CN114480525B

CN114480525B - 一种提高d-生物素产量的生产方法

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Publication number: CN114480525B
Application number: CN202210011841.7A
Authority: CN
Inventors: 郭凤柱; 李飞龙; 周斌; 梅吉雷; 李光进; 况嘉铀; 江根强; 朱勇刚; 徐志南; 赵佳润
Original assignee: Zhejiang Silver Elephant Bio Engineering Co ltd; Zhejiang Shengda Bio Pharm Co ltd
Current assignee: Zhejiang Silver Elephant Bio Engineering Co ltd; Zhejiang Shengda Bio Pharm Co ltd
Priority date: 2022-01-06
Filing date: 2022-01-06
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2042-01-06
Also published as: CN114480525A

Abstract

本发明涉及一种提高D‑生物素产量的生产方法，属于生物技术领域。本发明公开了一种提高D‑生物素产量的生产方法，该方法是采用易变假单胞菌(Pseudomonas mutabilis)基因工程菌，以葡萄糖和甘油为复合碳源，并采用两阶段或三阶段控温策略，结合乙醇补料工艺进行D‑生物素的快速发酵生产，较原始工艺产量提高了21％‑170％，周期缩短了13％‑28％。本发明提供了一种简便、安全、高效的D‑生物素发酵生产方法，改变了已有生产工艺步骤，显著提高了D‑生物素的生产强度，不仅缩短了发酵周期，节约了成本，而且减少了发酵废液和废气的排放，减轻环境污染，另外，工艺简单易放大，易于实现工业化生产。

Description

一种提高D-生物素产量的生产方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体地涉及一种生产D-生物素的液体发酵方法的改进方法。

背景技术

生物素(Biotin)属于水溶性B族维生素，亦称维生素B₇、维生素H、辅酶 R(Coenzyme R,CoR)，是一种环状结构的物质，具有硫酚(Thiophene)的结构环，此种化学物质有八种同分异构体，但只有右旋生物素(D-生物素)是存在于自然界的，也只有其有维生素的活性。它是动物、植物和微生物营养的必需维生素之一，是羧化和脱羧化反应的辅酶，是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质，其在维持人和动物正常生长发育、保护皮肤健康、毛发和骨骼健康等方面起到必不可少的作用。因此，在食品、医疗、多维制剂和饲料添加剂行业得以广泛应用。据统计，2010-2018年期间，全球生物素需求量从150吨增长到230吨，年复合增长率为5.49％，其中国内需求增速显著大于国外需求增速。目前，全球市场每年需求量为250吨，并逐年增加。可见， D-生物素具有非常广阔的应用潜力及商业市场前景。

生物素为无色、无臭、长针状结晶物，在普通温度下相当稳定，紫外光下逐渐被破坏，易溶于热水和乙醇中，在弱酸性或弱碱性溶液中较稳定，强酸或强碱中加热则破坏其生物活性。

当前，商业化的D-生物素，大部分仍以化学合成法为主，且工艺主要以 Sternbach合成路线为基础，现行的工业化生产方法在此基础上进行改进。生物素分子结构复杂，具有三个手性中心，合成技术要求高，生产工艺属不对称合成，其合成路线长，对反应的要求高，生产难度极大，壁垒高，且从投料到出品需要一个月左右的时间。

经过检索，截至目前，公布的有关D-生物素制备方法的主要专利有：

1.申请号为85103248的“制备杂环化合物新方法”发明专利，是霍夫曼·拉罗奇有限公司在中国申请的专利，该专利叙述了一种用于制备生物素合成过程中的中间体以及制备生物素本身的方法，在该方法中，通过格利雅反应将侧链连到环状体系上，使得到的化合物脱水，然后使脱水产物基本上还原。

2.申请号为87107807.4的“圆球杆菌的bioA,bioD,bioF,bioC,bioH基因的克隆，载体和转化细胞以及生物素的制备方法”发明专利，是特朗斯吉恩有限公司在中国申请的专利，该专利公开了涉及DNA(脱氧核糖核酸)顺序，它是下列的在细菌中的生物素的生物合成链的基因之一：bioA,bioD,bioF,bioC和bioH基因；包含这些顺序的载体能够转化其它的微生物，以便改进生物素的生产。

3.专利号为ZL 91103221.5的“新的微生物以及利用这些微生物生产生物素同效维生素的方法”的发明专利，是资生堂株式会社在中国申请的专利，该专利公开了一种属于埃希氏杆菌属，芽孢杆菌属和赛氏杆菌属中任一属的突变菌株，该菌株具有的葡萄糖消耗速率至多为相应野生型菌株的四分之一，且其中的生物素反馈抑制途经已去除。该发明还提供了利用该突变菌株生产生物素的方法。

4.申请号为93102377.7的“新的微生物和用所述微生物制备d-生物素的方法”的发明专利，是田边制药株式会社在中国申请的专利，该专利公开了一种新的微生物，其是通过导入掺有沙雷氏菌属的生物素基因的重组质粒并进一步将外源生物素基因整合到染色体中所获得的，以及用所获得的微生物制备d-生物素的方法，包括在培养基中培养微生物并积累d-生物素，最后收集d-生物素。

5.专利号为ZL93116830.9的“生物素的生产方法”的发明专利，是住友化学工业株式会社在中国申请的专利，该专利公开了一种生产生物素的方法，其中在培养基中制备具有产生生物素能力的斯芬克斯小杆菌属微生物的培养物，并收集培养基中产生和积累的生物素，该发明同时公开了具有产生生物素能力的斯芬克斯小杆菌属的微生物。

6.专利号为ZL 94107234.7的“枯草芽胞杆菌中生物素的生物合成”的发明专利，是DSM IP资产有限公司在中国申请的专利，其公开了涉及编码枯草芽胞杆菌或其紧密相关菌种的生物素生物合成酶的基因的DNA序列，含有所说DNA 序列的载体，含有所说DNA序列和载体的细胞以及由所说细胞生产生物素的方法。

7.专利号为ZL 95192350.1的“制备D-(+)-生物素中间产物的改进方法”的发明专利，是默克专利股份有限公司在中国申请的专利，该专利公开了一种适合于作为制造D-(+)-生物素用的中间产物的杂环化合物的改进方法，和制造D-(+)-生物素本身的方法(化学合成方法)。

8.专利号为ZL 97109779.8的“生物素的发酵生产”，是弗·哈夫曼-拉罗切有限公司在中国申请的专利，该专利涉及从脱硫生物素生产生物素的方法，包括将脱硫生物素与含有BIOB以及NIFU和/或NIFS的酶反应系统接触，并从反应混合物中分离所产生的生物素，也涉及一种从脱硫生物素生产生物素的方法，包括在水性培养基中，在脱硫生物素的存在下培养一种微生物，该微生物已被自身编码 BIOB和NIFU和/或NIFS的DNA序列或包含于单个或互相独立的多个质粒中的这种DNA序列转化，从培养基中分离所产生的生物素。

9.专利号为ZL 98807467.2的“生物素的制备方法”的发明专利，是BASF公司在中国申请的专利，该专利描述了一种包括具有序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的生物素基因的基因构建体、含有这种基因构建体的生物体、这些序列或所述基因构建体用于制备生物素的用途以及一种用于制备生物素的方法。

10.专利号为ZL 98103370.9的“克服生物素同效维生素中DAPA氨基转移酶的瓶颈环节”的发明专利，是DSMIP资产有限公司在中国申请的专利，该专利公开了使用产生利用赖氨酸的DAPA氨基转移酶的细菌以增加生物素和生物素前体脱硫生物素生产的方法，该方法包括使用或在赖氨酸存在时培养，或其赖氨酸生物合成去调控的细菌。该发明主要解决了有KAPA-DAPA的瓶颈环节，进而使得DTB(生物素前体)生产显著改善。

11.专利号为ZL 99803153.4的“生物素的制备方法”，同样是BASF公司在中国申请的专利，该专利与一种基因构建物有关，该基因构建物包含下列基因：一种具有序列号1的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因；分别具有序列号3，序列号5和序列号7的生物素生物合成基因bioS1，bioS2和/或bioS3；以及在适当场合，至少一种选自bioA，bioB，bioF，bioC，bioD，bioH，bioP，bioW，bioX，bioY或 bioR的生物素合成基因序列。此外，还与含有这种基因构建物的生物和应用这种基团构建制备生物素有关。还与制备生物素的方法有关。

12.专利号为ZL 200410063478.5的“含生物素生物合成基因的DNA片段及其利用”，是住友化学工业株式会社在中国申请的专利，其公开了一种含来自鞘氨醇单胞菌属微生物的生物素生物合成中涉及的基因的DNA片段，包含该DNA 片段的质粒，包含该质粒的生物素合成转化子。还提供了利用来自鞘氨醇单胞菌属微生物的生物素生物合成中涉及的基因，用基因工程方法培育生物素合成微生物的技术。

13.专利号为ZL 200610155087.5的“D-生物素的纯化方法”，专利权人浙江医药股份有限公司新昌制药厂公开了一种用低级烷基醇(甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇)与冰乙酸的混合溶剂重结晶提纯含杂质的d-生物素的纯化方法。

14.专利号为ZL 200710111502.1的“由1,3-二苄基4-烷氧基生物素中间体合成D-生物素的方法”，专利权人浙江医药股份有限公司新昌制药厂公开了一种由 1,3-二苄基4-烷氧基生物素中间体合成D-生物素的方法，该方法通过(1)向作为生物素中间体的1,3-二苄基4-烷氧基生物素中间体中加入氢溴酸生成锍鎓溴化合物；(2)在醇钠的作用下与丙二酸二乙酯缩合生成双酯双苄生物素；(3)在无机酸催化下，双酯双苄生物素脱羧水解生成D-生物素。

15.专利号为ZL 201010301400.8的“一种d-生物素的制备方法”，专利权人浙江新和成股份有限公司公开了一种提高d-生物素收率的制备方法。其步骤如下：以锍鎓卤化物、2,2-二氰基乙酸乙酯为反应原料，经缩合、脱苄、水解、脱羧、开环，再用三光气环合得到d-生物素。

16.专利号为ZL 201210248605.3的“一种从南极磷虾中提取生物素的方法及高效薄层扫描分析方法”的发明专利，专利权人山东师范大学公开了一种采用氯仿、二甲基甲酰胺处理南极磷虾，经离心、醇提、浓缩来提取生物素的方法及高效薄层扫描分析生物素的方法。

17.专利号为ZL201310251591.5的“一种化学酶法合成生物素中间体内酯的方法”的发明专利，是本专利申请人之一浙江圣达生物药业股份有限公司(原浙江圣达药业有限公司)和浙江工业大学联合申请的，该专利提供了一种化学酶法合成生物素中间体内酯Ⅲ的方法，具体是以生物素中间体Ⅰ二醇和乙酸乙烯酯为反应底物，在脂肪酶的作用下进行不对称酯交换反应合成生物素中间体Ⅱ单酯，然后进一步合成得到生物素中间体内酯Ⅲ的方法。该发明酶的立体选择性强，反应转化率高，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。

18.专利号为ZL 201310755468.7的“一种d-生物素的合成方法”的发明专利，专利权人浙江新和成股份有限公司和上虞新和成生物化工有限公司联合公开了一种d-生物素的合成方法，包括：在酸催化剂的作用下，(2S,3S,4S)-5-(3,4-二氨基-四氢噻吩-2-基)戊酸与烷基碳酸酯发生关环反应，反应结束后，经过后处理得到d-生物素。

19.专利号为ZL 201410187254.9的“从玉米浆中提取生物素的方法及其薄层层析扫描检测方法”，专利权人山东师范大学公开了一种从玉米浆中提取生物素的方法，其以玉米浆为原料，经N,N-二甲基甲酰胺提取，无水乙醇提取除杂，丙酮提取除杂，乙酸丁酯和环己烷提取除杂，最终得到含生物素的样品液。该发明还提供了一种生物素的薄层层析扫描检测方法。

20.专利号为ZL201410188963.9的“以糖蜜为原料提取生物素的方法及检测方法”，专利权人山东师范大学公开了一种以糖蜜为原料提取生物素的方法，该方法以糖蜜原料，加入乙醇，40KHz超声处理，得糖蜜渣块后，再加入乙醇，20KHz超声处理，并结合N,N二甲基甲酰胺提取，最终得到含生物素的样品液。

21.专利号为ZL 201710432914.9的“一种促进生物素合成的质粒、细胞及其促进方法”的发明专利，专利权人浙江大学公开了一种促进生物素合成的方法，该方法通过B.subtilis168中bioW基因序列和S.cerevisiaeZJU001中S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)合成酶(sam2)基因序列来促进两段生物素操纵子基因bioBFHCD和 bioA对生物素的合成。通过该发明，获得的基因工程菌具有高效合成生物素的能力，在以庚二酸为底物的培养基中进行补料发酵时生物素产量可以达到 417mg/L，是原始大肠杆菌的200倍，产率达到10.4mg/(L·h)。

22.申请号为201780048750.8的“生物素的中间体的制造方法、及生物素的制造方法”的发明专利，是株式会社德山在中国申请的专利，其公开了一种生物素中间体(酰胺醇化合物)的新型制造方法，并以该中间体为原料制造生物素的方法。

23.专利号为ZL 201811527070.7的“一种d-生物素的制备方法”的发明专利，本专利申请人之一浙江圣达生物药业股份有限公司公开了一种d-生物素的制备方法：将双苄基生物素与三卤化硼的有机溶液，在无水有机溶剂的环境中，在惰性气体的保护下，经过一步反应脱去双苄基，得到d-生物素。在化学合成工艺中，该方法是简便、安全、高收率、高纯度的一锅煮d-生物素的制备方法，适合工业化生产。

24.专利号为ZL 201810979544.5的“沙棘中生物素的提取方法及采用该方法得到的生物素”的发明专利，专利权人青海清华博众生物技术有限公司公开了一种沙棘中生物素的提取方法及采用该方法得到的生物素。该提取方法包括：采用纤维素酶对沙棘进行酶解，同时采用超声对其进行辅助破壁，然后再将酶解和超声破壁后的样品依次经过滤、离心和吸附，去除样品中的杂质得到生物素。

25.申请号为201910585879.3的“一种促进生物素合成的方法、促进生物素合成的重组细胞和基因工程菌”的发明专利，也是由本专利申请人之一浙江圣达生物药业股份有限公司申请的，该方法通过引入枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis168)来源的编码庚二酸辅酶A合成酶基因bioW和能够裂解长链脂肪酰基-ACP的P450氧化酶基因bioI来强化生物素前体庚二酸硫酯的供应，促进下游生物素合成基因bioAFDB对生物素的合成。通过该发明，获得的工程菌生物素合成能力得到了极大的提升，在添加少量庚二酸的情况下，上罐分批发酵产生了80mg/L生物素，其产量是野生型易变假单胞菌(Pseudomonas mutabilis)的8000倍。

26.申请号为201910591872.2的“促进生物素合成的方法、促进生物素合成的重组细胞和基因工程菌”的发明专利，同样是由本专利申请人之一浙江圣达生物药业股份有限公司申请的，其公开了一种促进生物素合成的方法、促进生物素合成的重组细胞和基因工程菌，该方法将枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtilis168) 生物素合成操纵子bioWAFDBI中各个生物素合成基因bioW、bioA、bioF、bioD、 bioB和bioI单独克隆并重新进行排列组合，其中，基因bioF、bioA、bioD和bioB 可以来自其他含有相应基因的微生物。通过强启动子过表达上述重排的生物素合成基因簇，包含这些顺序的载体能够转化到其他微生物中，尤其是易变假单胞菌。通过发明，获得的工程菌生物素合成能力得到了极大的提升，在添加庚二酸的情况下，上罐补料分批发酵产生了272mg/L生物素，其产量是野生型易变假单胞菌的27200倍。

27.申请号为202010747897.X的“一种从槟榔嫩果中提取槟榔生物素的方法”的发明专利，申请人海南口味王科技发展有限公司公开了一种从槟榔嫩果中提取生物素的方法，包括：低温干燥、粉碎、乙醇浸提、酶解、过滤、离心、浓缩和干燥。

如前文所述，目前，商业化的D-生物素的获得绝大部分仍然由化学合成法来制备(成本高、安全隐患高、工艺复杂、结构相似的副产物多、环境负担过重等)，还有少量采用直接提取方法从动植物中提取制备，包括酶提取法、有机溶剂助提法等(存在提取率低、安全性低等)，此外，还有极少量通过微生物发酵制备(相对成本低、更安全、工艺简单、环境友好)，但是由于现有发酵方法产 D-生物素的产量普遍偏低，仍多处于研发阶段，且国内发酵水平较国际领先水平有较大差距，无法满足工业化生产，因此，需要开发一种改进的提高D-生物素产量的微生物发酵方法，对打破现有化学合成的技术壁垒，改善现有发酵工艺具有十分重要的意义，另一方面，也可以满足工业化放大需求。

发明内容

本发明公开一种提高D-生物素产量的生产方法，其中，

将易变假单胞菌接种于发酵培养基，于温度26℃-32℃，溶氧2％以上，初始pH6.8-7.5的条件下发酵110h-145h，收获发酵液，得到D-生物素；

所述发酵培养基的组成均为：复合碳源30g/L-60g/L、氮源6g/L-39g/L、无机盐14g/L-36g/L、有机酸0.1-3g/L，余量为水；

所述复合碳源包括葡萄糖和甘油；

所述易变假单胞菌为包含生物素合成基因的易变假单胞菌基因工程菌。

在一些实施方式中，所述葡萄糖和甘油的浓度比为(15-30)：(15-30)。

在一些实施方式中，所述有机酸选自乙酸、庚二酸、柠檬酸、琥珀酸中的至少一种。

在一些实施方式中，所述氮源选自有机氮源、无机氮源或其组合。

在一些实施方式中，所述有机氮源选自酵母粉、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、鱼粉、玉米浆中的至少一种。

在一些实施方式中，所述无机氮源选自硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素中的至少一种。

在一些实施方式中，所述无机盐选自Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄、 K₂HPO₄·3H₂O、KH₂PO₄、ZnSO₄·7H₂O、MgSO₄·7H₂O、FeSO₄·7H₂O中的至少一种。

在一些实施方式中，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖15-30g/L、甘油15-30 g/L、蛋白胨10-40g/L、(NH₄)₂SO₄ 1-4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O10-20 g/L、KH₂PO₄ 3-10 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2-1.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.08-0.1g/L、庚二酸0.1-3g/L，余量为水。

在一些实施方式中，从发酵初始至所述发酵液中的所述葡萄糖含量为0时之前的阶段，控制发酵温度为30-32℃；

当所述发酵液中的所述葡萄糖含量为0时起至发酵结束的阶段，控制发酵温度为25-29℃。

当所述发酵液中的所述葡萄糖含量为0时起至所述发酵中的所述甘油含量自然降至0.5-2.5g/L时之前的阶段，控制发酵温度为28-29℃；

当所述发酵液中的所述甘油含量自然降至0.5-2.5g/L时起至发酵结束的阶段，控制发酵温度为25-27℃。

在一些实施方式中，当所述发酵液中所述甘油浓度降至1g/L时，流加 600-1000g/L甘油，使所述发酵液中甘油浓度在0.5-1.5g/L。

在一些实施方式中，当流加所述甘油时，同时流加乙醇，使所述发酵液中乙醇浓度在0.01-0.5g/L。

在一些实施方式中，所述乙醇的流加为以下的梯度流加：所述乙醇的流加为以下的梯度流加：自流加所述甘油初始至第6-8h结束，控制所述乙醇在发酵液中的浓度≤0.05g/L；自流加所述甘油初始的第7-9h开始至第20-24h结束，控制所述乙醇在发酵液中的浓度≤0.1g/L；自流加所述甘油初始的第21-25h开始至第 40-48h结束，控制所述乙醇在发酵液中的浓度≤0.3g/L；自流加所述甘油初始的第41-49h开始至发酵结束，控制所述乙醇在发酵液中的浓度≤0.5g/L。

在一些实施方式中，所述易变假单胞菌基因工程菌包含生物素合成基因 bioW、bioI和bioAFDB的组合；或者包含生物素合成基因bioW、bioA、bioF、 bioD、bioB和bioI的组合。

附图说明

图1为微生物平板法测定生物素标准曲线图。

具体实施方式

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能提高发酵法生产D-生物素方法的改进方法，使D-生物素产量较原始工艺提高了21％-170％，发酵周期缩短了13％-28％。

为实现本发明目的，本公开的一些实施方式提供了一种提高D-生物素产量的生产方法，其中，

将易变假单胞菌接种于发酵培养基，于温度26℃-32℃，溶氧2％以上，pH 7.2-8.0的条件下发酵110h-145h，收获发酵液，得到D-生物素；

所述复合碳源包括葡萄糖和甘油；

所述易变假单胞菌为合成D-生物素的易变假单胞菌基因工程菌。

在利用基因工程菌易变假单胞菌(含有D-生物素合成基因)发酵生产D-生物素的过程中，利用葡萄糖作为单独的碳源，菌种发酵后只能促进菌体生长，但是无法促进D-生物素的合成，发酵后D-生物素的含量几乎为0，单独利用葡萄糖作为碳源可能改变了菌种的代谢通路，使得其无法合成D-生物素，因此葡萄糖不能作为发酵培养基的碳源，故在发酵易变假单胞菌生产D-生物素时，通常是摒弃葡萄糖作为氮源进行发酵生产的。在利用甘油作为碳源时，可促进菌体快速增殖，并且有效生产D-生物素，且产量较优，而本发明人却令人意想不到地发现，在将甘油和先前已经摒弃作为发酵碳源的葡萄糖的组合作为发酵培养基的碳源时，发酵易变假单胞菌生产D-生物素，却获得了意料不到的结果，即选择甘油和葡萄糖作为组合碳源，其发酵获得的D-生物素产量远高于单独利用甘油发酵生产D-生物素。

在一些实施方式中，葡萄糖和甘油的浓度比为(15-30):(15-30)。在一些实施方式中，葡萄糖和甘油的浓度比为例如(15-20)g/L:(20-30)g/L、(15-25) g/L:(25-30)g/L或(15-20)g/L:(15-25)g/L，诸如15:16、15:18、15:19、15:22、 15:24、15:26、15:28、15:29、17:16、17:18、17:19、17:22、17:24、17:26、17:28、 17:29、19:16、19:18、19:19、19:22、19:24、19:26、19:28、19:29、21:16、21:18、 21:19、21:22、21:24、21:26、21:28、21:29、25:16、25:18、25:19、25:22、25:24、 25:26、25:28、25:29、27:16、27:18、27:19、27:22、27:24、27:26、27:28、27:29、 29:16、29:18、29:19、29:22、29:24、29:26、29:28、30:29。本发明通过控制葡萄糖和甘油的浓度比在(15-30):(15-30)的范围内，可以进一步提高D-生物素的产量。

本公开并不对易变假单胞菌基因工程菌做特别的限定，易变假单胞菌基因工程菌可以为本领已知的可以产D-生物素的任何易变假单胞菌基因工程菌。

在一些实施方式中，易变假单胞菌基因工程菌包含生物素合成基因bioW、 bioA、bioF、bioD、bioB和bioI的组合。在一些实施方式中，生物素合成基因 bioW、bioA、bioF、bioD、bioB和bioI均来源于枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis168)。在一些实施方式中，生物素合成基因bioW、bioA、bioF、bioD、bioB 和bioI均来源于枯草芽孢杆菌168的生物素合成操纵子bioWAFDBI。在一些实施方式中，基因bioW为如SEQ ID NO.1所示的DNA序列，基因bioA为如SEQ ID NO.2所示的DNA序列，基因bioF为如SEQ ID NO.3所示的DNA序列，基因bioD为如SEQ ID NO.4所示的DNA序列，基因bioB为如SEQ ID NO.5所示的DNA序列，基因bioI为如SEQ ID NO.6所示的DNA序列。

在一些实施方式中，易变假单胞菌基因工程菌为含有SEQ ID NO.1-6所示 DNA序列的易变假单胞菌基因工程菌。

在一些实施方式中，含有SEQ ID NO.1-6所示DNA序列的易变假单胞菌基因工程菌含有枯草芽孢杆菌来源的bioW和bioI以及枯草芽孢杆菌或其他微生物来源的bioA、bioF、bioD、bioB。在一些实施方式中，含有SEQ ID NO.1-6所示 DNA序列的易变假单胞菌基因工程菌以易变假单胞菌ATCC31014作为出发菌株进行基因工程构建。

在一些实施方式中，含有SEQ ID NO.1-6所示DNA序列的易变假单胞菌基因工程菌的构建方法如下：将枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis168)生物素合成操纵子bioWAFDBI中各个生物素合成基因bioW(SEQ ID NO.1)、bioA(SEQID NO.2)、bioF(SEQ IDNO.3)、bioD(SEQ ID NO.4)、bioB(SEQ ID NO.5)和bioI(SEQ IDNO.6)单独克隆并进行重排，通过强启动子过表达上述重排的生物素合成基因簇，从而促进生物素的高效合成；其中，生物素合成基因bioW编码庚二酸辅酶 A合成酶，生物素合成基因bioA编码7，8-二氨基壬酸转氨酶，生物素合成基因 bioF编码7-酮基-8-氨基壬酸合成酶，生物素合成基因bioD编码脱硫生物素合成酶，生物素合成基因bioB编码生物素合成酶，生物素合成基因bioI编码裂解长链脂肪酰基-ACP生成庚二酸-ACP的P450氧化酶。在一些实施方式中，基因bioW 和bioI来自于枯草芽孢杆菌168，基因bioA、bioF、bioD和bioB来自于枯草芽孢杆菌168或其它含有相应基因的微生物。在一些实施方式中，所述基因bioA、 bioF、bioD和bioB来自其它含有相应基因的微生物，包括来自铜绿假单胞菌 PAO1的生物素合成基因bioA、bioF、bioD和bioB，或者大肠杆菌MG1655的生物素合成基因bioA、bioF、bioD和bioB或者恶臭假单胞菌KT2240的生物素合成基因bioA、bioF、bioD和bioB。在一些实施方式中，在bioW、bioA、bioF、bioD、bioB和bioI各自基因前加入优化的核糖体结合位点，通过Gibison多片段重组构建广宿主表达质粒pBBR1M-bioWIABFD，该表达质粒含有强启动转录的生物素合成基因簇bioWIABFD，能促进生物素高效合成。在一些实施方式中，含有 SEQ ID NO.1-6所示DNA序列的易变假单胞菌基因工程菌及其构建方法来源于申请号为CN201910591872.2，名称为《促进生物素合成的方法、促进生物素合成的重组细胞和基因工程菌》的中国发明专利申请。

在一些实施方式中，易变假单胞菌基因工程菌包含生物素合成基因bioW、 bioI和bioAFDB的组合。在一些实施方式中，生物素合成基因bioW、bioI和 bioAFDB均来源于枯草芽孢杆菌168。在一些实施方式中，基因bioW为如SEQ ID NO.1所示的DNA序列，基因bioI为如SEQ ID NO.6所示的DNA序列，基因(生物素合成簇基因)bioAFDB为如SEQ ID NO.7所示的DNA序列。

在一些实施方式中，易变假单胞菌基因工程菌为含有SEQ ID NO.1、6、7 所示DNA序列的易变假单胞菌基因工程菌。

在一些实施方式中，含有SEQ ID NO.1、6、7所示DNA序列的易变假单胞菌基因工程菌含有枯草芽孢杆菌来源的编码庚二酸辅酶A合成酶基因bioW和能够裂解长链脂肪酰基-ACP的P450氧化酶基因bioI。在一些实施方式中，含有 SEQ ID NO.1、6、7所示DNA序列的易变假单胞菌基因工程菌的构建方法如下：通过引入枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168)来源的编码庚二酸辅酶A合成酶基因bioW SEQ ID NO.1和能够裂解长链脂肪酰基-ACP的P450氧化酶基因bioI SEQ ID NO.2来强化生物素前体庚二酸硫酯的供应，促进下游生物素合成基因(生物素合成簇基因)bioAFDB SEQ ID NO.3对生物素的合成。在一些实施方式中，

在一些实施方式中，含有SEQ ID NO.1、6、7所示DNA序列的易变假单胞菌基因工程菌以易变假单胞菌ATCC31014作为出发菌株进行基因工程构建。

在一些实施方式中，含有SEQ ID NO.1、6、7所示DNA序列的易变假单胞菌基因工程菌及其构建方法来源于申请号为CN201910585879.3，名称为《一种促进生物素合成的方法、促进生物素合成的重组细胞和基因工程菌》的中国发明专利申请。

在一些实施方式中，有机酸包括但不限于乙酸、庚二酸、柠檬酸、琥珀酸中的至少一种。

本发明对氮源并没有特别的限定，可以包括有机氮源和无机氮源或其组合。

在一些实施方式中，氮源选自有机氮源、无机氮源或其组合。在一些实施方式中，有机氮源包括但不限于酵母粉、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、鱼粉、玉米浆中的至少一种。在一些典型的实施方式中，有机氮源例如为酵母粉。在一些实施方式中，无机氮源包括但不限于：硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素中的至少一种。在一些优选的实施方式中，无机氮源为硫酸铵。上述氮源可以是单独使用，也可以混合使用。

在一些实施方式中，无机盐包括但不限于Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄、 K₂HPO₄·3H₂O、KH₂PO₄、ZnSO₄·7H₂O、MgSO₄·7H₂O、FeSO₄·7H₂O中的至少一种。

在一些实施方式中，从发酵初始至所述发酵液中的所述葡萄糖含量为0时的阶段，控制发酵温度为30-32℃；当所述发酵液中的所述葡萄糖含量为0时之后起至发酵结束的阶段，控制发酵温度为25-29℃。本发明将发酵控制在两阶段温度进一步获得了更高的D-生物素产量，本发明发现，以葡萄糖的消耗量在其含量为0时作为温度控制的转折点，进行两段控温，不仅可以促进菌体增殖，而且可以实现D-生物素的进一步提高。

在一些实施方式中，从发酵初始至所述发酵液中的所述葡萄糖含量为0时之前的阶段，控制发酵温度为30-32℃；当所述发酵液中的所述葡萄糖含量为0时起至所述发酵中的所述甘油含量自然降至0.5-2.5g/L时之前的阶段，控制发酵温度为28-29℃；当所述发酵液中的所述甘油含量自然降至0.5-2.5g/L时起至发酵结束的阶段，控制发酵温度为25-27℃。本发明发现，以葡萄糖的消耗量在其含量为0时作为转折点控温的两阶段发酵，可以实现D-生物素的进一步积累。此外，将当葡萄糖的消耗量在其含量为0时和当甘油的含量自然降至1g/L两者作为温度控制的转折点，进行三段控温，可以在上述基础上，实现D-生物素的更进一步的积累，使得D-生物素的产量更高。

在一些实施方式中，当流加甘油时，同时流加乙醇，使所述发酵液中乙醇浓度在0.01-0.5g/L。本发明发现，当发酵过程中，开始流加甘油时，同时流加乙醇，不仅几乎不会对菌种生长和发酵过程产生不良的影响，而且反而可以进一步提高D-生物素的收率。

在一些实施方式中，乙醇的流加为以下的梯度流加：所述乙醇的流加为以下的梯度流加：自流加所述甘油初始至第6-8h结束，控制所述乙醇在发酵液中的浓度≤0.05g/L；自流加所述甘油初始的第7-9h开始至第20-24h结束，控制所述乙醇在发酵液中的浓度≤0.1g/L；自流加所述甘油初始的第21-25h开始至第 40-48h结束，控制所述乙醇在发酵液中的浓度≤0.3g/L；自流加所述甘油初始的第41-49h开始至发酵结束，控制所述乙醇在发酵液中的浓度≤0.5g/L。

在上述梯度流加流加乙醇的过程中，可以最大限度地提供菌体的活力，几乎不影响对菌体产生毒害作用的前提下，使得D-生物素更多地溶于乙醇，促进D- 生物素的进一步生成和积累。但是由于乙醇本身对于菌种的毒害作用的事实，因此目前还未有人通过添加乙醇来提高D-生物素的，而本发明出乎意料地通过添加乙醇实现D-生物素产量的提高。

在一些发酵过程中，控制发酵转速为300-500r/min.。

在一些实施方式中，易变假单胞菌经过种子培养基培养，得到种子液，将种子液以0.5％-10％(体积比)的接种量接种于发酵培养基中。在一些实施方式中，直接将易变假单胞菌菌液以0.5％-10％(体积比)的接种量接种于发酵培养基中。

在一些实施方式中，种子液的发酵条件为：28-32℃、好气培养。

在一些实施方式中，溶氧控制在2％以上，并将发酵转速控制在300-500r/min 之间。

在一些实施方式中，种子培养基为：葡萄糖10-25g/L、蛋白胨10-25g/L、酵母抽提物5-15g/L、Na₂HPO₄·12H₂O10-22 g/L、KH₂PO₄ 2-8g/L、(NH₄)₂SO₄ 1-5 g/L、MgSO₄·7H₂O0.4-1.5g/L，pH6.8-8.0。

在一些实施方式中，以OD(OD_600nm)终点为转种指标，将易变假单胞菌接入种子培养基，当其中OD达到1.5-3.0，立即转接种于发酵培养基中。本发明以 OD为指标判定转种时机，使得种子液质量稳定。

在一些实施方式中，种子液培养方式为摇床旋转培养、振荡培养、发酵罐搅拌培养或鼓泡培养中的一种或组合。

在一些实施方式中，发酵培养方式为摇床旋转培养、振荡培养、发酵罐搅拌培养或鼓泡培养中的一种或组合。

在一些实施方式中，在发酵过程中，维持发酵过程中的pH 6.8-8.0。

在一些实施方式中，维持发酵过程中的pH恒定的溶液没有特别的限定，可以为本领已知的无机酸和无机碱的组合。在一些实施方式中，无机酸包括但不限于HCl、H₃PO₄或H₂SO₄中的至少一种或其组合。在一些实施方式中，无机碱包括但不限于NaOH、氨水中的至少一种或其组合。

本公开对固体培养基和种子培养基不做具体的限定，即包括本领域已知的适用于易变假单胞菌生长的任何固体培养基和种子培养基组成。在一些实施方式中，固体培养基的组成可以为例如：固体培养基(g/L)：酵母抽提物2-8、蛋白胨6-12、 NaCl 8-12、琼脂粉15-22，pH 7.0-7.4。在一些实施方式中，种子培养基的组成可以为例如：种子培养基(g/L)：葡萄糖15-25、蛋白胨15-25、酵母抽提物5-12、 Na₂HPO₄·12H₂O15-20、KH₂PO₄ 2-5、(NH₄)₂SO₄0.5-3、MgSO₄·7H₂O 0.2-1.2， pH6.8-7.2。

本公开对菌种的活化不做具体限定，同时可以根据生产的需求选择是否进行种子培养和发酵过程，或者直接将菌种进行发酵。在一些实施方式中，可以将经固体培养基培养的单菌落，接入种子培养基中，于26-30℃、150-220r/min的条件下，振荡培养，待OD(OD_600nm)达到1.8-2.2时，即可得到种子液。在一些实施方式中，可以将保存在甘油中的菌体直接接种于种子培养基中，于26-30℃、 150-220r/min的条件下，振荡培养，待OD(OD_600nm)达到1.8-2.2时，即可得到种子液。在一些实施方式中，将种子液按接种量0.5-4％(体积百分比)接入发酵培养基中。在一些实施方式中，可以将保存在甘油中的菌体直接接种于发酵培养基进行发酵。

本发明的优点和积极效果是：

本发明改变了现有微生物发酵法生产工艺步骤，采用葡萄糖和甘油作为复合碳源，令人意外地提高了D-生物素的产率，另外，以OD为指标判定转种时机，使得种子液质量稳定；分阶段温度发酵生产，也一定程度上提高后期D-生物素转化率。同时在发酵过程中添加乙醇，可以进一步提高了D-生物素的产量。本发明改进了现有发酵生产方法，显著提高了D-生物素的产率，不仅可以缩短发酵周期，节约成本，而且减少了发酵废液和废气的排放，减轻环境污染，工艺较化学合成方法简单易放大，易于实现绿色、高效、节能的产业化大规模生产。

为了使本领域技术人员更好的理解本发明的目的、技术方案，以下结合具体实施例，将对本发明作进一步说明，但以下实施例仅是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例

实施例1发酵生产D-生物素的方法

本实施例选择的易变假单胞菌基因工程菌为含有SEQ ID NO.1-6所示DNA 序列的基因工程菌。

该基因工程菌以易变假单胞菌ATCC31014作为出发菌株，进行基因工程的构建，获得工程菌名称为PM/WIABFD，来源于申请号为CN201910591872.2，名称为《促进生物素合成的方法、促进生物素合成的重组细胞和基因工程菌》的中国发明专利申请，其具体构建方法来源于说明书实施例1和实施例2。

培养基组成如下：

种子培养基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母抽提物10、Na₂HPO₄·12H₂O 18、KH₂PO₄4.05、(NH₄)₂SO₄2、MgSO₄·7H₂O 0.8，pH 7.1。

发酵培养基(g/L)：甘油20、葡萄糖20、蛋白胨20、(NH₄)₂SO₄2、 Na₂HPO₄·12H₂O 18、KH₂PO₄4.05、MgSO₄·7H₂O 0.8、FeSO₄·7H₂O0.012、庚二酸 1，pH 7.0。

将保藏在甘油中的上述菌种，接入种子培养基中，于28℃、200r/min的条件下，摇床培养，待OD达到2.0，即可制成种子液。

将培养好的种子液以1％(体积比)的接种量转接入含有6L发酵培养基的 10L机械搅拌式发酵罐中，发酵过程中，温度控制在28℃，溶氧控制在2％以上，转速400r/min，使用NaOH和HCl的组合，控制发酵的pH 7.2；当发酵液中甘油浓度降至1g/L时，自动流加800g/L甘油，使甘油在发酵液中的终浓度控制在1g/L左右。

发酵结束后，取发酵液1ml，并按照如下来源的方法，测定D-生物素含量，测定方法如下：

植物乳杆菌的培养：

在MRS平板上，挑取植物乳杆菌(ATCC 8014)单菌落，接种至含有50mL MRS液体培养基的锥形瓶中，37℃200rpm培养过夜至OD_600nm＝2.8左右。

取1ml菌液于1.5ml离心管中，5000g离心2min，弃上清，用PBS重悬菌体，再次5000g离心2min，重复三次，最后用PBS重悬菌体，终体积100μL。

生物素测定平板的制备：

将上述菌悬液加入到含有未凝固的生物素测定培养基中，充分混匀后，立即倒入干净的大培养板中，待凝固。

上样：

随后，吸取适量的生物素标准品和发酵上清液样品，点加在提前准备好的无菌干燥滤纸片上(直径为6mm、且无生物素污染)。待滤纸片干燥后，用镊子转移至混有植物乳杆菌的生物素测定平板上，使滤纸片与培养基贴合。37℃恒温培养箱中静置16-24h。

计算：

根据不同浓度的生物素所产生的菌圈面积绘制生物素标准曲线，具体参见图 1，根据该标准曲线面积和生物素浓度的函数关系，从样品形成的菌圈面积可以计算出发酵液中的生物素浓度。

经检测D-生物素最高产量为330mg/L较以下对比例1的原始工艺提高21％，发酵周期为144h，较以下对比例1的原始工艺缩短了13.3％。

实施例2发酵生产D-生物素的方法

种子培养基(g/L)：葡萄糖21、酵母粉19、酵母抽提物10、Na₂HPO₄·12H₂O 18、KH₂PO₄4、(NH₄)₂SO₄2、MgSO₄·7H₂O 0.7，pH 7.0。

发酵培养基(g/L)：甘油22、葡萄糖21、蛋白胨19、(NH₄)₂SO₄2、NaH₂PO₄15、K₂HPO₄·3H₂O 3、MgSO₄·7H₂O 0.6、FeSO₄·7H₂O 0.01、庚二酸1，pH 7.0。

将保藏在甘油中的菌种(菌种：与实施例1的基因工程菌相同)，接入种子培养基中，于29℃、210r/min的条件下，摇床培养，待OD达到2.0，即可制成种子液。

将培养好的种子液以1.2％(体积比)的接种量转接入含有6L发酵培养基的10L机械搅拌式发酵罐中，发酵过程中，温度控制在28℃，溶氧控制在2％以上，转速410r/min，使用NaOH和HCl的组合，控制发酵的pH 7.4；当发酵液中甘油浓度降至1g/L时，自动流加805g/L甘油，使甘油在发酵液中的终浓度控制在1g/L左右直至发酵结束。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测D-生物素最高产量为340mg/L，发酵周期为142h。

实施例3发酵生产D-生物素的方法

种子培养基(g/L)：葡萄糖18、蛋白胨20、酵母抽提物9、NaH₂PO₄12、 K₂HPO₄·3H₂O2、NH₄Cl4、MgSO₄·7H₂O 0.9，pH 7.1。

发酵培养基(g/L)：甘油20、葡萄糖22、酵母膏23、NH₄NO₃3、NaH₂PO₄ 15、 K₂HPO₄·3H₂O 3.5、MgSO₄·7H₂O 0.7、FeSO₄·7H₂O 0.01、庚二酸1.1，pH 7.0。

将保藏在甘油中的菌种(菌种：与实施例1的基因工程菌相同)，接入种子培养基中，于28℃、220r/min的条件下，摇床培养，待OD达到2.1，即可制成种子液。

将培养好的种子液以1.3％(体积比)的接种量转接入含有6L发酵培养基的10L机械搅拌式发酵罐中，发酵过程中，温度控制在29℃，溶氧控制在2％以上，转速415r/min，使用NaOH和HCl的组合，控制发酵的pH 7.2；当发酵液中甘油浓度降至1.1g/L时，自动流加810g/L甘油，使甘油在发酵液中的终浓度控制在1.1g/L左右直至发酵结束。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测D-生物素最高产量为341mg/L，发酵周期为143h。

实施例4发酵生产D-生物素的方法

菌种：与实施例1的基因工程菌相同。

种子培养基(g/L)、发酵培养基(g/L)组成同实施例1；种子液的发酵方法同实施例1。

将培养好的种子液以1％的接种量转接入含有6L发酵培养基的10L机械搅拌式发酵罐中，初始pH 7.0，分两阶段温度控制：第I阶段，从发酵初始到发酵液中的葡萄糖含量为0时之前，控制发酵温度在30℃；第II阶段，当发酵液中的葡萄糖含量为0时起至发酵结束的阶段，控制发酵温度在28℃，当发酵液中甘油浓度降至1g/L时，自动流加甘油，使甘油在发酵液中的终浓度控制在1g/L 直至发酵结束；发酵过程中，转速400r/min，溶氧控制在2％以上，并流加氨水使pH维持在7.0左右。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测D-生物素最高产量为380mg/L较对比例1的工艺提高39.7％，发酵周期为144h，较对比例1的工艺缩短了13.3％。

实施例5发酵生产D-生物素的方法

菌种：与实施例1的基因工程菌相同。

将培养好的种子液以1％的接种量转接入含有6L发酵培养基的10L机械搅拌式发酵罐中，初始pH 7.0，分三阶段温度控制：第I阶段，从发酵初始至所述发酵液中的所述葡萄糖含量为0时之前，控制发酵温度恒定在30℃以利于菌体的快速增殖；第II阶段，当发酵液中的葡萄糖含量为0时起至发酵中的甘油含量自然降至1g/L时之前，控制发酵温度在28℃；第III阶段，当发酵液中的甘油浓度降至1g/L时起至发酵结束，控制发酵温度在26℃；当发酵液中甘油浓度降至1g/L时，自动流加甘油，将发酵液中的甘油浓度控制在1g/L左右直至发酵结束，以利于产物生成；发酵过程中，转速400r/min，溶氧控制在2％以上，并流加氨水使pH维持在7.0左右。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测D-生物素最高产量为610mg/L较对比例1的工艺提高124％，发酵周期为120h，较对比例1的工艺缩短了27.7％。

实施例6发酵生产D-生物素的方法

菌种：与实施例1的基因工程菌相同。

将培养好的种子液以1％的接种量转接入含有6L发酵培养基的10L机械搅拌式发酵罐中，发酵过程中，温度控制在28℃，溶氧控制在2％以上，转速400 r/min，使用NaOH或HCl控制pH 7.2；当发酵液中甘油浓度降至1g/L时，自动流加800g/L甘油，使甘油在发酵液中的终浓度控制在1g/L左右直至发酵结束。

当开始流加甘油时，同时梯度流加乙醇，在甘油补料的第1至第8h，使得发酵液中的乙醇浓度为0.05g/L；在甘油补料的第8h后至第24h，使得发酵液中的乙醇浓度为0.1g/L；在甘油补料的第24h后至48h，使得发酵液中的乙醇浓度为0.2g/L；在甘油补料的第48h后至发酵结束使得发酵液中的乙醇浓度为0.4g/L。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测D-生物素最高产量为450mg/L较对比例1的工艺提高65％，发酵周期为144h，较对比例1的工艺缩短了13.3％。

实施例7发酵生产D-生物素的方法

菌种：与实施例1的基因工程菌相同。

发酵方法与实施例4相近，唯一不同的是，当开始流加甘油时，还同时梯度流加乙醇，在甘油补料的第1至第8h，使得发酵液中的乙醇浓度为0.05g/L；在甘油补料的第8h后至第24h，使得发酵液中的乙醇浓度为0.1g/L；在甘油补料的第24h后至48h，使得发酵液中的乙醇浓度为0.3g/L；在甘油补料的第48h后至发酵结束使得发酵液中的乙醇浓度为0.5g/L。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测D-生物素最高产量为660mg/L较对比例1的工艺提高142％，发酵周期为144h，较对比例1的工艺缩短了13.3％。

实施例8发酵生产D-生物素的方法

菌种：与实施例1的基因工程菌相同。

将培养好的种子液以1％的接种量转接入含有6L发酵培养基的10L机械搅拌式发酵罐中，初始pH 7.0，分三阶段温度控制：第I阶段，自发酵初始至在发酵液中的葡萄糖含量为0之前，控制在30℃以利于菌体的快速增殖；第II阶段，当发酵液中葡萄糖含量为0时起至发酵液中的甘油浓度降至1g/L之前，温度控制在28℃；第III阶段，当发酵液中的甘油浓度降至1g/L时起至发酵结束，控制温度26℃；同时在发酵液中的甘油浓度为1g/L时，自动流加甘油，将发酵液中的甘油浓度控制在1g/L左右直至发酵结束；发酵过程中，转速400r/min，溶氧控制在2％以上，并流加氨水使pH维持在7.0左右。

当开始流加甘油时，同时梯度流加乙醇，在甘油补料的第1至第8h，使得发酵液中的乙醇浓度为0.05g/L；在甘油补料的第8h后至第23h，使得发酵液中的乙醇浓度为0.1g/L；在甘油补料的第23h后至47h，使得发酵液中的乙醇浓度为0.2g/L；在甘油补料的第47h后至发酵结束使得发酵液中的乙醇浓度为0.4g/L。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测D-生物素最高产量为750mg/L较对比例1的工艺提高175％，发酵周期为120h，较对比例1的工艺缩短了27.7％。

实施例9发酵生产D-生物素的方法

本实施例选择的易变假单胞菌基因工程菌为含SEQ ID NO.1、6、7所示DNA 序列的基因工程菌。

该基因工程菌以易变假单胞菌ATCC31014作为出发菌株，进行基因工程的构建，来源于申请号为CN201910585879.3，名称为《一种促进生物素合成的方法、促进生物素合成的重组细胞和基因工程菌》的中国发明专利申请，其具体构建方法来源于说明书实施例1、实施例2和实施例3，所选择的菌种是该专利中的工程菌PM/WIAFDB。

培养基组成如下：

种子培养基(g/L)组成同实施例1；

发酵培养基(g/L)：甘油20、葡萄糖20、酵母粉20、(NH₄)₂SO₄2、 Na₂HPO₄·12H₂O 18、KH₂PO₄4.05、MgSO₄·7H₂O 0.8、FeSO₄·7H₂O0.012，庚二酸 1，pH 7.0。

将保藏在甘油中的上述菌种，接入种子培养基中，于28℃、200r/min的条件下，摇床培养，待OD达到2.3，即可制成种子液。

将培养好的种子液以1.5％(体积比)的接种量转接入含有6L发酵培养基的10L机械搅拌式发酵罐中，发酵过程中，温度控制在28℃，溶氧控制在2％以上，转速400r/min，使用NaOH和HCl的组合，控制发酵的pH 7.2；当发酵液中甘油浓度降至1g/L时，自动流加甘油，使甘油在发酵液中的终浓度控制在 1.2g/L左右直至发酵结束。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测D-生物素最高产量为101mg/L较对比例5的工艺提高18.8％，发酵周期为68h，较原始工艺缩短了5％。

对比例1利用现有技术的发酵工艺发酵生产D-生物素

菌种：与实施例1的基因工程菌相同。

发酵培养基(g/L)：

甘油40、蛋白胨20、(NH₄)₂SO₄ 2、Na₂HPO₄·12H₂O 18、KH₂PO₄4.05、 MgSO₄·7H₂O0.8、FeSO₄·7H₂O 0.012，庚二酸1，pH 7.0。

种子培养基(g/L)组成同实施例1；种子液的发酵方法同实施例1。

将培养好的种子液(OD～2.0)以1％的接种量转接入含有2L发酵培养基的 5L机械搅拌式发酵罐中，发酵过程中，温度控制在28℃，溶氧控制在2％以上，转速400r/min，使用NaOH或HCl控制pH 7.2；当发酵液中的甘油浓度降至1g/L 时，自动慢速流加800g/L甘油，使甘油浓度控制在1g/L左右直至发酵结束。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测，D-生物素产量为272mg/L，发酵周期166h。

对比例2发酵生产D-生物素

菌种：与实施例1的基因工程菌相同。

此对比例将葡萄糖作为发酵培养基的碳源。

发酵培养基(g/L)：

葡萄糖40、蛋白胨20、(NH₄)₂SO₄2、Na₂HPO₄·12H₂O 18、KH₂PO₄4.05、 MgSO₄·7H₂O0.8、FeSO₄·7H₂O 0.012，庚二酸1，pH 7.0。

将培养好的种子液(OD～2.0)以1％的接种量转接入含有2L发酵培养基的 5L机械搅拌式发酵罐中，发酵过程中，温度控制在28℃，溶氧控制在2％以上，转速400r/min，使用NaOH或HCl控制pH 7.2；当发酵液中的葡萄糖浓度降至 1g/L时，自动慢速流加800g/L葡萄糖，使葡萄糖浓度控制在1g/L左右直至发酵结束。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测，D-生物素产量几乎为0mg/L，发酵周期166h。

对比例3发酵生产D-生物素

菌种：与实施例1的基因工程菌相同。

此对比例将蔗糖作为发酵培养基的碳源。在现有技术中可知蔗糖也可以作为有利的碳源被假单胞菌利用以生长和代谢。

发酵培养基(g/L)：

蔗糖40、蛋白胨20、(NH₄)₂SO₄ 2、Na₂HPO₄·12H₂O 18、KH₂PO₄ 4.05、 MgSO₄·7H₂O0.8、FeSO₄·7H₂O 0.012，庚二酸1，pH 7.0。

将培养好的种子液(OD～2.0)以1％的接种量转接入含有2L发酵培养基的 5L机械搅拌式发酵罐中，发酵过程中，温度控制在28℃，溶氧控制在2％以上，转速400r/min，使用NaOH或HCl控制pH 7.2；当发酵液中的蔗糖浓度降至1g/L 时，自动慢速流加800g/L蔗糖，使蔗糖浓度控制在1g/L左右直至发酵结束。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测，D-生物素产量几乎为0mg/L，发酵周期168h。

对比例4发酵生产D-生物素

菌种：与实施例1的基因工程菌相同。

此对比例将蔗糖和甘油作为发酵培养基的碳源。

发酵培养基(g/L)：

甘油20、蔗糖20、蛋白胨20、(NH₄)₂SO₄ 2、Na₂HPO₄·12H₂O 18、KH₂PO₄4.05、MgSO₄·7H₂O 0.8、FeSO₄·7H₂O 0.012，庚二酸1，pH 7.0。

将培养好的种子液以1％的接种量转接入含有6L发酵培养基的10L机械搅拌式发酵罐中，发酵过程中，温度控制在28℃，溶氧控制在2％以上，转速400 r/min，使用NaOH或HCl控制pH 7.2；当发酵液中的蔗糖耗尽，甘油浓度降至 1g/L时，自动流加800g/L甘油，使甘油浓度控制在1g/L左右直至发酵结束。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测D-生物素最高产量为5mg/L，发酵周期为168h。

对比例5发酵生产D-生物素

菌种：与实施例9的基因工程菌相同。

发酵培养基(g/L)：

甘油40、酵母粉20、(NH₄)₂SO₄2、Na₂HPO₄·12H₂O 18、KH₂PO₄4.05、 MgSO₄·7H₂O0.8、FeSO₄·7H₂O 0.012，庚二酸1，pH 7.0。

将培养好的种子液(OD～2.0)以1.5％的接种量转接入含有2L发酵培养基的5L机械搅拌式发酵罐中，发酵过程中，温度控制在28℃，溶氧控制在2％以上，转速400r/min，使用NaOH或HCl控制pH 7.2；当发酵液中的甘油浓度降至1g/L时，自动慢速流加800g/L甘油，使甘油浓度控制在1.2g/L左右直至发酵结束。

发酵结束后，取发酵液1ml，利用上述实施例1中测定D-生物素含量的方法，测定D-生物素含量。经检测，D-生物素产量为85mg/L，发酵周期72h。

通过实施例1和对比例1的比较，以及实施例9和对比例5的比较，本公开在通过不同的易变假单胞菌基因工程菌，利用本公开发酵培养基生产D-生物素中，均可以获得更为显著的D-生物素产量。同时需要说明的是，在利用实施例9 的基因工程菌发酵生产D-生物素的过程中，在利用葡萄糖和甘油作为组合碳源发酵的基础上，与通过如本公开实施方式所述的两段控温发酵方式的组合、三段控温发酵方式的组合或与发酵后期流加乙醇发酵方式的组合均分别进一步获得更高的D-生物素产量。

同时本公开利用葡萄糖和甘油作为组合碳源以及两段控温发酵方式、三段控温发酵方式和发酵后期流加乙醇发酵方式的组合，可以在更进一步获得更高的 D-生物素产量。

由上述实施例和对比例可以看出，在现有技术中，在利用能够合成D-生物素的易变假单胞菌基因工程菌的发酵工艺中，为了获得目的产物D-生物素，通常是仅利用甘油作为发酵培养基的碳源生产D-生物素，现有技术中鲜有利用糖和甘油最为发酵培养基的组合碳源，现有技术人员往往因糖在易变假单胞菌的实际发酵生产D-生物素的过程中，因无法获得D-生物素而放弃对于该糖在发酵培养基的添加，而仅选择甘油作为发酵培养基的碳源发酵获得D-生物素(参见对比例1和5)。同时也并非任意的糖和甘油的组合作为发酵培养基的碳源都能获得D-生物素的高产(参见对比例3和4)，而本发明令人意外地发现，通过添加甘油和已经被本领域技术人员放弃在发酵培养基中添加的碳源——葡萄糖的组合，作为易变假单胞菌基因工程菌发酵生产D-生物素的碳源，却获得了预料不到的技术效果，不仅可以实现高产D-生物素，而且获得D-生物素的产量也远远高于单独利用甘油作为发酵碳源的发酵工艺，需要说明的是，本发明的发酵方法可以适用于任何能够合成D-生物素的易变假单胞菌基因工程菌。

同时，本发明发现以葡萄糖的消耗量在其含量为0时作为转折点控温的两阶段发酵，通过监控葡萄糖的消耗，来控制温度变化，不仅实现菌体的积累和D- 生物素的高产，可以实现D-生物素的进一步积累(参见实施例4)。此外，将当葡萄糖的消耗量在其含量为0时和当甘油的含量自然降至1g/L两者作为温度控制的转折点，进行三段控温，可以在上述基础上，实现D-生物素的更进一步的积累，使得D-生物素的产量更高(参见实施例5)。

此外，本发明发现，当发酵过程中，开始流加甘油时，同时流加乙醇，不仅几乎不会对菌种生长和发酵过程产生不良的影响，而且反而可以进一步提高D- 生物素的收率(参见实施例6)，在发酵生产过程中，使得D-生物素更多地溶于乙醇，有效解除了发酵过程中的反馈抑制作用。

最后，本发明发现，利用葡萄糖、甘油的组合应用于发酵培养基，同时配合两段或三段控温以及在发酵过程中添加乙醇，三者之间产生了协同作用，可以更有效地提高D-生物素的生产效率(参见实施例7和8)。

序列表

<110> 浙江圣达生物药业股份有限公司

浙江新银象生物工程有限公司

<120> 一种提高D-生物素产量的生产方法

<130> 1

<141> 2022-01-06

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 777

<212> DNA

<213> 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

atgcaagaag aaacttttta tagtgtcaga atgagggctt caatgaatgg atctcatgaa 60

gacggcggaa agcatatatc cggcggagaa cggcttattc ctttccatga gatgaagcat 120

acagtcaatg ctttattaga aaaagggtta tcccattcaa gaggaaaacc tgattttatg 180

caaattcaat ttgaagaggt acatgaatcg ataaaaacca ttcagccatt gcctgtgcat 240

acgaatgaag tgagctgccc ggaagaagga caaaagcttg cccgattgtt attggaaaaa 300

gaaggcgttt cacgagacgt gattgaaaaa gcatatgaac aaatccctga atggtcagat 360

gtcaggggtg cggtgttgtt tgatattcat acaggcaagc gaatggatca aacaaaagaa 420

aaaggggtgc gggtctccag aatggattgg ccggacgcta attttgaaaa atgggcgctt 480

cacagtcacg tgccagctca ttcaagaata aaagaggccc ttgcgctcgc ttcaaaggta 540

agccggcacc cggcagtcgt tgcagaatta tgctggtcgg acgatccgga ttacataaca 600

ggctatgttg cgggtaagaa aatgggctat cagcgtatta cagcaatgaa agaatacggg 660

actgaagagg gctgccgagt cttttttatt gatggatcca atgatgtaaa cacgtacata 720

catgacctgg agaagcagcc tattttaata gagtgggagg aagatcatga ctcatga 777

<210> 2

<211> 1347

<212> DNA

<213> 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 2

atgactcatg atttgataga aaaaagtaaa aagcacctct ggctgccatt tacccaaatg 60

aaagattatg atgaaaaccc cttaatcatc gaaagcggga ctggaatcaa agtcaaagac 120

ataaacggca aggaatacta tgacggtttt tcatcggttt ggcttaatgt ccacggacac 180

cgcaaaaaag aactagatga cgccataaaa aaacagctcg gaaaaattgc gcactccacg 240

ttattgggca tgaccaatgt tccagcaacc cagcttgccg aaacattaat cgacatcagc 300

ccaaaaaagc tcacgcgggt cttttattca gacagcggcg cagaggcgat ggaaatagcc 360

ctaaaaatgg cgtttcagta ttggaagaac atcgggaagc ccgagaaaca aaaattcatc 420

gcaatgaaaa acgggtatca cggtgatacg attggcgccg tcagtgtcgg ttcaattgag 480

ctttttcacc acgtatacgg cccgttgatg ttcgagagtt acaaggcccc gattccttat 540

gtgtatcgtt ctgaaagcgg tgatcctgag gagtgccgtg atcagtgcct ccgagagctt 600

gcacagctgc ttgaggaaca tcatgaggaa attgccgcgc tttccattga atcaatggta 660

caaggcgcgt ccggtatgat cgtgatgccg gaaggatatt tggcaggcgt gcgcgagcta 720

tgtacaacat acgatgtctt aatgatcgtt gatgaagtcg ctacaggctt tggccgtaca 780

ggaaaaatgt ttgcgtgcga gcacgagaat gtccagcctg atctgatggc tgccggtaaa 840

ggcattacag gaggctattt gccaattgcc gttacgtttg ccactgaaga catctataag 900

gcattctatg atgattatga aaacctaaaa acctttttcc atggccattc ctatacaggc 960

aatcagcttg gctgtgcggt tgcgcttgaa aatctggcat tatttgaatc tgaaaacatt 1020

gtggaacaag tagcggaaaa aagtaaaaag ctccattttc ttcttcaaga tctgcacgct 1080

cttcctcatg ttggggatat tcggcagctt ggctttatgt gcggtgcaga gcttgtacga 1140

tcaaaggaaa ctaaagaacc ttacccggct gatcggcgga ttggatacaa agtttcctta 1200

aaaatgagag agttaggaat gctgacaaga ccgcttgggg acgtgattgc atttcttcct 1260

cctcttgcca gcacagctga agagctctcg gaaatggttg ccattatgaa acaagcgatc 1320

cacgaggtta cgagccttga agattga 1347

<210> 3

<211> 1170

<212> DNA

<213> 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 3

atgaagattg attcctggtt aaacgagcgg ttagacagaa tgaaagaagc cggcgtacat 60

cgtaacctgc ggtcaatgga tggagcgccg gttccagaga ggaatattga tggcgaaaat 120

caaacggtct ggtcctcaaa caattattta gggctcgcaa gcgatagacg tttgatcgat 180

gcagcccaaa cagcattgca gcaatttggg acaggaagca gcggttcacg tttaacgaca 240

ggcaattcgg tctggcatga aaagctagaa aagaagattg ccagctttaa actgacagaa 300

gcggccctgc tgttttcgag cggttacttg gccaatgtcg gtgtcctttc atccttgcca 360

gaaaaggaag atgtcatttt aagtgaccag ctcaatcatg caagtatgat cgacggctgc 420

cgactttcta aggctgatac agttgtttat cggcatattg atatgaatga tcttgaaaac 480

aagctgaatg aaacacagcg ttatcagcgc cgttttatcg taacagacgg agtattcagc 540

atggatggca caatcgcccc tcttgatcag atcatctcac ttgcgaaacg ctatcatgcc 600

ttcgtggtcg ttgatgatgc ccacgcaaca ggagttttgg gcgattcggg acaaggaacg 660

agtgaatact ttggtgtttg tcccgacatt gttatcggca ccttaagcaa agctgttggc 720

gcggaaggag gttttgcggc aggatcagcg gtcttcatcg actttttgct gaaccatgcc 780

agaacattta tctttcaaac cgctattccg ccagccagct gtgcggctgc tcacgaggct 840

ttcaacatca ttgaagccag cagggaaaaa cgacagcttt tattttctta tatcagcatg 900

atcagaacca gtctgaagaa tatgggttat gtggtgaaag gagatcacac accgattatt 960

cctgtagtca ttggcgatgc ccataaaacg gtcctatttg ctgaaaaact gcagggcaag 1020

ggaatttatg ctcctgccat tcggccgcca accgttgcgc cgggtgaaag ccggattcga 1080

attacaatca cgtctgacca cagtatgggt gatattgatc atttgctgca aacatttcat 1140

tcaatcggaa aggagctgca catcatttga 1170

<210> 4

<211> 696

<212> DNA

<213> 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 4

atgaggggtt tttttgtgac gggaactgat acagaagtag ggaaaacggt tatatccagc 60

ggtcttgctg ccttattgaa agacaataat agacatgtcg gggtgtataa accattttta 120

agcgggatat cgcgccatca tccagatagt gatacaagtt tgctgaaaga tatgtcgcag 180

accagtcttt ctcatgaaga cattacgcct tttgccttca aggcgccgct tgcaccatac 240

gttgcaggga aacttgaggg aaagactgtc accatggaag aggttttaag ccattggggg 300

cggattagag aaaaacatga atgcttcatc gtagaaggtg caggcggtat ttctgtgcca 360

ttgggagagg actatttggt cagtcatgtc ataaaagcgt tgcagcttcc catgattatt 420

gtggcgcgtc ctcgccttgg aaccattaat catacctttt taactgtcaa atatgcagaa 480

agcatggggc ttccaatcgc cggaattatc atcaatggaa tcagtgactc tcctgatgaa 540

gatgaaaaaa ccaatcctga gatgattgag cgcttatgcg gtgtgccgat tttaggggtt 600

acgccaaagc ttgccaacgt gacgaaagaa acggttctac atatggtaaa agaccatatc 660

aatctatcat tactgatgaa tcaagtgggg gtatga 696

<210> 5

<211> 1008

<212> DNA

<213> 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 5

atgaatcaat ggatggaact cgcagaccgg gtgctggctg gagcagaagt gactgacgaa 60

gaggcgcttt caatattaca ttgtcctgat gaagatattt tgctattaat gcacggggct 120

tttcacatca gaaaacactt ttacggaaaa aaagtaaagc tcaatatgat tatgaatgcg 180

aaatccgggc tctgcccgga aaactgcggc tattgttcac agtctgcgat ttcgaaagcg 240

ccgattgagt cttaccggat ggtgaataag gaaacgctgc ttgaaggcgc gaagcgggcg 300

cacgatctga atatcggcac atattgtatc gtggcaagcg gcagaggtcc gtctaacaga 360

gaagtggatc aggtcgtaga tgcggttcag gaaattaaag agacgtatgg actgaagatt 420

tgtgcatgtc ttggactgtt gaagccagag caggcgaagc ggctcaaaga tgcaggagta 480

gaccgctata atcataattt gaatacgtca cagagaaacc attcaaacat cacaacctca 540

catacatacg atgacagagt caatacggtt gaaatcgcaa aagaatcggg gctgtctccg 600

tgttcaggcg ccattatcgg gatgaaggag acgaaacagg atgtcattga catcgccaaa 660

agcttgaagg ctcttgacgc ggattccatt cctgtgaatt ttttgcatgc aattgatggc 720

acgccgttag aaggcgtcaa cgaattaaac ccgctgtatt gtttaaaagt gctggcgctg 780

ttccgtttta tcaatccatc aaaagaaatt cgcatttccg gaggaagaga ggtcaatctc 840

cgcacattgc agccattagg gctttacgcc gcaaactcca tttttgtcgg agactactta 900

acaactgccg ggcaagagga gacggaggat cataaaatgc tgagtgattt aggctttgaa 960

gttgaatcag tcgaagaaat gaaggctagt ttaagtgcga aaagctga 1008

<210> 6

<211> 1188

<212> DNA

<213> 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 6

atgacaattg catcgtcaac tgcatcttct gagtttttga aaaacccata ttctttttac 60

gacacattgc gagctgttca tcctatctat aaagggagtt tcttaaaata cccgggctgg 120

tatgtcacag gatatgaaga aacggctgct attttgaaag atgcgagatt caaagtccgc 180

accccgctgc ctgagagctc aaccaaatat caggaccttt cacatgtgca aaatcaaatg 240

atgctgtttc agaaccagcc tgatcataga cgattgcgga cgcttgccag cggagcgttt 300

acgccgagaa cgacagagag ttatcagccg tatatcattg aaactgtcca tcatttgctt 360

gatcaagtgc aaggtaaaaa aaagatggag gtcatttcgg actttgcttt tcctttagca 420

agttttgtca tagctaacat tataggtgta ccggaggaag atagggagca attaaaggag 480

tgggctgcga gtctcattca aacgattgat tttacccgct caagaaaggc attaacagag 540

ggcaatatta tggctgtgca ggctatggca tatttcaaag agctgattca aaagagaaaa 600

cgccaccctc aacaggatat gatcagcatg ctcttgaagg ggagagaaaa ggataagctg 660

acggaagagg aggcggcatc tacgtgcata ttgctggcga tcgccggaca tgagacaacg 720

gtcaatctca tcagcaattc agtcctttgt ctgctgcagc atccagaaca gcttttgaaa 780

ctgagagaaa atccagatct tattggtacc gcagtcgagg aatgtttacg ctatgaaagc 840

cccacgcaaa tgacagccag agttgcgtca gaggatattg acatctgcgg ggtgacgatc 900

cgtcaaggag aacaagtcta tcttttgtta ggagcggcta atcgagaccc tagcatattc 960

acgaaccccg atgtcttcga tattacgaga agtcctaatc cgcatctttc attcgggcat 1020

ggccatcatg tttgcttagg gtcctcgctg gcacgattag aagcgcaaat tgcgattaac 1080

actcttctgc agcgaatgcc cagccttaat cttgcggatt ttgaatggcg gtatcggccg 1140

ctttttggat ttcgggcgct tgaggagctg ccggtgactt ttgaataa 1188

<210> 7

<211> 4208

<212> DNA

<213> 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 7

atgactcatg atttgataga aaaaagtaaa aagcacctct ggctgccatt tacccaaatg 60

aaagattatg atgaaaaccc cttaatcatc gaaagcggga ctggaatcaa agtcaaagac 120

ataaacggca aggaatacta tgacggtttt tcatcggttt ggcttaatgt ccacggacac 180

cgcaaaaaag aactagatga cgccataaaa aaacagctcg gaaaaattgc gcactccacg 240

ttattgggca tgaccaatgt tccagcaacc cagcttgccg aaacattaat cgacatcagc 300

ccaaaaaagc tcacgcgggt cttttattca gacagcggcg cagaggcgat ggaaatagcc 360

ctaaaaatgg cgtttcagta ttggaagaac atcgggaagc ccgagaaaca aaaattcatc 420

gcaatgaaaa acgggtatca cggtgatacg attggcgccg tcagtgtcgg ttcaattgag 480

ctttttcacc acgtatacgg cccgttgatg ttcgagagtt acaaggcccc gattccttat 540

gtgtatcgtt ctgaaagcgg tgatcctgat gagtgccgtg atcagtgcct ccgagagctt 600

gcacagctgc ttgaggaaca tcatgaggaa attgccgcgc tttccattga atcaatggta 660

caaggcgcgt ccggtatgat cgtgatgccg gaaggatatt tggcaggcgt gcgcgagcta 720

tgtacaacat acgatgtctt aatgatcgtt gatgaagtcg ctacaggctt tggccgtaca 780

ggaaaaatgt ttgcgtgcga gcacgagaat gtccagcctg atctgatggc tgccggtaaa 840

ggcattacag gaggctattt gccaattgcc gttacgtttg ccactgaaga catctataag 900

gcattctatg atgattatga aaacctaaaa acctttttcc atggccattc ctatacaggc 960

aatcagcttg gctgtgcggt tgcgcttgaa aatctggcat tatttgaatc tgaaaacatt 1020

gtggaacaag tagcggaaaa aagtaaaaag ctccattttc ttcttcaaga tctgcacgct 1080

cttcctcatg ttggggatat tcggcagctt ggctttatgt gcggtgcaga gcttgtacga 1140

tcaaaggaaa ctaaagaacc ttacccggct gatcggcgga ttggatacaa agtttcctta 1200

aaaatgagag agttaggaat gctgacaaga ccgcttgggg acgtgattgc atttcttcct 1260

cctcttgcca gcacagctga agagctctcg gaaatggttg ccattatgaa acaagcgatc 1320

cacgaggtta cgagccttga agattgattc ctggttaaac gagcggttag acagaatgaa 1380

agaagccggc gtacatcgta acctgcggtc aatggatgga gcgccggttc cagagaggaa 1440

tattgatggc gaaaatcaaa cggtctggtc ctcaaacaat tatttagggc tcgcaagcga 1500

tagacgtttg atcgatgcag cccaaacagc attgcagcaa tttgggacag gaagcagcgg 1560

ttcacgttta acgacaggca attcggtctg gcatgaaaag ctagaaaaga agattgccag 1620

ctttaaactg acagaagcgg ccctgctgtt ttcgagcggt tacttggcca atgtcggtgt 1680

cctttcatcc ttgccagaaa aggaagatgt cattttaagt gaccagctca atcatgcaag 1740

tatgatcgac ggctgccgac tttctaaggc tgatacagtt gtttatcggc atattgatat 1800

gaatgatctt gaaaacaagc tgaatgaaac acagcgttat cagcgccgtt ttatcgtaac 1860

agacggagta ttcagcatgg atggcacaat cgcccctctt gatcagatca tctcacttgc 1920

gaaacgctat catgccttcg tggtcgttga tgatgcccac gcaacaggag ttttgggcga 1980

ttcgggacaa ggaacgagtg aatactttgg tgtttgtccc gacattgtta tcggcacctt 2040

aagcaaagct gttggcgcgg aaggaggttt tgcggcagga tcagcggtct tcatcgactt 2100

tttgctgaac catgccagaa catttatctt tcaaaccgct attccgccag ccagctgtgc 2160

ggctgctcac gaggctttca acatcattga agccagcagg gaaaaacgac agcttttatt 2220

ttcttatatc agcatgatca gaaccagtct gaagaatatg ggttatgtgg tgaaaggaga 2280

tcacacaccg attattcctg tagtcattgg cgatgcccat aaaacggtcc tatttgctga 2340

aaaactgcag ggcaagggaa tttatgctcc tgccattcgg ccgccaaccg ttgcgccggg 2400

tgaaagccgg attcgaatta caatcacgtc tgaccacagt atgggtgata ttgatcattt 2460

gctgcaaaca tttcattcaa tcggaaagga gctgcacatc atttgagggg tttttttgtg 2520

acgggaactg atacagaagt agggaaaacg gttatatcca gcggtcttgc tgccttattg 2580

aaagacaata atagacatgt cggggtgtat aaaccatttt taagcgggat atcgcgccat 2640

catccagata gtgatacaag tttgctgaaa gatatgtcgc agaccagtct ttctcatgaa 2700

gacattacgc cttttgcctt caaggcgccg cttgcaccat acgttgcagg gaaacttgag 2760

ggaaagactg tcaccatgga agaggtttta agccattggg ggcggattag agaaaaacat 2820

gaatgcttca tcgtagaagg tgcaggcggt atttctgtgc cattgggaga ggactatttg 2880

gtcagtcatg tcataaaagc gttgcagctt cccatgatta ttgtggcgcg tcctcgcctt 2940

ggaaccatta atcatacctt tttaactgtc aaatatgcag aaagcatggg gcttccaatc 3000

gccggaatta tcatcaatgg aatcagtgac tctcctgatg aagatgaaaa aaccaatcct 3060

gagatgattg agcgcttatg cggtgtgccg attttagggg ttacgccaaa gcttgccaac 3120

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aaagctga 4208

Claims

1.一种提高D-生物素产量的生产方法，其特征在于：

将易变假单胞菌接种于发酵培养基，于温度26℃-32℃，溶氧2%以上，初始pH6.8-7.5的条件下发酵110h-145h，收获发酵液，得到D-生物素；

所述发酵培养基的组成均为：复合碳源30 g/L -60 g/L、氮源6 g/L -39 g/L、无机盐14 g/L -36 g/L、有机酸0.1-3 g/L，余量为水；

所述复合碳源为葡萄糖和甘油；

所述易变假单胞菌为包含生物素合成基因的易变假单胞菌基因工程菌；所述葡萄糖和甘油的浓度比为（15-30）∶（15-30）；

所述易变假单胞菌基因工程菌包含生物素合成基因bioW、bioI和bioAFDB的组合；或者包含生物素合成基因bioW、bioA、bioF、bioD、bioB和bioI的组合；

所述有机酸为庚二酸。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述发酵培养基满足以下a-b中的至少一种：

a．所述氮源选自有机氮源、无机氮源或其组合；

所述有机氮源选自酵母粉、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、鱼粉、尿素中的至少一种；

所述无机氮源选自硫酸铵、氯化铵、硝酸铵中的至少一种；

b．所述无机盐选自Na₂HPO₄•12H₂O、NaH₂PO₄、K₂HPO₄•3H₂O、KH₂PO₄、ZnSO₄•7H₂O、MgSO₄•7H₂O、FeSO₄•7H₂O中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：

所述发酵培养基的组成为：葡萄糖15-30 g/L、甘油15-30 g/L、蛋白胨10-39 g/L、(NH₄)₂SO₄1-4 g/L、Na₂HPO₄•12H₂O 10-20 g/L、KH₂PO₄3-10 g/L、MgSO₄•7H₂O 0.2-1.5 g/L、FeSO₄•7H₂O 0.08-0.1 g/L、庚二酸0.1-3 g/L，余量为水。

4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：

从发酵初始至所述发酵液中的所述葡萄糖含量为0时之前的阶段，控制发酵温度为30-32℃；

当所述发酵液中的所述葡萄糖含量为0时起至发酵结束的阶段，控制发酵温度为26-29℃。

5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：

当所述发酵液中的所述葡萄糖含量为0时起至所述发酵中的所述甘油含量自然降至0.5-2.5 g/L时之前的阶段，控制发酵温度为28-29℃；

当所述发酵液中的所述甘油含量自然降至0.5-2.5 g/L时起至发酵结束的阶段，控制发酵温度为26-27℃。

6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：当所述发酵液中的所述甘油浓度降至1 g/L时，流加600-1000g/L甘油，使所述发酵液中甘油浓度在1.5 g/L。

7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于：当流加所述甘油时，同时流加乙醇，使所述发酵液中乙醇浓度在0.01 -0.5g/L。

8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于：所述乙醇的流加为以下的梯度流加：自流加所述甘油初始至第8h结束，控制所述乙醇在发酵液中的浓度≤0.05g/L；自流加所述甘油初始的第9h开始至第24h结束，控制所述乙醇在发酵液中的浓度≤0.1g/L；自流加所述甘油初始的第25h开始至第48h结束，控制所述乙醇在发酵液中的浓度≤0.3g/L；自流加所述甘油初始的第49h开始至发酵结束，控制所述乙醇在发酵液中的浓度≤0.5g/L。