JP2022512839A - モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその応用 - Google Patents
モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその応用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022512839A JP2022512839A JP2021523213A JP2021523213A JP2022512839A JP 2022512839 A JP2022512839 A JP 2022512839A JP 2021523213 A JP2021523213 A JP 2021523213A JP 2021523213 A JP2021523213 A JP 2021523213A JP 2022512839 A JP2022512839 A JP 2022512839A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tyrosine
- mutation
- proline
- leucine
- pet
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 title claims abstract description 70
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 324
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 306
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 306
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 306
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 237
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 232
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 230
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 230
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 230
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 225
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 225
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 220
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 184
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 claims description 98
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 98
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims description 98
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 78
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 claims description 78
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 78
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 78
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 75
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 73
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 67
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 67
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 67
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 claims description 67
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical group CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 66
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 56
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 52
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 41
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 38
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 38
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 37
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 35
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 32
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 30
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 28
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 25
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 claims description 25
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 25
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 23
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 22
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 21
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 21
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims description 21
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical group OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 18
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 16
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 15
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 15
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical group CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 14
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000004475 Arginine Chemical group 0.000 claims description 12
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 12
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 claims description 12
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 12
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 12
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 claims description 11
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 claims description 11
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 11
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 11
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 claims description 11
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 10
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 9
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 claims description 9
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 9
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 9
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims description 9
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 claims description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000004220 glutamic acid Chemical group 0.000 claims description 6
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 6
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 5
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 125000004209 (C1-C8) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 3
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- -1 treonine Chemical group 0.000 claims description 3
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 claims description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 2
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 108010084715 isopropanol dehydrogenase (NADP) Proteins 0.000 claims description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 101710197852 Baeyer-Villiger monooxygenase Proteins 0.000 description 15
- 101710137307 FAD-containing monooxygenase EthA Proteins 0.000 description 15
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- MIVFGJCDFNYZSI-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-3-(1-methylsulfanylcyclopropyl)benzene Chemical compound ClC=1C=C(C=CC=1)C1(CC1)SC MIVFGJCDFNYZSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241000972318 Brachymonas petroleovorans Species 0.000 description 2
- 101710132699 Lysozyme 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100026848 Lysozyme-like protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- YFGHCGITMMYXAQ-UHFFFAOYSA-N 2-[(diphenylmethyl)sulfinyl]acetamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(S(=O)CC(=O)N)C1=CC=CC=C1 YFGHCGITMMYXAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003852 3-chlorobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C(Cl)=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000003997 cyclic ketones Chemical class 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 150000002211 flavins Chemical class 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960001165 modafinil Drugs 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- SBQLYHNEIUGQKH-UHFFFAOYSA-N omeprazole Chemical compound N1=C2[CH]C(OC)=CC=C2N=C1S(=O)CC1=NC=C(C)C(OC)=C1C SBQLYHNEIUGQKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000381 omeprazole Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 102200108020 rs199473054 Human genes 0.000 description 1
- 102200104782 rs864309490 Human genes 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
【課題】モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその応用を提供する。【解決手段】当該モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１に示すアミノ酸配列に突然変異が生じたアミノ酸配列であり、突然変異は、少なくとも第４５位、第９５位、第１０６位、第１０８位、第１１４位、第１８６位、第１９０位、第１９１位、第２４９位、第２５７位、第３９３位、第４３６位、第４９９位、第５００位、第５０１位、第５０３位、第５０４位、第５５９位及び第５６０位のうちの１つの突然変異部位を含む。【選択図】なし
Description
本発明は生物工学分野に関し、より詳しく言えば、モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその応用に関する。
キラルスルホキシドは、自然界に幅広く存在し、多くの重要な生物活性分子の構造単位であるとともに、合成天然物及びキラル薬物の重要な中間体でもある。キラルスルホキシドの多くは、１つ以上のキラル中心を含み、異なるキラル薬物は、薬理活性、代謝経路、代謝速度及び毒性に大きな差があり、一方のエナンチオマーが効果的であり、他方のエナンチオマーは効果が薄くあるいは無効で、毒性があることも少なくない。したがって、キラル中心を含む化合物を高立体選択的に構築することが、医薬品の研究及び開発において重要な意義を有する。
Ｂａｅｙｅｒ Ｖｉｌｌｉｇｅｒモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯｓ）はフラビン類モノオキシゲナーゼに属し、一般には鎖状又は環状ケトンを立体選択的に酸化して、対応のエステル又はラクトンを生成させるために用いられる。ＢＶＭＯｓは硫黄、窒素及びリンの求電子性酸化反応を触媒でき、他にもケトンとボロンの求核性酸化反応をも触媒できる。キラル薬物合成分野でＢＶＭＯｓは大きな応用があり、例えば硫黄を含むキラル前駆体の酸化を触媒して、キラル薬物モダフィニル及びオメプラゾールの合成に利用される（ＣＮ１０５６９５４２５Ａ）。
ＢＶＭＯｓのいくつかが既に商品化されているが、ＢＶＭＯｓには一般に酵素活性が低い、安定性が低い、スルホン副産物が生成するなどの問題がある。一般的に、定向進化により野生型酵素を改良させ、酵素の各種の特性を高めることによって、生産に応用可能にさせられる（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１１，１１１：４１６５－４２２２．）。
本発明は、従来のモノオキシゲナーゼにおける、酵素活性が低くスルホン副産物の含有量が高いという技術上の課題を解決するために、モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその応用を提供することを目的とする。
前記目的を達成するための本発明の一態様では、モノオキシゲナーゼ突然変異体を提供する。当該モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１に示すアミノ酸配列に突然変異が生じたアミノ酸配列であり、突然変異は、少なくとも第４５位、第９５位、第１０６位、第１０８位、第１１４位、第１８６位、第１９０位、第１９１位、第２４９位、第２５７位、第３９３位、第４３６位、第４９９位、第５００位、第５０１位、第５０３位、第５０４位、第５５９位及び第５６０位のうちの１つの突然変異部位を含み、且つ突然変異は、第４５位のメチオニンがトレオニンに突然変異し、第９５位のアラニンがトレオニンに突然変異し、第１０６位のシステインがセリンに突然変異し、第１０８位のトレオニンがセリンに突然変異し、第１１４位のメチオニンがロイシンに突然変異し、第１８６位のメチオニンがイソロイシンに突然変異し、第１９０位のプロリンがグルタミン、グリシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、バリン、トレオニン、イソロイシン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン又はロイシンに突然変異し、第１９１位のロイシンがバリンに突然変異し、第２４９位のシステインがバリンに突然変異し、第２５７位のシステインがアラニンに突然変異し、第３９３位のシステインがバリンに突然変異し、第４３６位のシステインがセリンに突然変異し、第４９９位のロイシンがアラニンに突然変異し、第５００位のグリシンがロイシンに突然変異し、第５０１位のセリンがトレオニンに突然変異し、第５０３位のイソロイシンがアラニンに突然変異し、第５０４位のプロリンがトレオニン、バリン又はセリンに突然変異し、第５５９位のチロシンがフェニルアラニン、リシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アスパラギン、セリン、アルギニン、バリン、アスパラギン酸、イソロイシン、セリン、ロイシン又はアラニンに突然変異し、そして第５６０位のチロシンがフェニルアラニン、ロイシン、セリン、プロリン、メチオニン又はアラニンに突然変異することであり、又はモノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、突然変異が生じたアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異が生じたアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
さらに、突然変異は、少なくとも第５５９位のチロシンのリシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのプロリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのグルタミンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアスパラギンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのトレオニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアルギニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアスパラギン酸への突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのイソロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのセリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのセリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのグルタミンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのグリシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのアルギニンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのアスパラギンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのフェニルアラニンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのグルタミン酸への突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのバリンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのトレオニンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのイソロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのヒスチジンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのチロシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのプロリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのヒスチジンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのリシンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのロイシンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのロイシンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのグルタミンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアスパラギンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのプロリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのセリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのセリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのセリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのプロリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのトレオニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのトレオニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのグリシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのトレオニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのグルタミンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのイソロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのグルタミンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０３位のアスパラギンのバリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのトレオニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのバリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのセリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異である突然変異部位の組み合わせの１つを含み、
好ましくは、突然変異は、少なくとも第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第４５位のメチオニンのトレオニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第１８６位のメチオニンのイソロイシンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異と第４５位のメチオニンのトレオニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異と第４５位のメチオニンのトレオニンへの突然変異と第１８６位のメチオニンのイソロイシンへの突然変異である突然変異部位の組み合わせの１つを含む。
好ましくは、突然変異は、少なくとも第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第４５位のメチオニンのトレオニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第１８６位のメチオニンのイソロイシンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異と第４５位のメチオニンのトレオニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異と第４５位のメチオニンのトレオニンへの突然変異と第１８６位のメチオニンのイソロイシンへの突然変異である突然変異部位の組み合わせの１つを含む。
本発明のもう一つの態様では、ＤＮＡ分子を提供する。当該ＤＮＡ分子は前記モノオキシゲナーゼ突然変異体をコードする。
本発明のもう一つの態様では、組換えプラスミドを提供する。当該組換えプラスミドは前記ＤＮＡ分子を含む。
さらに、組換えプラスミドはｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９である。
本発明のもう一つの態様では、宿主細胞を提供する。当該宿主細胞は前記組換えプラスミドを含む。
さらに、宿主細胞は原核細胞、酵母及び真核細胞を含み、原核細胞として好ましいのは大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞である。
本発明のもう一つの態様では、キラルスルホキシド生産方法を提供する。当該方法は、モノオキシゲナーゼによって触媒されてチオエーテル類化合物に一原子酸素添加反応を行わせるステップを含み、モノオキシゲナーゼは前記モノオキシゲナーゼ突然変異体である。
さらに、チオエーテル類化合物は
であり、ただし、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立してＣ1～Ｃ8アルキル基、Ｃ5～Ｃ10シクロアルキル基、Ｃ5～Ｃ10アリール基もしくはＣ5～Ｃ10ヘテロアリール基であり、又はＲ1と、Ｒ2とがカルボニル基上の炭素とともにＣ5～Ｃ10複素環基、Ｃ5～Ｃ10炭素環基もしくはＣ5～Ｃ10ヘテロアリール基を形成し、Ｃ5～Ｃ10複素環基及びＣ5～Ｃ10ヘテロアリール基におけるヘテロ原子はそれぞれ独立して窒素、酸素及び硫黄から少なくとも一つが選ばれ、Ｃ5～Ｃ10アリール基におけるアリール基、Ｃ5～Ｃ10ヘテロアリール基におけるヘテロアリール基、Ｃ5～Ｃ10炭素環基における炭素環基もしくはＣ5～Ｃ10複素環基における複素環基はそれぞれ独立して、置換されず又はハロゲン、アルコキシ基もしくはアルキル基のうちの少なくとも一つによって置換される。
さらに、チオエーテル類化合物は
さらに、チオエーテル類化合物は
である。
さらに、モノオキシゲナーゼは、請求項１又は２のモノオキシゲナーゼ突然変異体の酵素破砕液、全細胞、凍結乾燥酵素粉末、凍結乾燥細胞、固定化酵素又は固定化細胞である。
さらに、一原子酸素添加反応の反応系にはさらにＮＡＤ／ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨである補因子が含まれ、補因子循環系はグルコース及びグルコース脱水素酵素、ギ酸塩及びギ酸脱水素酵素、グルコース－６－リン酸及びグルコース－６－リン酸脱水素酵素、又は第二級アルコール及び第二級アルコール脱水素酵素を含む。
さらに、一原子酸素添加反応の反応系においてモノオキシゲナーゼの添加量は基質の質量の０．１倍～１０倍である。
さらに、一原子酸素添加反応の温度は１０～５０℃であり、好ましくは３０℃である。
さらに、一原子酸素添加反応はｐＨが７～１０、好ましくはｐＨが９である条件下で行われる。
本発明のモノオキシゲナーゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１に示すモノオキシゲナーゼをもとに、部位特異的突然変異による突然変異でそのアミノ酸配列を改変させることによって、タンパク質の構造及び機能の変化を実現し、さらに指向性スクリーニングにより前記突然変異部位を有するモノオキシゲナーゼを得たものであり、本発明のモノオキシゲナーゼ突然変異体は、酵素活性が大幅に高まることが利点であり、キラルスルホキシドの産業的生産のコストが大幅に低減される。
なお、矛盾がない限り、本願の実施例及び実施例の特徴を互いに組み合わせることができる。次に実施例を用いて本発明を詳細に説明する。
ブラキモナス・ペトロレオボランス（Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓ ｐｅｔｒｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）に由来するモノオキシゲナーゼは（３－クロロベンジル）ジメチルスルフィドの変換を高選択的に触媒できる。しかし、（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドの変換では、ブラキモナス・ペトロレオボランス（Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓ ｐｅｔｒｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）に由来するモノオキシゲナーゼの触媒生成物のｅｅ値はわずか４３．９％である。他のモノオキシゲナーゼをスクリーニングしたところ、ロドコッカス・ルーバーＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤ１に由来するモノオキシゲナーゼＢＶＭＯが、基質（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドの変換を高選択的に触媒でき、ｅｅ値は９９％であるが、その活性は低く、反応後スルホン副産物（過酸化物）の含有量は多く、反応時多くの酵素は添加され、生成物の分離抽出は難しいことを発見した。本発明の発明者は定向進化によりＢＶＭＯの活性を高め、酵素の使用量を低減し、酵素の選択性を向上させ、スルホン副産物の含有量を減らすために様々な試みを行った。
本発明の発明者は定向進化によりモノオキシゲナーゼＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１（ＭＴＴＳＩＤＲＥＡＬＲＲＫＹＡＥＥＲＤＫＲＩＲＰＤＧＮＤＱＹＩＲＬＤＨＶＤＧＷＳＨＤＰＹＭＰＩＴＰＲＥＰＫＬＤＨＶＴＦＡＦＩＧＧＧＦＳＧＬＶＴＡＡＲＬＲＥＳＧＶＥＳＶＲＩＩＤＫＡＧＤＦＧＧＶＷＹＷＮＲＹＰＧＡＭＣＤＴＡＡＭＶＹＭＰＬＬＥＥＴＧＹＭＰＴＥＫＹＡＨＧＰＥＩＬＥＨＣＱＲＩＧＫＨＹＤＬＹＤＤＡＬＦＨＴＥＶＴＤＬＶＷＱＥＨＤＱＲＷＲＩＳＴＮＲＧＤＨＦＴＡＱＦＶＧＭＧＴＧＰＬＨＶＡＱＬＰＧＩＰＧＩＥＳＦＲＧＫＳＦＨＴＳＲＷＤＹＤＹＴＧＧＤＡＬＧＡＰＭＤＫＬＡＤＫＲＶＡＶＩＧＴＧＡＴＡＶＱＣＶＰＥＬＡＫＹＣＲＥＬＹＶＶＱＲＴＰＳＡＶＤＥＲＧＮＨＰＩＤＥＫＷＦＡＱＩＡＴＰＧＷＱＫＲＷＬＤＳＦＴＡＩＷＤＧＶＬＴＤＰＳＥＬＡＩＥＨＥＤＬＶＱＤＧＷＴＡＬＧＱＲＭＲＡＡＶＧＳＶＰＩＥＱＹＳＰＥＮＶＱＲＡＬＥＥＡＤＤＥＱＭＥＲＩＲＡＲＶＤＥＩＶＴＤＰＡＴＡＡＱＬＫＡＷＦＲＱＭＣＫＲＰＣＦＨＤＤＹＬＰＡＦＮＲＰＮＴＨＬＶＤＴＧＧＫＧＶＥＲＩＴＥＮＧＶＶＶＡＧＶＥＹＥＶＤＣＩＶＹＡＳＧＦＥＦＬＧＴＧＹＴＤＲＡＧＦＤＰＴＧＲＤＧＶＫＬＳＥＨＷＡＱＧＴＲＴＬＨＧＭＨＴＹＧＦＰＮＬＦＶＬＱＬＭＱＧＡＡＬＧＳＮＩＰＨＮＦＶＥＡＡＲＶＶＡＡＩＶＤＨＶＬＳＴＧＴＳＳＶＥＴＴＫＥＡＥＱＡＷＶＱＬＬＬＤＨＧＲＰＬＧＮＰＥＣＴＰＧＹＹＮＮＥＧＫＰＡＥＬＫＤＲＬＮＶＧＹＰＡＧＳＡＡＦＦＲＭＭＤＨＷＬＡＡＧＳＦＤＧＬＴＦＲ）であって、対応する塩基配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２（ａｔｇａｃａａｃｃａｇｔａｔｃｇａｔｃｇｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃｇｃｃｇｃａａａｔａｔｇｃｃｇａａｇａｇｃｇｃｇａｔａａａｃｇｃａｔｃｃｇｃｃｃｇｇａｔｇｇｃａａｃｇａｔｃａｇｔａｔａｔｔｃｇｃｃｔｇｇａｔｃａｔｇｔｔｇａｃｇｇｔｔｇｇａｇｃｃａｔｇａｃｃｃｔｔａｔａｔｇｃｃｇａｔｃａｃｃｃｃｇｃｇｃｇａｇｃｃｇａａａｃｔｇｇａｃｃａｔｇｔｔａｃａｔｔｔｇｃａｔｔｃａｔｃｇｇｃｇｇｃｇｇｔｔｔｔａｇｃｇｇｔｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｃｃｇｃａｃｇｔｃｔｇｃｇｔｇａａａｇｔｇｇｃｇｔｇｇａｇａｇｔｇｔｔｃｇｃａｔｃａｔｃｇａｃａａａｇｃａｇｇｃｇａｔｔｔｃｇｇｃｇｇｃｇｔｔｔｇｇｔａｔｔｇｇａａｃｃｇｔｔａｔｃｃｇｇｇｔｇｃｃａｔｇｔｇｃｇａｔａｃｃｇｃａｇｃａａｔｇｇｔｇｔａｃａｔｇｃｃｔｃｔｇｃｔｇｇａａｇａｇａｃｃｇｇｃｔａｃａｔｇｃｃｇａｃａｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａｔｇｇｔｃｃｇｇａｇａｔｔｃｔｇｇａｇｃａｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｔｃｇｇｃａａａｃａｃｔａｃｇａｃｃｔｇｔａｔｇａｃｇａｔｇｃｃｃｔｇｔｔｃｃａｔａｃｃｇａａｇｔｔａｃｃｇａｃｃｔｇｇｔｇｔｇｇｃａｇｇａｇｃａｔｇａｔｃａｇｃｇｔｔｇｇｃｇｃａｔｃａｇｃａｃａａａｃｃｇｃｇｇｔｇａｃｃａｔｔｔｃａｃｃｇｃａｃａｇｔｔｃｇｔｔｇｇｃａｔｇｇｇｔａｃｃｇｇｃｃｃｇｃｔｇｃａｃｇｔｔｇｃａｃａｇｃｔｇｃｃｇｇｇｔａｔｔｃｃｇｇｇｔａｔｃｇａｇａｇｃｔｔｃｃｇｔｇｇｔａａｇａｇｃｔｔｃｃａｔａｃｃａｇｃｃｇｃｔｇｇｇａｃｔａｔｇａｃｔａｔａｃａｇｇｔｇｇｃｇａｃｇｃａｃｔｇｇｇｃｇｃａｃｃｔａｔｇｇａｃａａａｃｔｇｇｃａｇａｃａａａｃｇｃｇｔｇｇｃａｇｔｇａｔｔｇｇｔａｃｃｇｇｃｇｃａａｃｃｇｃｃｇｔｔｃａｇｔｇｃｇｔｔｃｃｇｇａａｃｔｇｇｃｃａａｇｔａｃｔｇｃｃｇｃｇａａｃｔｇｔａｔｇｔｇｇｔｔｃａｇｃｇｃａｃｃｃｃｇａｇｔｇｃｃｇｔｔｇａｔｇａａｃｇｃｇｇｃａａｃｃａｔｃｃｇａｔｃｇａｔｇａａａａｇｔｇｇｔｔｃｇｃｃｃａｇａｔｔｇｃｃａｃａｃｃｔｇｇｔｔｇｇｃａｇａａａｃｇｃｔｇｇｃｔｇｇａｔａｇｃｔｔｔａｃｃｇｃａａｔｃｔｇｇｇａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｇａｃａｇａｔｃｃｇａｇｃｇａａｃｔｇｇｃｃａｔｃｇａｇｃａｔｇａａｇａｃｃｔｇｇｔｇｃａｇｇａｔｇｇｔｔｇｇａｃａｇｃａｃｔｇｇｇｔｃａｇｃｇｃａｔｇｃｇｔｇｃａｇｃｃｇｔｇｇｇｔａｇｃｇｔｔｃｃｇａｔｔｇａａｃａｇｔａｔａｇｃｃｃｇｇａｇａａｃｇｔｇｃａｇｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇａａｇａｇｇｃｃｇａｃｇａｔｇａａｃａｇａｔｇｇａａｃｇｃａｔｔｃｇｃｇｃａｃｇｔｇｔｇｇａｔｇａｇａｔｔｇｔｇａｃｃｇａｔｃｃｔｇｃｃａｃｃｇｃｃｇｃｃｃａｇｃｔｇａａａｇｃａｔｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｇａｔｇｔｇｃａａｇｃｇｔｃｃｇｔｇｃｔｔｃｃａｃｇａｔｇａｃｔａｔｃｔｇｃｃｔｇｃａｔｔｃａａｃｃｇｃｃｃｇａａｔａｃｃｃａｔｃｔｇｇｔｇｇａｃａｃａｇｇｔｇｇｃａａａｇｇｃｇｔｇｇａｇｃｇｃａｔｔａｃｃｇａａａａｃｇｇｔｇｔｇｇｔｇｇｔｔｇｃａｇｇｔｇｔｇｇａａｔａｔｇａｇｇｔｇｇａｃｔｇｃａｔｃｇｔｇｔａｃｇｃｃａｇｔｇｇｃｔｔｃｇａｇｔｔｃｔｔａｇｇｃａｃｃｇｇｔｔａｔａｃａｇａｃｃｇｔｇｃａｇｇｔｔｔｃｇａｔｃｃｇａｃｃｇｇｃｃｇｔｇａｔｇｇｃｇｔｔａａａｃｔｇａｇｃｇａａｃａｔｔｇｇｇｃｃｃａａｇｇｃａｃａｃｇｔａｃｃｃｔｇｃａｔｇｇｃａｔｇｃａｔａｃｃｔａｃｇｇｃｔｔｔｃｃｇａａｃｃｔｇｔｔｔｇｔｇｃｔｇｃａｇｃｔｇａｔｇｃａｇｇｇｔｇｃａｇｃｃｃｔｇｇｇｔａｇｃａａｃａｔｃｃｃｇｃａｃａａｃｔｔｔｇｔｔｇａａｇｃｃｇｃｃｃｇｃｇｔｇｇｔｇｇｃｃｇｃａａｔｔｇｔｔｇａｔｃａｔｇｔｇｃｔｇａｇｃａｃａｇｇｃａｃｃａｇｔａｇｃｇｔｔｇａａａｃｃａｃｃａａｇｇａａｇｃｃｇａａｃａａｇｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇａｔｃａｃｇｇｔｃｇｃｃｃｔｃｔｇｇｇｃａａｃｃｃｇｇａｇｔｇｔａｃａｃｃｔｇｇｔｔａｔｔａｃａａｔａａｔｇａａｇｇｃａａａｃｃｇｇｃｃｇａａｃｔｇａａｇｇａｃｃｇｔｃｔｇａａｃｇｔｔｇｇｃｔａｔｃｃｇｇｃｃｇｇｔａｇｃｇｃｃｇｃｃｔｔｔｔｔｔｃｇｔａｔｇａｔｇｇａｃｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｃａｇｃｃｇｇｃａｇｔｔｔｔｇａｔｇｇｃｃｔｇａｃａｔｔｃｃｇｃｔａａ）であるモノオキシゲナーゼの活性及び選択性を向上して、酵素の使用量を減らし、スルホン副産物の含有量を減らす。まず全プラスミドＰＣＲによりモノオキシゲナーゼＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１に突然変異部位を導入して、突然変異体の活性及びスルホン副産物の含有量を検出することで、活性が高められ又はスルホン副産物の含有量が低減された突然変異体を選択した。
ＢＶＭＯを鋳型として、３４対の部位特異的突然変異プライマー（Ｍ４５Ｔ、Ｖ９５Ｉ、Ｃ１０６Ｓ、Ｄ１０７Ａ、Ｔ１０８Ｉ、Ｔ１０８Ｓ、Ｍ１１４Ｌ、Ｍ１８６Ｉ、Ｐ１９０Ｆ、Ｐ１９０Ｌ、Ｌ１９１Ｖ、Ｌ１９１Ａ、Ｃ２４９Ｖ、Ｃ２５７Ａ、Ｃ３９３Ｖ、Ｃ４３６Ｓ、Ｌ４９９Ａ、Ｌ４９９Ｇ、Ｇ５００Ｌ、Ｓ５０１Ｔ、Ｎ５０２Ｑ、Ｉ５０３Ｇ、Ｉ５０３Ａ、Ｉ５０３Ｍ、Ｐ５０４Ｆ、Ｇ５５８Ｖ、Ｇ５５８Ｎ、Ｙ５５９Ｆ、Ｙ５５９Ｌ、Ｙ５５９Ａ、Ｙ５６０Ｆ、Ｙ５６０Ｌ、Ｙ５６０Ａ、Ｃ５５５Ｓ）を設計し、ｐＥＴ－２８ｂ（＋）を発現ベクターとして部位特異的突然変異により目的遺伝子を備える突然変異プラスミドを得た。
部位特異的突然変異とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法によって、目的ＤＮＡ断片（ゲノムであってもよく、プラスミドであってもよい）に対して、塩基の添加、削除、点突然変異などを含む所望の変化を導入する（通常、好適な方向を表す変化である）ことを指す。部位特異的突然変異は、ＤＮＡで発現される目的タンパク質の性状及び特徴付けを迅速かつ効率的に向上させることができ、遺伝子研究作業において非常に有用な手段である。
全プラスミドＰＣＲによって部位特異的突然変異を導入する方法は、簡単かつ有効であり、現在、多く使用される手段である。その原理は、突然変異部位を含む一対のプライマー（順方向、逆方向）及び鋳型プラスミドをアニーリングし、ポリメラーゼで「循環延長」することであり、いわゆる循環伸長とは、ポリメラーゼで鋳型に応じてプライマーを伸長させ、一周した後にプライマー５'末端に戻って終了し、さらに繰り返して加熱しアニーリングし伸長するサイクルを指す。この反応は、ローリングサークル増幅とは異なり、複数のタンデムコピーを生成しない。順方向プライマーの伸長生成物と逆方向プライマーの伸長生成物は、アニーリングされてペアリングして切り欠きのある開環プラスミドとなる。伸長生成物をＤｐｎ Ｉで酵素切断し、元々の鋳型プラスミドが、一般的な大腸菌に由来し、ｄａｍメチル化修飾されたものであり、Ｄｐｎ Ｉに感受性があって細かく切断されるが、インビトロで合成された、突然変異配列を有するプラスミドは、メチル化されておらず切断されないため、その後の形質転換においてうまく形質転換でき、突然変異プラスミドのクローンを得ることができる。
上記突然変異プラスミドを大腸菌細胞内に形質転換し、大腸菌に過剰発現させる。その後、超音波処理による細胞破壊で粗酵素を取得する。アミノ酸デヒドロゲナーゼの誘導発現に最適な条件は、２５℃で、０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて一晩誘導することである。
本発明の典型的な一実施形態では、モノオキシゲナーゼ突然変異体を提供する。当該モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１に示すアミノ酸配列に突然変異が生じたアミノ酸配列であり、突然変異は、少なくとも第４５位、第９５位、第１０６位、第１０８位、第１１４位、第１８６位、第１９０位、第１９１位、第２４９位、第２５７位、第３９３位、第４３６位、第４９９位、第５００位、第５０１位、第５０３位、第５０４位、第５５９位及び第５６０位のうちの１つの突然変異部位を含み、且つ前記突然変異は、前記第４５位のメチオニンがトレオニンに突然変異し、第９５位のアラニンがトレオニンに突然変異し、第１０６位のシステインがセリンに突然変異し、第１０８位のトレオニンがセリンに突然変異し、第１１４位のメチオニンがロイシンに突然変異し、第１８６位のメチオニンがイソロイシンに突然変異し、第１９０位のプロリンがグルタミン、グリシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、バリン、トレオニン、イソロイシン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン又はロイシンに突然変異し、第１９１位のロイシンがバリンに突然変異し、第２４９位のシステインがバリンに突然変異し、第２５７位のシステインがアラニンに突然変異し、第３９３位のシステインがバリンに突然変異し、第４３６位のシステインがセリンに突然変異し、第４９９位のロイシンがアラニンに突然変異し、第５００位のグリシンがロイシンに突然変異し、第５０１位のセリンがトレオニンに突然変異し、第５０３位のイソロイシンがアラニンに突然変異し、第５０４位のプロリンがトレオニン、バリン又はセリンに突然変異し、第５５９位のチロシンがフェニルアラニン、リシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アスパラギン、セリン、アルギニン、バリン、アスパラギン酸、イソロイシン、セリン、ロイシン又はアラニンに突然変異しそして第５６０位のチロシンがフェニルアラニン、ロイシン、セリン、プロリン、メチオニン又はアラニンに突然変異することであり、又は前記モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は前記突然変異が生じたアミノ酸配列における前記突然変異部位を有し、且つ前記突然変異が生じたアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
好ましくは、突然変異は、少なくとも第５５９位のチロシンのリシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのプロリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのグルタミンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアスパラギン酸への突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのトレオニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアルギニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアスパラギンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのイソロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのセリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのセリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのグルタミンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのグリシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのアルギニンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのアスパラギンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのフェニルアラニンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのグルタミン酸への突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのバリンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのトレオニンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのイソロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのヒスチジンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのチロシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのプロリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのヒスチジンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのリシンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのロイシンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのロイシンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのグルタミンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアスパラギンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのプロリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのセリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのセリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのセリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのプロリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのトレオニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのトレオニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのグリシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのトレオニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのグルタミンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのイソロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのグルタミンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０３位のアスパラギンのバリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのトレオニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのバリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのセリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異である突然変異部位の組み合わせの１つを含む。
好ましくは、突然変異は、少なくとも第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第４５位のメチオニンのトレオニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第１８６位のメチオニンのイソロイシンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異と第４５位のメチオニンのトレオニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異と第４５位のメチオニンのトレオニンへの突然変異と第１８６位のメチオニンのイソロイシンへの突然変異である突然変異部位の組み合わせの１つを含む。
本発明のモノオキシゲナーゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１に示すモノオキシゲナーゼをもとに、部位特異的突然変異による突然変異でそのアミノ酸配列を改変させることによって、タンパク質の構造及び機能の変化を実現し、さらに指向性スクリーニングにより前記突然変異部位を有するモノオキシゲナーゼを得たものであり、本発明のモノオキシゲナーゼ突然変異体は、酵素活性が大幅に高まることが利点であり、しかも酵素の選択性が大幅に向上し、スルホン副産物の含有量が大幅に減らされ、キラルスルホキシドの産業的生産のコストが大幅に減らされる。
本発明の典型的な一実施形態では、ＤＮＡ分子を提供する。当該ＤＮＡ分子は前記モノオキシゲナーゼ突然変異体をコードする。前記ＤＮＡによってコードされたモノオキシゲナーゼには、酵素活性及び酵素の選択性が向上され、スルホン副産物の含有量が減らされており、キラルスルホキシドの産業的生産では酵素の添加量が低減され、分離精製後処理の難度が下がる。
本発明に係るＤＮＡ分子は、「発現カセット」の形態で存在してもよい。「発現カセット」とは、線形又は環状の核酸分子を指し、特定のヌクレオチド配列を適切な宿主細胞で発現することを指導することができるＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含む。一般的には、目的ヌクレオチドに有効に接続されるプロモータを含み、非強制的には、終止シグナル及び／又は他の制御要素に有効に接続されたプロモータを含む。発現カセットは、ヌクレオチド配列を正確に翻訳するに必要な配列をさらに含むことができる。コード領域は、通常、目的タンパク質をコードするが、センス又はアンチセンス方向において、例えばアンチセンスＲＮＡ又は非翻訳的ＲＮＡなどの目的機能的ＲＮＡもコードする。目的ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラ型であってもよく、これは、少なくとも１つの成分と少なくとも１つの他の成分とが異種であることを意味する。発現カセットは、天然に存在するものであって、但し異種発現ための有効組換えの形で獲得されるものであってもよい。
本発明の１つの典型的な実施形態によれば、組換えプラスミドを提供する。該組換えプラスミドは、上記いずれかのＤＮＡ分子を含む。上記組換えプラスミド中のＤＮＡ分子は、正確かつ円滑に複製、転写又は発現することができるように、組換えプラスミドの適切な位置に位置付けられる。
本発明は、上記ＤＮＡ分子を限定する際に用いられる限定語が「含む」であるが、ＤＮＡ配列の両端にその機能には関与しない他の配列を任意に加えることができることを意味するものではない。組換え操作の要件を満たすために、ＤＮＡ配列の両端に適切な制限酵素の酵素切断部位を添加したり、開始コドン、終止コドンなどを別途に追加したりする必要があるため、閉鎖式の表現で上記ＤＮＡ分子を限定すれば、このような状況をカバーできないことが当業者に知られている。
本発明で使用される用語「プラスミド」は、二本鎖又は一本鎖の線状又は環状形式の任意のプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はアグロバクテリウム二元核酸分子を含み、好ましくは組換え発現プラスミドであり、原核発現プラスミドであってもよく、真核発現プラスミドであってもよいが、好ましくは原核発現プラスミドである。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９から選択される。より好ましくは、上記組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）である。
本発明の１つの典型的な実施形態によれば、上記いずれかの組換えプラスミドを含む宿主細胞を提供する。本発明に適用される宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞を含むが、これらに限定されない。好ましくは、原核細胞は、真菌、例えばグラム陰性菌又はグラム陽性菌である。より好ましくは、原核細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞である。モノオキシゲナーゼ誘導発現の最適条件は、２５℃、０．１ｍＭのＩＰＴＧで１６時間誘導である。突然変異プラスミドを大腸菌細胞に形質転換し、次に超音波細胞破砕法により粗酵素を得る。
本発明の典型的な一実施形態では、キラルスルホキシド生産方法を提供する。当該方法は、モノオキシゲナーゼによって触媒されてチオエーテル類化合物に一原子酸素添加反応を行わせるステップを含み、ただし、モノオキシゲナーゼは前記いずれかのモノオキシゲナーゼ突然変異体である。本発明のモノオキシゲナーゼ突然変異体はより高い酵素触媒活性及び選択性を有するため、本発明のモノオキシゲナーゼ突然変異体を利用してキラルスルホキシドを製造する場合、生産コストが減らされるだけでなく、得られたキラルスルホキシドのｅｅ値は９９％を超え、ｄｅ値は９９％を超えている。
本発明の典型的な一実施形態では、チオエーテル類化合物は
であり、ただし、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立してＣ1～Ｃ8アルキル基、Ｃ5～Ｃ10シクロアルキル基、Ｃ5～Ｃ10アリール基もしくはＣ5～Ｃ10ヘテロアリール基であり、又はＲ1と、Ｒ2とがカルボニル基上の炭素とともにＣ5～Ｃ10複素環基、Ｃ5～Ｃ10炭素環基もしくはＣ5～Ｃ10ヘテロアリール基を形成し、Ｃ5～Ｃ10複素環基及びＣ5～Ｃ10ヘテロアリール基におけるヘテロ原子はそれぞれ独立して窒素、酸素及び硫黄から少なくとも一つが選ばれ、Ｃ5～Ｃ10アリール基におけるアリール基、Ｃ5～Ｃ10ヘテロアリール基におけるヘテロアリール基、Ｃ5～Ｃ10炭素環基における炭素環基もしくはＣ5～Ｃ10複素環基における複素環基はそれぞれ独立して、置換されず又はハロゲン、アルコキシ基もしくはアルキル基のうちの少なくとも一つによって置換される。
典型的には、
であり、チオエーテル類化合物は
（（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィド）である。
モノオキシゲナーゼは、モノオキシゲナーゼ突然変異体の酵素破砕液、全細胞、凍結乾燥酵素粉末、凍結乾燥細胞、固定化酵素又は固定化細胞であってもよい。
次に実施例を用いて本発明の有益な効果をさらに説明する。
（実施例１）
１０ｍＬ反応フラスコに１６ｍｇの（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドを加え、そして９．０の０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍｇのイソプロパノール、０．１６ｍｇのＮＡＤＰ+、１．６ｍｇのアルコール脱水素酵素凍結乾燥粉末を加え、そして１．６ｍｇのモノオキシゲナーゼＢＶＭＯ凍結乾燥酵素粉末を加え、均一に混合し、総体積は１ｍＬであり、３０℃で２００回転のシェーカーにおいて１６時間反応させた。反応サンプル系に３ｍＬのアセトニトリルを加え、均一に混合した後５ｍＬのＥＰ管に入れて、１２０００回転で３分間遠心分離させた。１００μＬの上清をサンプルボトルに入れて、９０％アセトニトリルを９００μＬ加え、ＨＰＬＣより検出し、検出波長は２１０ｎｍであった。結果は表１に示すとおりである。
１０ｍＬ反応フラスコに１６ｍｇの（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドを加え、そして９．０の０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍｇのイソプロパノール、０．１６ｍｇのＮＡＤＰ+、１．６ｍｇのアルコール脱水素酵素凍結乾燥粉末を加え、そして１．６ｍｇのモノオキシゲナーゼＢＶＭＯ凍結乾燥酵素粉末を加え、均一に混合し、総体積は１ｍＬであり、３０℃で２００回転のシェーカーにおいて１６時間反応させた。反応サンプル系に３ｍＬのアセトニトリルを加え、均一に混合した後５ｍＬのＥＰ管に入れて、１２０００回転で３分間遠心分離させた。１００μＬの上清をサンプルボトルに入れて、９０％アセトニトリルを９００μＬ加え、ＨＰＬＣより検出し、検出波長は２１０ｎｍであった。結果は表１に示すとおりである。
酵素液の調製手順：遠心分離して９６ウェルプレートから上清培地を除去し、各ウェルに２００μＬの酵素分解溶液（リゾチーム２ｍｇ／ｍＬ、ポリミキシン０．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ＝７．０）を加え、３７℃で保温して３時間破砕した。
ハイスループットスクリーニング手順：２５０μＬの活性測定系：基質の最終濃度は２ｍＭで、ＮＡＤＰＨの最終濃度は０．３ｍＭであり、酵素破砕液の添加量は１００μＬであり、ｐＨ＝９．０で、温度は３０℃であった。
スクリーニングして得た突然変異体を振盪フラスコにおいて培養した後、増幅反応を行わせた。
モノオキシゲナーゼ誘導発現の最適条件：２５℃、０．１ｍＭのＩＰＴＧで一晩誘導する。
（実施例２）
１０ｍＬ反応フラスコに２０ｍｇの（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドを加え、そして９．０の０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍｇのイソプロパノール、０．２ｍｇのＮＡＤＰ+、２０ｍｇのアルコール脱水素酵素を加え、そして２０ｍｇのモノオキシゲナーゼＢＶＭＯを加え、均一に混合し、総体積は１ｍＬであり、３０℃で２００回転のシェーカーにおいて１６時間反応させた。反応サンプル系に３ｍＬのアセトニトリルを加え、均一に混合した後５ｍＬのＥＰ管に入れて、１２０００回転で３分間遠心分離させた。１００μＬの上清をサンプルボトルに入れて、９０％アセトニトリルを９００μＬ加え、ＨＰＬＣより検出し、検出波長は２１０ｎｍであった。
１０ｍＬ反応フラスコに２０ｍｇの（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドを加え、そして９．０の０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍｇのイソプロパノール、０．２ｍｇのＮＡＤＰ+、２０ｍｇのアルコール脱水素酵素を加え、そして２０ｍｇのモノオキシゲナーゼＢＶＭＯを加え、均一に混合し、総体積は１ｍＬであり、３０℃で２００回転のシェーカーにおいて１６時間反応させた。反応サンプル系に３ｍＬのアセトニトリルを加え、均一に混合した後５ｍＬのＥＰ管に入れて、１２０００回転で３分間遠心分離させた。１００μＬの上清をサンプルボトルに入れて、９０％アセトニトリルを９００μＬ加え、ＨＰＬＣより検出し、検出波長は２１０ｎｍであった。
一部位突然変異体は、原種より変換効果が優れるが、理想的な効果には至らなかった。飽和突然変異を組み合わせると複数の突然変異部位による相乗効果がある突然変異体が得られ、しかもそのアミノ酸の構成の最適化が可能である。結果は表２に示すとおりである。
突然変異部位を組み合わせるとより優れた突然変異体を得る。したがって、ＤＮＡシャッフリング（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）より突然変異部位をランダムに組み替えて突然変異ライブラリーを構築した後、より優れた突然変異体を得ることを図るため、スクリーニングを行った。
ＤＮＡシャッフリング（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）は分子レベルにおいて行われる遺伝子の有性的組換えである。ヌクレアーゼＩで一組の相同遺伝子をランダムな断片に消化し、これらのランダムな断片がライブラリーになり、一方がプライマーで他方が鋳型となってＰＣＲ増幅を行った。一方の遺伝子コピーの断片が他方の遺伝子コピーのプライマーになると、鋳型の交換及び遺伝子組換えが発生することになる。
酵素液の調製手順：遠心分離して９６ウェルプレートから上清培地を除去し、各ウェルに２００μＬの酵素分解溶液（リゾチーム２ｍｇ／ｍＬ、ポリミキシン０．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ＝７．０）を加え、３７℃で保温して３時間破砕した。
ハイスループットスクリーニング手順：２５０μＬの活性測定系：基質の最終濃度は２ｍＭで、ＮＡＤＰＨの最終濃度は０．３ｍＭであり、酵素破砕液の添加量は１００μＬであり、ｐＨ＝９．０で、温度は３０℃であった。
スクリーニングして得た突然変異体を振盪フラスコにおいて培養した後、増幅反応を行わせた。
モノオキシゲナーゼ誘導発現の最適条件：２５℃、０．１ｍＭのＩＰＴＧで一晩誘導する。
（実施例３）
１０ｍＬ反応フラスコに３０ｍｇの（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドを加え、そして９．０の０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、３０ｍｇのイソプロパノール、０．３ｍｇのＮＡＤＰ+、３０ｍｇのアルコール脱水素酵素を加え、そして３０ｍｇのモノオキシゲナーゼＢＶＭＯを加え、均一に混合し、総体積は１ｍＬであり、３０℃で２００回転のシェーカーにおいて１６時間反応させた。反応サンプル系に３ｍＬのアセトニトリルを加え、均一に混合した後５ｍＬのＥＰ管に入れて、１２０００回転で３分間遠心分離させた。１００μＬの上清をサンプルボトルに入れて、９０％アセトニトリルを９００μＬ加え、ＨＰＬＣより検出し、検出波長は２１０ｎｍであった。結果は表３に示すとおりである。
１０ｍＬ反応フラスコに３０ｍｇの（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドを加え、そして９．０の０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、３０ｍｇのイソプロパノール、０．３ｍｇのＮＡＤＰ+、３０ｍｇのアルコール脱水素酵素を加え、そして３０ｍｇのモノオキシゲナーゼＢＶＭＯを加え、均一に混合し、総体積は１ｍＬであり、３０℃で２００回転のシェーカーにおいて１６時間反応させた。反応サンプル系に３ｍＬのアセトニトリルを加え、均一に混合した後５ｍＬのＥＰ管に入れて、１２０００回転で３分間遠心分離させた。１００μＬの上清をサンプルボトルに入れて、９０％アセトニトリルを９００μＬ加え、ＨＰＬＣより検出し、検出波長は２１０ｎｍであった。結果は表３に示すとおりである。
上述したのが本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明はこれに限定されない。当業者は、本発明に様々な変更と変形を行うことができる。本発明の趣旨及び原理を逸脱せず行った修正、同等な置き換え、改善などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。
さらに、モノオキシゲナーゼは、上記のモノオキシゲナーゼ突然変異体の酵素破砕液、全細胞、凍結乾燥酵素粉末、凍結乾燥細胞、固定化酵素又は固定化細胞である。
上記突然変異プラスミドを大腸菌細胞内に形質転換し、大腸菌に過剰発現させる。その後、超音波処理による細胞破壊で粗酵素を取得する。モノオキシゲナーゼの誘導発現に最適な条件は、２５℃で、０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて一晩誘導することである。
（実施例１）
１０ｍＬ反応フラスコに１６ｍｇの（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドを加え、そして９．０ｍｇの０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍｇのイソプロパノール、０．１６ｍｇのＮＡＤＰ+、１．６ｍｇのアルコール脱水素酵素凍結乾燥粉末を加え、そして１．６ｍｇのモノオキシゲナーゼＢＶＭＯ凍結乾燥酵素粉末を加え、均一に混合し、総体積は１ｍＬであり、３０℃で２００回転のシェーカーにおいて１６時間反応させた。反応サンプル系に３ｍＬのアセトニトリルを加え、均一に混合した後５ｍＬのＥＰ管に入れて、１２０００回転で３分間遠心分離させた。１００μＬの上清をサンプルボトルに入れて、９０％アセトニトリルを９００μＬ加え、ＨＰＬＣより検出し、検出波長は２１０ｎｍであった。結果は表１に示すとおりである。
１０ｍＬ反応フラスコに１６ｍｇの（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドを加え、そして９．０ｍｇの０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍｇのイソプロパノール、０．１６ｍｇのＮＡＤＰ+、１．６ｍｇのアルコール脱水素酵素凍結乾燥粉末を加え、そして１．６ｍｇのモノオキシゲナーゼＢＶＭＯ凍結乾燥酵素粉末を加え、均一に混合し、総体積は１ｍＬであり、３０℃で２００回転のシェーカーにおいて１６時間反応させた。反応サンプル系に３ｍＬのアセトニトリルを加え、均一に混合した後５ｍＬのＥＰ管に入れて、１２０００回転で３分間遠心分離させた。１００μＬの上清をサンプルボトルに入れて、９０％アセトニトリルを９００μＬ加え、ＨＰＬＣより検出し、検出波長は２１０ｎｍであった。結果は表１に示すとおりである。
（実施例２）
１０ｍＬ反応フラスコに２０ｍｇの（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドを加え、そして９．０ｍｇの０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍｇのイソプロパノール、０．２ｍｇのＮＡＤＰ+、２０ｍｇのアルコール脱水素酵素を加え、そして２０ｍｇのモノオキシゲナーゼＢＶＭＯを加え、均一に混合し、総体積は１ｍＬであり、３０℃で２００回転のシェーカーにおいて１６時間反応させた。反応サンプル系に３ｍＬのアセトニトリルを加え、均一に混合した後５ｍＬのＥＰ管に入れて、１２０００回転で３分間遠心分離させた。１００μＬの上清をサンプルボトルに入れて、９０％アセトニトリルを９００μＬ加え、ＨＰＬＣより検出し、検出波長は２１０ｎｍであった。
１０ｍＬ反応フラスコに２０ｍｇの（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドを加え、そして９．０ｍｇの０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍｇのイソプロパノール、０．２ｍｇのＮＡＤＰ+、２０ｍｇのアルコール脱水素酵素を加え、そして２０ｍｇのモノオキシゲナーゼＢＶＭＯを加え、均一に混合し、総体積は１ｍＬであり、３０℃で２００回転のシェーカーにおいて１６時間反応させた。反応サンプル系に３ｍＬのアセトニトリルを加え、均一に混合した後５ｍＬのＥＰ管に入れて、１２０００回転で３分間遠心分離させた。１００μＬの上清をサンプルボトルに入れて、９０％アセトニトリルを９００μＬ加え、ＨＰＬＣより検出し、検出波長は２１０ｎｍであった。
（実施例３）
１０ｍＬ反応フラスコに３０ｍｇの（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドを加え、そして９．０ｍｇの０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、３０ｍｇのイソプロパノール、０．３ｍｇのＮＡＤＰ+、３０ｍｇのアルコール脱水素酵素を加え、そして３０ｍｇのモノオキシゲナーゼＢＶＭＯを加え、均一に混合し、総体積は１ｍＬであり、３０℃で２００回転のシェーカーにおいて１６時間反応させた。反応サンプル系に３ｍＬのアセトニトリルを加え、均一に混合した後５ｍＬのＥＰ管に入れて、１２０００回転で３分間遠心分離させた。１００μＬの上清をサンプルボトルに入れて、９０％アセトニトリルを９００μＬ加え、ＨＰＬＣより検出し、検出波長は２１０ｎｍであった。結果は表３に示すとおりである。
１０ｍＬ反応フラスコに３０ｍｇの（１－（３－クロロフェニル）シクロプロピル）メチルスルフィドを加え、そして９．０ｍｇの０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、３０ｍｇのイソプロパノール、０．３ｍｇのＮＡＤＰ+、３０ｍｇのアルコール脱水素酵素を加え、そして３０ｍｇのモノオキシゲナーゼＢＶＭＯを加え、均一に混合し、総体積は１ｍＬであり、３０℃で２００回転のシェーカーにおいて１６時間反応させた。反応サンプル系に３ｍＬのアセトニトリルを加え、均一に混合した後５ｍＬのＥＰ管に入れて、１２０００回転で３分間遠心分離させた。１００μＬの上清をサンプルボトルに入れて、９０％アセトニトリルを９００μＬ加え、ＨＰＬＣより検出し、検出波長は２１０ｎｍであった。結果は表３に示すとおりである。
Claims (15)
- モノオキシゲナーゼ突然変異体であって、
前記モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１に示すアミノ酸配列に突然変異が生じたアミノ酸配列であり、前記突然変異は少なくとも第４５位、第９５位、第１０６位、第１０８位、第１１４位、第１８６位、第１９０位、第１９１位、第２４９位、第２５７位、第３９３位、第４３６位、第４９９位、第５００位、第５０１位、第５０３位、第５０４位、第５５９位及び第５６０位のうちの１つの突然変異部位を含み、且つ前記突然変異は前記第４５位のメチオニンがトレオニンに突然変異し、第９５位のアラニンがトレオニンに突然変異し、第１０６位のシステインがセリンに突然変異し、第１０８位のトレオニンがセリンに突然変異し、第１１４位のメチオニンがロイシンに突然変異し、第１８６位のメチオニンがイソロイシンに突然変異し、第１９０位のプロリンがグルタミン、グリシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、バリン、トレオニン、イソロイシン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン又はロイシンに突然変異し、第１９１位のロイシンがバリンに突然変異し、第２４９位のシステインがバリンに突然変異し、第２５７位のシステインがアラニンに突然変異し、第３９３位のシステインがバリンに突然変異し、第４３６位のシステインがセリンに突然変異し、第４９９位のロイシンがアラニンに突然変異し、第５００位のグリシンがロイシンに突然変異し、第５０１位のセリンがトレオニンに突然変異し、第５０３位のイソロイシンがアラニンに突然変異し、第５０４位のプロリンがトレオニン、バリン又はセリンに突然変異し、第５５９位のチロシンがフェニルアラニン、リシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アスパラギン、セリン、アルギニン、バリン、アスパラギン酸、イソロイシン、セリン、ロイシン又はアラニンに突然変異し、そして第５６０位のチロシンがフェニルアラニン、ロイシン、セリン、プロリン、メチオニン又はアラニンに突然変異することであり、又は前記モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、前記突然変異が生じたアミノ酸配列における前記突然変異部位を有し、且つ前記突然変異が生じたアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であることを特徴とするモノオキシゲナーゼ突然変異体。 - 前記突然変異は、少なくとも第５５９位のチロシンのリシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのプロリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのグルタミンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアスパラギンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのトレオニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアルギニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアスパラギン酸への突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのイソロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのセリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのセリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのグルタミンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのグリシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのアルギニンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのアスパラギンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのフェニルアラニンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのグルタミン酸への突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのバリンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのトレオニンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのイソロイシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのヒスチジンへの突然変異、第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのチロシンへの突然変異、第５６０位のチロシンのプロリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのヒスチジンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのリシンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのロイシンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのロイシンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのグルタミンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのアスパラギンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのプロリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのグルタミンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのセリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのセリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのセリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのプロリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのトレオニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのトレオニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのグリシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのトレオニンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのフェニルアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのバリンへの突然変異と第５６０位のチロシンのグルタミンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのアラニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのイソロイシンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０３位のアスパラギンのバリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのトレオニンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのバリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異、第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第５０４位のプロリンのセリンへの突然変異と第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異である突然変異部位の組み合わせの１つを含み、
好ましくは、前記突然変異は、少なくとも第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第４５位のメチオニンのトレオニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第１８６位のメチオニンのイソロイシンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異と第４５位のメチオニンのトレオニンへの突然変異、第１９０位のプロリンのロイシンへの突然変異と第５５９位のチロシンのメチオニンへの突然変異と第２４９位のシステインのバリンへの突然変異と第３９３位のシステインのバリンへの突然変異と第２５７位のシステインのアラニンへの突然変異と第４５位のメチオニンのトレオニンへの突然変異と第１８６位のメチオニンのイソロイシンへの突然変異である突然変異部位の組み合わせの１つを含むことを特徴とする請求項１に記載のモノオキシゲナーゼ突然変異体。 - 請求項１又は２に記載のモノオキシゲナーゼ突然変異体をコードすることを特徴とするＤＮＡ分子。
- 請求項３に記載のＤＮＡ分子を含むことを特徴とする組換えプラスミド。
- ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９であることを特徴とする請求項４に記載の組換えプラスミド。
- 請求項４又は５に記載の組換えプラスミドを含むことを特徴とする宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、原核細胞、酵母及び真核細胞を含み、前記原核細胞として好ましいのは、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞であることを特徴とする請求項６に記載の宿主細胞。
- モノオキシゲナーゼによって触媒されてチオエーテル類化合物に一原子酸素添加反応を行わせるステップを含むキラルスルホキシド生産方法であって、前記モノオキシゲナーゼは請求項１又は２に記載のモノオキシゲナーゼ突然変異体であることを特徴とするキラルスルホキシド生産方法。
- 前記チオエーテル類化合物は
- 前記チオエーテル類化合物は
- 前記モノオキシゲナーゼは請求項１又は２に記載のモノオキシゲナーゼ突然変異体の酵素破砕液、全細胞、凍結乾燥酵素粉末、凍結乾燥細胞、固定化酵素又は固定化細胞であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
- 前記一原子酸素添加反応の反応系にはさらにＮＡＤ／ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨである補因子が含まれ、補因子循環系はグルコース及びグルコース脱水素酵素、ギ酸塩及びギ酸脱水素酵素、グルコース－６－リン酸及びグルコース－６－リン酸脱水素酵素、又は第二級アルコール及び第二級アルコール脱水素酵素を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
- 前記一原子酸素添加反応の反応系において前記モノオキシゲナーゼの添加量は基質の質量の０．１倍～１０倍であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
- 前記一原子酸素添加反応の温度は１０～５０℃であり、好ましくは３０℃であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
- 前記一原子酸素添加反応はｐＨが７～１０、好ましくはｐＨが９である条件下で行われることを特徴とする請求項８に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2018/113938 WO2020093191A1 (zh) | 2018-11-05 | 2018-11-05 | 单加氧酶突变体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022512839A true JP2022512839A (ja) | 2022-02-07 |
| JP7293351B2 JP7293351B2 (ja) | 2023-06-19 |
Family
ID=70611243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021523213A Active JP7293351B2 (ja) | 2018-11-05 | 2018-11-05 | モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその応用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220002683A1 (ja) |
| EP (1) | EP3878953A4 (ja) |
| JP (1) | JP7293351B2 (ja) |
| WO (1) | WO2020093191A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115232799A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-10-25 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种苯乙烯单加氧酶突变体及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005512514A (ja) * | 2001-08-29 | 2005-05-12 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子 |
| CN108300707A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-07-20 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1235911A2 (en) * | 1999-12-10 | 2002-09-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Genes involved in cyclododecanone degradation pathway |
| CN105695425B (zh) | 2014-11-26 | 2019-05-17 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 一种环己酮单加氧酶及其在合成埃索美拉唑中的应用 |
| CN106754802B (zh) * | 2017-01-17 | 2019-06-25 | 深圳大学 | 异丁香酚单加氧酶突变体及其应用 |
-
2018
- 2018-11-05 WO PCT/CN2018/113938 patent/WO2020093191A1/zh unknown
- 2018-11-05 JP JP2021523213A patent/JP7293351B2/ja active Active
- 2018-11-05 EP EP18939722.7A patent/EP3878953A4/en active Pending
- 2018-11-05 US US17/290,749 patent/US20220002683A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005512514A (ja) * | 2001-08-29 | 2005-05-12 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子 |
| CN108300707A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-07-20 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J. BACTERIOL., vol. 183, no. 21, JPN6022016035, November 2001 (2001-11-01), pages 6478 - 6486, ISSN: 0004928689 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3878953A4 (en) | 2022-08-10 |
| EP3878953A1 (en) | 2021-09-15 |
| US20220002683A1 (en) | 2022-01-06 |
| JP7293351B2 (ja) | 2023-06-19 |
| WO2020093191A1 (zh) | 2020-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108048417B (zh) | 酮还原酶突变体及其应用 | |
| CN110257351B (zh) | 酮还原酶突变体及生产手性醇的方法 | |
| CN109402074B (zh) | 单加氧酶突变体及其应用 | |
| JP6988000B2 (ja) | ケトレダクターゼ変異体及びその応用 | |
| JP7022819B2 (ja) | トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用 | |
| JP7462795B2 (ja) | トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用 | |
| KR20230145092A (ko) | 에스테라아제 돌연변이체 및 이의 응용 | |
| JP7083408B2 (ja) | アミノ酸デヒドロゲナーゼ突然変異体及びその応用 | |
| CN110055230B (zh) | 单加氧酶突变体及其应用 | |
| JP2022512839A (ja) | モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその応用 | |
| CN110713992B (zh) | 酮还原酶突变体及生产手性醇的方法 | |
| JP7263557B2 (ja) | アミノ基転移酵素突然変異体及びその応用 | |
| KR20210153117A (ko) | 모노옥시게나아제 돌연변이체 및 이의 응용 | |
| JP7375052B2 (ja) | ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法 | |
| JPWO2016153053A1 (ja) | 改変ポリメラーゼ | |
| JP2023500967A (ja) | ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法 | |
| WO2023201809A1 (zh) | 转氨酶突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210521 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210521 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220506 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220805 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221125 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230213 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230526 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230607 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7293351 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |