JP4840847B2 - 改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ及びその利用 - Google Patents
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Description
本発明は、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ（以下、「ＤＥＲＡ」ともいう）の新規な利用形態、ＤＥＲＡの改変体（以下、「改変型ＤＥＲＡ」ともいう）及びそれをコードする核酸等、並びに改変型ＤＥＲＡのデザイン方法に関する。
２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ：ＥＣ ４．１．２．１）は解糖系酵素の一種であって、生体内ではＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒド間の可逆的アルドール反応を触媒する。
一方、ＤＥＲＡが一段階アルドール反応を触媒することが報告されている（非特許文献１（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２、２０１４−２０１６（１９９０））。この報告の中で、大腸菌由来ＤＥＲＡは、アクセプター基質としてのフェニルアルデヒドと、ドナー基質としてのアセトアルデヒドとの間のアルドール反応は触媒しない、と記載されている。このことから、大腸菌由来のＤＥＲＡは、ベンゼン環を含み疎水性が高い化合物を基質としたアルドール反応を触媒することができないものと考えられた。
一方、ＤＥＲＡが一段階アルドール反応を触媒することが報告されている（非特許文献１（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２、２０１４−２０１６（１９９０））。この報告の中で、大腸菌由来ＤＥＲＡは、アクセプター基質としてのフェニルアルデヒドと、ドナー基質としてのアセトアルデヒドとの間のアルドール反応は触媒しない、と記載されている。このことから、大腸菌由来のＤＥＲＡは、ベンゼン環を含み疎水性が高い化合物を基質としたアルドール反応を触媒することができないものと考えられた。
本発明は、ＤＥＲＡの新規な利用形態を提供すること、並びに当該新規な利用形態に好適な改変型ＤＥＲＡ及びそれをコードする核酸等を提供することを課題とする。
以上の背景の下、本発明者らは化学合成困難な化合物の合成にＤＥＲＡを利用することを試み、様々なアクセプター基質及びドナー基質を用いた合成実験を行った。その結果、驚くべきことに、アクセプター基質としてベンジルオキシアセトアルデヒドを用い、そしてドナー基質としてアセトンを用いた一段階アルドール反応をＤＥＲＡが触媒し、医農薬中間体として有用な（Ｓ）−５−ベンジルオキシ−４−ヒドロキシ−２−ペンタノン（（Ｓ）−５−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｅｎｔａｎｏｎｅ、以下、「（Ｓ）−ＢＨＰ」ともいう）を合成できることを見出した。この知見は、ベンゼン環を有し、疎水性の高い化合物をアクセプター基質とした一段階アルドール反応を大腸菌由来のＤＥＲＡが触媒し得るという、これまでの報告に照らせば予想に反する作用の発見であり、大腸菌由来のＤＥＲＡの新たな利用価値を創出する。即ち、本発明者らの当該成果によって、大腸菌由来のＤＥＲＡの用途が大幅に拡大することを期待できる。
ここで、アルドラーゼによる（Ｓ）−ＢＨＰの合成はこれまでに報告がない。（Ｓ）−ＢＨＰは生理活性などを有する化合物を合成する際の光学活性中間体として有用である。たとえば、以下の反応（Tetrahedron Lett． 33,2557-2560 （1992）を参照）によって（Ｓ）−ＢＨＰから、抗菌性化合物合成原料（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４８，５０１７−５０２２（１９８３）を参照）に用いられるキラル１，２，４−ペンタントリオールが得られる。
このように（Ｓ）−ＢＨＰは医薬中間体として有用な化合物であるが、現在一般に採用されている不斉触媒による合成では大量の触媒を要し、しかも極めて低い温度条件での反応であり（例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１、６６９−６８５（１９９９）を参照）、グリーンケミストリーの観点から問題である。そこで、温和な反応条件での（Ｓ）−ＢＨＰ製造が望まれる。本発明者らの成果によって、ＤＥＲＡを用いて（Ｓ）−ＢＨＰを合成可能なことが明らかとなり、現行の合成方法の問題を解消する途が開かれる。つまり、温和な反応条件による効率的な（Ｓ）−ＢＨＰの合成が可能となる。
ここで、アルドラーゼによる（Ｓ）−ＢＨＰの合成はこれまでに報告がない。（Ｓ）−ＢＨＰは生理活性などを有する化合物を合成する際の光学活性中間体として有用である。たとえば、以下の反応（Tetrahedron Lett． 33,2557-2560 （1992）を参照）によって（Ｓ）−ＢＨＰから、抗菌性化合物合成原料（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４８，５０１７−５０２２（１９８３）を参照）に用いられるキラル１，２，４−ペンタントリオールが得られる。
更に研究を進め、（Ｓ）−ＢＨＰの合成における、大腸菌由来のＤＥＲＡの合成活性及び立体選択性を調べたところ、改善の余地が見られた。そこで、大腸菌由来のＤＥＲＡの合成活性及び立体選択性を向上させるべく野生型酵素に変異を導入することを試みた。アミノ酸配列において変異の導入位置の決定、即ち改変型酵素のデザインにおいて独自の新規なモデリング手法を採用したところ、合成活性、立体選択性の向上した改変型酵素を複数取得することに成功した。このことは、実用化ないし工業的利用に向けて有望な改変型酵素を取得できたことを意味するだけでなく、採用したモデリング手法がＤＥＲＡの改変に有効であることを裏付けるものでもある。尚、同一の触媒機能を有するタンパク質は一般にその活性部位や基質特異性に関与する領域の位置や構造が類似していることが多い。例えば、超高熱菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘのＤＥＲＡは、アミノ酸相同性は２９％と低いが、立体構造や基質周辺のアミノ酸が類似していることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，１０７９９−１０８０６（２００３）参照）。従って、特定の大腸菌株由来のＤＥＲＡにおける特定のアミノ酸の置換の効果に関して得られた情報は、同属の大腸菌由来のＤＥＲＡについて適用できることは当然のこと、他の微生物由来のＤＥＲＡについても適用できると予想された。
尚、国際公開第０３／０７７８６８号パンフレット（特許文献１）には、デオキシリボースに対する活性を改善する目的で大腸菌由来DERAの最適化が報告されているが、（Ｓ）−ＢＨＰの合成についての言及はない。
尚、国際公開第０３／０７７８６８号パンフレット（特許文献１）には、デオキシリボースに対する活性を改善する目的で大腸菌由来DERAの最適化が報告されているが、（Ｓ）−ＢＨＰの合成についての言及はない。
本発明は主として以上の成果に基づくものであり、以下の改変型ＤＥＲＡ、改変型ＤＥＲＡをコードする遺伝子など、改変型ＤＥＲＡのデザイン方法、及びＤＥＲＡによる一段階アルドール反応を利用した化合物の合成方法を提供する。
[１] 野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列において、配列番号：１に示すアミノ酸配列の７３位、７６位、１３９位、２３８位、及び２３９位のアミノ酸からなる群より選択される一以上のアミノ酸に相当するアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、２３８位及び／又は２３９位の置換後のアミノ酸が以下の通りである、改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ：
２３８位の置換後のアミノ酸はチロシン、グリシン、アルギニン又はアラニン；
２３９位の置換後のアミノ酸はメチオニン、アスパラギン、グリシン又はロイシン。
[２] 前記野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼである、[１]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ。
[３] 前記野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列が、配列番号：１に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、[１]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ。
[４] 前記野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列が、配列番号：１に示すアミノ酸配列である、[１]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ。
[５] 配列番号：１に示すアミノ酸配列において７３位及び／又は７６位のアミノ酸が置換されており、置換後のアミノ酸が以下の通りである、[４]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ：
７３位の置換後のアミノ酸はプロリン、システイン、トレオニン、セリン又はトリプトファン；
７６位の置換後のアミノ酸はアルギニン、チロシン又はトリプトファン。
[６] 配列番号：１に示すアミノ酸配列において１３９位のアミノ酸が置換されており、置換後のアミノ酸がバリン又はメチオニンである、[４]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ。
[７] 配列番号：１に示すアミノ酸配列において２３８位及び／又は２３９位のアミノ酸が置換されており、置換後のアミノ酸が以下の通りである、[４]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ：
２３８位の置換後のアミノ酸はチロシン、グリシン、アルギニン又はアラニン；
２３９位の置換後のアミノ酸はメチオニン、アスパラギン、グリシン又はロイシン。
[８] 以下の（１）〜（１８）のいずれかのアミノ酸配列からなる、[１]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ：
（１）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換されてなるアミノ酸配列；
（２）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがシステインに置換され、７６位フェニルアラニンがアルギニンに置換されてなるアミノ酸配列；
（３）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトレオニンに置換されてなるアミノ酸配列；
（４）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトレオニンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（５）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがセリンに置換され、７６位フェニルアラニンがトリプトファンに置換されてなるアミノ酸配列；
（６）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがシステインに置換されてなるアミノ酸配列；
（７）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（８）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトリプトファンに置換され、７６位フェニルアラニンがトリプトファンに置換されてなるアミノ酸配列；
（９）配列番号：１のアミノ酸配列において、１３９位イソロイシンがバリンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１０）配列番号：１のアミノ酸配列において、１３９位イソロイシンがメチオニンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１１）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがチロシンに置換され、２３９位セリンがメチオニンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１２）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがグリシンに置換され、２３９位セリンがアスパラギンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１３）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがアルギニンに置換され、２３９位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１４）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがアラニンに置換され、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１５）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１６）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列
（１７）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換され、２３８位セリンがアルギニンに置換され、２３９位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１８）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換され、２３８位セリンがアラニンに置換され、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列。
[９] [１]〜[８]のいずれかに記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼをコードする、単離された核酸。
[１０] [９]に記載の核酸を保持するベクター。
[１１] [９]に記載の核酸を保有する形質転換体。
[１２] ベンゼン環に置換基を有するか又は無置換のベンジルオキシアセトアルデヒドからなるアクセプター基質と、炭素数３〜６のケトンからなるドナー基質とを、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼを触媒としたアルドール反応で結合させることを特徴とする、β−ケトールの合成方法。
[１３] 前記２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼが、[１]〜[８]のいずれかに記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼである、[１２]に記載の合成方法。
[１４] 前記アクセプター基質が、以下の化学式で表される化合物である、[１２]又は[１３]に記載の合成方法、
但し、式中Ｒはベンゼン環上の置換基であって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、又はシアノ基である。
[１５] 前記基質がベンジルオキシアセトアルデヒドであり、前記ドナー基質がアセトンである、[１２]又は[１３]に記載の合成方法。
[１６] ２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列における７３位のアミノ酸、７６位のアミノ酸、１３９位のアミノ酸、２３８位のアミノ酸、及び２３９位のアミノ酸からなる群より選択される一以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を構築することを特徴とする、改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのデザイン方法。
[１７] 以下のステップを含むことを特徴とする、改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのデザイン方法：
（１）２−デオキシリボース５−リン酸を基質とした場合の、触媒反応中の野生型又は改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの立体構造情報を用意するステップ；
（２）前記立体構造情報において、基質部分を２−デオキシリボース５−リン酸から目的基質に置換するステップ；
（３）野生型又は改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの分子力学計算を実施し、エネルギー最小化構造を算出するステップ；
（４）計算前後の構造を比較し、側鎖の移動が認められたアミノ酸を置換候補として選抜するステップ；
（５）野生型又は改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列において、前記選抜したアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を構築するステップ。
[１８] 前記ステップ（４）の前に、野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼを構成するアミノ酸の中より、目的基質から３Å内にあるアミノ酸を抽出し、前記ステップ（４）では抽出された該アミノ酸の中から置換候補を選抜する、[１７]に記載のデザイン方法。
[１９] 前記目的基質がβ−ケトールである、[１７]又は[１８]に記載のデザイン方法。
[１] 野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列において、配列番号：１に示すアミノ酸配列の７３位、７６位、１３９位、２３８位、及び２３９位のアミノ酸からなる群より選択される一以上のアミノ酸に相当するアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、２３８位及び／又は２３９位の置換後のアミノ酸が以下の通りである、改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ：
２３８位の置換後のアミノ酸はチロシン、グリシン、アルギニン又はアラニン；
２３９位の置換後のアミノ酸はメチオニン、アスパラギン、グリシン又はロイシン。
[２] 前記野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼである、[１]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ。
[３] 前記野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列が、配列番号：１に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、[１]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ。
[４] 前記野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列が、配列番号：１に示すアミノ酸配列である、[１]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ。
[５] 配列番号：１に示すアミノ酸配列において７３位及び／又は７６位のアミノ酸が置換されており、置換後のアミノ酸が以下の通りである、[４]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ：
７３位の置換後のアミノ酸はプロリン、システイン、トレオニン、セリン又はトリプトファン；
７６位の置換後のアミノ酸はアルギニン、チロシン又はトリプトファン。
[６] 配列番号：１に示すアミノ酸配列において１３９位のアミノ酸が置換されており、置換後のアミノ酸がバリン又はメチオニンである、[４]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ。
[７] 配列番号：１に示すアミノ酸配列において２３８位及び／又は２３９位のアミノ酸が置換されており、置換後のアミノ酸が以下の通りである、[４]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ：
２３８位の置換後のアミノ酸はチロシン、グリシン、アルギニン又はアラニン；
２３９位の置換後のアミノ酸はメチオニン、アスパラギン、グリシン又はロイシン。
[８] 以下の（１）〜（１８）のいずれかのアミノ酸配列からなる、[１]に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ：
（１）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換されてなるアミノ酸配列；
（２）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがシステインに置換され、７６位フェニルアラニンがアルギニンに置換されてなるアミノ酸配列；
（３）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトレオニンに置換されてなるアミノ酸配列；
（４）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトレオニンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（５）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがセリンに置換され、７６位フェニルアラニンがトリプトファンに置換されてなるアミノ酸配列；
（６）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがシステインに置換されてなるアミノ酸配列；
（７）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（８）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトリプトファンに置換され、７６位フェニルアラニンがトリプトファンに置換されてなるアミノ酸配列；
（９）配列番号：１のアミノ酸配列において、１３９位イソロイシンがバリンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１０）配列番号：１のアミノ酸配列において、１３９位イソロイシンがメチオニンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１１）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがチロシンに置換され、２３９位セリンがメチオニンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１２）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがグリシンに置換され、２３９位セリンがアスパラギンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１３）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがアルギニンに置換され、２３９位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１４）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがアラニンに置換され、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１５）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１６）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列
（１７）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換され、２３８位セリンがアルギニンに置換され、２３９位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１８）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換され、２３８位セリンがアラニンに置換され、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列。
[９] [１]〜[８]のいずれかに記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼをコードする、単離された核酸。
[１０] [９]に記載の核酸を保持するベクター。
[１１] [９]に記載の核酸を保有する形質転換体。
[１２] ベンゼン環に置換基を有するか又は無置換のベンジルオキシアセトアルデヒドからなるアクセプター基質と、炭素数３〜６のケトンからなるドナー基質とを、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼを触媒としたアルドール反応で結合させることを特徴とする、β−ケトールの合成方法。
[１３] 前記２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼが、[１]〜[８]のいずれかに記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼである、[１２]に記載の合成方法。
[１４] 前記アクセプター基質が、以下の化学式で表される化合物である、[１２]又は[１３]に記載の合成方法、
[１５] 前記基質がベンジルオキシアセトアルデヒドであり、前記ドナー基質がアセトンである、[１２]又は[１３]に記載の合成方法。
[１６] ２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列における７３位のアミノ酸、７６位のアミノ酸、１３９位のアミノ酸、２３８位のアミノ酸、及び２３９位のアミノ酸からなる群より選択される一以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を構築することを特徴とする、改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのデザイン方法。
[１７] 以下のステップを含むことを特徴とする、改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのデザイン方法：
（１）２−デオキシリボース５−リン酸を基質とした場合の、触媒反応中の野生型又は改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの立体構造情報を用意するステップ；
（２）前記立体構造情報において、基質部分を２−デオキシリボース５−リン酸から目的基質に置換するステップ；
（３）野生型又は改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの分子力学計算を実施し、エネルギー最小化構造を算出するステップ；
（４）計算前後の構造を比較し、側鎖の移動が認められたアミノ酸を置換候補として選抜するステップ；
（５）野生型又は改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列において、前記選抜したアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を構築するステップ。
[１８] 前記ステップ（４）の前に、野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼを構成するアミノ酸の中より、目的基質から３Å内にあるアミノ酸を抽出し、前記ステップ（４）では抽出された該アミノ酸の中から置換候補を選抜する、[１７]に記載のデザイン方法。
[１９] 前記目的基質がβ−ケトールである、[１７]又は[１８]に記載のデザイン方法。
（改変型ＤＥＲＡ）
本発明の第１の局面は改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ（改変型ＤＥＲＡ）に関する。本発明は、野生型ＤＥＲＡがベンジルオキシアセトアルデヒドとアセトン間のアルドール反応を触媒し、β−ケトールを合成する事実を見出したこと（後述の実施例を参照）、及び野生型ＤＥＲＡにおける特定のアミノ酸の置換がＤＥＲＡの合成活性及び基質特異性の向上に効果的であるとの知見（後述の実施例を参照）に基づき、β−ケトールの合成活性が野生型ＤＥＲＡよりも向上した改変型ＤＥＲＡを提供する。本発明の改変型ＤＥＲＡは、対応する野生型酵素のアミノ酸配列において特定のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する。本発明の改変型ＤＥＲＡは、典型的には、天然に存在するＤＥＲＡ、即ち野生型のＤＥＲＡにおいて一部のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって作製或いは設計される。このように本発明の改変型ＤＥＲＡの基礎となる（由来する）ＤＥＲＡのことを本明細書では「野生型ＤＥＲＡ」と表現する。また、野生型ＤＥＲＡを構成するアミノ酸の中で、置換対象となるアミノ酸（つまり、野生型ＤＥＲＡの構成アミノ酸の中で、改変型ＤＥＲＡと比較して相違が認められるもの）のことを「置換アミノ酸」又は「置換対象アミノ酸」という。
本発明の第１の局面は改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ（改変型ＤＥＲＡ）に関する。本発明は、野生型ＤＥＲＡがベンジルオキシアセトアルデヒドとアセトン間のアルドール反応を触媒し、β−ケトールを合成する事実を見出したこと（後述の実施例を参照）、及び野生型ＤＥＲＡにおける特定のアミノ酸の置換がＤＥＲＡの合成活性及び基質特異性の向上に効果的であるとの知見（後述の実施例を参照）に基づき、β−ケトールの合成活性が野生型ＤＥＲＡよりも向上した改変型ＤＥＲＡを提供する。本発明の改変型ＤＥＲＡは、対応する野生型酵素のアミノ酸配列において特定のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する。本発明の改変型ＤＥＲＡは、典型的には、天然に存在するＤＥＲＡ、即ち野生型のＤＥＲＡにおいて一部のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって作製或いは設計される。このように本発明の改変型ＤＥＲＡの基礎となる（由来する）ＤＥＲＡのことを本明細書では「野生型ＤＥＲＡ」と表現する。また、野生型ＤＥＲＡを構成するアミノ酸の中で、置換対象となるアミノ酸（つまり、野生型ＤＥＲＡの構成アミノ酸の中で、改変型ＤＥＲＡと比較して相違が認められるもの）のことを「置換アミノ酸」又は「置換対象アミノ酸」という。
野生型ＤＥＲＡの具体例としてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株が産生するＤＥＲＡを挙げることができる。当該野生型ＤＥＲＡを構成するアミノ酸配列を配列番号：１に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株が産生する野生型ＤＥＲＡの他、好適な野生型ＤＥＲＡとして、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株が産生する野生型ＤＥＲＡと高い相同性を有するＤＥＲＡを例示することができる。ここでのアミノ酸配列の相同性は８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることが更に好ましく、９５％以上であることが更に更に好ましい。例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＣＦＴＯ７３（１００％）、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７（９９％）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ｓｔｒ．３０１（９９％）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ ｓｔｒ． ＡＴＣＣ９１５０（９６％）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２（９６％）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（９４％）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ０１ ｂｉｏｖａｒ ｅｌｔｏｒ ｓｔｒ． Ｎ１６９６１（８３％）、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ＲＩＭＤ２２１０６３３（８２％）、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ＹＪ０１６（８１％）等が産生するＤＥＲＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株が産生するＤＥＲＡとアミノ酸配列の相同性が非常に高く、好適な野生型ＤＥＲＡであるといえる。尚、微生物名に続く括弧内の数字は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２由来ＤＥＲＡに対する相同性を示す。
本発明における置換対象アミノ酸は、野生型ＤＥＲＡを構成するアミノ酸配列の中で、配列番号：１に示すアミノ酸配列の７３位、７６位、１３９位、２３８位、又は２３９位のアミノ酸に相当するアミノ酸である。ここで、本明細書においてアミノ酸残基について使用する場合の用語「相当する」とは、比較されるタンパク質（酵素）間においてその機能の発揮に同等の貢献をしていることを意味し、特に基質特異性に対する貢献が同等であることを意味する。例えば、基準のアミノ酸配列（つまり配列番号：１のアミノ酸配列）に対して比較対象のアミノ酸配列を、一次構造（即ちアミノ酸配列）の部分的な相同性を考慮しつつ、最適な比較ができるように並べたときに（このときに必要に応じてギャップを導入し、アライメントを最適化してもよい）、基準のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を「相当するアミノ酸」として特定することができる。また、下記改変型DERAのデザイン方法のステップ(4)で抽出される238位及び239位、ステップ(a)で抽出される73位、76位及び139位と空間位置が同じアミノ酸も含まれる。
本発明の改変型ＤＥＲＡは、野生型ＤＥＲＡのアミノ酸配列において上記置換対象アミノ酸が一つ以上置換されたアミノ酸配列を有する。例えば、本発明の一形態では７３位の置換及び７６位の置換が行われた改変型ＤＥＲＡが提供される。また、本発明の他の一形態では２２８位の置換及び２３９位の置換が行われた改変型ＤＥＲＡが提供される。
ここで、置換後のアミノ酸の種類は特に限定されないが、例えば７３位の置換ではプロリン、システイン、トレオニン、セリン又はトリプトファン、７６位の置換ではアルギニン、チロシン又はトリプトファン、１３９位の置換ではバリン又はメチオニン、２３８位の置換ではチロシン、グリシン、アルギニン又はアラニン、２３９位の置換ではメチオニン、アスパラギン、グリシン、又はロイシンである。
本発明の改変型ＤＥＲＡの具体例として、以下のアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。これらのアミノ酸配列はいずれも、配列番号：１のアミノ酸配列（大腸菌Ｋ−１２株の野生型ＤＥＲＡのアミノ酸配列）において特定のアミノ酸配列が置換されたアミノ酸配列であり、後述の実施例に示す改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）に対応する。
（１）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１）
（２）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがシステインに置換され、７６位フェニルアラニンがアルギニンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント２）
（３）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトレオニンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント３）
（４）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトレオニンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント４）
（５）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがセリンに置換され、７６位フェニルアラニンがトリプトファンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント５）
（６）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがシステインに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント６）
（７）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント７）
（８）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトリプトファンに置換され、７６位フェニルアラニンがトリプトファンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント８）
（９）配列番号：１のアミノ酸配列において、１３９位イソロイシンがバリンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント９）
（１０）配列番号：１のアミノ酸配列において、１３９位イソロイシンがメチオニンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１０）
（１１）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがチロシンに置換され、２３９位セリンがメチオニンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１１）
（１２）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがグリシンに置換され、２３９位セリンがアスパラギンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１２）
（１３）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがアルギニンに置換され、２３９位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１３）
（１４）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがアラニンに置換され、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１４）
（１５）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１５）
（１６）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１６）
（１７）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換され、２３８位セリンがアルギニンに置換され、２３９位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１７）
（１８）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換され、２３８位セリンがアラニンに置換され、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１８）
（１）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１）
（２）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがシステインに置換され、７６位フェニルアラニンがアルギニンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント２）
（３）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトレオニンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント３）
（４）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトレオニンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント４）
（５）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがセリンに置換され、７６位フェニルアラニンがトリプトファンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント５）
（６）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがシステインに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント６）
（７）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント７）
（８）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトリプトファンに置換され、７６位フェニルアラニンがトリプトファンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント８）
（９）配列番号：１のアミノ酸配列において、１３９位イソロイシンがバリンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント９）
（１０）配列番号：１のアミノ酸配列において、１３９位イソロイシンがメチオニンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１０）
（１１）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがチロシンに置換され、２３９位セリンがメチオニンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１１）
（１２）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがグリシンに置換され、２３９位セリンがアスパラギンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１２）
（１３）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがアルギニンに置換され、２３９位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１３）
（１４）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがアラニンに置換され、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１４）
（１５）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１５）
（１６）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１６）
（１７）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換され、２３８位セリンがアルギニンに置換され、２３９位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１７）
（１８）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換され、２３８位セリンがアラニンに置換され、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列（バリアント１８）
後述の実施例に示すように、以上の改変型ＤＥＲＡでは、ベンジルオキシアセトアルデヒドをアクセプター基質とした（Ｓ）−ＢＨＰの合成において高収率が得られ、エナンチオマー過剰率（ｅｅ）も高い。特にバリアント４では９６．４％ｅｅである。
本発明の改変型ＤＥＲＡは、野生型ＤＥＲＡのアミノ酸配列において上記特定のアミノ酸置換が行われたアミノ酸配列を有することを特徴とするが、上記特定のアミノ酸置換に係る位置以外において一部のアミノ酸改変が行われていてもよい。このように本発明は、上記特定のアミノ酸置換が行われたアミノ酸配列を有する改変型ＤＥＲＡと比較した場合にその機能は同等であるものの一部においてアミノ酸配列が相違するタンパク質（以下、「相同タンパク質」ともいう）をも提供する。「一部においてアミノ酸配列が相違する」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違は、アルドール反応に関わる特性が大幅に低下しない限度において（好ましくは実質的に保持される限度において）許容される。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは例えば全アミノ酸の約30％未満に相当する数であり、好ましくは約20％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5％未満に相当する数であり、最も好ましくは約1％未満に相当する数である。即ち相同タンパク質は、上記改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）のアミノ酸配列（（１）〜（１８））のいずれかと例えば約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90％以上、より一層好ましくは約95%以上、最も好ましくは約99%以上の同一性を有する。
好ましくは、保存的アミノ酸置換をアルドール反応に関与しないアミノ酸残基に生じさせることによって相同タンパク質を得る。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパルギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
好ましくは、保存的アミノ酸置換をアルドール反応に関与しないアミノ酸残基に生じさせることによって相同タンパク質を得る。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパルギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
ここで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるという。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。あるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。同様に、ある核酸に相同的なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。
二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重＝12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重＝2、3、又は4として決定することができる。また、二つの核酸配列の相同度を、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで利用可能）のGAPプログラムを用いて、ギャップ加重＝50、ギャップ長加重＝3として決定することができる。
二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。あるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。同様に、ある核酸に相同的なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。
二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重＝12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重＝2、3、又は4として決定することができる。また、二つの核酸配列の相同度を、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで利用可能）のGAPプログラムを用いて、ギャップ加重＝50、ギャップ長加重＝3として決定することができる。
本発明の改変型ＤＥＲＡは、対応する野生型ＤＥＲＡに比してβ−ケトールの合成活性及び／又はβ−ケトールに対する立体選択性（基質特異性）が向上している。好ましい形態としては、これら二つの特性が野生型ＤＥＲＡよりも優れた改変型ＤＥＲＡが提供される。本発明の改変型ＤＥＲＡは、好ましくは、野生型ＤＥＲＡの２倍以上のβ−ケトール合成活性を有する。
本発明の改変型ＤＥＲＡは、それをコードする遺伝子を適当な発現系で発現することによって調製することができる。以下、改変型ＤＥＲＡをコードする遺伝子の調製方法、及び得られた遺伝子を用いた改変型ＤＥＲＡの調製方法の一例を説明する。
＜野生型ＤＥＲＡをコードする遺伝子の取得＞
野生型ＤＥＲＡ遺伝子はＤＥＲＡ産生菌から取得することができる。ここでのＤＥＲＡ産生菌とは、ＤＥＲＡ遺伝子を本来的に保有する菌、又はＤＥＲＡ遺伝子が外来的に導入された菌のことをいう。前者の例として大腸菌Ｋ−１２株を挙げることがき、後者の例としては大腸菌Ｋ−１２株のＤＥＲＡ遺伝子をクローニングしたベクターを保有する大腸菌株を挙げることができる。
ＤＥＲＡ遺伝子を本来的に保有する菌からＤＥＲＡ遺伝子を取得するには、例えば、当該菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＤＥＲＡ特異的なプライマーを用いたＰＣＲ等を実施すればよい。一方、ＤＥＲＡ遺伝子がクローニングされたベクターを保有する菌を利用できる場合には、常法に従って、当該菌からＤＥＲＡ遺伝子を抽出・精製することができる。
尚、大腸菌Ｋ−１２株及び大腸菌Ｋ−１２株のＤＥＲＡをクローニングしたベクターを保有する大腸菌はいずれもアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などのカルチャーコレクションより取得することができる。
＜野生型ＤＥＲＡをコードする遺伝子の取得＞
野生型ＤＥＲＡ遺伝子はＤＥＲＡ産生菌から取得することができる。ここでのＤＥＲＡ産生菌とは、ＤＥＲＡ遺伝子を本来的に保有する菌、又はＤＥＲＡ遺伝子が外来的に導入された菌のことをいう。前者の例として大腸菌Ｋ−１２株を挙げることがき、後者の例としては大腸菌Ｋ−１２株のＤＥＲＡ遺伝子をクローニングしたベクターを保有する大腸菌株を挙げることができる。
ＤＥＲＡ遺伝子を本来的に保有する菌からＤＥＲＡ遺伝子を取得するには、例えば、当該菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＤＥＲＡ特異的なプライマーを用いたＰＣＲ等を実施すればよい。一方、ＤＥＲＡ遺伝子がクローニングされたベクターを保有する菌を利用できる場合には、常法に従って、当該菌からＤＥＲＡ遺伝子を抽出・精製することができる。
尚、大腸菌Ｋ−１２株及び大腸菌Ｋ−１２株のＤＥＲＡをクローニングしたベクターを保有する大腸菌はいずれもアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などのカルチャーコレクションより取得することができる。
＜改変型ＤＥＲＡをコードするポリヌクレオチドの構築＞
以上のようにして取得された野生型ＤＥＲＡ遺伝子に対して、発現産物であるタンパク質において特定のアミノ酸が置換されるように変異を加えることにより、目的とする改変型ＤＥＲＡをコードする遺伝子を作製することができる。このような位置特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照）、その中から適切な方法を選択して用いることができる。
以上のようにして取得された野生型ＤＥＲＡ遺伝子に対して、発現産物であるタンパク質において特定のアミノ酸が置換されるように変異を加えることにより、目的とする改変型ＤＥＲＡをコードする遺伝子を作製することができる。このような位置特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照）、その中から適切な方法を選択して用いることができる。
位置特異的変異導入法として、位置特異的アミノ酸飽和変異法を採用することができる。位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造を基に、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ，ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ」手法である（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３１，５８５−５９２（２００３））。例えば、Ｑｕｉｃｋ ｃｈｅｎｇｅ（ストラタジーン社）等のキット、Ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ＰＣＲ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １６，７３５１−７３６７（１９８８））を用いて位置特異的アミノ酸飽和変異を導入することが可能である。ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼ等を用いることができる。但し、ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−（東洋紡社）、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ（ストラタジーン社）などの精度の高いＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。
一方、ＤＥＲＡ遺伝子にランダムな変異を挿入し、各変異体（改変体）の発現産物の基質特異性を比較して好ましい基質特異性を有する遺伝子を選択することによっても、改変型ＤＥＲＡをコードする遺伝子を作製することができる。このようなランダム変異を導入する場合は、まず例えばエラープロンPCRを利用して標的とする遺伝子領域にランダムに変異を導入し、改変型ＤＥＲＡ遺伝子ライブラリーを構築する。そして、得られたライブラリーより、酵素活性や基質特異性を指標としてクローンを選抜する。
（改変型ＤＥＲＡをコードする核酸など）
本発明の他の局面は、上記本発明の改変型ＤＥＲＡに関連する核酸に関する。この局面では、改変型ＤＥＲＡをコードする単離された核酸、改変型ＤＥＲＡをコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、改変型ＤＥＲＡをコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
改変型ＤＥＲＡをコードする核酸は、典型的には、改変型ＤＥＲＡの調製に利用される。改変型ＤＥＲＡをコードする核酸を用いた遺伝子工学的調製方法によれば、より均質な状態の改変型ＤＥＲＡを得ることが可能である。また、当該方法は、大量の改変型ＤＥＲＡを調製する場合にも好適な方法といえる。尚、改変型ＤＥＲＡをコードする核酸の用途は改変型ＤＥＲＡの調製に限られない。例えば、改変型ＤＥＲＡの作用機構の解明などを目的とした実験用のツールとして、或いはＤＥＲＡの更なる改変体をデザイン又は作製するためのツールとして、当該核酸を利用することもできる。
本発明の他の局面は、上記本発明の改変型ＤＥＲＡに関連する核酸に関する。この局面では、改変型ＤＥＲＡをコードする単離された核酸、改変型ＤＥＲＡをコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、改変型ＤＥＲＡをコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
改変型ＤＥＲＡをコードする核酸は、典型的には、改変型ＤＥＲＡの調製に利用される。改変型ＤＥＲＡをコードする核酸を用いた遺伝子工学的調製方法によれば、より均質な状態の改変型ＤＥＲＡを得ることが可能である。また、当該方法は、大量の改変型ＤＥＲＡを調製する場合にも好適な方法といえる。尚、改変型ＤＥＲＡをコードする核酸の用途は改変型ＤＥＲＡの調製に限られない。例えば、改変型ＤＥＲＡの作用機構の解明などを目的とした実験用のツールとして、或いはＤＥＲＡの更なる改変体をデザイン又は作製するためのツールとして、当該核酸を利用することもできる。
本明細書における用語「核酸」は、それを含むことが意図されていないことが明らかな場合を除いて、DNA（cDNA及びゲノムDNAを含む）、RNA（mRNAを含む）、DNA類似体、及びRNA類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定されず、即ち1本鎖及び2本鎖のいずれであってもよい。好ましくは2本鎖DNAである。またコドンの縮重も考慮される。即ちタンパク質をコードする核酸の場合には、その発現産物として当該タンパク質が得られる限り任意の塩基配列を有していてよい。
本明細書において「改変型ＤＥＲＡをコードする核酸」とは、それを発現させた場合に当該改変型ＤＥＲＡが得られる核酸のことをいい、当該改変型ＤＥＲＡのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸をも含む。
本明細書において用語「単離された核酸」とは、もともと天然に存在している核酸（例えば大腸菌内の核酸）の場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態の核酸をいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された核酸」の好ましい形態では、天然状態において共存する他のDNA成分（天然状態において隣接するDNA配列を含む）を実質的に含まない。
例えばcDNA分子など遺伝子組み換え技術によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、dNTPなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態の核酸をいう。
核酸がベクターや組成物の一部として存在していても又は外来性分子として細胞内に存在していても、人為的操作の結果として存在している限り「単離された核酸」である。
尚、特に言及しない限り、本明細書において単に「核酸」と記載した場合には、単離された状態の核酸を意味する。
核酸がベクターや組成物の一部として存在していても又は外来性分子として細胞内に存在していても、人為的操作の結果として存在している限り「単離された核酸」である。
尚、特に言及しない限り、本明細書において単に「核酸」と記載した場合には、単離された状態の核酸を意味する。
本発明の核酸は好ましい態様として以下の配列を有する。これらの塩基配列は、後述の実施例に示す改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）をコードする核酸である。
（１）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、プロリンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１）
（２）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、システインをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、アルギニンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント２）
（３）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、トレオニンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント３）
（４）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、トレオニンをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、チロシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント４）
（５）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、セリンをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、トリプトファンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント５）
（６）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、システインをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント６）
（７）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、プロリンをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、チロシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント７）
（８）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、トリプトファンをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、トリプトファンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント８）
（９）配列番号：２の塩基配列において、１３９位イソロイシンをコードする部分が、バリンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント９）
（１０）配列番号：２の塩基配列において、１３９位イソロイシンをコードする部分が、メチオニンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１０）
（１１）配列番号：２の塩基配列において、２３８位セリンをコードする部分が、チロシンをコードする塩基に置換され、２３９位セリンをコードする部分が、メチオニンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１１）
（１２）配列番号：２の塩基配列において、２３８位セリンをコードする部分が、グリシンをコードする塩基に置換され、２３９位セリンをコードする部分が、アスパラギンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１２）
（１３）配列番号：２の塩基配列において、２３８位セリンをコードする部分が、アルギニンをコードする塩基に置換され、２３９位セリンをコードする部分が、グリシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１３）
（１４）配列番号：２の塩基配列において、２３８位セリンをコードする部分が、アラニンをコードする塩基に置換され、２３９位セリンをコードする部分が、ロイシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１４）
（１５）配列番号：２の塩基配列において、２３９位セリンをコードする部分が、ロイシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１５）
（１６）配列番号：２の塩基配列において、２３８位セリンをコードする部分が、グリシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１６）
（１７）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、プロリンをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、チロシンをコードする塩基に置換され、２３８位セリンをコードする部分が、アルギニンをコードする塩基に置換され、２３９位セリンをコードする部分が、グリシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１７）
（１８）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、プロリンをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、チロシンをコードする塩基に置換され、２３８位セリンをコードする部分が、アラニンをコードする塩基に置換され、２３９位セリンをコードする部分が、ロイシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１８）
（１）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、プロリンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１）
（２）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、システインをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、アルギニンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント２）
（３）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、トレオニンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント３）
（４）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、トレオニンをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、チロシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント４）
（５）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、セリンをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、トリプトファンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント５）
（６）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、システインをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント６）
（７）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、プロリンをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、チロシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント７）
（８）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、トリプトファンをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、トリプトファンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント８）
（９）配列番号：２の塩基配列において、１３９位イソロイシンをコードする部分が、バリンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント９）
（１０）配列番号：２の塩基配列において、１３９位イソロイシンをコードする部分が、メチオニンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１０）
（１１）配列番号：２の塩基配列において、２３８位セリンをコードする部分が、チロシンをコードする塩基に置換され、２３９位セリンをコードする部分が、メチオニンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１１）
（１２）配列番号：２の塩基配列において、２３８位セリンをコードする部分が、グリシンをコードする塩基に置換され、２３９位セリンをコードする部分が、アスパラギンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１２）
（１３）配列番号：２の塩基配列において、２３８位セリンをコードする部分が、アルギニンをコードする塩基に置換され、２３９位セリンをコードする部分が、グリシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１３）
（１４）配列番号：２の塩基配列において、２３８位セリンをコードする部分が、アラニンをコードする塩基に置換され、２３９位セリンをコードする部分が、ロイシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１４）
（１５）配列番号：２の塩基配列において、２３９位セリンをコードする部分が、ロイシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１５）
（１６）配列番号：２の塩基配列において、２３８位セリンをコードする部分が、グリシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１６）
（１７）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、プロリンをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、チロシンをコードする塩基に置換され、２３８位セリンをコードする部分が、アルギニンをコードする塩基に置換され、２３９位セリンをコードする部分が、グリシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１７）
（１８）配列番号：２の塩基配列において、７３位バリンをコードする部分が、プロリンをコードする塩基に置換され、７６位フェニルアラニンをコードする部分が、チロシンをコードする塩基に置換され、２３８位セリンをコードする部分が、アラニンをコードする塩基に置換され、２３９位セリンをコードする部分が、ロイシンをコードする塩基に置換されてなる塩基配列（バリアント１８）
本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。
本発明の他の態様では、上記改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）をコードする核酸（（１）〜（１８））のいずれかの塩基配列と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸（以下、「相同核酸」ともいう。また、相同核酸を規定する塩基配列を「相同塩基配列」ともいう）が提供される。相同核酸の例として、上記改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）をコードする核酸（（１）〜（１８））のいずれかの塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、かつβ−ケトールの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。
以上のような相同核酸は例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などによって得られる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同核酸を得ることができる。
以上のような相同核酸は例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などによって得られる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同核酸を得ることができる。
本発明の他の態様は、上記改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）をコードする核酸（（１）〜（１８））のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸に関する。本発明の更に他の態様は、上記改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）をコードする核酸（（１）〜（１８））のいずれかの塩基配列、或いはこれらいずれかに相補的な塩基配列に対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%同一な塩基配列を有する核酸を提供する。
本発明の更に別の態様は、上記改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）をコードする核酸（（１）〜（１８））のいずれかの塩基配列又はその相同塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸に関する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
本発明の更に他の態様は、上記改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）をコードする核酸（（１）〜（１８））のいずれかの塩基配列、或いはこれらいずれかに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（核酸断片）を提供する。このような核酸断片は、上記改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）をコードする核酸（（１）〜（１８））のいずれかの塩基配列を有する核酸など本発明の核酸を検出、同定、及び／又は増幅することなどに用いることができる。核酸断片は例えば、上記改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）をコードする核酸（（１）〜（１８））のいずれかの塩基配列において連続するヌクレオチド部分（例えば約10〜約100塩基長、好ましくは約20〜約100塩基長、更に好ましくは約30〜約100塩基長）にハイブリダイズする部分を少なくとも含むように設計される。
プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
本発明のさらに他の局面は、本発明の核酸（改変型ＤＥＲＡ又はその一部或いはそれらの相同体をコードする核酸）を含有するベクターに関する。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）を含む。
使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
宿主細胞としては、取り扱いの容易さの点から、大腸菌などの細菌細胞を用いることが好ましい。
本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
宿主細胞としては、取り扱いの容易さの点から、大腸菌などの細菌細胞を用いることが好ましい。
本発明の他の局面は、本発明の核酸が導入された宿主細胞（即ち形質転換体）に関する。本発明の形質転換体は、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得ることができる。トランスフェクション等はリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))等によって実施することができる。
本発明の形質転換体は、本発明の改変型ＤＥＲＡを生産することに利用することができる。即ち、本発明の他の局面は、上記形質転換体を用いた、本発明の改変型ＤＥＲＡの生産方法を提供する。本発明の生産方法は、上記形質転換体を本発明の改変型ＤＥＲＡが産生される条件下で培養するステップを少なくとも含む。通常はこのステップに加えて、産生されたタンパク質を回収（分離及び精製）するステップが実施される。
形質転換体の培養に使用する培地の栄養源としては、形質転換体の培養に通常用いられるものを使用することができる。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
形質転換体の培養に使用する培地の栄養源としては、形質転換体の培養に通常用いられるものを使用することができる。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
形質転換体が生育可能であって且つ改変型ＤＥＲＡが産生される温度条件で形質転換体の培養が行われる。例えば、３０℃〜４０℃の範囲内（好ましくは３７℃付近）に培養温度を設定することができる。培養時間は、培養対象の形質転換体の生育特性や改変型ＤＥＲＡの産生特性などを考慮して設定することができる。培地のｐＨは、形質転換体が生育し且つＤＥＲＡが産生される範囲内に調製される。好ましくは培地のｐＨを６．０〜９．０程度（好ましくはｐＨ７．０付近）とする。
改変型ＤＥＲＡを生産する菌体を含む培養液をそのまま、或いは濃縮、不純物の除去などを経た後に酵素溶液として利用することもできるが、一般的には培養液又は菌体より改変型ＤＥＲＡを一旦回収する。産生される改変型ＤＥＲＡが分泌型タンパク質であれば培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して不溶物を除去した後、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを利用した塩析、メタノールやエタノール又はアセトンなどによる分別沈殿法、透析、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過や吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー（例えば、セファデックス（Sephadex）ゲル（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、DEAEセファロースCL-6B （ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースCL-6B （ファルマシアバイオテク）、CMセファロースCL-6B（ファルマシアバイオテク））などを組み合わせて分離、精製を行ことにより改変型ＤＥＲＡの精製品を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、培養液をろ過、遠心処理等することによって菌体を採取し、次いで菌体を加圧処理、超音波処理などの機械的方法またはリゾチームなどによる酵素的方法で破壊した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより改変型ＤＥＲＡの精製品を得ることができる。
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥や真空乾燥或いはスプレードライなどにより粉末化して提供することも可能である。その際、精製酵素を予めリン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、トリス塩酸緩衝液やGOODの緩衝液に溶解させておいてもよい。好ましくは、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液を使用することができる。尚、ここでGOODの緩衝液としてはPIPES、MES又はMOPSが挙げられる。
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥や真空乾燥或いはスプレードライなどにより粉末化して提供することも可能である。その際、精製酵素を予めリン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、トリス塩酸緩衝液やGOODの緩衝液に溶解させておいてもよい。好ましくは、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液を使用することができる。尚、ここでGOODの緩衝液としてはPIPES、MES又はMOPSが挙げられる。
（ＤＥＲＡを触媒としたβ−ケトールの合成方法）
本発明は他の局面として、ＤＥＲＡを触媒としたβ−ケトールの合成方法を提供する。本発明の合成方法では、アクセプター基質としてベンゼン環に置換基を有するか又は無置換のベンジルオキシアセトアルデヒド（以下の化学式）を使用し、ドナー基質として炭素数３〜６のケトンを用い、ＤＥＲＡを触媒としたアルドール反応で両者を結合させることでβ−ケトールを合成する。尚、アクセプター基質に対してドナー基質を０．５〜１０等量添加して反応を行うことが好ましい。また、水に溶解しない基質の場合は、乳化剤としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等を使用することが好ましい。
但し、式中Ｒはベンゼン環上の置換基であって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、又はシアノ基である。
本発明は他の局面として、ＤＥＲＡを触媒としたβ−ケトールの合成方法を提供する。本発明の合成方法では、アクセプター基質としてベンゼン環に置換基を有するか又は無置換のベンジルオキシアセトアルデヒド（以下の化学式）を使用し、ドナー基質として炭素数３〜６のケトンを用い、ＤＥＲＡを触媒としたアルドール反応で両者を結合させることでβ−ケトールを合成する。尚、アクセプター基質に対してドナー基質を０．５〜１０等量添加して反応を行うことが好ましい。また、水に溶解しない基質の場合は、乳化剤としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等を使用することが好ましい。
本発明の好ましい態様では、以下に示すベンジルオキシアセトアルデヒドがアクセプター基質として用いられる。
一方、ドナー基質については好ましくはアセトンが用いられる。ドナー基質としてアセトンを用いたβ−ケトールの合成反応を以下に示す。
但し、式中Ｒはベンゼン環上の置換基であって、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、又はシアノ基である。
本発明の最も好ましい態様では、以下の反応式に示すように、ベンジルオキシアセトアルデヒドとアセトンを用いた一段階アルドール反応によって光学活性な５−ベンジルオキシ−４−ヒドロキシ−２−ペンタノン（（Ｓ）−ＢＨＰ）が合成される。
本発明の合成方法ではＤＥＲＡを触媒として用いるが、ＤＥＲＡは野生型であっても改変型であってもよい。好ましくは本発明の改変型ＤＥＲＡを触媒として用いる。本発明の改変型ＤＥＲＡを用いることによって高収量が望める。また、後述の実施例で明らかなように一部の改変型ＤＥＲＡでは、対応する野生型ＤＥＲＡよりも高いエナンチオマー過剰率（ｅｅ）が得られる。従って、改変型ＤＥＲＡを用いることは立体選択性の点からも好ましい。
この反応は、トリス塩酸緩衝液やトリエタノールアミン緩衝液等の緩衝液中に、基質であるベンジルオキシアセトアルデヒド及びアセトンを溶解又は分散した状態で行う事ができる。ここで、緩衝液の水素イオン濃度（ｐＨ）は例えば３〜１２であり、好ましくは５〜９である。
この反応では、基質の前記緩衝液への溶解性を高めるために、メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の水と相溶性を有する有機溶媒を添加することもできる。これらの有機溶媒の使用量は、前記緩衝液に対して０．０１〜３０重量％であることが好ましい。
また、この反応は、トルエン、ジエチルエーテル、ヘキサンや、酢酸エチル等の水と相溶性を有しない有機溶媒と前記緩衝液を用いて２相系で反応を行うことも可能であり、更には、これらの有機溶媒中で、前記緩衝液を用いることなく反応を行うこともできる。
この反応では、基質の前記緩衝液への溶解性を高めるために、メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の水と相溶性を有する有機溶媒を添加することもできる。これらの有機溶媒の使用量は、前記緩衝液に対して０．０１〜３０重量％であることが好ましい。
また、この反応は、トルエン、ジエチルエーテル、ヘキサンや、酢酸エチル等の水と相溶性を有しない有機溶媒と前記緩衝液を用いて２相系で反応を行うことも可能であり、更には、これらの有機溶媒中で、前記緩衝液を用いることなく反応を行うこともできる。
本発明に使用されるベンジルオキシアセトアルデヒド（前記（化３））は、市販のものを使用することができるが、（特開２０００−２９０２１４号公報）に記載の方法に従って２−ベンジルオキシエタノールを酸化することによって製造することも出来る。
ベンジルオキシアセトアルデヒド（前記（化３））の反応液中の濃度は、特に制限されないが、通常、０．０１〜２０重量％が好ましい。
また、アセトンとしては、市販のものを使用することができる。アセトンの使用量は、ベンジルオキシアセトアルデヒド１モルに対して０．５〜２０モルであり、好ましくは２〜１０モルである。
ベンジルオキシアセトアルデヒド（前記（化３））の反応液中の濃度は、特に制限されないが、通常、０．０１〜２０重量％が好ましい。
また、アセトンとしては、市販のものを使用することができる。アセトンの使用量は、ベンジルオキシアセトアルデヒド１モルに対して０．５〜２０モルであり、好ましくは２〜１０モルである。
この反応の基質であるベンジルオキシアセトアルデヒド（式（１））及びアセトンの添加方法は、特に限定されず、一括或いは分割して添加することができる。またこれらの基質は、水又は前記有機溶媒に予め溶解して添加することもできる。
この反応の反応温度は、使用するアルドラーゼの熱安定性により異なるが、通常１〜８０℃である。
この反応で製造される５−ベンジルオキシ−４−ヒドロキシ−２−ペンタノン（（Ｓ）−ＢＨＰ）の単離・精製は、抽出、蒸留或いはカラムクロマトグラフィー等の公知の方法により行うことができる。
この反応の反応温度は、使用するアルドラーゼの熱安定性により異なるが、通常１〜８０℃である。
この反応で製造される５−ベンジルオキシ−４−ヒドロキシ−２−ペンタノン（（Ｓ）−ＢＨＰ）の単離・精製は、抽出、蒸留或いはカラムクロマトグラフィー等の公知の方法により行うことができる。
（改変型ＤＥＲＡのデザイン方法）
本発明はさらに他の局面として改変型ＤＥＲＡのデザイン方法を提供する。本発明のデザイン方法によって得られる構造情報を基にして、改変型ＤＥＲＡを製造（調製）することができる。
本発明は大別して２種類のデザイン方法を提供する。第１のデザイン方法は、野生型ＤＥＲＡに対して特定のアミノ酸置換を行うことにより収量や基質特異性の向上ができたという事実に基づくものであり、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列における７３位のアミノ酸、７６位のアミノ酸、１３９位のアミノ酸、２３８位のアミノ酸、及び２３９位のアミノ酸からなる群より選択される一以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することを特徴とする。
一方、本発明の第２のデザイン方法は、改変型ＤＥＲＡを取得する際に本発明者らが採用した手法の有効性が実験的に確認されたことに基づき、コンピュータ上でのモデリング手法を含む。具体的には、以下のステップ（１）〜（５）を含むことを特徴とする。
（１）２−デオキシリボース５−リン酸（以下、「２ＤＲ５Ｐ」ともいう）を基質とした場合の、触媒反応中の野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの立体構造情報を用意するステップ。
（２）前記立体構造情報において、基質部分を２−デオキシリボース５−リン酸から目的基質に置換するステップ。
（３）野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの主鎖を固定し、側鎖のみ振動する条件で分子力学計算を実施し、エネルギー最小化構造を算出するステップ。
（４）計算前後の構造を比較し、側鎖の移動が認められたアミノ酸を置換候補として選抜するステップ。
（５）野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列において、前記選抜したアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を構築するステップ。
本発明はさらに他の局面として改変型ＤＥＲＡのデザイン方法を提供する。本発明のデザイン方法によって得られる構造情報を基にして、改変型ＤＥＲＡを製造（調製）することができる。
本発明は大別して２種類のデザイン方法を提供する。第１のデザイン方法は、野生型ＤＥＲＡに対して特定のアミノ酸置換を行うことにより収量や基質特異性の向上ができたという事実に基づくものであり、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列における７３位のアミノ酸、７６位のアミノ酸、１３９位のアミノ酸、２３８位のアミノ酸、及び２３９位のアミノ酸からなる群より選択される一以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することを特徴とする。
一方、本発明の第２のデザイン方法は、改変型ＤＥＲＡを取得する際に本発明者らが採用した手法の有効性が実験的に確認されたことに基づき、コンピュータ上でのモデリング手法を含む。具体的には、以下のステップ（１）〜（５）を含むことを特徴とする。
（１）２−デオキシリボース５−リン酸（以下、「２ＤＲ５Ｐ」ともいう）を基質とした場合の、触媒反応中の野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの立体構造情報を用意するステップ。
（２）前記立体構造情報において、基質部分を２−デオキシリボース５−リン酸から目的基質に置換するステップ。
（３）野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの主鎖を固定し、側鎖のみ振動する条件で分子力学計算を実施し、エネルギー最小化構造を算出するステップ。
（４）計算前後の構造を比較し、側鎖の移動が認められたアミノ酸を置換候補として選抜するステップ。
（５）野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列において、前記選抜したアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を構築するステップ。
ステップ（１）では、本来の基質である２−デオキシリボース５−リン酸に対して作用するときの野生型ＤＥＲＡの立体構造情報を取得する。野生型ＤＥＲＡの立体構造情報は例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（http://www.pdbj.org/index_j.html）より取得することができる。野生型ＤＥＲＡの由来は特に限定されず、例えば大腸菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株）由来の野生型ＤＥＲＡの立体構造情報（例えば、１JCL）を取得する。
立体構造情報を取得した後、基質と活性中心アミノ酸（１６７位のリジン）を抽出しておくとよい。
立体構造情報を取得した後、基質と活性中心アミノ酸（１６７位のリジン）を抽出しておくとよい。
ステップ（２）では基質の書き換え（置換）を行う。即ち、本来の基質である２−デオキシリボース５−リン酸から目的基質へと書き換える。例えば、ステップ（１）において複合体の立体構造の情報を取得することにし、ステップ（２）では複合体の立体構造情報から基質部分の情報を削除した後、目的基質の立体構造情報を適用する。ここで、目的基質に関して分子力学計算を実施し、得られたエネルギー最小化構造を適用することが好ましい。ステップ（４）で、初期構造とエネルギー最小化構造との基質を含めた3次元位置比較を行うためである。
目的基質の例として各種β−ケトール（例えば（Ｓ）−ＢＨＰ）を挙げることができる。
目的基質の例として各種β−ケトール（例えば（Ｓ）−ＢＨＰ）を挙げることができる。
ステップ（３）では、目的基質と野生型ＤＥＲＡとの複合体全体に関して分子力学計算を実施し、エネルギー最小化構造を算出する。分子力学計算は、野生型ＤＥＲＡの主鎖を固定し、側鎖のみ振動する条件で実施することが好ましい。基質近傍のアミノ酸最適化により、目的基質への選択性向上を目標としている。そこで、基質近傍の空間に着目するため、側鎖のみ振動する条件で算出を行う。
ステップ（４）では、ステップ（３）の分子力学計算前後の構造を比較する。即ち、エネルギー最小化が行われる前の野生型ＤＥＲＡの構造と、エネルギー最小化が行われた野生型ＤＥＲＡの構造とを比較する。その結果、野生型ＤＥＲＡの構成アミノ酸の中で、エネルギー最小化前後で側鎖の移動が認められたアミノ酸を置換候補として選抜する。ここで、目的基質を（Ｓ）−ＢＨＰに設定した場合は、（Ｓ）−ＢＨＰのベンゼン環に面する親水領域のアミノ酸の内、計算前後で側鎖の移動が認められたアミノ酸を置換候補として選抜するとよい。側鎖の移動は、立体配置に影響のある部分を示しており、該当アミノ酸の置換により、目的基質への最適化できる可能性がある。
ステップ（４）の前に、野生型ＤＥＲＡを構成するアミノ酸の中より、目的基質から３Å内にあるアミノ酸を抽出することにし、ステップ（４）では抽出されたアミノ酸の中から置換候補を選抜することが好ましい。このように、基質に対して直接作用し得るアミノ酸を予め抽出することにすれば、有効に作用する置換候補を効率的に選抜できる。
ステップ（５）では、野生型ＤＥＲＡのアミノ酸配列において、ステップ（４）で選抜されたアミノ酸を他のアミノ酸に置換する。このようにして、野生型ＤＥＲＡのアミノ酸配列の中で特定のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を構築し、改変型ＤＥＲＡを構成するアミノ酸配列とする。
ここで、本来の基質２ＤＲ５Ｐに対するＤＥＲＡの反応でのドナー基質はアセトアルデヒドであり、一方で本発明における、ＤＥＲＡによる一段階アルドール反応でのドナー基質はケトン（通常はアセトン）である。従って、両反応のドナー基質を比較すれば、水素原子からメチル基への変化が認められる。本発明の一態様では、この変化に注目し、一段階アルドール反応に対する触媒能の高い改変型ＤＥＲＡをデザインするため、ステップ（２）〜（４）、好ましくはステップ（４）に代えて、又はこれらのステップに加えて以下のステップ（ａ）を実施する。
（ａ）野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの構成アミノ酸の中で、目的基質であるβ−ケトールの末端メチル基周辺に位置するアミノ酸を置換候補として選抜するステップ。
具体的には例えば、目的基質を（Ｓ）−ＢＨＰに設定した場合、酵素の活性中心アミノ酸近傍に位置することとなる、（Ｓ）−ＢＨＰの末端メチル基に面する疎水性アミノ酸を置換候補として選抜するとよい。
尚、このステップ（ａ）の前においても、野生型ＤＥＲＡを構成するアミノ酸の中より、目的基質から３Å内にあるアミノ酸を抽出することにし、ステップ（ａ）では抽出されたアミノ酸の中から置換候補を選抜することが好ましい。
（ａ）野生型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの構成アミノ酸の中で、目的基質であるβ−ケトールの末端メチル基周辺に位置するアミノ酸を置換候補として選抜するステップ。
具体的には例えば、目的基質を（Ｓ）−ＢＨＰに設定した場合、酵素の活性中心アミノ酸近傍に位置することとなる、（Ｓ）−ＢＨＰの末端メチル基に面する疎水性アミノ酸を置換候補として選抜するとよい。
尚、このステップ（ａ）の前においても、野生型ＤＥＲＡを構成するアミノ酸の中より、目的基質から３Å内にあるアミノ酸を抽出することにし、ステップ（ａ）では抽出されたアミノ酸の中から置換候補を選抜することが好ましい。
以上のデザイン方法は、例えばソフトウエアＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（アクセリス社製）用いて行うことができ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ３モジュールを利用して分子力学計算によるエネルギー最小化構造の算出をすることができる。
（活性測定方法）
本発明において「アルドラーゼ活性」とは、２−デオキシリボース５−リン酸（２ＤＲ５Ｐ）をＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドに分解する活性をいう。アルドラーゼ活性の測定方法は、既報の方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２５，５６１−５６６（１９８２）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７，３３３３−３３３９（１９９５））に準ずる。アルドラーゼ活性の測定方法の原理、使用する試薬、及び測定条件を以下に示す。
＜測定原理＞
ＤＥＲＡによる２ＤＲ５Ｐの分解反応によって生じるアセトアルデヒドをアルコール脱水素酵素でエタノールに変換させる。この時共役して減少するＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型）の量から２ＤＲ５Ｐ分解活性を算出する。
＜試薬＞
活性測定液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ ２ＤＲ５Ｐ、２００Ｕ出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来アルコールデヒドロゲナーゼ（シグマ社）、０．１ｍＭ ＮＡＤＨ
＜測定条件＞
１ｍｌの活性測定液に酵素液を添加し、４０℃でのＮＡＤＨの減少に伴う波長３４０nmの吸収度の減少を２分間測定する。１分間当たり１μmolのＮＡＤＨを減少させる酵素量を酵素活性の１単位（Ｕ）とする。尚、ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおけるミリモル吸光係数は６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１とする。
本発明において「アルドラーゼ活性」とは、２−デオキシリボース５−リン酸（２ＤＲ５Ｐ）をＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドに分解する活性をいう。アルドラーゼ活性の測定方法は、既報の方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２５，５６１−５６６（１９８２）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７，３３３３−３３３９（１９９５））に準ずる。アルドラーゼ活性の測定方法の原理、使用する試薬、及び測定条件を以下に示す。
＜測定原理＞
ＤＥＲＡによる２ＤＲ５Ｐの分解反応によって生じるアセトアルデヒドをアルコール脱水素酵素でエタノールに変換させる。この時共役して減少するＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型）の量から２ＤＲ５Ｐ分解活性を算出する。
＜試薬＞
活性測定液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ ２ＤＲ５Ｐ、２００Ｕ出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来アルコールデヒドロゲナーゼ（シグマ社）、０．１ｍＭ ＮＡＤＨ
＜測定条件＞
１ｍｌの活性測定液に酵素液を添加し、４０℃でのＮＡＤＨの減少に伴う波長３４０nmの吸収度の減少を２分間測定する。１分間当たり１μmolのＮＡＤＨを減少させる酵素量を酵素活性の１単位（Ｕ）とする。尚、ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおけるミリモル吸光係数は６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１とする。
尚、特に記載のない限り、本明細書における遺伝子工学的操作は例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或いはCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参考にして行うことができる。
１．野生型ＤＥＲＡによる（Ｓ）−ＢＨＰの合成
２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）の新規な用途を見出すべく、様々なアクセプター基質及びドナー基質を用いた合成反応系におけるＤＥＲＡの触媒活性を網羅的に検索した。具体的には下記実施例記載の大腸菌Ｋ−１２株由来のＤＥＲＡ凍結乾燥粉末を用い、トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．３）中で、０．５Ｍアセトン及び０．０５Ｍ各種アルデヒドを加え、触媒活性を検討した。検索の結果、驚くべきことにベンジルオキシアセトアルデヒドをアクセプター基質とし、アセトンをドナー基質とした一段階アルドール反応による（Ｓ）−ＢＨＰの合成をＤＥＲＡが触媒することを見出した。これまでに大腸菌由来のＤＥＲＡが一段階アルドール反応を触媒するという報告はあるものの、一方でフェニルアルデヒドとアセトアルデヒドとを結合する反応を触媒しないという報告があることから、大腸菌由来のＤＥＲＡは、ベンゼン環を含み疎水性が高い化合物を基質としたアルドール反応を触媒することができないものと予想された。本発明者らが見出した上記合成反応はこの予想に反するものであり、ＤＥＲＡの新規な用途を提供する。
本発明者らの検討した結果、以下の条件で反応させることによって９５％の合成収率、約８０％のエナンチオマー過剰率で（Ｓ）−ＢＨＰを合成できることが明らかとなった。
（１）反応液組成
０．５Ｍアセトン及び０．０５Ｍベンジルオキシアセトアルデヒドを含有する２００ｍｌの緩衝液（0.1M トリエタノールアミン pH7.3 (1mM EDTAを含む)）
（２）酵素量
大腸菌Ｋ−１２株由来のＤＥＲＡを３０００Ｕ
（３）反応温度
３０℃
（４）反応時間
７２時間
２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）の新規な用途を見出すべく、様々なアクセプター基質及びドナー基質を用いた合成反応系におけるＤＥＲＡの触媒活性を網羅的に検索した。具体的には下記実施例記載の大腸菌Ｋ−１２株由来のＤＥＲＡ凍結乾燥粉末を用い、トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．３）中で、０．５Ｍアセトン及び０．０５Ｍ各種アルデヒドを加え、触媒活性を検討した。検索の結果、驚くべきことにベンジルオキシアセトアルデヒドをアクセプター基質とし、アセトンをドナー基質とした一段階アルドール反応による（Ｓ）−ＢＨＰの合成をＤＥＲＡが触媒することを見出した。これまでに大腸菌由来のＤＥＲＡが一段階アルドール反応を触媒するという報告はあるものの、一方でフェニルアルデヒドとアセトアルデヒドとを結合する反応を触媒しないという報告があることから、大腸菌由来のＤＥＲＡは、ベンゼン環を含み疎水性が高い化合物を基質としたアルドール反応を触媒することができないものと予想された。本発明者らが見出した上記合成反応はこの予想に反するものであり、ＤＥＲＡの新規な用途を提供する。
本発明者らの検討した結果、以下の条件で反応させることによって９５％の合成収率、約８０％のエナンチオマー過剰率で（Ｓ）−ＢＨＰを合成できることが明らかとなった。
（１）反応液組成
０．５Ｍアセトン及び０．０５Ｍベンジルオキシアセトアルデヒドを含有する２００ｍｌの緩衝液（0.1M トリエタノールアミン pH7.3 (1mM EDTAを含む)）
（２）酵素量
大腸菌Ｋ−１２株由来のＤＥＲＡを３０００Ｕ
（３）反応温度
３０℃
（４）反応時間
７２時間
２．改変型ＤＥＲＡの調製
２−１．大腸菌由来アルドラーゼ遺伝子の取得
Ｃｈｅｎらの報告（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４、７４１−７４８（１９９２））に引用されているＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２由来ＤＥＲＡ遺伝子をクローニングしたベクター（ｐＢＲ３２２／ｄｅｒａと呼ぶ）を保有するＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８６９６３株を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。
ＬＢ液体培地（ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％（ｐＨ７．０））にＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８６９６３株を接種し、３７℃、１８時間振とう培養した。培養液を遠心し、沈澱として湿菌体を得た。湿菌体より、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ（プロメガ社）キットを用いてプラスミドベクターｐＢＲ３２２／ｄｅｒａを精製した。
２−１．大腸菌由来アルドラーゼ遺伝子の取得
Ｃｈｅｎらの報告（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４、７４１−７４８（１９９２））に引用されているＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２由来ＤＥＲＡ遺伝子をクローニングしたベクター（ｐＢＲ３２２／ｄｅｒａと呼ぶ）を保有するＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８６９６３株を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。
ＬＢ液体培地（ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％（ｐＨ７．０））にＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８６９６３株を接種し、３７℃、１８時間振とう培養した。培養液を遠心し、沈澱として湿菌体を得た。湿菌体より、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ（プロメガ社）キットを用いてプラスミドベクターｐＢＲ３２２／ｄｅｒａを精製した。
２−２．大腸菌由来ＤＥＲＡ遺伝子のクローニング
精製したｐＢＲ３２２／ｄｅｒａよりＤＥＲＡ遺伝子をＰＣＲにて増幅し、発現ベクターｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトＨｉｎｄ ＩＩＩからＥｃｏＲＩにクローニングした。
ＤＥＲＡ遺伝子末端の上流にＨｉｎｄＩＩＩおよび下流にＥｃｏＲＩリンカーを付与したプライマー（pUC18EcoRI-Fプライマー、pUC18HindIII-RVプライマー）を用いてＰＣＲを行い、目的断片を増幅した。ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を使用し、以下の手順でＰＣＲを行った。即ち、緩衝液を５μｌ、２５ｍＭに調整した硫酸マグネシウムを２μｌ、各２ｍＭに調整したｄＮＴＰ混合溶液を５μｌ、１０μＭに調整した上記プライマーＤＮＡを各々１．５μｌ、ｐＢＲ３２２／ｄｅｒａ １ｎｇ、前記ＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加え、全量を５０μｌに調整した。市販の温度サイクリング装置（Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ タカラ社）にて９４℃で２分反応させた後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で６０秒からなる温度サイクルを２５回行った。
反応終了後の反応液をアガロースゲル電気泳動に供して分離した後、目的の断片を切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｇｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて遺伝子を精製した。
pUC18EcoRI-Fプライマー：5'-GGGGAATTCGATGACTGATCTGA（配列番号：３）
pUC18HindIII-RVプライマー：5'-GGGAAGCTTTTAGTAGCTGC（配列番号：４）
精製したｐＢＲ３２２／ｄｅｒａよりＤＥＲＡ遺伝子をＰＣＲにて増幅し、発現ベクターｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトＨｉｎｄ ＩＩＩからＥｃｏＲＩにクローニングした。
ＤＥＲＡ遺伝子末端の上流にＨｉｎｄＩＩＩおよび下流にＥｃｏＲＩリンカーを付与したプライマー（pUC18EcoRI-Fプライマー、pUC18HindIII-RVプライマー）を用いてＰＣＲを行い、目的断片を増幅した。ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を使用し、以下の手順でＰＣＲを行った。即ち、緩衝液を５μｌ、２５ｍＭに調整した硫酸マグネシウムを２μｌ、各２ｍＭに調整したｄＮＴＰ混合溶液を５μｌ、１０μＭに調整した上記プライマーＤＮＡを各々１．５μｌ、ｐＢＲ３２２／ｄｅｒａ １ｎｇ、前記ＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加え、全量を５０μｌに調整した。市販の温度サイクリング装置（Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ タカラ社）にて９４℃で２分反応させた後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で６０秒からなる温度サイクルを２５回行った。
反応終了後の反応液をアガロースゲル電気泳動に供して分離した後、目的の断片を切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｇｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて遺伝子を精製した。
pUC18EcoRI-Fプライマー：5'-GGGGAATTCGATGACTGATCTGA（配列番号：３）
pUC18HindIII-RVプライマー：5'-GGGAAGCTTTTAGTAGCTGC（配列番号：４）
得られた遺伝子を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ（いずれもＮＥＢ社）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行い目的の断片を上記と同様に精製した。ｐＵＣ１８（東洋紡社）を同制限酵素で処理し、上記の遺伝子とライゲーションを行った。得られた組換えプラスミド（以下、ｐＵＣ１８／ｄｅｒａと呼ぶ）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ JM１０９を形質転換し、ＬＢ平板寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍＭＩＰＴＧ：イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、４０μｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含有する）に塗布した。ついで寒天培地を３７℃に静置し、培養した。生育した大腸菌コロニーのうち、白色コロニーを選抜した。
白色コロニーをＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）に接種し、上記と同様にプラスミドｐＵＣ１８／ｄｅｒａを精製した。精製したプラスミドを用いて以下の手順で塩基配列を決定した。まず、M１３ユニバーサルプライマー（M13 M４プライマー（配列番号：５）又はM13 RVプライマー（配列番号：６）（タカラ社））及びビックダイターミネーターサイクルシーケンシングキット（パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ社）を用いて目的の遺伝子を増幅した。次いでＡＢＩ ＰＩＳＭ ３１０ジェネティックアナライザー（パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を解析した。
得られた配列データを解析し、インサートが配列番号：２の大腸菌由来遺伝子配列に一致する事を確認した。つまり、インサートの塩基配列が、配列番号X03224としてGenBank、EMBAL等のデータベースに公開されているＤＥＲＡ（遺伝子名deoC）遺伝子配列と一致した。
M13 M４プライマー；5’-GTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号：５）
M13 RVプライマー；5’-CAGGAAACAGCATTGAC（配列番号：６）
白色コロニーをＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）に接種し、上記と同様にプラスミドｐＵＣ１８／ｄｅｒａを精製した。精製したプラスミドを用いて以下の手順で塩基配列を決定した。まず、M１３ユニバーサルプライマー（M13 M４プライマー（配列番号：５）又はM13 RVプライマー（配列番号：６）（タカラ社））及びビックダイターミネーターサイクルシーケンシングキット（パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ社）を用いて目的の遺伝子を増幅した。次いでＡＢＩ ＰＩＳＭ ３１０ジェネティックアナライザー（パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を解析した。
得られた配列データを解析し、インサートが配列番号：２の大腸菌由来遺伝子配列に一致する事を確認した。つまり、インサートの塩基配列が、配列番号X03224としてGenBank、EMBAL等のデータベースに公開されているＤＥＲＡ（遺伝子名deoC）遺伝子配列と一致した。
M13 M４プライマー；5’-GTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号：５）
M13 RVプライマー；5’-CAGGAAACAGCATTGAC（配列番号：６）
２−３．ｐＵＣ１８／ｄｅｒａ組換え菌の培養
ｐＵＣ１８／ｄｅｒａ組換え大腸菌の培養は、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ培地（トリプトン１．２％，酵母エキス２．４％、グリセロール４０ｍｌ／ｌ、リン酸２水素カリウム０．２３１％、リン酸水素２カリウム１．２５４％（リン酸は別途滅菌処理を行う））２０ｍｌに、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）上に生育させたコロニーを植菌し、３７℃で１８時間振とう培養した。本培養液を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ培地１０００ｍｌに加え、３７℃で、ＯＤ６６０＝０．６になるまで培養した後、終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、さらに６時間培養した。培養終了後、遠心分離（５０００ｇ、１０分）により集菌し、０．８５％ＮａＣｌで洗菌し、さらに遠心処理を行い湿菌体を得た。
酵素の粗精製はＷｏｎｇら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，７４１−７４８（１９９２））の報告を参考に行った。湿菌体重の５倍量の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ含有）に懸濁させ、超音波破砕後、遠心分離し、上清を回収した。上清に１％（ｗ／ｖ）ストレプトマイシン硫酸塩を加えて２０分間放置した後、遠心分離し、核酸を沈澱画分として取り除いた。得られた上清に硫酸アンモニウムを加え、３０から８０％（ｗ／ｖ）で沈澱する画分を遠心分離して得た。得られた沈澱に上記緩衝液を加えて懸濁した後、透析チューブ（和光純薬社）に移し、蒸留水に対して透析を行った。透析後、液体窒素にて予備凍結を行い、続いて凍結乾燥機（東京理化器械社）にて凍結乾燥を行い、粗酵素粉末を得た。
ｐＵＣ１８／ｄｅｒａ組換え大腸菌の培養は、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ培地（トリプトン１．２％，酵母エキス２．４％、グリセロール４０ｍｌ／ｌ、リン酸２水素カリウム０．２３１％、リン酸水素２カリウム１．２５４％（リン酸は別途滅菌処理を行う））２０ｍｌに、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）上に生育させたコロニーを植菌し、３７℃で１８時間振とう培養した。本培養液を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ培地１０００ｍｌに加え、３７℃で、ＯＤ６６０＝０．６になるまで培養した後、終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、さらに６時間培養した。培養終了後、遠心分離（５０００ｇ、１０分）により集菌し、０．８５％ＮａＣｌで洗菌し、さらに遠心処理を行い湿菌体を得た。
酵素の粗精製はＷｏｎｇら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，７４１−７４８（１９９２））の報告を参考に行った。湿菌体重の５倍量の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ含有）に懸濁させ、超音波破砕後、遠心分離し、上清を回収した。上清に１％（ｗ／ｖ）ストレプトマイシン硫酸塩を加えて２０分間放置した後、遠心分離し、核酸を沈澱画分として取り除いた。得られた上清に硫酸アンモニウムを加え、３０から８０％（ｗ／ｖ）で沈澱する画分を遠心分離して得た。得られた沈澱に上記緩衝液を加えて懸濁した後、透析チューブ（和光純薬社）に移し、蒸留水に対して透析を行った。透析後、液体窒素にて予備凍結を行い、続いて凍結乾燥機（東京理化器械社）にて凍結乾燥を行い、粗酵素粉末を得た。
２−４．２ＤＲ５Ｐ分解活性の測定
ＤＥＲＡによる２ＤＲ５Ｐの分解反応によって生じるアセトアルデヒドをアルコール脱水素酵素でエタノールに変換させることとし、この時共役して減少するＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型）の量から２ＤＲ５Ｐ分解活性を算出した。
活性測定液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ ２ＤＲ５Ｐ、２００Ｕ出芽酵母由来アルコールデヒドロゲナーゼ（シグマ社）、０．１ｍＭ ＮＡＤＨ）に酵素液を加え１ｍｌとし、４０℃でのＮＡＤＨの減少に伴う波長３４０nmの吸収度の減少を２分間測定した。４０℃で１分間当たり１μmolのＮＡＤＨを減少させる酵素量を酵素活性の１単位（U）と定義した。尚、ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおけるミリモル吸光係数は６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１とした。
ＤＥＲＡによる２ＤＲ５Ｐの分解反応によって生じるアセトアルデヒドをアルコール脱水素酵素でエタノールに変換させることとし、この時共役して減少するＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型）の量から２ＤＲ５Ｐ分解活性を算出した。
活性測定液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ ２ＤＲ５Ｐ、２００Ｕ出芽酵母由来アルコールデヒドロゲナーゼ（シグマ社）、０．１ｍＭ ＮＡＤＨ）に酵素液を加え１ｍｌとし、４０℃でのＮＡＤＨの減少に伴う波長３４０nmの吸収度の減少を２分間測定した。４０℃で１分間当たり１μmolのＮＡＤＨを減少させる酵素量を酵素活性の１単位（U）と定義した。尚、ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおけるミリモル吸光係数は６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１とした。
２−５． ラセミ体ＢＨＰ合成標品の作製
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８、４３２２−４３４３（１９９６）を参照し、以下の反応でラセミ体の合成標品を作製した。
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８、４３２２−４３４３（１９９６）を参照し、以下の反応でラセミ体の合成標品を作製した。
ベンジルオキシアセトアルデヒド（ｂｅｎｚｙｌｏｘｙａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ） ３g及びイソプロピニルオキシＴＭＳ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｎｙｌｏｘｙＴＭＳ） ２．６ｇを１００ｍｌ塩化メチレンに溶解した。得られた溶液に−７８℃、アルゴン雰囲気下でボロントリフルオリドジエチルエチレート（ｂｏｒｏｎ ｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄｅ−ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒａｔｅ）を滴下した。１０分間撹拌後、飽和炭酸ナトリウム溶液５０ｍｌを加え、室温まで昇温した。反応溶媒を酢酸エチルで抽出(150ml×3)し、飽和食塩水による洗浄、及び無水硫酸マグネシウムによる乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトにて精製(展開溶媒 トルエン/酢酸エチル=４/１)し、ＢＨＰ(1.2g、収率29%)を得た。
文献値（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１、６６９−６８５（１９９９））
1H NMR(400MHz CDCl3)：δ7.34(m,5H),4.57(d,J=12.2Hz, 1H), 4.54(d,J=12.2Hz, 1H),4.23(quintet,J=5.6Hz, 1H),3.49(dd,J=4.6, 9.6Hz, 1H),3.44(dd,J=6.0, 9.6Hz, 1H), 2.99(br s, 1H),2.69(dd,J=7.3, 17.0Hz, 1H),2.63(dd,J=4.4, 17.1Hz, 1H),2.18(s, 3H, Me)
文献値（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１、６６９−６８５（１９９９））
1H NMR(400MHz CDCl3)：δ7.34(m,5H),4.57(d,J=12.2Hz, 1H), 4.54(d,J=12.2Hz, 1H),4.23(quintet,J=5.6Hz, 1H),3.49(dd,J=4.6, 9.6Hz, 1H),3.44(dd,J=6.0, 9.6Hz, 1H), 2.99(br s, 1H),2.69(dd,J=7.3, 17.0Hz, 1H),2.63(dd,J=4.4, 17.1Hz, 1H),2.18(s, 3H, Me)
２−６．ＢＨＰの合成収量の評価
化合物の検出及び定量は、ガスクロマトグラフを用いて下記の条件にて行った。上記ラセミ合成標品のガスクロマトグラフチャートを図１に示す。
機器：島津社 ＧＣ−１７００
カラム:ＤＢ−１（１５ｍ×０．５３ｍｍ ID、Ｊ＆Ｗ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＩＮＣ)
カラム温度：２００℃（４分）
インジェクション温度：２５０℃
検出器温度：２９０℃
線速度：３０ｍ／ｓ
検出：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）
化合物の検出及び定量は、ガスクロマトグラフを用いて下記の条件にて行った。上記ラセミ合成標品のガスクロマトグラフチャートを図１に示す。
機器：島津社 ＧＣ−１７００
カラム:ＤＢ−１（１５ｍ×０．５３ｍｍ ID、Ｊ＆Ｗ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＩＮＣ)
カラム温度：２００℃（４分）
インジェクション温度：２５０℃
検出器温度：２９０℃
線速度：３０ｍ／ｓ
検出：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）
２−７．ＢＨＰの光学純度の測定方法
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１、６６９−６８５（１９９９）に従い、下記条件下、ＨＰＬＣを用いて化合物の光学純度を測定した。上記ラセミ合成標品のＨＰＬＣチャートを図２に示す。
ポンプ：島津社 ＬＣ−１０ＡＤ
移動相：ｎ−ヘキサン/イソプロパノール＝９５／５
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬＬ ＯＪ ０．４６ｃｍ×２５ｃｍ（ダイセル社）
カラム温度：４０℃
検出：島津社 ＳＰＤ−１０Ａ、２１０ｎｍ
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１、６６９−６８５（１９９９）に従い、下記条件下、ＨＰＬＣを用いて化合物の光学純度を測定した。上記ラセミ合成標品のＨＰＬＣチャートを図２に示す。
ポンプ：島津社 ＬＣ−１０ＡＤ
移動相：ｎ−ヘキサン/イソプロパノール＝９５／５
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬＬ ＯＪ ０．４６ｃｍ×２５ｃｍ（ダイセル社）
カラム温度：４０℃
検出：島津社 ＳＰＤ−１０Ａ、２１０ｎｍ
２−８．アルドラーゼ酵素のタンパク質立体構造の取得と変異位置の決定
大腸菌由来ＤＥＲＡの立体構造が既に報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，３６９−３７４，（２００１））。Protein Data Bank（http://www.pdbj.org/index_j.html）より該当する立体構造データ（PDB ID :1JCJ）を取得した。立体構造中の基質２ＤＲ５Ｐを（Ｓ）−ＢＨＰに置換した。基質置換後の立体構造において、InsightII（Accelrys社）を用いた分子力学法（力場：ＣＶＦＦ、タンパク主鎖固定）による計算を実施し、エネルギー最小化構造を算出した（図３を参照）。計算結果を基にして以下の通り変異位置を決定した。
（１）基質（Ｓ）−ＢＨＰから３Å以内における、計算前後のタンパク立体構造の変化より、基質のベンゼン環付近に配置されるアミノ酸に注目し、２３８位セリン及び２３９位セリンを変異位置として選抜した（図４を参照）。
（２）活性中心（１０２位アスパラギン、１６７位リジン、２０１位リジン）近傍に配置されることとなる、基質（Ｓ）−ＢＨＰの末端メチル基を取り囲むアミノ酸に注目し、７３位バリン、７６位フェニルアラニン、１３９位イソロイシンを変異位置として選抜した（図４を参照）。
大腸菌由来ＤＥＲＡの立体構造が既に報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，３６９−３７４，（２００１））。Protein Data Bank（http://www.pdbj.org/index_j.html）より該当する立体構造データ（PDB ID :1JCJ）を取得した。立体構造中の基質２ＤＲ５Ｐを（Ｓ）−ＢＨＰに置換した。基質置換後の立体構造において、InsightII（Accelrys社）を用いた分子力学法（力場：ＣＶＦＦ、タンパク主鎖固定）による計算を実施し、エネルギー最小化構造を算出した（図３を参照）。計算結果を基にして以下の通り変異位置を決定した。
（１）基質（Ｓ）−ＢＨＰから３Å以内における、計算前後のタンパク立体構造の変化より、基質のベンゼン環付近に配置されるアミノ酸に注目し、２３８位セリン及び２３９位セリンを変異位置として選抜した（図４を参照）。
（２）活性中心（１０２位アスパラギン、１６７位リジン、２０１位リジン）近傍に配置されることとなる、基質（Ｓ）−ＢＨＰの末端メチル基を取り囲むアミノ酸に注目し、７３位バリン、７６位フェニルアラニン、１３９位イソロイシンを変異位置として選抜した（図４を参照）。
２−９．２３８位、２３９位のアミノ酸飽和変異導入
Ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ＰＣＲ法を利用した位置特異的アミノ酸飽和変異導入により、野生型ＤＥＲＡの２３８位及び２３９位のアミノ酸置換を試みた。尚、位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造より、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ，ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ」手法として知られ、酵素の機能改変に利用されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３１，５８５−５９２（２００３））。
Ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ＰＣＲ法を利用した位置特異的アミノ酸飽和変異導入により、野生型ＤＥＲＡの２３８位及び２３９位のアミノ酸置換を試みた。尚、位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造より、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ，ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ」手法として知られ、酵素の機能改変に利用されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３１，５８５−５９２（２００３））。
まず、ＰＣＲで変異導入用断片１（上流側断片）及び変異導入用断片２（変異部分を含む下流側断片）を作製した。各断片の作製に使用したプライマーセットは次の通りである。
（変異導入用断片１を増幅させるプライマーセット１）
M１３ RVプライマー：5’-CAGGAAACAGCATTGAC（配列番号：６）
238&239_RVプライマー：5'-AGCGCCAAAGCGGTAGTGACGC（配列番号：８）
（変異導入用断片２を増幅させるプライマーセット２）
M１３ M４プライマー：5’- GTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号：５）
238&239_Fプライマー：5'-GTCACTACCGCTTTGGCGCTNNSNNSCTGCTGGCAAGCCTGCTGAA（配列番号：７）
（変異導入用断片１を増幅させるプライマーセット１）
M１３ RVプライマー：5’-CAGGAAACAGCATTGAC（配列番号：６）
238&239_RVプライマー：5'-AGCGCCAAAGCGGTAGTGACGC（配列番号：８）
（変異導入用断片２を増幅させるプライマーセット２）
M１３ M４プライマー：5’- GTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号：５）
238&239_Fプライマー：5'-GTCACTACCGCTTTGGCGCTNNSNNSCTGCTGGCAAGCCTGCTGAA（配列番号：７）
各ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとしてｐＵＣ１８／ｄｅｒａを使用した。また、サーマルサイクルは、９４℃で２分間反応させた後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で６０秒からなる反応サイクルを２５回行うこととした。尚、言及しない条件は上記（２−２．の欄）と同様とした。
得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動に供し、精製した。尚、精製操作は上記（２−２．の欄）と同様とした。
次いで、得られた変異導入用断片１及び２をプライマーとして用いてＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ＰＣＲを行い、２３８位アミノ酸及び２３９位アミノ酸を変異位置とした改変型ＤＥＲＡ遺伝子を取得した。反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を使用し、以下の手順で行った。即ち、緩衝液を２．５μｌ、２５ｍＭの硫酸マグネシウムを１μｌ、各２ｍＭのｄＮＴＰ混合溶液を２．５μｌ、変異導入用断片１及び２をそれぞれ１ｎｇ、前記ＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ加えて、全量を２５μｌに調整した。市販の温度サイクリング装置（Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ タカラ製）にて９４℃で２分間反応させた後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で６０秒からなる反応サイクルを合計１０回行った。
反応終了後、さらに下記の反応液を加えて、ＰＣＲを実施した。即ち、緩衝液を２．５μｌ、２５ｍＭの硫酸マグネシウムを１μｌ、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合溶液を２．５μｌ、１０μＭに調整したM13 M4プライマー（配列番号：５）及びM13 RVプライマー（配列番号：６）を各１．５μｌ、前記ＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ加えて、追加する反応液量を２５μｌに調整した。市販の温度サイクリング装置（Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ タカラ社）にて９４℃で２分間反応させた後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で６０秒からなる反応サイクルを合計２０回行った。
得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動に供し、目的の遺伝子を抽出・精製した。抽出・精製した遺伝子を上記と同様に制限酵素処理し、ｐＵＣ１８の該当するクローニングサイトにクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄｅｒａ２３８＆２３９を得た。当該ベクターを用いて、上記と同様に大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２３８位アミノ酸及び２３９位アミノ酸を変異位置とした改変型ＤＥＲＡライブラリーを構築した。
次いで、得られた変異導入用断片１及び２をプライマーとして用いてＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ＰＣＲを行い、２３８位アミノ酸及び２３９位アミノ酸を変異位置とした改変型ＤＥＲＡ遺伝子を取得した。反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を使用し、以下の手順で行った。即ち、緩衝液を２．５μｌ、２５ｍＭの硫酸マグネシウムを１μｌ、各２ｍＭのｄＮＴＰ混合溶液を２．５μｌ、変異導入用断片１及び２をそれぞれ１ｎｇ、前記ＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ加えて、全量を２５μｌに調整した。市販の温度サイクリング装置（Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ タカラ製）にて９４℃で２分間反応させた後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で６０秒からなる反応サイクルを合計１０回行った。
反応終了後、さらに下記の反応液を加えて、ＰＣＲを実施した。即ち、緩衝液を２．５μｌ、２５ｍＭの硫酸マグネシウムを１μｌ、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合溶液を２．５μｌ、１０μＭに調整したM13 M4プライマー（配列番号：５）及びM13 RVプライマー（配列番号：６）を各１．５μｌ、前記ＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ加えて、追加する反応液量を２５μｌに調整した。市販の温度サイクリング装置（Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ タカラ社）にて９４℃で２分間反応させた後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で６０秒からなる反応サイクルを合計２０回行った。
得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動に供し、目的の遺伝子を抽出・精製した。抽出・精製した遺伝子を上記と同様に制限酵素処理し、ｐＵＣ１８の該当するクローニングサイトにクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄｅｒａ２３８＆２３９を得た。当該ベクターを用いて、上記と同様に大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２３８位アミノ酸及び２３９位アミノ酸を変異位置とした改変型ＤＥＲＡライブラリーを構築した。
２−１０．７３位及び７６位のアミノ酸飽和変異導入
２３８位アミノ酸及び２３９位アミノ酸を変異位置とした場合と同様の手順で、７３位及び７６位を対象としたアミノ酸飽和変異導入を実施した。但し、７３位及び７６位に特異的に変異を導入するための断片（変異導入用断片１及び２）の作製には以下のプライマーセットを用いた。
（変異導入用断片１を増幅させるプライマーセット１）
M１３ RVプライマー：5’-CAGGAAACAGCATTGAC（配列番号：６）
73&76_RVプライマー：5’- CGTAGCGATACGGATTTCC（配列番号：１０）
（変異導入用断片２を増幅させるプライマーセット２）
M１３ M４プライマー：5’- GTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号：５）
73&76_Fプライマー：5’-GGAAATCCGTATCGCTACGNNSACCAACNNSCCACACGGTAACGACGACA（配列番号：９）
２３８位アミノ酸及び２３９位アミノ酸を変異位置とした場合と同様の手順で、７３位及び７６位を対象としたアミノ酸飽和変異導入を実施した。但し、７３位及び７６位に特異的に変異を導入するための断片（変異導入用断片１及び２）の作製には以下のプライマーセットを用いた。
（変異導入用断片１を増幅させるプライマーセット１）
M１３ RVプライマー：5’-CAGGAAACAGCATTGAC（配列番号：６）
73&76_RVプライマー：5’- CGTAGCGATACGGATTTCC（配列番号：１０）
（変異導入用断片２を増幅させるプライマーセット２）
M１３ M４プライマー：5’- GTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号：５）
73&76_Fプライマー：5’-GGAAATCCGTATCGCTACGNNSACCAACNNSCCACACGGTAACGACGACA（配列番号：９）
得られた遺伝子を上記（２−９．の欄）と同様にクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄｅｒａ７３＆７６を得た。当該ベクターで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、７３位アミノ酸及び７６位アミノ酸を変異位置とした改変型ＤＥＲＡライブラリーを得た。
２−１１．１３９位のアミノ酸飽和変異導入
２３８位アミノ酸及び２３９位アミノ酸を変異位置とした場合と同様の手順で、１３９位を対象としたアミノ酸飽和変異導入を実施した。但し、１３９位に特異的に変異を導入するための断片（変異導入用断片１及び２）の作製には以下のプライマーセットを用いた。
（変異導入用断片１を増幅させるプライマーセット１）
M１３ RVプライマー；5’-CAGGAAACAGCATTGAC（配列番号：６）
139_Rプライマー、5’-CACTTTCAGCAGTACATTCG（配列番号：１２）
（変異導入用断片２を増幅させるプライマーセット２）
M１３ M４プライマー；5’- GTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号：５）
139_Fプライマー、5'-CGAATGTACTGCTGAAAGTGNNSATCGAAACCGGCGAACTGAA（配列番号：１１）
２３８位アミノ酸及び２３９位アミノ酸を変異位置とした場合と同様の手順で、１３９位を対象としたアミノ酸飽和変異導入を実施した。但し、１３９位に特異的に変異を導入するための断片（変異導入用断片１及び２）の作製には以下のプライマーセットを用いた。
（変異導入用断片１を増幅させるプライマーセット１）
M１３ RVプライマー；5’-CAGGAAACAGCATTGAC（配列番号：６）
139_Rプライマー、5’-CACTTTCAGCAGTACATTCG（配列番号：１２）
（変異導入用断片２を増幅させるプライマーセット２）
M１３ M４プライマー；5’- GTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号：５）
139_Fプライマー、5'-CGAATGTACTGCTGAAAGTGNNSATCGAAACCGGCGAACTGAA（配列番号：１１）
一方、鋳型ＤＮＡとして、ｐＵＣ１８／ｄｅｒａを用いて行った。得られた遺伝子を上記と同様にクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄｅｒａ１３９を得た。当該ベクターで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１３９位アミノ酸を変異位置とした改変型ＤＥＲＡライブラリーを得た。
２−１２．７３位及び７６位変異と、２３８位及び２３９位変異との変異交配
２３８位アミノ酸及び２３９位アミノ酸を変異位置とした場合と同様の手順で、７３位及び／又は７６位変異ＤＥＲＡ（バリアント１〜８）と、２３８位及び／又は２３９位変異ＤＥＲＡ（バリアント１１〜１６）との変異組み合わせを実施した。但し、７３位及び／又は７６位に変異含む遺伝子断片、２３８位及び／又は２３９位に変位を含む変位断片（それぞれ変異組合せ用断片１及び２）の作製には以下のプライマーセットを用いた。
２３８位アミノ酸及び２３９位アミノ酸を変異位置とした場合と同様の手順で、７３位及び／又は７６位変異ＤＥＲＡ（バリアント１〜８）と、２３８位及び／又は２３９位変異ＤＥＲＡ（バリアント１１〜１６）との変異組み合わせを実施した。但し、７３位及び／又は７６位に変異含む遺伝子断片、２３８位及び／又は２３９位に変位を含む変位断片（それぞれ変異組合せ用断片１及び２）の作製には以下のプライマーセットを用いた。
（変異組合せ用断片１を増幅させるプライマーセット１、鋳型：バリアント１〜８）
M１３ RVプライマー：5’-CAGGAAACAGCATTGAC（配列番号：６）
alover-R1プライマー：5’-ACGGTTTTTTCTACGCCCAT（配列番号：１３）
M１３ RVプライマー：5’-CAGGAAACAGCATTGAC（配列番号：６）
alover-R1プライマー：5’-ACGGTTTTTTCTACGCCCAT（配列番号：１３）
（変異組合せ用断片２を増幅させるプライマーセット２：バリアント１１〜１６）
alover-F1プライマー：5’-ATGATGGAAGTGATCCGTGA（配列番号：１４）
M１３ M４プライマー：5’- GTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号：５）
alover-F1プライマー：5’-ATGATGGAAGTGATCCGTGA（配列番号：１４）
M１３ M４プライマー：5’- GTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号：５）
得られた遺伝子を上記（２−９．の欄）と同様にクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄｅｒａ７３＆７６＆２３８＆２３９を得た。当該ベクターで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、７３位アミノ酸、７６位アミノ酸、２３８位アミノ酸、及び２３９位アミノ酸を変異位置とした改変型ＤＥＲＡライブラリーを得た。
２−１３．改変型酵素のスクリーニング方法
50μg/mlアンピシリン含有LB平板寒天培地上に生育した大腸菌（改変型ＤＥＲＡライブラリー）を１ｍｌの培地（Terrific broth（50μg/ml アンピシリン、0.1mM IPTG含有））を加えた48穴培養プレート（日本ジェネティクス社）に接種した。接種した培養プレートを37℃恒温槽中で振盪培養した。培養開始18時間後に培養液を100μl、96wellマイクロプレートに分注し、分光計（テカン社）にて濁度を測定した（波長620nm）。残りの培養液を遠心(5000g、20分)して上清を取り除き、沈澱として菌体を得た。集菌した湿菌体に100μl CellLytic（SIGMA社）を加え溶菌し、粗酵素溶液とした。
新たな48穴培養プレートに粗酵素液（25μl）、緩衝液(100mM Bis-Tris pH7.3 1mM EDTA含有)、基質（１００μｌ ＤＭＳＯに、２５０μｍｏｌアセトン及び２５μｍｏｌベンジルオキシアセトアルデヒドを溶解）を加え、24時間、30℃にて振盪させて反応を行った。反応終了後、50μlの5N塩酸および、3mlのアセトン（内部標準0.75mg/ml 3’,4’-dimethoxyacetophenoneを含む）を加えた。混合後、プレートを遠心し、上清をガスクロマトグラフ分析（２−６．の欄を参照）及びHPLC分析（２−７．の欄を参照）に供試した。これらの分析結果より、合成活性が高く且つ基質選択性にも優れた改変型ＤＥＲＡを産生する菌株を特定した。
以上のスクリーニングの結果得られた改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）を図５の表に示す。この表に示すように、合成効率が高く、且つ立体選択性にも優れた改変型ＤＥＲＡを合計１８種類、取得することに成功した。これらのバリアントはいずれも、野生型に比較して収率が向上している。また多くのバリアントではエナンチオマー過剰率の向上も認められる。この結果から、７３位、７６位、１３９位、２３８位、及び２３９位のアミノ酸置換がＤＥＲＡの特性の改善に有効であることがわかる。一方、バリアント１〜４はエナンチオマー過剰率が９０％以上であり、しかも収率が野生型よりも大幅に向上している。この結果から７３位及び７６位の置換が特に有効であるといえる。
50μg/mlアンピシリン含有LB平板寒天培地上に生育した大腸菌（改変型ＤＥＲＡライブラリー）を１ｍｌの培地（Terrific broth（50μg/ml アンピシリン、0.1mM IPTG含有））を加えた48穴培養プレート（日本ジェネティクス社）に接種した。接種した培養プレートを37℃恒温槽中で振盪培養した。培養開始18時間後に培養液を100μl、96wellマイクロプレートに分注し、分光計（テカン社）にて濁度を測定した（波長620nm）。残りの培養液を遠心(5000g、20分)して上清を取り除き、沈澱として菌体を得た。集菌した湿菌体に100μl CellLytic（SIGMA社）を加え溶菌し、粗酵素溶液とした。
新たな48穴培養プレートに粗酵素液（25μl）、緩衝液(100mM Bis-Tris pH7.3 1mM EDTA含有)、基質（１００μｌ ＤＭＳＯに、２５０μｍｏｌアセトン及び２５μｍｏｌベンジルオキシアセトアルデヒドを溶解）を加え、24時間、30℃にて振盪させて反応を行った。反応終了後、50μlの5N塩酸および、3mlのアセトン（内部標準0.75mg/ml 3’,4’-dimethoxyacetophenoneを含む）を加えた。混合後、プレートを遠心し、上清をガスクロマトグラフ分析（２−６．の欄を参照）及びHPLC分析（２−７．の欄を参照）に供試した。これらの分析結果より、合成活性が高く且つ基質選択性にも優れた改変型ＤＥＲＡを産生する菌株を特定した。
以上のスクリーニングの結果得られた改変型ＤＥＲＡ（バリアント１〜１８）を図５の表に示す。この表に示すように、合成効率が高く、且つ立体選択性にも優れた改変型ＤＥＲＡを合計１８種類、取得することに成功した。これらのバリアントはいずれも、野生型に比較して収率が向上している。また多くのバリアントではエナンチオマー過剰率の向上も認められる。この結果から、７３位、７６位、１３９位、２３８位、及び２３９位のアミノ酸置換がＤＥＲＡの特性の改善に有効であることがわかる。一方、バリアント１〜４はエナンチオマー過剰率が９０％以上であり、しかも収率が野生型よりも大幅に向上している。この結果から７３位及び７６位の置換が特に有効であるといえる。
ここで、バリアント１やバリアント７では７３位のアミノ酸がプロリンに置換されている。野生型ＤＥＲＡの７３位のアミノ酸はバリンであるから、７３位のコドンがＧＴＡからＣＣＣに置換されたことになる。つまり、３塩基置換が生じた結果としてこれらの改変型ＤＥＲＡが得られた。このような置換は位置特異的アミノ酸飽和変異の実施によって可能になるものであり、エラープロンＰＣＲ等によるランダム変異では連続した２塩基以上の変異導入は困難である。このように、少なくとも一部の改変型ＤＥＲＡについては、アミノ酸置換の導入方法として位置特異的アミノ酸飽和変異を採用することによってはじめて獲得できたものであるといえる。
本発明によれば、野生型酵素のアミノ酸配列の一部が置換された改変型ＤＥＲＡが提供される。本発明の改変型ＤＥＲＡはベンジルオキシアセトアルデヒドをアクセプター基質とする一段階アルドール反応に関して優れた触媒能を発揮する。本発明の改変型ＤＥＲＡは、β−ケトールの合成用触媒として好適に利用することができる。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (7)
- 以下の（１）〜（１８）のいずれかのアミノ酸配列からなる、改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ：
（１）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換されてなるアミノ酸配列；
（２）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがシステインに置換され、７６位フェニルアラニンがアルギニンに置換されてなるアミノ酸配列；
（３）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトレオニンに置換されてなるアミノ酸配列；
（４）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトレオニンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（５）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがセリンに置換され、７６位フェニルアラニンがトリプトファンに置換されてなるアミノ酸配列；
（６）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがシステインに置換されてなるアミノ酸配列；
（７）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（８）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがトリプトファンに置換され、７６位フェニルアラニンがトリプトファンに置換されてなるアミノ酸配列；
（９）配列番号：１のアミノ酸配列において、１３９位イソロイシンがバリンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１０）配列番号：１のアミノ酸配列において、１３９位イソロイシンがメチオニンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１１）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがチロシンに置換され、２３９位セリンがメチオニンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１２）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがグリシンに置換され、２３９位セリンがアスパラギンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１３）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがアルギニンに置換され、２３９位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１４）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがアラニンに置換され、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１５）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１６）配列番号：１のアミノ酸配列において、２３８位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１７）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換され、２３８位セリンがアルギニンに置換され、２３９位セリンがグリシンに置換されてなるアミノ酸配列；
（１８）配列番号：１のアミノ酸配列において、７３位バリンがプロリンに置換され、７６位フェニルアラニンがチロシンに置換され、２３８位セリンがアラニンに置換され、２３９位セリンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列。 - 請求項１に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼをコードする、単離された核酸。
- 請求項２に記載の核酸を保持するベクター。
- 請求項２に記載の核酸を保有する形質転換体（但し、ヒトを宿主とした形質転換によって得られるものを除く）。
- ベンゼン環に置換基を有するか又は無置換のベンジルオキシアセトアルデヒドからなるアクセプター基質と、炭素数３〜６のケトンからなるドナー基質とを、請求項１に記載の改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼを触媒としたアルドール反応で結合させることを特徴とする、β−ケトールの合成方法。
- 前記アクセプター基質が、以下の化学式で表される化合物である、請求項５に記載の合成方法、
- 前記基質がベンジルオキシアセトアルデヒドであり、前記ドナー基質がアセトンである、請求項５又は６に記載の合成方法。
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