチル酸スズ、ステアリン酸スズ、オレイン酸スズ、リン酸スズ、二塩化ジブチルスズ、ジラウリン酸ジブチルスズ、１、１、３、３−テトラブチル−１、３−ジラウリルオキシジスタノキサンなどが挙げられる。
Ｆｅ、Ｃｏ、Ｓｂ、Ｍｎの金属触媒としては、例えば、それらの酢酸塩、安息香酸塩、ナフテン酸塩、アセチルアセトナート塩などが挙げられる。
なお、触媒の配合量は、金属単体またはその化合物として、反応液に対して０．０００１〜５質量％の範囲、好ましくは、０．００１〜１質量％の範囲である。
また、不活性溶媒は、少なくとも、ペンタメチレンジカルバメートを溶解し、ペンタメチレンジカルバメートおよびイソシアネートに対して不活性であり、かつ、熱分解における温度において安定であれば、特に制限されないが、熱分解反応を効率よく実施するには、生成するイソシアネートよりも高沸点であることが好ましい。このような不活性溶媒としては、例えば、フタル酸ジオクチル、フタル酸ジデシル、フタル酸ジドデシルなどのエステル類、例えば、ジベンジルトルエン、トリフェニルメタン、フェニルナフタレン、ビフェニル、ジエチルビフェニル、トリエチルビフェニルなどの熱媒体として常用される芳香族系炭化水素や脂肪族系炭化水素などが挙げられる。
また、不活性溶媒は、市販品としても入手可能であり、例えば、バーレルプロセス油Ｂ−０１（芳香族炭化水素類、沸点：１７６℃）、バーレルプロセス油Ｂ−０３（芳香族炭化水素類、沸点：２８０℃）、バーレルプロセス油Ｂ−０４ＡＢ（芳香族炭化水素類、沸点：２９４℃）、バーレルプロセス油Ｂ−０５（芳香族炭化水素類、沸点：３０２℃）、バーレルプロセス油Ｂ−２７（芳香族炭化水素類、沸点：３８０℃）、バーレルプロセス油Ｂ−２８ＡＮ（芳香族炭化水素類、沸点：４３０℃）、バーレルプロセス油Ｂ−３０（芳香族炭化水素類、沸点：３８０℃）、バーレルサーム２００（芳香族炭化水素類、沸点：３８２℃）、バーレルサーム３００（芳香族炭化水素類、沸点：３４４℃）、バーレルサーム４００（芳香族炭化水素類、沸点：３９０℃）、バーレルサーム１Ｈ（芳香族炭化水素類、沸点：２１５℃）、バーレルサーム２Ｈ（芳香族炭化水素類、沸点：２９４℃）、バーレルサーム３５０（芳香族炭化水素類、沸点：３０２℃）、バーレルサーム４７０（芳香族炭化水素類、沸点：３１０℃）、バーレルサームＰＡ（芳香族炭化水素類、沸点：１７６℃）、バーレルサーム３３０（芳香族炭化水素類、沸点：２５７℃）、バーレルサーム４３０（芳香族炭化水素類、沸点：２９１℃）、（以上、松村石油社製）、ＮｅｏＳＫ−ＯＩＬ１４００（芳香族炭化水素類、沸点：３９１℃）、ＮｅｏＳＫ−ＯＩＬ１３００（芳香族炭化水素類、沸点：２９１℃）、ＮｅｏＳＫ−ＯＩＬ３３０（芳香族炭化水素類、沸点：３３１℃）、ＮｅｏＳＫ−ＯＩＬ１７０（芳香族炭化水素類、沸点：１７６℃）、ＮｅｏＳＫ−ＯＩＬ２４０（芳香族炭化水素類、沸点：２４４℃）、ＫＳＫ−ＯＩＬ２６０（芳香族炭化水素類、沸点：２６６℃）、ＫＳＫ−ＯＩＬ２８０（芳香族炭化水素類、沸点：３０３℃）、（以上、綜研テクニックス社製）などが挙げられる。
不活性溶媒の配合量は、ペンタメチレンジカルバメート１質量部に対して０．００１〜１００質量部の範囲、好ましくは、０．０１〜８０質量部、より好ましくは、０．１〜５０質量部の範囲である。
また、この熱分解反応は、ペンタメチレンジカルバメート、触媒および不活性溶媒を一括で仕込む回分反応、また、触媒を含む不活性溶媒中に、減圧下でペンタメチレンジカルバメートを仕込んでいく連続反応のいずれでも実施することができる。
また、熱分解では、ペンタメチレンジイソシアネートおよびアルコールが生成するとともに、副反応によって、例えば、アロファネート、アミン類、尿素、炭酸塩、カルバミン酸塩、二酸化炭素などが生成する場合があるため、必要により、得られたペンタメチレンジイソシアネートは、公知の方法により精製される。
また、カルバメート法としては、詳しくは述べないが、上記した尿素法の他、公知のカーボネート法、すなわち、ペンタメチレンジアミンと、炭酸ジアルキルあるいは炭酸ジアリールとからペンタメチレンジカルバメートを合成し、そのペンタメチレンジカルバメートを、上記と同様に熱分解して、ペンタメチレンジイソシアネートを得る方法などを採用することもできる。
このようにして得られる本発明のペンタメチレンジイソシアネートの純度は、例えば、９５〜１００質量％、好ましくは、９７〜１００質量％、より好ましくは９８〜１００質量％、とりわけ好ましくは、９９〜１００質量％、最も好ましくは、９９．５〜１００質量％である。
また、ペンタメチレンジイソシアネートには、例えば、安定剤などを添加することができる。
安定剤としては、例えば、酸化防止剤、酸性化合物、スルホンアミド基を含有する化合物、有機亜リン酸エステルなどが挙げられる。
酸化防止剤としては、例えば、ヒンダードフェノール系酸化防止剤などが挙げられ、具体的には、例えば、２、６−ジ（ｔ−ブチル）−４−メチルフェノール、２、４、６−トリ−ｔ−ブチルフェノール、２、２’−メチレンビス−（４−メチル−６−ｔ−ブチルフェノール）、２、２’−チオ−ビス−（４−メチル−６−ｔ−ブチルフェノール）、４、４’−チオ−ビス（３−メチル−６−ｔ−ブチルフェノール）、４、４’−ブチリデン−ビス−（６−ｔ−ブチル−３−メチルフェノール）、４、４’−メチリデン−ビス−（２、６−ジ−ｔ−ブチルフェノール）、２、２’−メチレン−ビス−［４−メチル−６−（１−メチルシクロヘキシル）−フェノール］、テトラキス−［メチレン−３−（３、５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−プロピオニル］−メタン、１、３、５−トリメチル−２、４、６−トリス−（３、５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−プロピオニル−メタン、１、３、５−トリメチル−２、４、６−トリス−（３、５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンジル）−ベンゼン、Ｎ、Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス−（３、５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシヒドロ桂皮酸アミド、１、３、５−トリス−（３、５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンジル）−イソシアヌレート、１、１、３−トリス−（５−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−２−メチルフェニル）−ブタン、１、３、５−トリス−（３、５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンジル）−メシチレン、エチレングリコール−ビス−［３、３−ビス−（３’−ｔ−ブチルー４’−ヒドロキシフェニル）−ブチレート、２、２’−チオジエチル−ビス−３−（３、５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−プロピオネート、ジ−（３−ｔ−ブチル−４’−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）−ジシクロペンタジエン、２、２’−メチレン−ビス−（４−メチル−６−シクロヘキシルフェノール）、１、６−ヘキサンジオール−ビス−（３、５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−プロピオネート、２、４−ビス−（ｎ−オクチルチオ）−６−（４−ヒドロキシ−３、５−ジ−ｔ−ブチルアニリノ）−１、３、５−トリアジン、ジエチル−３、５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシベジルホスホネート、トリエチレングリコール−ビス−３−（ｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）−プロピオネート、さらには、例えば、ＩＲＧＡＮＯＸ１０１０、ＩＲＧＡＮＯＸ１０７６、ＩＲＧＡＮＯＸ１０９８、ＩＲＧＡＮＯＸ１１３５、ＩＲＧＡＮＯＸ１７２６、ＩＲＧＡＮＯＸ２４５、ＩＲＧＡＮＯＸ３１１４、ＩＲＧＡＮＯＸ３７９０（以上、ＢＡＳＦジャパン社製、商品名）などが挙げられる。
これら酸化防止剤は、単独使用または２種類以上併用することができる。
酸性化合物としては、例えば、有機酸性化合物が挙げられ、具体的には、例えば、リン酸エステル、亜リン酸エステル、次亜リン酸エステル、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ヒドロキシ酢酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、スルホン酸、スルホン酸エステル、フェノール、エノール、イミド、オキシムなどが挙げられる。
これら酸性化合物は、単独使用または２種類以上併用することができる。
スルホンアミド基を含有する化合物としては、例えば、芳香族スルホンアミド類、脂肪族スルホンアミド類などが挙げられる。
芳香族スルホンアミド類としては、例えば、ベンゼンスルホンアミド、ジメチルベンゼンスルホンアミド、スルファニルアミド、ｏ−およびｐ−トルエンスルホンアミド、ヒドロキシナフタレンスルホンアミド、ナフタレン−１−スルホンアミド、ナフタレン−２−スルホンアミド、ｍ−ニトロベンゼンスルホンアミド、ｐ−クロロベンゼンスルホンアミドなどが挙げられる。
脂肪族スルホンアミド類としては、例えば、メタンスルホンアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタンスルホンアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルエタンスルホンアミド、Ｎ、Ｎ−ジエチルメタンスルホンアミド、Ｎ−メトキシメタンスルホンアミド、Ｎ−ドデシルメタンスルホンアミド、Ｎ−シクロヘキシル−１−ブタンスルホンアミド、２−アミノエタンスルホンアミドなどが挙げられる。
これらスルホンアミド基を含有する化合物は、単独使用または２種類以上併用することができる。
有機亜リン酸エステルとしては、例えば、有機亜リン酸ジエステル、有機亜リン酸トリエステルなどが挙げられ、より具体的には、例えば、トリエチルホスファイト、トリブチルホスファイト、トリス（２−エチルヘキシル）ホスファイト、トリデシルホスファイト、トリラウリルホスファイト、トリス（トリデシル）ホスファイト、トリステアリルホスファイト、トリフェニルホスファイト、トリス（ノニルフェニル）ホスファイト、トリス（２、４−ジ−ｔ−ブチルフェニル）ホスファイト、ジフェニルデシルホスファイト、ジフェニル（トリデシル）ホスファイトなどのモノフォスファイト類、例えば、ジステアリル・ペンタエリスリチル・ジホスファイト、ジ・ドデシル・ペンタエリスリトール・ジホスファイト、ジ・トリデシル・ペンタエリスリトール・ジホスファイト、ジノニルフェニル・ペンタエリスリトール・ジホスファイト、テトラフェニル・テトラ・トリデシル・ペンタエリスリチル・テトラホスファイト、テトラフェニル・ジプロピレングリコール・ジホスファイト、トリペンタエリスリトール・トリホスファイトなどの多価アルコールから誘導されたジ、トリあるいはテトラホスファイト類、さらに、例えば、炭素数が１〜２０のジ・アルキル・ビスフェノールＡ・ジホスファイト、４、４’−ブチリデン−ビス（３−メチル−６−ｔ−ブチルフェニル−ジ・トリデシル）ホスファイトなどのビスフェノール系化合物から誘導されたジホスファイト類、水添ビスフェノールＡホスファイトポリマー（分子量２４００〜３０００）などのポリホスファイト類、トリス（２、３−ジクロロプロピル）ホスファイトなどが挙げられる。
これら有機亜リン酸エステルは、単独使用または２種類以上併用することができる。
安定剤として、好ましくは、酸化防止剤、酸性化合物、スルホンアミド基を含有する化合物が挙げられる。より好ましくは、ペンタメチレンジイソシアネートに、酸化防止剤と、酸性化合物および／またはスルホンアミド基を含有する化合物とを配合し、含有させる。
これら安定剤を添加することにより、そのペンタメチレンジイソシアネートを用いて得られるイソシアネート変性体（後述）の、貯蔵安定性の向上を図ることができる。
なお、安定剤の配合割合は、特に制限されず、必要および用途に応じて、適宜設定される。
具体的には、酸化防止剤の配合割合は、ペンタメチレンジイソシアネート１００質量部に対して、例えば、０．０００５〜０．０５質量部である。
また、酸性化合物および／またはスルホンアンド基を含有する化合物の配合割合（併用される場合には、それらの総量）は、ペンタメチレンジイソシアネート１００質量部に対して、例えば、０．０００５〜０．０２質量部である。
また、本発明は、さらに、ポリイソシアネート組成物を含んでいる。
ポリイソシアネート組成物は、より具体的には、ペンタメチレンジイソシアネートを変性することにより得られ、下記（ａ）〜（ｅ）の官能基を少なくとも１種含有している。（ａ）イソシアヌレート基
（ｂ）アロファネート基
（ｃ）ビウレット基
（ｄ）ウレタン基
（ｅ）ウレア基
上記（ａ）の官能基（イソシアヌレート基）を含有するポリイソシアネート組成物は、ペンタメチレンジイソシアネートのトリマー（三量体）であって、例えば、ペンタメチレンジイソシアネートを公知のイソシアヌレート化触媒の存在下において反応させ、三量化することにより、得ることができる。
上記（ｂ）の官能基（アロファネート基）を含有するポリイソシアネート組成物は、ペンタメチレンジイソシアネートのアロファネート変性体であって、例えば、ペンタメチレンジイソシアネートとモノアルコールとを反応させた後、公知のアロファネート化触媒の存在下でさらに反応させることにより、得ることができる。
上記（ｃ）の官能基（ビウレット基）を含有するポリイソシアネート組成物は、ペンタメチレンジイソシアネートのビウレット変性体であって、例えば、ペンタメチレンジイソシアネートと、例えば、水、第三級アルコール（例えば、ｔ−ブチルアルコールなど）、第二級アミン（例えば、ジメチルアミン、ジエチルアミンなど）などとを反応させた後、公知のビウレット化触媒の存在下でさらに反応させることにより、得ることができる。
上記（ｂ）の官能基（ウレタン基）を含有するポリイソシアネート組成物は、ペンタメチレンジイソシアネートのポリオール変性体であって、例えば、ペンタメチレンジイソシアネートとポリオール成分（例えば、トリメチロールプロパンなど。詳しくは後述）との反応により、得ることができる。
上記（ｅ）の官能基（ウレア基）を含有するポリイソシアネート組成物は、ペンタメチレンジイソシアネートのポリアミン変性体であって、例えば、ペンタメチレンジイソシアネートと水、ポリアミン成分（後述）などとの反応により、得ることができる。
なお、ポリイソシアネート組成物は、上記（ａ）〜（ｅ）の官能基を少なくとも１種含有していればよく、２種以上含有することもできる。そのようなポリイソシアネート組成物は、上記の反応を適宜併用することにより、生成される。
ポリイソシアネート組成物として、好ましくは、ペンタメチレンジイソシアネートのトリマー（イソシアヌレート基を含有するポリイソシアネート組成物）が挙げられる。
なお、ペンタメチレンジイソシアネートのトリマーは、イソシアヌレート基の他、さらに、イミノオキサジアジンジオン基などを有するポリイソシアネートを、含んでいる。
そして、本発明のポリウレタン樹脂は、上記のペンタメチレンジイソシアネート、および／または、上記のポリイソシアネート組成物と、活性水素化合物とを反応させることにより得ることができる。
活性水素化合物としては、例えば、ポリオール成分（水酸基を２つ以上有するポリオールを主として含有する成分）、ポリアミン成分（アミノ基を２つ以上有するポリアミンを主として含有する化合物）などが挙げられる。
本発明において、ポリオール成分としては、低分子量ポリオールおよび高分子量ポリオールが挙げられる。
低分子量ポリオールは、水酸基を２つ以上有する数平均分子量４００未満の化合物であって、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、１、３−プロパンジオール、１、４−ブチレングリコール、１、３−ブチレングリコール、１、２−ブチレングリコール、１、５−ペンタンジオール、１、６−ヘキサンジオール、ネオペンチルグリコール、３−メチル−１、５−ペンタンジオール、２、２、２−トリメチルペンタンジオール、３、３−ジメチロールヘプタン、アルカン（Ｃ７〜２０）ジオール、１、３−または１、４−シクロヘキサンジメタノールおよびそれらの混合物、１、３−または１、４−シクロヘキサンジオールおよびそれらの混合物、水素化ビスフェノールＡ、１、４−ジヒドロキシ−２−ブテン、２、６−ジメチル−１−オクテン−３、８−ジオール、ビスフェノールＡ、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ジプロピレングリコールなどの２価アルコール、例えば、グリセリン、トリメチロールプロパンなどの３価アルコール、例えば、テトラメチロールメタン（ペンタエリスリトール）、ジグリセリンなどの４価アルコール、例えば、キシリトールなどの５価アルコール、例えば、ソルビトール、マンニトール、アリトール、イジトール、ダルシトール、アルトリトール、イノシトール、ジペンタエリスリトールなどの６価アルコール、例えば、ペルセイトールなどの７価アルコール、例えば、ショ糖などの８価アルコールなどが挙げられる。
これら低分子量ポリオールは、単独使用または２種類以上併用することができる。
高分子量ポリオールは、水酸基を２つ以上有する数平均分子量４００以上の化合物であって、例えば、ポリエーテルポリオール、ポリエステルポリオール、ポリカーボネートポリオール、ポリウレタンポリオール、エポキシポリオール、植物油ポリオール、ポリオレフィンポリオール、アクリルポリオール、および、ビニルモノマー変性ポリオールが挙げられる。
ポリエーテルポリオールとしては、例えば、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレンエーテルグリコールなどが挙げられる。
ポリプロピレングリコールとしては、例えば、上記した低分子量ポリオールまたは芳香族／脂肪族ポリアミンを開始剤とする、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイドなどのアルキレンオキサイドの付加重合物（２種以上のアルキレンオキサイドのランダムおよび／またはブロック共重合体を含む。）が挙げられる。
ポリテトラメチレンエーテルグリコールとしては、例えば、テトラヒドロフランのカチオン重合により得られる開環重合物や、テトラヒドロフランの重合単位に上記した２価アルコールを共重合した非晶性ポリテトラメチレンエーテルグリコールなどが挙げられる。
ポリエステルポリオールとしては、例えば、上記した低分子量ポリオールと多塩基酸とを、公知の条件下、反応させて得られる重縮合物が挙げられる。
多塩基酸としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、メチルコハク酸、グルタール酸、アジピン酸、１、１−ジメチル−１、３−ジカルボキシプロパン、３−メチル−３−エチルグルタール酸、アゼライン酸、セバシン酸、その他の飽和脂肪族ジカルボン酸（Ｃ１１〜１３）、例えば、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、その他の不飽和脂肪族ジカルボン酸、例えば、オルソフタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、トルエンジカルボン酸、ナフタレンジカルボン酸、その他の芳香族ジカルボン酸、例えば、ヘキサヒドロフタル酸、その他の脂環族ジカルボン酸、例えば、ダイマー酸、水添ダイマー酸、ヘット酸などのその他のカルボン酸、および、それらカルボン酸から誘導される酸無水物、例えば、無水シュウ酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、無水２−アルキル（Ｃ１２〜Ｃ１８）コハク酸、無水テトラヒドロフタル酸、無水トリメリット酸、さらには、これらのカルボン酸などから誘導される酸ハライド、例えば、シュウ酸ジクロライド、アジピン酸ジクロライド、セバシン酸ジクロライドなどが挙げられる。
また、ポリエステルポリオールとして、例えば、植物由来のポリエステルポリオール、具体的には、上記した低分子量ポリオールを開始剤として、ヒドロキシル基含有植物油脂肪酸（例えば、リシノレイン酸を含有するひまし油脂肪酸、１２−ヒドロキシステアリン酸を含有する水添ひまし油脂肪酸など）などのヒドロキシカルボン酸を、公知の条件下、縮合反応させて得られる植物油系ポリエステルポリオールなどが挙げられる。
また、ポリエステルポリオールとして、例えば、上記した低分子量ポリオール（好ましくは、２価アルコール）を開始剤として、例えば、ε−カプロラクトン、γ−バレロラクトンなどのラクトン類や、例えば、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチドなどのラクチド類などを開環重合して得られる、ポリカプロラクトンポリオール、ポリバレロラクトンポリオール、さらには、それらに上記した２価アルコールを共重合したラクトン系ポリエステルポリオールなどが挙げられる。
ポリカーボネートポリオールとしては、例えば、上記した低分子量ポリオール（好ましくは、２価アルコール）を開始剤とするエチレンカーボネートの開環重合物や、例えば、１、４−ブタンジオール、１、５−ペンタンジオール、３−メチル−１、５−ペンタンジオールや１、６−ヘキサンジオールなどの２価アルコールと、開環重合物とを共重合した非晶性ポリカーボネートポリオールなどが挙げられる。
また、ポリウレタンポリオールは、上記により得られたポリエステルポリオール、ポリエーテルポリオールおよび／またはポリカーボネートポリオールを、イソシアネート基（ＮＣＯ）に対する水酸基（ＯＨ）の当量比（ＯＨ／ＮＣＯ）が１を超過する割合で、ポリイソシアネートと反応させることによって、ポリエステルポリウレタンポリオール、ポリエーテルポリウレタンポリオール、ポリカーボネートポリウレタンポリオール、あるいは、ポリエステルポリエーテルポリウレタンポリオールなどとして得ることができる。
エポキシポリオールとしては、例えば、上記した低分子量ポリオールと、例えば、エピクロルヒドリン、β−メチルエピクロルヒドリンなどの多官能ハロヒドリンとの反応により得られるエポキシポリオールが挙げられる。
植物油ポリオールとしては、例えば、ひまし油、やし油などのヒドロキシル基含有植物油などが挙げられる。例えば、ひまし油ポリオール、または、ひまし油脂肪酸とポリプロピレンポリオールとの反応により得られるエステル変性ひまし油ポリオールなどが挙げられる。
ポリオレフィンポリオールとしては、例えば、ポリブタジエンポリオール、部分ケン価エチレン−酢酸ビニル共重合体などが挙げられる。
アクリルポリオールとしては、例えば、ヒドロキシル基含有アクリレートと、ヒドロキシル基含有アクリレートと共重合可能な共重合性ビニルモノマーとを、共重合させることによって得られる共重合体が挙げられる。
ヒドロキシル基含有アクリレートとしては、例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２、２−ジヒドロキシメチルブチル（メタ）アクリレート、ポリヒドロキシアルキルマレエート、ポリヒドロキシアルキルフマレートなどが挙げられる。好ましくは、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
共重合性ビニルモノマーとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｓ−ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、イソペンチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、イソノニル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシルアクリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート（炭素数１〜１２）、例えば、スチレン、ビニルトルエン、α−メチルスチレンなどの芳香族ビニル、例えば、（メタ）アクリロニトリルなどのシアン化ビニル、例えば、（メタ）アクリル酸、フマル酸、マレイン酸、イタコン酸などのカルボキシル基を含むビニルモノマー、または、そのアルキルエステル、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、オリゴエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレートなどのアルカンポリオールポリ（メタ）アクリレート、例えば、３−（２−イソシアネート−２−プロピル）−α−メチルスチレンなどのイソシアネート基を含むビニルモノマーなどが挙げられる。
そして、アクリルポリオールは、これらヒドロキシル基含有アクリレート、および、共重合性ビニルモノマーを、適当な溶剤および重合開始剤の存在下において共重合させることにより得ることができる。
また、アクリルポリオールには、例えば、シリコーンポリオールやフッ素ポリオールが含まれる。
シリコーンポリオールとしては、例えば、上記したアクリルポリオールの共重合において、共重合性ビニルモノマーとして、例えば、γ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシランなどのビニル基を含むシリコーン化合物が配合されたアクリルポリオールが挙げられる。
フッ素ポリオールとしては、例えば、上記したアクリルポリオールの共重合において、共重合性ビニルモノマーとして、例えば、テトラフルオロエチレン、クロロトリフルオロエチレンなどのビニル基を含むフッ素化合物が配合されたアクリルポリオールが挙げられる。
ビニルモノマー変性ポリオールは、上記した高分子量ポリオールと、ビニルモノマーとの反応により得ることができる。
高分子量ポリオールとして、好ましくは、ポリエーテルポリオール、ポリエステルポリオールおよびポリカーボネートポリオールから選択される高分子量ポリオールが挙げられる。
また、ビニルモノマーとしては、例えば、上記したアルキル（メタ）アクリレート、シアン化ビニルまたはシアン化ビニリデンなどが挙げられる。これらビニルモノマーは、単独使用または２種類以上併用することができる。また、これらのうち、好ましくは、アルキル（メタ）アクリレートが挙げられる。
そして、ビニルモノマー変性ポリオールは、これら高分子量ポリオール、および、ビニルモノマーを、例えば、ラジカル重合開始剤（例えば、過硫酸塩、有機過酸化物、アゾ系化合物など）の存在下などにおいて反応させることにより得ることができる。
これら高分子量ポリオールは、単独使用または２種類以上併用することができる。
高分子量ポリオールとして、好ましくは、ポリエステルポリオール、アクリルポリオールが挙げられ、より好ましくは、ポリエステルポリオールが挙げられ、さらに好ましくは、植物由来のポリエステルポリオールが挙げられる。
これらポリオール成分は、単独使用または２種類以上併用することができる。
ポリアミン成分としては、例えば、芳香族ポリアミン、芳香脂肪族ポリアミン、脂環族ポリアミン、脂肪族ポリアミン、アミノアルコール、第１級アミノ基、または、第１級アミノ基および第２級アミノ基を有するアルコキシシリル化合物、ポリオキシエチレン基含有ポリアミンなどが挙げられる。
芳香族ポリアミンとしては、例えば、４、４’−ジフェニルメタンジアミン、トリレンジアミンなどが挙げられる。
芳香脂肪族ポリアミンとしては、例えば、１、３−または１、４−キシリレンジアミンもしくはその混合物などが挙げられる。
脂環族ポリアミンとしては、例えば、３−アミノメチル−３、５、５−トリメチルシクロヘキシルアミン（別名：イソホロンジアミン）、４、４’−ジシクロヘキシルメタンジアミン、２、５（２、６）−ビス（アミノメチル）ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、１、４−シクロヘキサンジアミン、１−アミノ−３−アミノメチル−３、５、５−トリメチルシクロヘキサン、ビス−（４−アミノシクロヘキシル）メタン、ジアミノシクロヘキサン、３、９−ビス（３−アミノプロピル）−２、４、８、１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカン、１、３−および１、４−ビス（アミノメチル）シクロヘキサンおよびそれらの混合物などが挙げられる。
脂肪族ポリアミンとしては、例えば、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、１、３−プロパンジアミン、１、４−ブタンジアミン、１、５−ペンタンジアミン、１、６−ヘキサメチレンジアミン、ヒドラジン（水和物を含む。）、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、１、２−ジアミノエタン、１、２−ジアミノプロパン、１、３−ジアミノペンタンなどが挙げられる。
アミノアルコールとしては、例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）エタノールアミンなどが挙げられる。
第１級アミノ基、または、第１級アミノ基および第２級アミノ基を有するアルコキシシリル化合物としては、例えば、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−フェニル−γ−アミノプロピルトリメトキシシランなどのアルコキシシリル基含有モノアミン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルメチルジメトキシシランなどが挙げられる。
ポリオキシエチレン基含有ポリアミンとしては、例えば、ポリオキシエチレンエーテルジアミンなどのポリオキシアルキレンエーテルジアミンが挙げられる。より具体的には、例えば、日本油脂製のＰＥＧ＃１０００ジアミンや、ハンツマン社製のジェファーミンＥＤ―２００３、ＥＤＲ−１４８、ＸＴＪ−５１２などが挙げられる。
これらポリアミン成分は、単独使用または２種類以上併用することができる。
なお、本発明では、必要に応じて、公知の添加剤、例えば、可塑剤、ブロッキング防止剤、耐熱安定剤、耐光安定剤、酸化防止剤、離型剤、触媒、さらには、顔料、染料、滑剤、フィラー、加水分解防止剤などを添加することができる。これら添加剤は、各成分の合成時に添加してもよく、あるいは、各成分の混合・溶解時に添加してもよく、さらには、合成後に添加することもできる。
そして、本発明のポリウレタン樹脂は、例えば、バルク重合や溶液重合などの重合方法により製造することができる。
バルク重合では、例えば、窒素気流下において、ペンタメチレンジイソシアネートおよび／またはポリイソシアネート組成物を撹拌しつつ、これに、活性水素化合物を加えて、反応温度５０〜２５０℃、さらに好ましくは５０〜２００℃で、０．５〜１５時間程度反応させる。
溶液重合では、有機溶剤に、ペンタメチレンジイソシアネートおよび／またはポリイソシアネート組成物、活性水素化合物を加えて、反応温度５０〜１２０℃、さらに好ましくは５０〜１００℃で、０．５〜１５時間程度反応させる。
有機溶剤としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類、例えば、アセトニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソブチルなどのアルキルエステル類、例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、オクタンなどの脂肪族炭化水素類、例えば、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサンなどの脂環族炭化水素類、例えば、トルエン、キシレン、エチルベンゼンなどの芳香族炭化水素類、例えば、メチルセロソルブアセテート、エチルセロソルブアセテート、メチルカルビトールアセテート、エチルカルビトールアセテート、エチレングリコールエチルエーテルアセテート、プロピレングリコールメチルエーテルアセテート、３−メチル−３−メトキシブチルアセテート、エチル−３−エトキシプロピオネートなどのグリコールエーテルエステル類、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、例えば、塩化メチル、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、臭化メチル、ヨウ化メチレン、ジクロロエタンなどのハロゲン化脂肪族炭化水素類、例えば、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、Ｎ、Ｎ’−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホニルアミドなどの極性非プロトン類などが挙げられる。
さらに、有機溶剤としては、例えば、非極性溶剤（非極性有機溶剤）が挙げられ、これら非極性溶剤としては、脂肪族、ナフテン系炭化水素系有機溶剤を含む、アニリン点が、例えば、１０〜７０℃、好ましくは、１２〜６５℃の、低毒性で溶解力の弱い非極性有機溶剤や、ターペン油に代表される植物性油などが挙げられる。
かかる非極性有機溶剤は、市販品として入手可能であり、そのような市販品としては、例えば、ハウス（シェル化学製、アニリン点１５℃）、スワゾール３１０（丸善石油製、アニリン点１６℃）、エッソナフサＮｏ．６（エクソン化学製、アニリン点４３℃）、ロウス（シェル化学製、アニリン点４３℃）、エッソナフサＮｏ．５（エクソン製、アニリン点５５℃）、ペガゾール３０４０（モービル石油製、アニリン点５５℃）などの石油炭化水素系有機溶剤、その他、メチルシクロヘキサン（アニリン点４０℃）、エチルシクロヘキサン（アニリン点４４℃）、ガムテレピンＮ（安原油脂製、アニリン点２７℃）などのターペン油類などが挙げられる。
さらに、上記重合反応においては、必要に応じて、例えば、ウレタン化触媒を添加することができる。
アミン類としては、例えば、トリエチルアミン、トリエチレンジアミン、ビス−（２−ジメチルアミノエチル）エーテル、Ｎ−メチルモルホリンなどの３級アミン類、例えば、テトラエチルヒドロキシルアンモニウムなどの４級アンモニウム塩、例えば、イミダゾール、２−エチル−４−メチルイミダゾールなどのイミダゾール類などが挙げられる。
有機金属化合物としては、例えば、酢酸錫、オクチル酸錫、オレイン酸錫、ラウリル酸錫、ジブチル錫ジアセテート、ジメチル錫ジラウレート、ジブチル錫ジラウレート、ジブチル錫ジメルカプチド、ジブチル錫マレエート、ジブチル錫ジラウレート、ジブチル錫ジネオデカノエート、ジオクチル錫ジメルカプチド、ジオクチル錫ジラウリレート、ジブチル錫ジクロリドなどの有機錫系化合物、例えば、オクタン酸鉛、ナフテン酸鉛などの有機鉛化合物、例えば、ナフテン酸ニッケルなどの有機ニッケル化合物、例えば、ナフテン酸コバルトなどの有機コバルト化合物、例えば、オクテン酸銅などの有機銅化合物、例えば、オクチル酸ビスマス、ネオデカン酸ビスマスなどの有機ビスマス化合物などが挙げられる。
さらに、ウレタン化触媒として、例えば、炭酸カリウム、酢酸カリウム、オクチル酸カリウムなどのカリウム塩が挙げられる。
これらウレタン化触媒は、単独使用または２種類以上併用することができる。
また、上記重合反応においては、（未反応の）ペンタメチレンジイソシアネートおよび／またはポリイソシアネート組成物を、例えば、蒸留や抽出などの公知の除去手段により除去することができる。
バルク重合および溶液重合では、例えば、ペンタメチレンジイソシアネートおよび／またはポリイソシアネート組成物と、活性水素化合物とを、活性水素化合物中の活性水素基（水酸基、アミノ基）に対するペンタメチレンジイソシアネートおよび／またはポリイソシアネート組成物中のイソシアネート基の当量比（ＮＣＯ／活性水素基）が、例えば、０．７５〜１．３、好ましくは、０．９〜１．１となるように配合する。
また、上記重合反応をより工業的に実施する場合には、ポリウレタン樹脂は、その用途に応じて、例えば、ワンショット法およびプレポリマー法などの公知の方法により、得ることができる。また、その他の方法により、ポリウレタン樹脂を、例えば、水系ディスパージョン（ＰＵＤ）などとして得ることもできる。
ワンショット法では、例えば、ペンタメチレンジイソシアネートおよび／またはポリイソシアネート組成物と活性水素化合物とを、活性水素化合物中の活性水素基（水酸基、アミノ基）に対するペンタメチレンジイソシアネートおよび／またはポリイソシアネート組成物中のイソシアネート基の当量比（ＮＣＯ／活性水素基）が、例えば、０．７５〜１．３、好ましくは、０．９〜１．１となるように処方（混合）した後、例えば、室温〜２５０℃、好ましくは、室温〜２００℃で、例えば、５分〜７２時間、好ましくは、４〜２４時間硬化反応させる。なお、硬化温度は、一定温度であってもよく、あるいは、段階的に昇温または冷却することもできる。
また、プレポリマー法では、例えば、まず、ペンタメチレンジイソシアネートおよび／またはポリイソシアネート組成物と活性水素化合物の一部（好ましくは、高分子量ポリオール）とを反応させて、分子末端にイソシアネート基を有するイソシアネート基末端プレポリマーを合成する。次いで、得られたイソシアネート基末端プレポリマーと、活性水素化合物の残部（好ましくは、低分子量ポリオールおよび／またはポリアミン成分）とを反応させて、硬化反応させる。なお、プレポリマー法において、活性水素化合物の残部は、鎖伸長剤として用いられる。
イソシアネート基末端プレポリマーを合成するには、ペンタメチレンジイソシアネートおよび／またはポリイソシアネート組成物と活性水素化合物の一部とを、活性水素化合物の一部中の活性水素基に対するペンタメチレンジイソシアネートおよび／またはポリイソシアネート組成物中のイソシアネート基の当量比（ＮＣＯ／活性水素基）が、例えば、１．１〜２０、好ましくは、１．３〜１０、さらに好ましくは、１．３〜６となるように処方（混合）し、反応容器中にて、例えば、室温〜１５０℃、好ましくは、５０〜１２０℃で、例えば、０．５〜１８時間、好ましくは、２〜１０時間反応させる。なお、この反応においては、必要に応じて、上記したウレタン化触媒を添加してもよく、また、反応終了後には、必要に応じて、未反応のペンタメチレンジイソシアネートおよび／またはポリイソシアネート組成物を、例えば、蒸留や抽出などの公知の除去手段により、除去することもできる。
次いで、得られたイソシアネート基末端プレポリマーと、活性水素化合物の残部とを反応させるには、イソシアネート基末端プレポリマーと、活性水素化合物の残部とを、活性水素化合物の残部中の活性水素基に対するイソシアネート基末端プレポリマー中のイソシアネート基の当量比（ＮＣＯ／活性水素基）が、例えば、０．７５〜１．３、好ましくは、０．９〜１．１となるように処方（混合）し、例えば、室温〜２５０℃、好ましくは、室温〜２００℃で、例えば、５分〜７２時間、好ましくは、１〜２４時間硬化反応させる。
また、ポリウレタン樹脂を水系ディスパージョンとして得るには、例えば、まず、ペンタメチレンジイソシアネートおよび／またはポリイソシアネート組成物と、後述する親水基を含有する活性水素化合物（以下、親水基含有活性水素化合物と略する。）を含む活性水素化合物とを反応させることにより、イソシアネート基末端プレポリマーを得る。
次いで、得られたイソシアネート基末端プレポリマーと鎖伸長剤とを水中で反応させて分散させる。これによって、イソシアネート基末端プレポリマーが鎖伸長剤によって鎖伸長された水性ポリウレタン樹脂を、内部乳化型の水系ディスパージョンとして得ることができる。
イソシアネート基末端プレポリマーと鎖伸長剤とを水中で反応させるには、例えば、まず、イソシアネート基末端プレポリマーを水に添加して、イソシアネート基末端プレポリマーを分散させる。次いで、これに鎖伸長剤を添加して、イソシアネート基末端プレポリマーを鎖伸長する。
親水基含有活性水素化合物は、親水基と活性水素基とを併有する化合物であって、親水基としては、例えば、アニオン性基（例えば、カルボキシル基など）、カチオン性基、ノニオン性基（例えば、ポリオキシエチレン基など）が挙げられる。親水基含有活性水素化合物として、より具体的には、カルボン酸基含有活性水素化合物、ポリオキシエチレン基含有活性水素化合物などが挙げられる。
カルボン酸基含有活性水素化合物としては、例えば、２、２−ジメチロール酢酸、２、２−ジメチロール乳酸、２、２−ジメチロールプロピオン酸、２、２−ジメチロールブタン酸、２、２−ジメチロール酪酸、２、２−ジメチロール吉草酸などのジヒドロキシルカルボン酸、例えば、リジン、アルギニンなどのジアミノカルボン酸、または、それらの金属塩類やアンモニウム塩類などが挙げられる。
ポリオキシエチレン基含有活性水素化合物は、主鎖または側鎖にポリオキシエチレン基を含み、２つ以上の活性水素基を有する化合物であって、例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン側鎖含有ポリオール（側鎖にポリオキシエチレン基を含み、２つ以上の活性水素基を有する化合物）などが挙げられる。
これら親水基含有活性水素化合物は、単独使用または２種類以上併用することができる。
鎖伸長剤としては、例えば、上記した２価アルコール、上記した３価アルコールなどの低分子量ポリオール、例えば、脂環族ジアミン、脂肪族ジアミンなどのジアミンなどを使用することができる。
これら鎖伸長剤は、単独使用または２種類以上併用することができる。
このように、親水基含有活性水素化合物を含む活性水素化合物を使用する場合には、必要により、親水基を公知の中和剤で中和する。
また、活性水素化合物として、親水基含有活性水素化合物を使用しない場合には、例えば、公知の界面活性剤を用いて乳化することにより、外部乳化型の水系ディスパージョンとして得ることができる。
そして、このような、５−ペンタメチレンジイソシアネート、ポリイソシアネート組成物およびポリウレタン樹脂は、高生産速度および高反応収率で得られる１、５−ペンタメチレンジアミンを原料として製造されるため、高生産速度および高反応収率で得ることができる。
［実施例］
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
なお、Ｌ−リジンおよび１、５−ペンタメチレンジアミンは高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により定量した。これらの分析条件およびリジン脱炭酸酵素活性の測定方法は次の通りである。
＜１、５−ペンタメチレンジアミンの分析条件＞
カラム；Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０ ４Ｅ（昭和電工社製）
カラム温度；４０℃
溶離液；０．２Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．７）＋２．３ｍＭ １−オクタンスルホン酸ナトリウム
溶離液の流量；０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出はオルトフタルアルデヒドを用いたポストカラム誘導体化法〔Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、８３、３５３−３５５（１９７３）〕を用いた。
＜リジン脱炭酸酵素活性の測定方法＞
２００ｍＭ Ｌ−リジン一塩酸塩および０．１５ｍＭ ピリドキサールリン酸（広島和光工業社製）を含む２００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に菌体懸濁液またはその処理物を添加して合計０．２ｍＬとし、３７℃で６分間反応した。反応液に０．２Ｍ 塩酸を１ｍＬ添加して反応を停止した。この反応停止液を水で適当に希釈し、生成した１、５−ペンタメチレンジアミンをＨＰＬＣにより定量した。
活性の単位は１分間に１μｍｏｌの１、５−ペンタメチレンジアミンを生成する活性を１ｕｎｉｔとした。
＜ペンタメチレンジイソシアネート濃度（単位：質量％）＞
後述する実施例１２で得られたペンタメチレンジイソシアネートを用い、以下のＨＰＬＣ分析条件下で得られたクロマトグラムの面積値から作成した検量線により、ポリイソシアネート組成物中のペンタメチレンジイソシアネートの濃度を算出した。
装置；Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所社製）
１） ポンプ ＬＣ−２０ＡＴ
２） デガッサ ＤＧＵ−２０Ａ３
３） オートサンプラ ＳＩＬ−２０Ａ
４） カラム恒温槽 ＣＯＴ−２０Ａ
５） 検出器 ＳＰＤ−２０Ａ
カラム；ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＳＩＬＩＣＡ ＳＧ−１２０
カラム温度；４０℃
溶離液；ｎ−ヘキサン／メタノール／１、２−ジクロロエタン=９０／５／５（体積
比）
流量；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出方法；ＵＶ ２２５ｎｍ
＜イソシアネート基の転化率（単位：％）＞
イソシアネート基の転化率は、以下のＧＰＣ測定条件において得られたクロマトグラムにより、全ピーク面積に対するペンタメチレンジイソシアネートのピークよりも高分子量側にあるピークの面積の割合を、イソシアネート基の転化率とした。
装置；ＨＬＣ−８０２０（東ソー社製）
カラム；Ｇ１０００ＨＸＬ、Ｇ２０００ＨＸＬおよびＧ３０００ＨＸＬ（以上、東ソー製商品名）を直列に連結
カラム温度；４０℃
溶離液；テトラヒドロフラン
流量；０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出方法；示差屈折率
標準物質；ポリエチレンオキシド（東ソー社製、商品名：ＴＳＫ標準ポリエチレンオキシド）
＜イソシアネート３量体濃度（単位：質量％）＞
上記した（イソシアネート基の転化率）と同様の測定を行い、ペンタメチレンジイソシアネートの３倍の分子量に相当するピーク面積比率を、イソシアネート３量体濃度とした。
＜イソシアネート基濃度（単位：質量％）＞
ポリイソシアネート組成物のイソシアネート基濃度は、電位差滴定装置を用いて、ＪＩＳ Ｋ−１５５６に準拠したｎ−ジブチルアミン法により、測定した。
＜粘度（単位：ｍＰａ・ｓ）＞
東機産業社製のＥ型粘度計ＴＶ−３０を用いて、ポリイソシアネート組成物の２５℃における粘度を測定した。
＜色相（単位：ＡＰＨＡ）＞
ＪＩＳ Ｋ−００７１に準拠した方法により、ポリイソシアネート組成物の色相を測定した。
（参考例１）
［リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）のクローニング］
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）から常法に従い調製したゲノムＤＮＡをＰＣＲの鋳型に用いた。
ＰＣＲ用のプライマーには、リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００９０４８）の塩基配列に基づいて設計した配列番号１および２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（インビトロジェン社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーは、５’末端付近にそれぞれＫｐｎＩおよびＸｂａＩの制限酵素認識配列を有する。
前記のゲノムＤＮＡ１ｎｇ／μＬおよび各プライマー０．５ｐｍｏｌ／μＬを含む２５μＬのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９４℃、３０秒間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、２分間からなる反応サイクルを３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応産物およびプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造社製）をＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡社製）を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（Ａｍ）１００μｇ／ｍＬ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性でかつ白色コロニーとなった形質転換体を得た。このようにして得られた形質転換体よりプラスミドを抽出した。
通常の塩基配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列が配列番号３に示す塩基配列であることを確認した。
得られたリジン脱炭酸酵素をコードするＤＮＡを持つプラスミドをｐＣＡＤＡ１と命名した。
また配列番号３に記載のＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳した配列を配列番号４に示した。
［形質転換体の調製］
ｐＣＡＤＡ１を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＷ／ｐＣＡＤＡ１と命名した。
該形質転換体を２Ｌのバッフル付き三角フラスコ中のＡｍ１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地５００ｍｌに接種し、３０℃にて２６．５時間振盪培養した。その後、培養液を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体を回収した（乾燥菌体換算濃度は３１％（ｗ／ｗ））。
［触媒菌体の超音波破砕物の調製］
得られた形質転換体Ｗ／ｐＣＡＤＡ１の回収菌体を希釈液（０．１５ｍＭ ピリドキサールリン酸および５ｇ／Ｌ ウシアルブミン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））に懸濁し、菌体懸濁液を調製した。そして、菌体懸濁液をそれぞれバイオラピュター（オリンパス社製）により氷水中で１５分間破砕した。
［触媒死菌体の調製］
形質転換体Ｗ／ｐＣＡＤＡ１の回収菌体を水に懸濁し、乾燥菌体換算濃度１２．５ｗｔ％の菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液を５８℃の湯浴で３０分間保温し、熱処理を施し、使用するまで−２０℃で凍結保存した。
［精製酵素の調製］
精製酵素は上記の方法で形質転換体を培養し、回収した菌体をＳａｂｏら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３（１９７４）ｐｐ．６６２-６７０．）の方法により精製した。精製した酵素の酵素活性を測定したところ１０００ｕｎｉｔ／ｍｇの精製酵素が得られた。
これにより、精製酵素１μｇあたりの活性が１ｕｎｉｔ（Ｕ）であることが確認された。
また、触媒死菌体の活性を測定したところ、１００ｕｎｉｔ／ｍｇ−乾燥菌体（Ｄｒｙ Ｃｅｌｌ）であった。
（参考例２）
［変異酵素の作製］
ｐＣＡＤＡ１を鋳型として表１〜６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（インビトロジェン社に委託して合成した）を用いて、ＰＣＲを行った。
即ち、ｐＣＡＤＡ１を鋳型として配列表の配列番号５と配列番号６を用いて変性：９６℃、３０秒間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、５分間２０秒からなる反応サイクルを１６サイクルの条件でＰＣＲを行った。
得られた増幅断片をＤｐｎＩ処理し、ライゲーション・ハイを用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、または、ＤｐｎＩ処理した増幅断片を直接コンピテントセルＤＨ５αに添加し、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。作成した株よりプラスミドを調製して塩基配列を決定し目的の塩基が置換されていることを確認した。得られたプラスミドをｐＣＡＤ２と命名した。
同様にｐＣＡＤ３からｐＣＡＤ２０およびｐＣＡＤ２３からｐＣＡＤ１１９のプラスミドを構築した。使用したオリゴヌクレオチドの配列を表１〜６に示す。
ｐＣＡＤＡ２からｐＣＡＤＡ２０を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＷ／ｐＣＡＤＡ２〜Ｗ／ｐＣＡＤＡ２０と命名した。同様にｐＣＡＤ２３からｐＣＡＤ１１９を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＷ／ｐＣＡＤＡ２３〜Ｗ／ｐＣＡＤＡ１１９と命名した。
該形質転換体を２Ｌのバッフル付き三角フラスコ中のＡｍ１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地５００ｍｌに接種し、３０℃にて２６．５時間振盪培養した。その後、培養液を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体を回収した（乾燥菌体換算濃度は３１ｗｔ％）。
触媒菌体の超音波破砕物の調製及び触媒死菌体の調製は参考例１の方法に従った。
また、変異酵素の変異前と変異後との対応関係を、表７〜９に示す。
（参考例３）
［多重変異株の作成］
ｐＣＡＤＡ５を鋳型として配列番号１９および２０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（インビトロジェン社に委託して合成した）を用いて、ＰＣＲを行った。
そして、変性：９６℃、３０秒間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、５分間２０秒からなる反応サイクルを１６サイクルの条件でＰＣＲを行った。
得られた増幅断片をＤｐｎＩ処理し、ライゲーション・ハイを用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、または、ＤｐｎＩ処理した増幅断片を直接コンピテントセルＤＨ５αに添加し、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。作成した株よりプラスミドを調製して塩基配列を決定し目的の塩基が置換されていることを確認した。このプラスミドを鋳型として同様に配列番号３５および３６に示す塩基配列を用いて同様にプラスミドを作製し、さらにこのプラスミドに配列番号４１および４２に示す塩基配列を用いて上記の方法でプラスミドを作製することにより４重変異体の配列をもつプラスミドｐＣＡＤＡ２１を作製した。得られた４重変異体のＤＮＡ配列を配列表の配列番号４３に示す。アミノ酸配列を配列表の配列番号４４に示す。
さらにこのプラスミドに配列番号９および１０に示す塩基配列を用いて上記の方法でプラスミドを作製することにより５重変異体の配列をもつプラスミドｐＣＡＤＡ２２を作製した。このプラスミドを通常の方法でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＷ／ｐＣＡＤＡ２１及びＷ／ｐＣＡＤＡ２２と命名した。得られた５重変異体のＤＮＡ配列を配列表の配列番号４５に示す。アミノ酸配列を配列表の配列番号４６に示す。
次にｐＣＡＤＡ７３を鋳型として配列番号２３５および２３６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲを行った。そして、変性：９６℃、３０秒間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、５分間２０秒からなる反応サイクルを１６サイクルの条件でＰＣＲを行った。得られた増幅断片をＤｐｎＩ処理し、この断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。作成した株よりプラスミドを調製して塩基配列を決定し目的の塩基が置換されていることを確認した。得られたプラスミドをｐＣＡＤＡ１２０と命名した。
次にｐＣＡＤＡ９５を鋳型として配列番号２２７および２２８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲを行った。そして、変性：９６℃、３０秒間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、５分間２０秒からなる反応サイクルを１６サイクルの条件でＰＣＲを行った。得られた増幅断片をＤｐｎＩ処理し、この断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。作成した株よりプラスミドを調製して塩基配列を決定し目的の塩基が置換されていることを確認した。得られたプラスミドをｐＣＡＤＡ１２１と命名した。
次にｐＣＡＤＡ１１３を鋳型として配列番号２３５および２３６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲを行った。そして、変性：９６℃、３０秒間、アニーリング：５５℃、３０秒間、伸長反応：６８℃、５分間２０秒からなる反応サイクルを１６サイクルの条件でＰＣＲを行った。得られた増幅断片をＤｐｎＩ処理し、この断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。作成した株よりプラスミドを調製して塩基配列を決定し目的の塩基が置換されていることを確認した。得られたプラスミドをｐＣＡＤＡ１２２と命名した。
これらのプラスミド、ｐＣＡＤＡ１２０、ｐＣＡＤＡ１２１、ｐＣＡＤＡ１２２を通常の方法でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換し、得られた形質転換体をＷ／ｐＣＡＤＡ１２０、Ｗ／ｐＣＡＤＡ１２１、およびＷ／ｐＣＡＤＡ１２２と命名した。
該形質転換体を２Ｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地５００ｍｌに接種し、３０℃にて２６．５時間振盪培養した。その後、培養液を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体を回収した（乾燥菌体換算濃度は３１ｗｔ％）。
触媒菌体の超音波破砕物の調製及び触媒死菌体の調製は参考例１の方法に従った。
（参考例４）
［リジン生産菌の作製とリジン発酵］
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ１３０３２）に対しＭ．Ｉｋｅｄａら（Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２００６） ３３： ６１０-６１５）が記載の方法によりＡＰＧ−４株（ｈｏｍ、ｌｙｓＣ、ｐｙｃ、ｇｎｄ変異株）を作製した。
リジン発酵のためにあらかじめ３０ｇの炭酸カルシウムを入れ、滅菌した５００ｍｌバッフル付きフラスコに７５ｍｌの滅菌した表１０に示す前培養用培地を無菌的に加えたもの２本を用意し、上記で得られたＡＰＧ−４株をそれぞれ１コロニー植菌したのち３０℃、１２０ｒｐｍで１８時間攪拌培養し、これを前培養液とした。
得られた前培養液全量を表１１に示す本培養用培地８４０ｍｌを入れた３Ｌ通気培養槽に入れ、通気量１Ｌ／ｍｉｎ、攪拌回転数８００ｒｐｍ、３０℃で５０時間培養した。培養中のｐＨはアンモニアで７．０に調整し、培養２０時間目から４０％グルコース、４．５％塩化アンモニウムの混合液を１時間あたり２６．７ｇの流速で培養終了まで添加した。培養終了時のＯＤ６６０は３７０であった。培養終了後の発酵液には２７ｇ／Ｌのリジンが蓄積していた。得られた発酵液を発酵液Ａとした。
また、別の発酵液を得るために５％グルコース及び２％硫安を含むＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｃａｔ．２４４６２０）１５ｍｌを１００ｍｌバッフル付きフラスコに入れ、上記で得られたＡＰＧ−４株を１コロニー植菌したのち３０℃、１２０ｒｐｍで２４時間培養し前培養液とした。
得られた前培養液全量を表１２に示す本培養用培地３５０ｍｌを入れた１Ｌ通気培養槽に入れ、通気量１８０ｍｌ／ｍｉｎ、攪拌回転数７００ｒｐｍ、３１．５℃で５０時間培養した。培養中のｐＨはアンモニアで７．０に調整し、本培養開始後２５時間目に５０ｇ、４２時間目に３０ｇの糖蜜を添加した。
培養終了後の発酵液には１６ｇ／Ｌのリジンが蓄積していた。得られた発酵液を発酵液Ｂとした。
なお、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ１３０３２）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手した。
（実施例５）
［野生型酵素における 大腸菌、コリネバクテリウム、酵母の添加効果］
５００ｍｌのバッフル付きフラスコに１００ｍｌのＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｃａｔ．２４４６２０）をいれ滅菌したものを２本用意し、大腸菌（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ１３０３２）をそれぞれに植菌し、３０℃、２０時間、１２０ｒｐｍの振盪培養を行った。
また、５００ｍｌのバッフル付きフラスコに１００ｍｌのＹＰＤ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｃａｔ． ２４２８２０）をいれたものを１本用意し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＡＴＣＣ２０１３８８）を植菌し、３０℃、２０時間、１２０ｒｐｍの振盪培養を行った。
得られた培養液からそれぞれ菌体を遠心分離し上清を除き、上清と同量の脱イオン交換水で菌体を懸濁し、再度遠心分離を行った。この操作を１０回繰り返し菌体を洗浄した後、以下の実験に使用した。
得られた菌体に１２．５％のリジン塩酸塩水溶液１０ｍｌを加え、良く懸濁した。この懸濁液から１ｍｌ取り、９ｍｌの１２．５％のリジン塩酸塩水溶液と混合し、菌体濃度１／１０の溶液を作製した。
この操作を１０回繰り返し、菌体濃度１／１０ずつの希釈系列を作製した。菌体濃度を測定するために各濃度の溶液から１００μｌずつをＬＢプレートに撒き、２４時間３０℃で培養し、出てきたコロニー数を測定した。また、各濃度の溶液から５ｍｌずつを１５ｍｌスクリューキャップつきのＰＰ容器に入れ、０．４％ＰＬＰ水溶液を５０μｌ、及び参考例１で調製した触媒死菌体を乾燥菌体換算で０．１５３％に希釈して５０μｌ添加した。コントロールには菌体を加えない１２．５％のリジン塩酸塩水溶液を使用し、上記と同様に実施した。
反応は容器を振盪方向に並行、水平に設置し、２００ｒｐｍ、４２℃、２０時間反応を行った。反応液５０μｌに０．２Ｍ 塩酸を９５０μｌを添加して反応を停止した。この反応停止液を水で適当に希釈し、生成した１、５−ペンタメチレンジアミンをＨＰＬＣにより定量した。
結果を表１３に示す。
なお、表１３において、蓄積濃度はコントロールの蓄積濃度を１としたときの相対値で示した。
（実施例６）
［野生型酵素における コーンスティープリカー、酵母エキス、糖蜜、ペプトンの添加効果］
１２．５％のリジン塩酸塩水溶液に２０ｇ／Ｌのコーンスティープリカー（日本食品加工）（６Ｎ ＮａＯＨで中和）（以後ＣＳＬと略すことがある）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、糖蜜（大日本明治製糖）、またはペプトン（Ｄｉｆｃｏ）を混合した溶液を調製し、それぞれ１／２倍ずつ１２．５％のリジン塩酸塩水溶液で希釈することにより２０ｇ／Ｌから０．１５６ｇ／Ｌの希釈系列を作製した。
各濃度の溶液から５ｍｌずつを１５ｍｌスクリューキャップつきのＰＰ容器に入れ、０．４％ＰＬＰ水溶液を５０μｌ、及び参考例１で調製した触媒死菌体を乾燥菌体換算で０．１５３％に希釈して５０μｌ添加した。コントロールには添加物を加えない１２．５％のリジン塩酸塩水溶液を使用し、上記と同様に実施した。
反応は容器を振盪方向に並行、水平に設置し、２００ｒｐｍ、４２℃、２０時間反応を行った。結果を表１４に示す。
なお、表１４において、蓄積濃度はコントロールの蓄積濃度を１としたときの相対値で示した。
（実施例７）
［野生型酵素における コリネバクテリウム＋コーンスティープリカー、コリネバクテリウム＋酵母エキス、コリネバクテリウム＋糖蜜の添加効果］
５００ｍｌのバッフル付きフラスコに１００ｍｌのＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｃａｔ．２４４６２０）をいれ滅菌したものを用意し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ１３０３２）を植菌し、３０℃、２０時間、１２０ｒｐｍの振盪培養を行った。得られた培養液から菌体を遠心分離し上清を除き、上清と同量の脱イオン交換水で菌体を懸濁し、再度遠心分離を行った。この操作を１０回繰り返し菌体を洗浄した後、１２．５％のリジン塩酸塩水溶液に懸濁し、以下の実験に使用した。
１２．５％のリジン塩酸塩水溶液に０．５ｇ／Ｌのコーンスティープリカー（日本食品加工）（６Ｎ ＮａＯＨで中和）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、糖蜜（大日本明治製糖）、またはペプトン（Ｄｉｆｃｏ）を混合した溶液をそれぞれ調製し、これらの液９ｍｌに、実施例５と同様に上記菌体溶液１ｍｌを混合し、菌体濃度１／１０ずつの希釈系列を作製した。各濃度の溶液から５ｍｌずつを１５ｍｌスクリューキャップつきのＰＰ容器に入れ、０．４％ＰＬＰ水溶液を５０μｌ、及び参考例１で調製した触媒死菌体を乾燥菌体換算で０．１５３％に希釈して５０μｌ添加した。コントロールにはそれぞれ菌体を添加しない溶液を使用した。
反応は容器を振盪方向に並行、水平に設置し、２００ｒｐｍ、４２℃、２０時間反応を行った。反応液５０μｌに０．２Ｍ 塩酸を９５０μｌを添加して反応を停止した。この反応停止液を水で適当に希釈し、生成した１、５−ペンタメチレンジアミンをＨＰＬＣにより定量した。結果を表１５に示す。
なお、表１５において、蓄積濃度はコントロールの蓄積濃度を１としたときの相対値で示した。
（実施例８）
［野生型酵素における 発酵液の反応の効果］
参考例４で調製した発酵液Ａから５ｍｌをとり、１５ｍｌスクリューキャップつきのＰＰ容器に入れ、０．４％ＰＬＰ水溶液を５０μｌ、及び参考例１で調製した触媒死菌体を乾燥菌体換算で０．１５３％に希釈して１０μｌ添加した。次に発酵液Ａを遠心分離し、上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、除菌した。この上清を５ｍｌをとり、１５ｍｌスクリューキャップつきのＰＰ容器に入れ、０．４％ＰＬＰ水溶液を５０μｌ、及び参考例１で調製した触媒死菌体を乾燥菌体換算で０．１５３％に希釈して１０μｌ添加した。さらにこの上清１ｍｌとリジン濃度が２７ｇ／Ｌとなるようにリジン塩酸塩（Ｗａｋｏ）をイオン交換水に溶解したものを９ｍｌを混合し、この液を発酵液の希釈混合液とした。この液から５ｍｌをとり、１５ｍｌスクリューキャップつきのＰＰ容器に入れ、０．４％ＰＬＰ水溶液を５０μｌ、及び参考例１で調製した触媒死菌体を乾燥菌体換算で０．１５３％に希釈して１０μｌ添加した。コントロールにはリジン濃度が２７ｇ／Ｌとなるようにリジン塩酸塩（Ｗａｋｏ）をイオン交換水に溶解したものを用いた。
反応は容器を振盪方向に並行、水平に設置し、２００ｒｐｍ、４２℃、２４時間反応を行った。反応液５０μｌに０．２Ｍ 塩酸を９５０μｌを添加して反応を停止した。この反応停止液を水で適当に希釈し、生成した１、５−ペンタメチレンジアミンをＨＰＬＣにより定量した。結果を表１６に示す。
なお、転換率（％）＝生成した１、５−ペンタメチレンジアミン（ｍｏｌ）／基質リジン（ｍｏｌ）とした。
次に参考例４で調製した発酵液Ａ、および発酵液Ｂにリジン濃度が１００ｇ／Ｌとなるようにリジン塩酸塩（Ｗａｋｏ）を溶解した液をそれぞれ５ｍｌをとり、１５ｍｌスクリューキャップつきのＰＰ容器に入れ、０．４％ＰＬＰ水溶液を５０μｌ、及び参考例１で調製した触媒死菌体を乾燥菌体換算で０．８３％に希釈して１００、５０、２５、１２．５μｌ添加した。これらは精製酵素に換算するとそれぞれ１６．１ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌに相当する活性であった。また、これらはリジン１ｇあたり１６１Ｕ、８０Ｕ、４０Ｕ、２０Ｕに相当する活性であった。コントロールにはリジン濃度が１００ｇ／Ｌとなるようにリジン塩酸塩（Ｗａｋｏ）をイオン交換水に溶解したものを用いた。
反応は容器を振盪方向に並行、水平に設置し、２００ｒｐｍ、４２℃、２４時間反応を行った。反応液５０μｌに０．２Ｍ 塩酸を９５０μｌを添加して反応を停止した。この反応停止液を水で適当に希釈し、生成した１、５−ペンタメチレンジアミンをＨＰＬＣにより定量した。結果を表１７〜２０および図１〜３に示す。
なお、転換率（％）＝生成した１、５−ペンタメチレンジアミン（ｍｏｌ）／基質リジン（ｍｏｌ）とした。
（実施例９）
［変異酵素の反応］
参考例１、参考例２及び参考例３で得られたＷ／ｐＣＡＤＡ１からＷ／ｐＣＡＤＡ２２をを２Ｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地５００ｍＬに接種し、３０℃にて光学密度（ＯＤ）（６６０ｎｍ）が０．５になるまで振盪培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピルーβーチオガラクトピラノシド）が０．１ｍＭとなるように添加し、さらに１４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、菌体を回収した（乾燥菌体換算濃度は約３０ｗｔ％）。
［菌体破砕液の調製］
得られた形質転換体Ｗ／ｐＣＡＤＡ１からＷ／ｐＣＡＤＡ２２の回収菌体を希釈液（０．１５ｍＭ ピリドキサールリン酸および５ｇ／Ｌ ウシアルブミン（ＳＩＧＭＡ社製）を含む１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））に懸濁し、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液を参考例１の方法と同様にそれぞれバイオラピュター（オリンパス社製）により氷水中で５分間破砕し、菌体破砕液を調製した。
［リジン脱炭酸酵素活性の測定方法］
２００ｍＭ Ｌ−リジン一塩酸塩および０．１５ｍＭ ピリドキサールリン酸（広島和光工業社製）を含む２００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、ｐＨ８．０）に菌体破砕液を２０μl添加して合計０．２ｍＬとし、３７℃で４分間反応した。反応液に０．２Ｍ塩酸を１ｍＬ添加して反応を停止した。この反応停止液を水で適当に希釈し、生成した１、５−ペンタメチレンジアミンをＨＰＬＣにより定量した。結果を表２１（ｐＨ７．０）、表２２（ｐＨ８．０）に示す。
なお、表２１中の数値は濃度であり、Ｗ／ｐＣＡＤＡ１の濃度を１としたときの相対値で示した。
なお、表２２中の数値は濃度であり、Ｗ／ｐＣＡＤＡ１の濃度を１としたときの相対値で示した。
また、０．５Ｍ１、５−ペンタメチレンジアミン、２００ｍＭ Ｌ−リジン一塩酸塩および０．１５ｍＭ ピリドキサールリン酸（広島和光工業社製）を含む２００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に菌体破砕液を２０μl添加して合計０．２ｍＬとし、３７℃で６分間反応した。比較として２００ｍＭ Ｌ−リジン一塩酸塩および０．１５ｍＭ ピリドキサールリン酸（広島和光工業社製）を含む２００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に菌体破砕液を２０μl添加して合計０．２ｍＬとし、３７℃で６分間反応した。反応液に０．２Ｍ 塩酸を１ｍＬ添加して反応を停止した。この反応停止液を水で適当に希釈し、減少したリジンの量をＨＰＬＣにより定量した。結果を表２３に示す。
なお、表２３中の数値は濃度であり、Ｗ／ｐＣＡＤＡ１の濃度を１としたときの相対値で示した。
（実施例１０）
［変異酵素 発酵液での反応の効果］
参考例１、参考例２及び参考例３で得られたＷ／ｐＣＡＤＡ１からＷ／ｐＣＡＤＡ２２を３ｍｌのＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｃａｔ．２４４６２０）を入れた試験管に植菌し、２６℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した。得られた培養液１ｍｌを１．５ｍｌチューブに入れ、遠心分離により菌体を集菌した。上清を取り除き得られた菌体に１ｍｌの菌体破砕液（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．００４％ＰＬＰ、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））を加えた後、菌体を懸濁し、５８℃で３０分加熱した。
次に参考例４で調製した発酵液Ａに１００ｇ／Ｌとなるようにリジン塩酸塩（Ｗａｋｏ）を溶解した液をそれぞれ５ｍｌをとり、１５ｍｌスクリューキャップつきのＰＰ容器に入れ、０．４％ＰＬＰ水溶液を５０μｌ、及び上記で調製した菌体破砕液を５０μｌ添加した。これは精製酵素に換算して０．５４ｍｇ／Ｌの濃度に相当する活性であった。また、これは、リジン１ｇに対して５．４Ｕに相当する活性であった。コントロールにはリジン濃度が１００ｇ／Ｌとなるようにリジン塩酸塩（Ｗａｋｏ）をイオン交換水に溶解したものを用いた。
反応は容器を振盪方向に並行、水平に設置し、２００ｒｐｍ、４２℃、２０時間反応を行った。反応液に０．２Ｍ 塩酸を１ｍＬ添加して反応を停止した。この反応停止液を水で適当に希釈し、生成した１、５−ペンタメチレンジアミンをＨＰＬＣにより定量した。結果を表２４に示す。
なお、表２４中の数値は濃度であり、コントロール試験区のＷ／ｐＣＡＤＡ１の濃度を１としたときの相対値で示した。
次に参考例１、参考例２及び参考例３で得られたＷ／ｐＣＡＤＡ１及びＷ／ｐＣＡＤＡ２３からＷ／ｐＣＡＤＡ１１９を３ｍｌのＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｃａｔ．２４４６２０）を入れた試験管に植菌し、ＩＰＴＧ（イソプロピルーβーチオガラクトピラノシド）が０．１ｍＭとなるように添加し、３３℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した。得られた培養液１ｍｌを１．５ｍｌチューブに入れ、使用するまで−２０℃で保存した。
次に参考例４で調製した発酵液Ａに１０質量％となるようにリジン塩酸塩（Ｗａｋｏ）を溶解した液をそれぞれ５ｍｌをとり、１５ｍｌスクリューキャップつきのＰＰ容器に入れ、０．４％ＰＬＰ水溶液を５０μｌ、及び上記で凍らせた培養液を溶解した後、良く攪拌したものを２００μｌ添加した。コントロールにはリジン濃度が１０質量％となるようにリジン塩酸塩（Ｗａｋｏ）をイオン交換水に溶解したものを用いた。反応は容器を振盪方向に並行、水平に設置し、２００ｒｐｍ、４５℃、２時間反応を行った。反応液に２Ｍ塩酸を１ｍＬ添加して反応を停止した。この反応停止液を水で適当に希釈し、生成した１、５−ペンタメチレンジアミンをＨＰＬＣにより定量した。
結果を表２５〜２９に示す。
なお、表２５〜２９中の数値は濃度であり、コントロール試験区のＷ／ｐＣＡＤＡ１の濃度を１としたときの相対値で示した。
（実施例１１）
［高濃度蓄積反応］
３００ｍＬのフラスコに、Ｌ−リジン塩酸塩を、終濃度が４５質量％となるように、およびピリドキサールリン酸を終濃度０．１５ｍＭとなるように調製した基質溶液１２０ｇを加えた。次に、実施例５に記載のコリネバクテリウム菌を２．５ｘ１０＾７細胞／ｍＬとなるように添加し、参考例３で調製したＷ／ｐＣＡＤ２１の触媒死菌体を（乾燥菌体重量換算０．０６４８ｇ、菌体活性１６４ｕｎｉｔ／ｍｇ乾燥菌体）を添加して４２℃、２００ｒｐｍ、２４時間反応した。反応収率は９９％であった。
（実施例１２）
［１、５−ペンタメチレンジイソシアネートの製造］
（リジン発酵液から製造したＰＤＡの精製）
実施例８の表１７に示した触媒死菌体を２５μＬ添加した反応液を硫酸でｐＨを６．０に調整した後、８０００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により菌体などの沈殿物を除去した。陽イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ８ （Ｈ＋ 型））を充填したカラムに通液し、陽イオン交換樹脂に１、５−ペンタメチレンジアミンを吸着させた後、０．７Ｍ食塩水をカラムに通液して樹脂を充分洗浄して不純物を除去し、吸着した１、５−ペンタメチレンジアミンを６Ｎ塩酸で溶出した。そして、この溶出液に３０％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを１２に調整した。
（精製ＰＤＡの濃縮）
分液ロートに１、５−ペンタメチレンジアミン水溶液１００質量部をｎ−ブタノール（抽出溶媒）１００質量部とを仕込み、１０分間混合し、その後３０分間静置した。次いで有機層（１、５−ペンタメチレンジアミンを含むｎ−ブタノール）を抜き出した。
次いで、温度計、蒸留塔、冷却管および窒素導入管を備えた４つ口フラスコに、有機層の抽出液（１、５−ペンタメチレンジアミンを含むｎ−ブタノール）１００質量部を仕込み、１００ｋＰａの減圧下、オイルバス温度１２０℃として、ｎ−ブタノールを留去させ、純度９９．９質量％の１、５−ペンタメチレンジアミンを得た。
（ＰＤＩの合成）
電磁誘導撹拌機、自動圧力調整弁、温度計、窒素導入ライン、ホスゲン導入ライン、凝縮器、原料フィードポンプを備え付けたジャケット付き加圧反応器に、オルトジクロロベンゼン２０００質量部を仕込んだ。次いで、ホスゲン２３００質量部をホスゲン導入ラインから加え、撹拌を開始した。反応器のジャケットには冷水を通し、内温を約１０℃に保った。そこへ、ペンタメチレンジアミン４００質量部をオルトジクロロベンゼン２６００質量部に溶解した溶液を、フィードポンプにて６０分かけてフィードし、３０℃以下、常圧下で冷ホスゲン化を開始した。フィード終了後、加圧反応器内は淡褐白色スラリー状液となった。
次いで、反応器の内液を徐々に１６０℃まで昇温しながら、０．２５ＭＰａに加圧し、さらに圧力０．２５ＭＰａ、反応温度１６０℃で９０分間熱ホスゲン化した。なお、熱ホスゲン化の途中で、ホスゲン１１００質量部を、さらに添加した。熱ホスゲン化の過程で、加圧反応器内液は、淡褐色澄明溶液となった。熱ホスゲン化終了後、１００〜１４０℃において、窒素ガスを１００Ｌ／時で通気し、脱ガスした。
次いで、減圧下でオルトジクロルベンゼンを留去した後、同じく減圧下でペンタメチレンジイソシアネートを留去させた。
次いで、留去させたペンタメチレンジイソシアネートを、攪拌機、温度計、還流管、および、窒素導入管を備えた４つ口フラスコに装入し、窒素を導入しながら、常圧下で、１９０℃、３時間加熱処理を行った。
次いで、加熱処理後のペンタメチレンジイソシアネートを、ガラス製フラスコに装入し、充填物を充填した蒸留管、還流比調節タイマーを装着した蒸留塔、および、冷却器を装備する精留装置を用いて、１２７〜１３２℃、２．７ＫＰａの条件下、さらに還流しながら精留し、純度９９．８質量％のペンタメチレンジイソシアネートを４５０質量部得た。
（実施例１３）
［ポリイソシアネート組成物の製造］
攪拌機、温度計、還流管、および、窒素導入管を備えた４つ口フラスコに、上記により得られたペンタメチレンジイソシアネートを５００質量部、１、３−ブタンジオール（以下、１、３−ＢＧと略する場合がある。）を３．９質量部、２、６−ジ（ｔｅｒｔ-ブチル）−４−メチルフ
ェノールを０．２５質量部、トリス（トリデシル）ホスファイトを０．２５質量部装入し、８０℃で３時間反応させた。この溶液を６０℃に降温した後、トリマー化触媒としてＮ−（２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム−２−エチルヘキサノエートを０．１質量部添加した。１時間反応させた後、ｏ−トルエンスルホンアミドを０．１２質量部添加した（イソシアネート基の転化率：１０質量％）。得られた反応液を薄膜蒸留装置（真空度０．０９３ＫＰａ、温度１５０℃）に通液して未反応のペンタメチレンジイソシアネートを除去し、さらに、得られた組成物１００質量部に対し、ｏ−トルエンスルホンアミドを０．０２質量部添加し、ポリイソシアネート組成物を得た。
このポリイソシアネート組成物のペンタメチレンジイソシアネート濃度は０．４質量％、イソシアネート３量体濃度は４６質量％、イソシアネート基濃度は２４．０質量％、２５℃における粘度は１９３０ｍＰａ・ｓ、色相はＡＰＨＡ２０であった。
なお、上記発明は、本発明の例示の実施形態として提供したが、これは単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。当該技術分野の当業者によって明らかな本発明の変形例は、後記特許請求の範囲に含まれる。
本発明の１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法を用いて得られる１、５−ペンタメチレンジアミンは、例えば、バイオマス由来のポリマー原料、農薬、医薬の中間体などの種々の産業分野において、好適に用いることができる。

Claims (1)

  1. リジン脱炭酸反応の減速または停止を防ぐ物質の存在下において、Ｌ−リジン及び／またはその塩を、リジン脱炭酸酵素及び／または変異型リジン脱炭酸酵素によって、リジン脱炭酸反応させ、
    前記リジン脱炭酸反応の減速または停止を防ぐ物質が、
    大腸菌、酵母、コリネバクテリウムの培養液、コリネバクテリウムの培養上清、コーンスティープリカー、酵母エキス、糖蜜、ペプトンの炭素源、および、コリネバクテリウムと前記炭素源との混合物
    からなる群から選択される少なくとも１種であり、
    リジン脱炭酸酵素及び／または変異型リジン脱炭酸酵素をリジン１ｇ当たり５ｕｎｉｔから１６５ｕｎｉｔ使用する、または、リジン１ｇあたり精製酵素換算で５μｇから１６５μｇ使用する
    ことを特徴とする、１、５−ペンタメチレンジアミンの製造方法。
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