JP2023500967A - ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法 - Google Patents
ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023500967A JP2023500967A JP2022527053A JP2022527053A JP2023500967A JP 2023500967 A JP2023500967 A JP 2023500967A JP 2022527053 A JP2022527053 A JP 2022527053A JP 2022527053 A JP2022527053 A JP 2022527053A JP 2023500967 A JP2023500967 A JP 2023500967A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pet
- group
- ketoreductase
- amino acid
- mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101001110310 Lentilactobacillus kefiri NADP-dependent (R)-specific alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 title claims abstract description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 46
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- -1 ketone compound Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 102220067424 rs757120802 Human genes 0.000 claims description 149
- 102220573086 Claudin-14_A94V_mutation Human genes 0.000 claims description 96
- 102200006535 rs104894361 Human genes 0.000 claims description 60
- 102220283965 rs1426424086 Human genes 0.000 claims description 60
- 102200142011 rs121909050 Human genes 0.000 claims description 43
- 102220198194 rs1057519905 Human genes 0.000 claims description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 25
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 24
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 20
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 claims description 18
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 16
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 14
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical group C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 13
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 12
- 125000001313 C5-C10 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 11
- 102200081484 rs1553259760 Human genes 0.000 claims description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 10
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 6
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 6
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 6
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 6
- 102220596420 Centrosomal protein of 63 kDa_K71R_mutation Human genes 0.000 claims description 5
- 102220520419 Oxidoreductase NAD-binding domain-containing protein 1_F59C_mutation Human genes 0.000 claims description 5
- 102220471762 Proteasome subunit alpha type-7_K28A_mutation Human genes 0.000 claims description 5
- 102220196059 rs1057518086 Human genes 0.000 claims description 5
- 102220005392 rs34259907 Human genes 0.000 claims description 5
- 102220543801 39S ribosomal protein L15, mitochondrial_K28R_mutation Human genes 0.000 claims description 4
- 125000000172 C5-C10 aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 125000004209 (C1-C8) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- 102220565400 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP5_K28Q_mutation Human genes 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102220198193 rs1057519904 Human genes 0.000 claims description 3
- 102220031208 rs201534650 Human genes 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 102220510029 Importin-7_K61D_mutation Human genes 0.000 claims 2
- 102220005372 rs281860646 Human genes 0.000 claims 2
- 101100545108 Bacillus subtilis (strain 168) yxjB gene Proteins 0.000 claims 1
- 102220580937 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1_K40R_mutation Human genes 0.000 claims 1
- 102220613970 Protein delta homolog 1_M16R_mutation Human genes 0.000 claims 1
- 102220232854 rs766277488 Human genes 0.000 claims 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 26
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 10
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 102220226383 rs973493604 Human genes 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 102220262613 rs1554429221 Human genes 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- NTPLXRHDUXRPNE-UHFFFAOYSA-N 4-methoxyacetophenone Chemical compound COC1=CC=C(C(C)=O)C=C1 NTPLXRHDUXRPNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220511091 APC membrane recruitment protein 1_K44R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102000005751 Alcohol Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108010031132 Alcohol Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 101710132699 Lysozyme 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100026848 Lysozyme-like protein 2 Human genes 0.000 description 2
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- HCEKGPAHZCYRBZ-UHFFFAOYSA-N 1-(3-fluorophenyl)ethanone Chemical compound CC(=O)C1=CC=CC(F)=C1 HCEKGPAHZCYRBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220511113 APC membrane recruitment protein 1_K46S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001539125 Acetobacter pasteurianus 386B Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100021973 Carbonyl reductase [NADPH] 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000186394 Eubacterium Species 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010036197 NAD phosphite oxidoreductase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 102220389202 c.83A>T Human genes 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N ethyl acetoacetate Chemical compound CCOC(=O)CC(C)=O XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 150000004675 formic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010084715 isopropanol dehydrogenase (NADP) Proteins 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 1
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- IMACFCSSMIZSPP-UHFFFAOYSA-N phenacyl chloride Chemical compound ClCC(=O)C1=CC=CC=C1 IMACFCSSMIZSPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 102220044801 rs587781587 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01184—Carbonyl reductase (NADPH) (1.1.1.184)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの製造方法を開示する。該ケトレダクターゼ突然変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列においてアミノ酸突然変異が起こった配列を有し、突然変異の部位はＫ２００Ｈを含む。本発明では、突然変異により得られる突然変異体は、ケトン系化合物を原料として、立体特異的還元の作用により、キラルアルコールを効率よく製造することができ、且つ安定性を極めて大きく向上させ、キラルアルコールの工業的製造への普及に適している。【選択図】なし
Description
本発明は、化合物合成の技術分野に関し、具体的には、ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法に関する。
キラルアルコールは、自然界に広く存在し、多くの重要な生物活性分子の構造単位であり、天然産物とキラル医薬品を合成する重要な中間体である。多くのキラル医薬品は、１つ又は複数のキラル中心を含む。異なるキラル医薬品の薬理学的活性、代謝過程、代謝速度及び毒性には、顕著な差異がある。通常、１つのエナンチオマーは、有効であり、別のエナンチオマーは、効果が低く又は無効であり、さらに有毒である。そのため、キラル中心を含む化合物をいかに効率的且つ立体特異的に構築するかは、医薬の研究や開発において重要な意義がある。
ケトレダクターゼ（Ketoreductase、ＫＲＥＤ）は、カルボニルレダクターゼ（Carbony-reductase）とも呼ばれ、酵素分類番号がＥＣ １．１．１．１８４であり、プロキラルアルデヒドやケトンを還元してキラルアルコールを製造することによく用いられている。ＫＲＥＤは、アルデヒド類やケトン類基質を対応するアルコール製品に転化するだけではなく、その逆反応を触媒し、すなわちアルコール基質を触媒し酸化して対応するアルデヒドやケトンを得ることもできる。ケトレダクターゼで触媒される反応には、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）を含む補因子の関与が必要とされる。
アルデヒドやケトンの還元反応には、一般的に還元型の補因子ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの関与が必要である。実際の反応では、酸化型の補因子ＮＡＤ＋やＮＡＤＰ＋を添加し、次に、適切な補因子再生系により還元型のＮＡＤＨやＮＡＤＰＨに再生する。よく使われる補因子再生系には、グルコースとグルコース脱水素酵素、ギ酸塩とギ酸脱水素酵素、第二級アルコールと第二級アルコール脱水素酵素、亜リン酸塩と亜リン酸脱水素酵素、及びその他の類似系が含まれる。一般に、補酵素再生系の入れ換えは、ケトレダクターゼの機能に実質的な影響を与えない。
多くのＫＲＥＤはすでに商業化製造に用いられている。しかし、一般的に、ＫＲＥＤは応用中に安定性が低いという欠点があり、具体的には、熱安定性及び有機溶剤の耐性に表されている。指向性進化の手段を通じて酵素を改変することにより、酵素の安定性を高め、それによって製造によく応用することができる。
本発明は、ケトレダクターゼの安定性を向上させるために、ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成させるために、本発明の一態様によれば、ケトレダクターゼ突然変異体を提供する。該ケトレダクターゼ突然変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列においてアミノ酸突然変異が起こった配列を有し、突然変異の部位はＫ２００Ｈを含む。
さらに、突然変異の部位は、さらに、少なくとも、Ａ１５、Ｋ２８、Ｇ３６、Ｋ３９、Ｇ４３、Ｑ４４、Ａ４６、Ｖ４７、Ｆ５９、Ｋ６１、Ｔ６５、Ｋ７１、Ａ９４Ｖ、Ａ１４４、Ｍ１４６、Ｙ１５２、Ｎ１５６、Ｉ８６、Ｋ２０８、及びＫ２３７のうちの１つを含み、又はケトレダクターゼ突然変異体のアミノ酸配列は、突然変異が起こったアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異が起こったアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
さらに、突然変異の部位は、さらに、少なくとも、Ａ１５Ｃ、Ｋ２８Ａ／Ｅ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ｇ３６Ｃ、Ｋ３９Ｉ／Ｖ、Ｇ４３Ｃ／Ｍ、Ｑ４４Ｒ、Ａ４６Ｃ、Ｖ４７Ｃ、Ｆ５９Ｃ、Ｋ６１Ｅ／Ｈ、Ｔ６５Ａ、Ｋ７１Ｒ、Ａ９４Ｖ、Ａ１４４Ｔ、Ｍ１４６Ｉ、Ｙ１５２Ｆ、Ｎ１５６Ｓ、Ｉ８６Ｖ、Ｋ２０８Ｒ、及びＫ２３７Ｅの突然変異のうちの１つを含む。
さらに、アミノ酸突然変異は、Q44R+N156S+K200H、Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43Mという部位組み合わせ突然変異のいずれかを含む。
さらに、起こったアミノ酸突然変異は、I86V+M146I+K200H、M146I+K200H、M146L+N156S+K200H、M146L+K200H、K200H+G201D、Q44R+M146I+K200H、K61E+K200H+K237E、I86V+M146I+K200H、M146I+K200H+G201D、M146L+K200H+G201D、N156S+K200H+G201D、K200H+G201D+K237E、K28E+M146I+K200H+G201D、K28E+M146L+K200H+G201D、K28E+N156S+K200H+G201D、Q44R+M146L+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D、I86V+M146I+K200H+K61H、I86V+M146I+K200H+K208R、I86V+M146I+K200H+G201D、I86V+M146L+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+V47C+F59C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+G43C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28Q、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28S、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+I39V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K71R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+A144T、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+Y152F、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K28E、及びQ44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36Cという部位組み合わせ突然変異のうちのいずれかを含む。
本発明の別の態様によれば、ＤＮＡ分子を提供する。該ＤＮＡ分子は上記ケトレダクターゼ突然変異体をコードする。
本発明のさらに別の態様によれば、組換えプラスミドを提供する。該組換えプラスミドには、上記ＤＮＡ分子が連結されている。
さらに、組換えプラスミドはpET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18又はpUC-19である。
本発明のさらに別の態様によれば、宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、上記いずれか１種の組換えプラスミドを含有する。
さらに、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含み、好ましくは、原核細胞は、大腸菌である。
本発明の別の態様によれば、キラルアルコールの製造方法を提供する。該方法は、プロキラルケトン系化合物の還元反応をケトレダクターゼで触媒してキラルアルコールを製造するステップを含み、ケトレダクターゼは、上記いずれか１種のケトレダクターゼ突然変異体である。
さらに、キラルケトン系化合物は、下記構造式を有し、
式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はヘテロアリール基であり、若しくは、Ｒ１及びＲ２は、カルボニル基上の炭素とともに複素環式基、炭素環式基又はヘテロアリール基を形成し、複素環式基及びヘテロアリール基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、アリール基のうちのアリール基、ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、炭素環式基のうちの炭素環式基又は複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して、未置換又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換され、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ８アルキル基、Ｃ５～Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ５～Ｃ１０アリール基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基であり、若しくは、Ｒ１及びＲ２は、カルボニル基上の炭素とともにＣ５～Ｃ１０複素環式基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、Ｃ５～Ｃ１０複素環式基及びＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、Ｃ５～Ｃ１０アリール基のうちのアリール基、Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して、未置換又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換され、
好ましくは、ケトン系化合物は下記構造式を有し、
式中、Ｒ３はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣＨ３であり、Ｒ４はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣＨ３であり、Ｒ５はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、ＯＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３であり、
より好ましくは、ケトン系化合物は下記構造式を有する。
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ８アルキル基、Ｃ５～Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ５～Ｃ１０アリール基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基であり、若しくは、Ｒ１及びＲ２は、カルボニル基上の炭素とともにＣ５～Ｃ１０複素環式基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、Ｃ５～Ｃ１０複素環式基及びＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、Ｃ５～Ｃ１０アリール基のうちのアリール基、Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して、未置換又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換され、
好ましくは、ケトン系化合物は下記構造式を有し、
より好ましくは、ケトン系化合物は下記構造式を有する。
さらに、ケトレダクターゼを用いてケトン系化合物を還元反応させてキラルアルコールを生産する反応系には、補酵素、補酵素再生系及び緩衝液がさらに含まれている。
さらに、反応系において、ケトン系化合物の濃度が１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌである。
さらに、反応系のｐＨ値が５～９であり、反応系の反応温度が４～６０℃である。
さらに、補酵素はＮＡＤＨである。
さらに、補酵素再生系は、イソプロパノール、補酵素ＮＡＤ＋、及びケトレダクターゼを含む。
さらに、緩衝液は、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液、バルビタールナトリウム－塩酸緩衝液又はクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液である。
本発明では、突然変異により得られる突然変異体は、ケトン系化合物を原料として、立体特異的還元の作用により、キラルアルコールを効率よく製造することができ、しかも、安定性を極めて大きく向上させ、キラルアルコールの工業的製造への普及に適している。
なお、矛盾しない限り、本出願の実施例及び実施例の特徴を互いに組み合わせることができる。以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明する。
名詞の解釈：
「ケトレダクターゼ」及び「ＫＲＥＤ」は、本出願において相互に交換して使用することができ、ケトン基を対応するアルコールに還元することができるポリペプチドを意味する。具体的には、本出願のケトレダクターゼポリペプチドは、ケトン化合物を対応するアルコール産物に立体特異的に還元することができる。このポリペプチドは、通常、還元剤として補因子である還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を利用する。本出願において、ケトレダクターゼには、天然に存在する（野生型）ケトレダクターゼと、人工的な処理により生産された非天然に存在するケトレダクターゼ突然変異体とが含まれる。
「ケトレダクターゼ」及び「ＫＲＥＤ」は、本出願において相互に交換して使用することができ、ケトン基を対応するアルコールに還元することができるポリペプチドを意味する。具体的には、本出願のケトレダクターゼポリペプチドは、ケトン化合物を対応するアルコール産物に立体特異的に還元することができる。このポリペプチドは、通常、還元剤として補因子である還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を利用する。本出願において、ケトレダクターゼには、天然に存在する（野生型）ケトレダクターゼと、人工的な処理により生産された非天然に存在するケトレダクターゼ突然変異体とが含まれる。
「天然に存在する」又は「野生型」は、「突然変異体」に対して、自然界で発見された形態を指す。例えば、天然に存在する又は野生型のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、生物に存在する配列であって、自然界の由来から単離することができ、人為的に意図的に修飾又は改変されていないものである。
本出願において、例えば、細胞、核酸又はポリペプチドの「組換え」が記載された場合、既に、自然界には存在しない方式に修飾されたもの、又は自然界に存在する形態と同一であるが、合成材料、及び／又は組換え技術を用いた処理により調製又は誘導されて獲得されたもの、又は天然又は固有の形態に対応する細胞、核酸又はポリペプチドを指す。ここで、非限定的な例としては、細胞内で固有の（非組換え）形態以外の遺伝子を発現している、又は固有の遺伝子を異なるレベルで発現している組換え細胞が含まれる。
「配列相同性の百分率」とは、ポリヌクレオチドアラインメントを指し、比較窓を跨いで２つの最適なアラインメントの配列を比較することにより決定され、ここで、比較窓におけるポリヌクレオチド配列の部分は、基準配列に比べて、２つの配列の最適なアラインメントに用いるために、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含むことができる。この百分率は、２つの配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が出現する位置の数を決定して整合する位置の数を生成し、整合する位置の数を比較窓内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列相同性の百分率を得ることにより算出することができる。特異的に、百分率は、２つの配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が出現し、若しくは核酸塩基又はアミノ酸残基がギャップとアラインメントする位置の数を決定して整合する位置の数を生成し、整合する位置の数を比較窓内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列相同性の百分率を得ることにより算出することができる。ここで、「基準配列」とは配列比較の基礎となる指定配列を指す。基準配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、全長遺伝子又はポリペプチド配列のセグメントであってもよい。
部位特異的突然変異：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法を通じて目的ＤＮＡ断片（ゲノムでもプラスミドでもよい）に必要な変化（通常は有利な方向を特徴付ける変化）を導入することを指し、塩基の追加、削除、点突然変異などを含む。部位特異的突然変異は、ＤＮＡが発現する目的タンパク質の性状及び特徴を迅速且つ効率的に高めることができ、遺伝子研究における非常に有用な手段である。
Acetobacter pasteurianus 386Bに由来のケトレダクターゼＫＲＥＤ突然変異体であるＥ１４４Ａ＋Ｌ１５２Ｙ＋Ｌ１９８Ｑ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｇ６Ｓ＋Ｌ１４６Ｍ＋１４７Ｖ＋Ｄ４２Ｅ＋Ｔ１９９Ｖ（本発明のテンプレートとして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する。本発明では、「Ｅ１４４Ａ」を例として、「元のアミノ酸＋部位＋突然変異後のアミノ酸」、即ち、第１４４位のＥはＡに変更されたものである。）は、目的基質を触媒して生成物を得ることを示すが、その安定性には改良する余裕がある。本発明では、指向進化の方法を通じてＫＲＥＤの安定性向上を図る。
SEQ ID NO:1:
MARVASKVAIVSGAANGIGKATAQLLAKEGAKVVIGDLKEEEGQKAVAEIKAAGGEAAFVKLNVTDEAAWKAAIGQTLKLYGRLDIAVNNAGIAYSGSVESTSLEDWRRVQSINLDGVFLGTQVAIEAMKKSGGGSIVNLSSIAGMVGDPMYAAYNASKGGVRLFTKSAALHCAKSGYKIRVNSVHPGYIWTPMVAGQVKGDAAARQKLVDLHPIGHLGEPNDIAYGILYLASDESKFVTGSELVIDGGYTAQ
MARVASKVAIVSGAANGIGKATAQLLAKEGAKVVIGDLKEEEGQKAVAEIKAAGGEAAFVKLNVTDEAAWKAAIGQTLKLYGRLDIAVNNAGIAYSGSVESTSLEDWRRVQSINLDGVFLGTQVAIEAMKKSGGGSIVNLSSIAGMVGDPMYAAYNASKGGVRLFTKSAALHCAKSGYKIRVNSVHPGYIWTPMVAGQVKGDAAARQKLVDLHPIGHLGEPNDIAYGILYLASDESKFVTGSELVIDGGYTAQ
本出願では、まず、部位特異的突然変異によりＫＲＥＤに突然変異部位を導入し、突然変異体について活性を検出し、活性が向上した突然変異体を選出する。この中で、突然変異体Ｅ１４４Ａ＋Ｌ１５２Ｙ＋Ｌ１９８Ｑ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｇ６Ｓ＋Ｌ１４６Ｍ＋１４７Ｖ＋Ｄ４２Ｅ＋Ｔ１９９Ｖ＋Ｋ２００Ｈは、出発テンプレートと比較して、安定性が約３倍向上している。その後、安定性がより顕著に向上した突然変異体を得るために、Ｅ１４４Ａ＋Ｌ１５２Ｙ＋Ｌ１９８Ｑ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｇ６Ｓ＋Ｌ１４６Ｍ＋１４７Ｖ＋Ｄ４２Ｅ＋Ｔ１９９Ｖ＋Ｋ２００Ｈをテンプレートとしてさらに突然変異を行う。
全プラスミドＰＣＲを利用して部位特異的突然変異を導入するのは、簡単で有効であり、しかも現在広く使用されている手段である。その原理は以下のとおりである。突然変異部位を含む一対のプライマー（順方向、逆方向）とテンプレートプラスミドとをアニーリングした後に、ポリメラーゼで「循環伸長」する。いわゆる循環伸長とは、ポリメラーゼがテンプレートに従ってプライマーを伸長し、１周後にプライマーの５’末端に戻って終了し、さらに繰り返した加熱アニーリングと伸長の循環をしたことである。この反応は、ローリング増幅と異なり、複数のタンデム複製を形成しない。この順方向・逆方向プライマーの伸長産物は、アニーリング後にペアリングされ、ニックの入った開環プラスミドとなる。ＤｐｎＩ酵素によって伸長産物を切断する。従来のテンプレートプラスミドは、一般的な大腸菌由来であり、ｄａｍメチル化修飾をしたものであるため、ＤｐｎＩに敏感であるので細断される。一方、インビトロで合成された突然変異配列を有するプラスミドは、メチル化されていないために切断されないため、その後の形質転換に成功し、突然変異プラスミドのクローンが得られる。突然変異プラスミドを宿主細胞に形質転換し、目的タンパク質の発現を誘導した後に、細胞を超音波破砕する方法により粗酵素を得る。ケトレダクターゼ誘導発現の最適条件：２５℃で、０．１ｍＭ ＩＰＴＧで１６ｈ誘導する。
本発明の代表的な実施形態において、ケトレダクターゼ突然変異体を提供する。このケトレダクターゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列においてアミノ酸突然変異が起こった配列を有し、突然変異部位はＫ２００Ｈを含む。本発明の突然変異により得られる突然変異体は、ケトン系化合物を原料として、立体特異的還元の作用によりキラルアルコールを効率的に製造することができ、安定性を極めて大きく向上させ、キラルアルコールの工業的製造への普及に適している。
好ましくは、突然変異部位は、さらに、Ａ１５、Ｋ２８、Ｇ３６、Ｋ３９、Ｇ４３、Ｑ４４、Ａ４６、Ｖ４７、Ｆ５９、Ｋ６１、Ｔ６５、Ｋ７１、Ａ９４Ｖ、Ａ１４４、Ｍ１４６、Ｙ１５２、Ｎ１５６、Ｉ８６、Ｋ２０８及びＫ２３７のうちの少なくとも１つを含み、又はケトレダクターゼ突然変異体のアミノ酸配列は、突然変異が起こったアミノ酸配列における突然変異部位を有し、かつ、突然変異が起こったアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。上記部位の突然変異は、酵素の安定性をさらに向上させることができる。より好ましくは、突然変異部位は、Ａ１５Ｃ、Ｋ２８Ａ／Ｅ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ｇ３６Ｃ、Ｋ３９Ｉ／Ｖ、Ｇ４３Ｃ／Ｍ、Ｑ４４Ｒ、Ａ４６Ｃ、Ｖ４７Ｃ、Ｆ５９Ｃ、Ｋ６１Ｅ／Ｈ、Ｔ６５Ａ、Ｋ７１Ｒ、Ａ９４Ｖ、Ａ１４４Ｔ、Ｍ１４６Ｉ、Ｙ１５２Ｆ、Ｎ１５６Ｓ、Ｉ８６Ｖ、Ｋ２０８Ｒ及びＫ２３７Ｅのうちの突然変異の少なくとも１つをさらに含む。ここで、「／」は「又は」を表す。
本発明の代表的な実施形態において、アミノ酸突然変異は、Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H、Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43Mという部位組み合わせ突然変異のいずれかを含む。
より好ましくは、起こったアミノ酸突然変異は、I86V+M146I+K200H、M146I+K200H、M146L+N156S+K200H、M146L+K200H、K200H+G201D、Q44R+M146I+K200H、K61E+K200H+K237E、I86V+M146I+K200H、M146I+K200H+G201D、M146L+K200H+G201D、N156S+K200H+G201D、K200H+G201D+K237E、K28E+M146I+K200H+G201D、K28E+M146L+K200H+G201D、K28E+N156S+K200H+G201D、Q44R+M146L+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D、I86V+M146I+K200H+K61H、I86V+M146I+K200H+K208R、I86V+M146I+K200H+G201D、I86V+M146L+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+V47C+F59C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+G43C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28Q、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28S、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+I39V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K71R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+A144T、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+Y152F、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K28E、及びQ44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36Cという部位組み合わせ突然変異のいずれかを含む。
本発明の代表的な実施形態によれば、ＤＮＡ分子を提供する。該ＤＮＡ分子は、上記ケトレダクターゼ突然変異体をコードする。該ＤＮＡ分子がコードする上記ケトレダクターゼは、非常に良い活性を有する。
本発明の上記ＤＮＡ分子は、また、「発現カセット」の形で存在してもよい。「発現カセット」とは、線状又は環状の核酸分子であって、適切な宿主細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を指導することができるＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含む核酸分子を指す。一般的には、目的ヌクレオチドに有効に連結されたプロモーターが含まれ、特異的に、終了シグナル及び／又は他の制御要素に有効に連結されている。発現カセットは、また、ヌクレオチド配列の正しい翻訳に必要な配列を含んでもよい。コード領域は、通常、目的タンパク質をコードするが、センス方向又はアンチセンス方向において、アンチセンスＲＮＡや非翻訳ＲＮＡなどの目的機能ＲＮＡもコードする。目的ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、その少なくとも１つの成分が他の少なくとも１つの成分と異種であることを意味するキメラであってもよい。発現カセットは、また、天然に存在するが、異種発現のための効果的な組換えにより形成し獲得されるものであることができる。
本発明の代表的な実施形態によれば、組換えプラスミドを提供する。該組換えプラスミドは、上記のいずれかのＤＮＡ分子を含む。上記組換えプラスミド中のＤＮＡ分子を組換えプラスミドの適切な位置に配置することにより、上記ＤＮＡ分子を正確かつ円滑に複製、転写又は発現することが可能になる。
本発明では、上記ＤＮＡ分子を限定する際に用いる限定語は「含む」であるが、ＤＮＡ配列の両端にその機能と関連しない他の配列を任意に付加してもよいわけではない。組換え操作の要件を満たすためには、ＤＮＡ配列の両端に適切な制限エンドヌクレアーゼの酵素切断部位を追加するか、又は始動コドン、終止コドンなどを追加する必要があるので、閉鎖的な表現で限定すれば、これらの状況を確実にカバーすることができないことは当業者に知られている。
本発明で使用される用語「プラスミド」は、二本鎖、一本鎖線状又は環状の形態の任意のプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はアグロバクテリウム二元核酸分子を含み、好ましくは、組換え発現プラスミドであり、原核発現プラスミドであってもよいし、真核発現プラスミドであってもよいが、好ましくは原核発現プラスミドであり、いくつかの実施態様では、組換えプラスミドは、pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18又はpUC-19から選ばれる。より好ましくは、上記組換えプラスミドはpET-22b(+)である。
本発明の代表的な実施形態によれば、宿主細胞を提供し、宿主細胞は、上記いずれかの組換えプラスミドを含有する。本発明に適用できる宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞を含むが、これらに制限されない。好ましくは、原核細胞は、真正細菌、例えばグラム陰性菌又はグラム陽性菌である。より好ましくは、原核細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞である。
本発明の代表的な実施形態によれば、キラルアルコールの生産方法を提供する。該方法は、ケトレダクターゼを用いてキラルケトン系化合物を還元反応させてキラルアルコールを生産するステップを含み、ケトレダクターゼは、上記いずれかのケトレダクターゼ突然変異体である。本発明の上記ケトレダクターゼ突然変異体が非常に良い活性を有するため、本発明のケトレダクターゼ突然変異体を用いて製造されるキラルアルコールは、反応速度を向上させ、基質の濃度を高め、酵素用量を減少させ、後処理の難度を低減させることができる。
本出願では、キラルケトン系化合物は、下記構造式を有するものを含むが、これに制限されるものではなく、
式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はヘテロアリール基であり、若しくは、Ｒ１及びＲ２は、カルボニル基上の炭素とともに複素環式基、炭素環式基又はヘテロアリール基を形成し、前記複素環式基及びヘテロアリール基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、前記アリール基のうちのアリール基、ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、炭素環式基のうちの炭素環式基又は複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して、未置換又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換され、好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ８アルキル基、Ｃ５～Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ５～Ｃ１０アリール基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基であり、若しくは、Ｒ１及びＲ２は、カルボニル基上の炭素とともにＣ５～Ｃ１０複素環式基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、Ｃ５～Ｃ１０複素環式基及びＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、Ｃ５～Ｃ１０アリール基のうちのアリール基、Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して、未置換又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換され、
好ましくは、ケトン系化合物の構造は、下記構造式を有し、
式中、Ｒ３はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣＨ３であり、Ｒ４はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣＨ３であり、Ｒ５はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、ＯＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３であり、
より好ましくは、ケトン系化合物は下記構造式を有する。
好ましくは、ケトン系化合物の構造は、下記構造式を有し、
より好ましくは、ケトン系化合物は下記構造式を有する。
本出願の前述宿主細胞は、ケトレダクターゼの発現及び単離に用いられ、又は、特異的に、ケトン基質をキラルアルコール産物に転化することに直接用いられ得る。好ましくは、原核細胞は大腸菌である。
上述した還元反応には一般に補因子が必要であり、この補因子は、通常ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨであり、且つ該還元反応は、該補因子を再生するための系、例えばＤ－グルコース、補酵素ＮＡＤ＋及びグルコース脱水素酵素ＧＤＨ；ギ酸根化合物、補酵素ＮＡＤ＋及びギ酸根脱水素酵素ＦＤＨ；又はイソプロパノール、補酵素ＮＡＤ＋及びアルコール脱水素酵素ＡＤＨを含んでもよい。純化したケトレダクターゼを用いたいくつかの実施形態では、このような補因子、及び特異的にこのような補因子再生系は、通常、基質及びケトレダクターゼとともに反応媒体に添加される。ケトレダクターゼと同様に、補因子再生系を含む任意の酵素は、このような細胞の抽出物又は溶解産物の形態であってもよく、又は、純化した酵素として反応混合物に添加される。細胞抽出物又は細胞溶解産物を用いた実施態様では、抽出物又は溶解産物を産生するための細胞は、補因子再生系だけを含有する、又は補因子再生系とケトレダクターゼを含有する酵素を発現するものであることができる。全細胞を用いた実施態様では、該細胞は、補因子再生系とケトレダクターゼを含有する酵素を発現するものであることができる。
全細胞、細胞抽出物又は純化したケトレダクターゼの使用にかかわらず、単一のケトレダクターゼを使用するか、又は特異的に２種以上のケトレダクターゼの混合物を使用することができる。
ケトレダクターゼを用いてキラルケトン系化合物を還元反応させてキラルアルコールを生産する反応系には、補酵素、補酵素再生系及び緩衝液がさらに含まれている。
本発明のケトレダクターゼ突然変異体は、触媒活性が高いため、基質の濃度を高め、生産効率を向上させることができ、反応系において、キラルケトン系化合物の濃度が１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌである。
反応系のｐＨ値が５～９であり、反応系の反応温度が４～６０℃であり、緩衝液は、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液、バルビタールナトリウム－塩酸緩衝液又はクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液である。
以下、実施例を参照して本発明の有益な効果をさらに説明する。
本出願では、酵素活性の検出方法は以下のとおりである。
１．試薬の調製：
基質としての（Ｒ）－１－（２,４－ジクロロアセトフェノン）母液６０ｍＭは、下記の通りである：５６．７ｍｇを秤量して０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＢ）ｐＨ７．０ Ｂｕｆｆｅｒ５ｍＬに溶解し、５０℃の水浴鍋に入れて溶解した。
基質としての（Ｒ）－１－（２,４－ジクロロアセトフェノン）母液６０ｍＭは、下記の通りである：５６．７ｍｇを秤量して０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＢ）ｐＨ７．０ Ｂｕｆｆｅｒ５ｍＬに溶解し、５０℃の水浴鍋に入れて溶解した。
ＮＡＤＨ母液１０ｍＭは、下記の通りである：３３．１７ｍｇのＮＡＤＨを秤量して０．１Ｍ ＰＢ ｐＨ７．０ Ｂｕｆｆｅｒ５ｍＬに溶解した。
２．酵素活性系：
まず酵素を加え、次に、基質である（Ｒ）－１－（２,４－ジクロロアセトフェノン）、ＮＡＤＨ及びＢｕｆｆｅｒの混合物を加え、マイクロプレートリーダに入れて、３０℃で、３４０ｎｍ波長で酵素活性を検出した。
まず酵素を加え、次に、基質である（Ｒ）－１－（２,４－ジクロロアセトフェノン）、ＮＡＤＨ及びＢｕｆｆｅｒの混合物を加え、マイクロプレートリーダに入れて、３０℃で、３４０ｎｍ波長で酵素活性を検出した。
検出系の調製を表１に示す。
安定性は残存活性を表し、即ち、処理後の活性と処理前の活性とのパーセンテージである。
ケトレダクターゼＫＲＥＤ突然変異体Ｅ１４４Ａ＋Ｌ１５２Ｙ＋Ｌ１９８Ｑ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｇ６Ｓ＋Ｌ１４６Ｍ＋１４７Ｖ＋Ｄ４２Ｅ＋Ｔ１９９Ｖは、本発明において単に「テンプレート」と呼ばれ、前記突然変異部位は該「テンプレート」を基に行った突然変異である。
実施例１
「テンプレート」及び突然変異体をそれぞれ４５℃、５３℃で１ｈ保温した後に、その活性を測定し、保温していない場合と比較した。安定性は、残存活性と初期活性とのパーセンテージとして表される。全ての突然変異体の熱安定性は５３℃で測定され、結果は表２に示される。
「テンプレート」及び突然変異体をそれぞれ４５℃、５３℃で１ｈ保温した後に、その活性を測定し、保温していない場合と比較した。安定性は、残存活性と初期活性とのパーセンテージとして表される。全ての突然変異体の熱安定性は５３℃で測定され、結果は表２に示される。
実施例２
飽和突然変異を組み合わせることで、突然変異部位同士に相乗作用がある突然変異体が得られ、且つそのアミノ酸の組成を最適化して組み合わせることができる。Ｑ４４Ｒ＋Ｎ１５６Ｓ＋Ｋ２００Ｈ＋Ｇ２０１Ｄをテンプレートとして、突然変異点を組み合わせ、このとき、酵素液の処理条件として６５℃で１ｈ処理した。次にその活性を測定し、保温していない場合と比較した。安定性は、その残存活性と初期活性とのパーセンテージとして表される。
飽和突然変異を組み合わせることで、突然変異部位同士に相乗作用がある突然変異体が得られ、且つそのアミノ酸の組成を最適化して組み合わせることができる。Ｑ４４Ｒ＋Ｎ１５６Ｓ＋Ｋ２００Ｈ＋Ｇ２０１Ｄをテンプレートとして、突然変異点を組み合わせ、このとき、酵素液の処理条件として６５℃で１ｈ処理した。次にその活性を測定し、保温していない場合と比較した。安定性は、その残存活性と初期活性とのパーセンテージとして表される。
ハイスループットスクリーニングにおける酵素液の調製方法は、下記の通りである：９６ウェルプレートを遠心分離して上清培地を除去し、１ウェルあたり酵素分解溶液（リゾチーム２ｍｇ／ｍＬ、ポリミキシン０．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ＝７．０）２００μＬを加え、３７℃で保温して３ｈ破砕した。酵素活性の検出方法は、下記の通りである：まず酵素を加え、次に基質として（Ｒ）－１－（２，４－ジクロロアセトフェノン）、ＮＡＤＨ及びＢｕｆｆｅｒの混合物を加え、マイクロプレートリーダに入れ、３０℃で、３４０ｎｍの波長で酵素活性を検出した。結果を表３に示す。
実施例３
Ｑ４４Ｒ＋Ｎ１５６Ｓ＋Ｋ２００Ｈ＋Ｇ２０１Ｄ＋Ｍ１４６Ｉ＋Ｋ６１Ｈ＋Ｋ２０８Ｒ＋Ａ９４Ｖ＋Ｋ３９Ｉをテンプレートとして突然変異を続けた。このときの酵素液処理条件として７１℃で１ｈ処理し、その後、活性を測定し、保温していない場合と比較し、安定性はその残存活性と初期活性とのパーセンテージとして表される。
Ｑ４４Ｒ＋Ｎ１５６Ｓ＋Ｋ２００Ｈ＋Ｇ２０１Ｄ＋Ｍ１４６Ｉ＋Ｋ６１Ｈ＋Ｋ２０８Ｒ＋Ａ９４Ｖ＋Ｋ３９Ｉをテンプレートとして突然変異を続けた。このときの酵素液処理条件として７１℃で１ｈ処理し、その後、活性を測定し、保温していない場合と比較し、安定性はその残存活性と初期活性とのパーセンテージとして表される。
ハイスループットスクリーニングにおける酵素液の調製方法は、下記の通りである：９６ウェルプレートを遠心分離して上清培地を除去し、１ウェル当たり２００μＬの酵素分解溶液（リゾチーム２ｍｇ／ｍＬ、ポリミキシン０．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ＝７．０）を加え、３７℃で３ｈ保温して粉砕した。酵素活性の検出方法は、下記の通りである：まず酵素を加え、次に基質である（Ｒ）－１－（２，４－ジクロロアセトフェノン）、ＮＡＤＨ及びＢｕｆｆｅｒの混合物を加え、マイクロプレートリーダに入れて、３０℃で、３４０ｎｍの波長で酵素活性を検出した。結果を表４に示す。
実施例４
酵素の安定性が向上する過程で、酵素全体の剛性が向上するので、安定性が向上した突然変異体はグルタルアルデヒドなどの化学物質、メタノールなどの有機溶媒に対する耐性が同時に向上することを示す。これは突然変異体全体の剛性向上の外的表現でもある。
酵素の安定性が向上する過程で、酵素全体の剛性が向上するので、安定性が向上した突然変異体はグルタルアルデヒドなどの化学物質、メタノールなどの有機溶媒に対する耐性が同時に向上することを示す。これは突然変異体全体の剛性向上の外的表現でもある。
前述突然変異体についてグルタルアルデヒド耐性及びメタノール耐性の試験を行った。グルタルアルデヒド耐性については、１％のグルタルアルデヒドにて１ｈ保温した後に、残存活性を測定した。アルデヒド耐性は保温しない場合の活性と保温した場合の活性とのパーセンテージとして表される。メタノール耐性については、６０％メタノール溶液にて１ｈ保温した後に、残存活性を測定した。メタノール耐性は保温しない場合の活性と保温した場合の活性とのパーセンテージとして表される。結果を表５に示す。
実施例５
突然変異体Ｑ４４Ｒ＋Ｎ１５６Ｓ＋Ｋ２００Ｈ＋Ｇ２０１Ｄ＋Ｍ１４６Ｉ＋Ｋ６１Ｈ＋Ｋ２０８Ｒ＋Ａ９４Ｖ＋Ｋ３９Ｉ＋Ａ１５Ｃ＋Ａ４６Ｃ＋Ｇ４３Ｍ＋Ｇ３６Ｃを用いて、様々な基質反応検証を行い、結果を表６に示す。
突然変異体Ｑ４４Ｒ＋Ｎ１５６Ｓ＋Ｋ２００Ｈ＋Ｇ２０１Ｄ＋Ｍ１４６Ｉ＋Ｋ６１Ｈ＋Ｋ２０８Ｒ＋Ａ９４Ｖ＋Ｋ３９Ｉ＋Ａ１５Ｃ＋Ａ４６Ｃ＋Ｇ４３Ｍ＋Ｇ３６Ｃを用いて、様々な基質反応検証を行い、結果を表６に示す。
１）２５ｍＬの反応フラスコに基質である２－クロロアセトフェノン２ｇ、０．１ＭのＰＢｐＨ７．０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ＋２０ｍｇ、ケトレダクターゼ突然変異体０．０５ｇを加え、均一に混合して全体積を１０ｍＬとし、５０℃で、２００ｒｐｍのシェーカーにて１６時間反応させた。
２）２５ｍＬの反応フラスコに基質である３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０．１ＭのＰＢｐＨ７．０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ＋２０ｍｇ、ケトレダクターゼ突然変異体０．０５ｇを加え、均一に混合して全体積を１０ｍＬとし、５０℃で、２００ｒｐｍのシェーカーにて１６時間反応させた。
３）２５ｍＬの反応フラスコに基質である４－メトキシアセトフェノン２ｇ、０．１ＭのＰＢｐＨ７．０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ＋２０ｍｇ、ケトレダクターゼ突然変異体０．０５ｇを加え、均一に混合して全体積を１０ｍＬとし、５０℃で、２００ｒｐｍのシェーカーにて１６時間反応させた。
４）２５ｍＬの反応フラスコに基質であるアセト酢酸エチル２ｇ、０．１ＭのＰＢ ｐＨ７．０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ＋２０ｍｇ、ケトレダクターゼ突然変異体０．０５ｇを加え、均一に混合して全体積を１０ｍＬとし、５０℃で、２００ｒｐｍのシェーカーにて１６時間反応させた。
以上は本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を限定するものではなく、当業者にとっては、本発明は様々な変更や変化が可能である。本発明の精神及び原則を逸脱することなく行われる修正、等同置換、改良などであれば、全て本発明の特許範囲に含まれるものとする。
Claims (18)
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列においてアミノ酸突然変異が起こった配列を有し、前記突然変異の部位はＫ２００Ｈを含むことを特徴とするケトレダクターゼ突然変異体。
- 前記突然変異の部位は、さらに、少なくとも、Ａ１５、Ｋ２８、Ｇ３６、Ｋ３９、Ｇ４３、Ｑ４４、Ａ４６、Ｖ４７、Ｆ５９、Ｋ６１、Ｔ６５、Ｋ７１、Ａ９４Ｖ、Ａ１４４、Ｍ１４６、Ｙ１５２、Ｎ１５６、Ｉ８６、Ｋ２０８、及びＫ２３７のうちの１つを含み、又は前記ケトレダクターゼ突然変異体のアミノ酸配列は、突然変異が起こったアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異が起こったアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載されたケトレダクターゼ突然変異体。
- 前記突然変異の部位は、さらに、少なくとも、Ａ１５Ｃ、Ｋ２８Ａ／Ｅ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ｇ３６Ｃ、Ｋ３９Ｉ／Ｖ、Ｇ４３Ｃ／Ｍ、Ｑ４４Ｒ、Ａ４６Ｃ、Ｖ４７Ｃ、Ｆ５９Ｃ、Ｋ６１Ｅ／Ｈ、Ｔ６５Ａ、Ｋ７１Ｒ、Ａ９４Ｖ、Ａ１４４Ｔ、Ｍ１４６Ｉ、Ｙ１５２Ｆ、Ｎ１５６Ｓ、Ｉ８６Ｖ、Ｋ２０８Ｒ、及びＫ２３７Ｅの突然変異のうちの１つを含む、ことを特徴とする請求項２に記載されたケトレダクターゼ突然変異体。
- 前記アミノ酸突然変異は、Q44R+N156S+K200H、Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43Mという部位組み合わせ突然変異のいずれかを含む、ことを特徴とする請求項３に記載されたケトレダクターゼ突然変異体。
- 起こった前記アミノ酸突然変異は、I86V+M146I+K200H、M146I+K200H、M146L+N156S+K200H、M146L+K200H、K200H+G201D、Q44R+M146I+K200H、K61E+K200H+K237E、I86V+M146I+K200H、M146I+K200H+G201D、M146L+K200H+G201D、N156S+K200H+G201D、K200H+G201D+K237E、K28E+M146I+K200H+G201D、K28E+M146L+K200H+G201D、K28E+N156S+K200H+G201D、Q44R+M146L+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D、I86V+M146I+K200H+K61H、I86V+M146I+K200H+K208R、I86V+M146I+K200H+G201D、I86V+M146L+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+V47C+F59C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+G43C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28Q、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28S、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+I39V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K71R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+A144T、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+Y152F、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K28E、及びQ44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36Cという部位組み合わせ突然変異のいずれかを含む、ことを特徴とする請求項１に記載されたケトレダクターゼ突然変異体。
- 請求項１から請求項５のいずれか１項に記載されたケトレダクターゼ突然変異体をコードする、ことを特徴とするＤＮＡ分子。
- 請求項６に記載されたＤＮＡ分子が連結されている、ことを特徴とする組換えプラスミド。
- pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18又はpUC-19である、ことを特徴とする請求項７に記載された組換えプラスミド。
- 請求項７又は８に記載された組換えプラスミドを含有する、ことを特徴とする宿主細胞。
- 原核細胞又は真核細胞を含み、好ましくは、前記原核細胞は大腸菌である、ことを特徴とする請求項９に記載された宿主細胞。
- プロキラルケトン系化合物の還元反応をケトレダクターゼで触媒してキラルアルコールを製造するステップを含むキラルアルコールの製造方法であって、
前記ケトレダクターゼは請求項１から請求項５のいずれか１項に記載されたケトレダクターゼ突然変異体である、ことを特徴とするキラルアルコールの製造方法。 - 前記キラルケトン系化合物は、下記構造式を有し、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ８アルキル基、Ｃ５～Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ５～Ｃ１０アリール基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基であり、若しくは、Ｒ１及びＲ２は、カルボニル基上の炭素とともにＣ５～Ｃ１０複素環式基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、前記Ｃ５～Ｃ１０複素環式基及びＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、前記Ｃ５～Ｃ１０アリール基のうちのアリール基、Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して、未置換又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換され、
好ましくは、前記ケトン系化合物は下記構造式を有し、
より好ましくは、前記ケトン系化合物は下記構造式を有する
- ケトレダクターゼを用いてケトン系化合物を還元反応させてキラルアルコールを生産する反応系には、補酵素、補酵素再生系及び緩衝液がさらに含まれている、ことを特徴とする請求項１１に記載された方法。
- 前記反応系において、前記ケトン系化合物の濃度が１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌである、ことを特徴とする請求項１３に記載された方法。
- 前記反応系のｐＨ値が５～９であり、前記反応系の反応温度が４℃～６０℃である、ことを特徴とする請求項１３に記載された方法。
- 前記補酵素はＮＡＤＨである、ことを特徴とする請求項１３に記載された方法。
- 前記補酵素再生系は、イソプロパノール、補酵素ＮＡＤ＋、及びケトレダクターゼを含む、ことを特徴とする請求項１６に記載された方法。
- 前記緩衝液は、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液、バルビタールナトリウム－塩酸緩衝液又はクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液である、ことを特徴とする請求項１３に記載された方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2019/116360 WO2021087894A1 (zh) | 2019-11-07 | 2019-11-07 | 酮还原酶突变体及生产手性醇的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023500967A true JP2023500967A (ja) | 2023-01-11 |
Family
ID=75848732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022527053A Pending JP2023500967A (ja) | 2019-11-07 | 2019-11-07 | ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220403421A1 (ja) |
| EP (1) | EP4056690A4 (ja) |
| JP (1) | JP2023500967A (ja) |
| WO (1) | WO2021087894A1 (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108048417A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-05-18 | 吉林凯莱英医药化学有限公司 | 酮还原酶突变体及其应用 |
| WO2019140682A1 (zh) * | 2018-01-22 | 2019-07-25 | 吉林凯莱英医药化学有限公司 | 酮还原酶突变体及其应用 |
| CN110257351A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-09-20 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 酮还原酶突变体及生产手性醇的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110713992B (zh) * | 2019-11-07 | 2021-08-03 | 凯莱英医药化学（阜新）技术有限公司 | 酮还原酶突变体及生产手性醇的方法 |
-
2019
- 2019-11-07 JP JP2022527053A patent/JP2023500967A/ja active Pending
- 2019-11-07 EP EP19951528.9A patent/EP4056690A4/en active Pending
- 2019-11-07 WO PCT/CN2019/116360 patent/WO2021087894A1/zh unknown
- 2019-11-07 US US17/774,891 patent/US20220403421A1/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108048417A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-05-18 | 吉林凯莱英医药化学有限公司 | 酮还原酶突变体及其应用 |
| WO2019140682A1 (zh) * | 2018-01-22 | 2019-07-25 | 吉林凯莱英医药化学有限公司 | 酮还原酶突变体及其应用 |
| CN110257351A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-09-20 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 酮还原酶突变体及生产手性醇的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4056690A4 (en) | 2022-12-21 |
| EP4056690A1 (en) | 2022-09-14 |
| US20220403421A1 (en) | 2022-12-22 |
| WO2021087894A1 (zh) | 2021-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110257351B (zh) | 酮还原酶突变体及生产手性醇的方法 | |
| US11162081B2 (en) | Ketoreductase mutant and application thereof | |
| CN112359027B (zh) | 细胞色素p450酶突变体及其应用 | |
| CN112391363B (zh) | 氨基酸脱氢酶突变体及其应用 | |
| JP7475499B2 (ja) | ケトレダクターゼ突然変異体及びその適用 | |
| JP2024504439A (ja) | エステラーゼ変異体及びその用途 | |
| CN111235127B (zh) | 转氨酶突变体及其应用 | |
| CN110713992B (zh) | 酮还原酶突变体及生产手性醇的方法 | |
| JP2008501351A (ja) | ヒドロキシ化合物の立体選択的製造用アルコール脱水素酵素 | |
| JP7263557B2 (ja) | アミノ基転移酵素突然変異体及びその応用 | |
| CN110055230B (zh) | 单加氧酶突变体及其应用 | |
| JP7498244B2 (ja) | モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその使用 | |
| EP4053269A1 (en) | Transaminase mutant and application thereof | |
| JP2023500967A (ja) | ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法 | |
| JP7293351B2 (ja) | モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその応用 | |
| JP7375052B2 (ja) | ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法 | |
| CN114807066A (zh) | 一种酮还原酶突变体 | |
| CN114807246A (zh) | 一种生产手性醇的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220513 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230602 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230901 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231102 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240202 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240329 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240528 |