JP7475499B2 - ケトレダクターゼ突然変異体及びその適用 - Google Patents
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Description
本発明は酵素生産の分野に関し、具体的には、ケトレダクターゼ突然変異体及びその適用に関する。
キラルアルコールは、重要な中間体として、キラル薬物やその他のキラルファインケミカルの合成に広く使用されており、関連する合成報告が国内外で数多く報告されている。多くのキラル薬物には１つ又は複数のキラル中心が含まれており、様々なキラル薬物の薬理活性、代謝プロセス、代謝速度、及び毒性が顕著に異なり、通常、一方のエナンチオマーが有効であり、もう一方のエナンチオマーが非効率的又は無効で、さらには毒性がある。
したがって、キラル中心を含む化合物を効率的且つ立体選択的に構築する方法は、医薬品の研究開発において重要な意味を有する。
キラルアルコールの生産は様々であり、例えば速度論的光学分割によってラセミ体アルコールを出発原料として単一構成のアルコールを取得することができるが、当該方法の理論収率は５０％であり、コストが比較的高い。キラルオキサザボロリジンのヒドロホウ素化、キラル遷移金属ロジウム、ルビジウム等を利用して不斉接触水素化によりキラルアルコールを合成することができるが、反応条件が比較的激しく、例えば高温高圧等であり、また遷移金属等の有毒試薬の残留問題に関わる。
ケトレダクターゼは、従来の化学触媒に代わる触媒として使用され、反応が穏やかで環境汚染が少ない等の利点を有し、製薬分野で大きな注目を集めている。
生物触媒は持続可能な発展観念及びグリーン化学に合致し、生物触媒は再生可能な材料に由来し、温和な条件で触媒作用を発揮し、異なる生物触媒は類似の条件で触媒反応し、より経済的なカスケード触媒反応に設計しやすい。そのため、ケトレダクターゼを利用してキラルアルコールを触媒合成することは極めて有望な触媒方式であるが、一定の困難が存在し、特に異なる基質に対して、例えば酵素の触媒活性が低く、酵素触媒後の生成物選択性が低い等の問題があり、そのため、キラル特異性の高い高活性のケトレダクターゼを開発することは重要な意味を有する。
本発明の主な目的は、従来技術におけるケトレダクターゼ又はその突然変異体が触媒できる基質の選択性が低いという問題を解決するために、ケトレダクターゼ突然変異体及びその適用を提供することである。
上記目的を実現するために、本発明の一態様によれば、ケトレダクターゼ突然変異体を提供し、配列番号１に示されるアミノ酸配列に比べ、当該ケトレダクターゼ突然変異体のアミノ酸配列は、Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ/Ｉ/Ｌ/Ｖ、Ｍ１９４Ｌ又はＬ１５２Ｇのうちの少なくとも１つの変異部位を含み、ここで、「/」は「あるいは」を表す。
さらに、ケトレダクターゼ突然変異体のアミノ酸配列は、Ｑ２４Ｌ、Ｖ３４Ｍ、Ｉ３５Ｖ、Ａ７２Ｖ、Ｌ８０Ｒ、Ｔ９４Ｓ、Ｙ９５Ｆ、Ｖ９９Ｔ、Ｓ１０１Ｎ、Ｌ１０４Ｓ、Ｉ１４３Ｖ、Ｉ１４７Ｖ、Ａ１５３Ｔ、Ｙ１７８Ｃ、Ｖ１８５Ｉ、Ｙ１８９Ｆ/Ｗ、Ｉ１９０Ｔ、Ｐ１９３Ｈ、Ｖ１９５Ｉ、Ｔ１９９Ｉ、Ｅ２０１Ｇ/Ｄ/Ｈ、Ｄ２０２Ａ、Ａ２０３Ｇ/Ｓ、Ｒ２０６Ｑ、Ｄ２３４Ｖ、Ｋ２３７Ｅ及びＴ２４０Ｉ等の突然変異部位の１つを含み、又はケトレダクターゼ突然変異体は突然変異が生じたアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異が生じたアミノ酸配列とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
さらに、ケトレダクターゼ突然変異体のアミノ酸配列は、Ｓ９６Ｗ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｙ１８９Ｆ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ、Ｔ９４Ｓ＋Ｓ９６Ｉ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｔ９４Ｓ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４７Ｖ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ａ１５３Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｑ２４Ｌ＋Ａ７２Ｖ＋Ｓ１０１Ｎ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｄ２３４Ｖ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｋ２３７Ｅ、Ｓ９６Ｗ＋Ｐ１９３Ｈ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｖ３４Ｍ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｈ、Ｌ８０Ｒ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｄ２３４Ｖ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｔ１９９Ｉ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｖ９９Ｔ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｌ１０４Ｓ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｉ３５Ｖ＋Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｖ１８５Ｉ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ＋Ｔ２４０Ｉ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１７８Ｃ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｒ２０６Ｑ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ａ２０３Ｓ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｒ２０６Ｑ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｄ２０１Ｇ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｙ１８９Ｗ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１７８Ｃ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｒ２０６Ｑ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ａ２０３Ｓ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１７８Ｃ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｄ２０２Ａ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１７８Ｃ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｄ２０２Ａ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｒ２０６Ｑのいずれかの組み合わせの突然変異部位を有する。
上記目的を実現するために、本発明の第２の態様によれば、ＤＮＡ分子を提供し、ＤＮＡ分子は上記いずれかのケトレダクターゼ突然変異体をコードする。
本発明の第３の態様によれば、組換えプラスミドを提供し、組換えプラスミドは上記記載のＤＮＡ分子が接続されている。
本発明の第４の態様によれば、宿主細胞を提供し、宿主細胞は上記いずれか１つの組換えプラスミドを含有する。
さらに、宿主細胞は原核細胞又は真核細胞を含み、好ましくは、原核細胞は大腸菌である。
本発明の第５の態様によれば、キラルアルコールの生産方法を提供し、方法は、上記いずれか１つのケトレダクターゼ突然変異体を用いて式(Ｉ)に示すキラルケトン系化合物の還元反応を触媒してキラルアルコールを生産するステップを含み、
ここで、ｎは０、１、２又は３であり、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、置換又は非置換のＣ1-10のアルキル、置換又は非置換のＣ3-6のシクロアルキル、置換又は非置換のＣ6-12のアリール、置換又は非置換のＣ3-6のヘテロシクリルから選択され、あるいは、Ｒ１はベンゼン環であり、且つ結合した複素環と共に縮合環系を形成する。
さらに、式(Ｉ)に示すキラルケトン系化合物は
さらに、ケトレダクターゼ突然変異体とキラルケトン系化合物との質量比は０.１～１０:１であり、好ましくは、還元反応系におけるケトン系化合物の濃度は１g/L～１００g/Lであり、好ましくは、２０～４５℃で還元反応を行う。
本発明の技術案を適用し、本願は合理的設計とランダム突然変異を結合する方法によって既存のケトレダクターゼ突然変異体のタンパク質を合理的に改変し、且つ得られた突然変異体に対して本願の基質ケトンを用いて触媒活性及び立体選択性選別を行い、最終的に高選択性及び高活性の突然変異体の菌株を得て、これらの突然変異体を含む菌株を本願のケトン系基質の触媒還元反応に適用し、その対応するキラルアルコール系化合物の生産効率を向上させることができる。
なお、本願の実施例及び実施例における特徴は、矛盾がない場合、互いに組み合わせることができる。以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明する。
「ケトレダクターゼ」及び「ＫＲＥＤ」は、本願において相互に交換して使用されることができ、ケトン基をその対応するアルコールに還元できるポリペプチドを意味する。具体的には、本願のケトレダクターゼはケトン化合物を対応するアルコール生成物に立体選択的に還元することができる。このようなケトレダクターゼは、通常、還元剤として、補因子還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤＨ)又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を利用する。
本願では、ケトレダクターゼとは、天然に存在する(野生型)ケトレダクターゼ及び人為的な処理によって産生される非天然に存在するケトレダクターゼ突然変異体に関する。
「天然に存在する」又は「野生型」は、「突然変異体」に対して、自然界で発見された形態を指す。例えば、天然に存在する又は野生型のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、生物に存在する配列であって、自然界の由来から単離することができ、人為的に意図的に修飾又は改変されていないものである。
本出願において、例えば、細胞、核酸又はポリペプチドの「組換え」が記載された場合、既に、自然界には存在しない方式に修飾されたもの、又は自然界に存在する形態と同一であるが、合成材料、及び/又は組換え技術を用いた処理により調製又は誘導されて獲得されたもの、又は天然又は固有の形態に対応する細胞、核酸又はポリペプチドを指す。ここで、非限定的な例としては、細胞内で固有の(非組換え)形態以外の遺伝子を発現している、又は固有の遺伝子を異なるレベルで発現している組換え細胞が含まれる。
「配列相同性の百分率」とは、ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間のアラインメントを指し、比較窓を跨いで２つの最適なアラインメントの配列を比較することにより決定され、ここで、比較窓におけるポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の部分は、基準配列に比べて、２つの配列の最適なアラインメントに用いるために、付加又は欠失(即ちギャップ)を含むことができる。
この百分率は、２つの配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が出現する位置の数を決定して整合する位置の数を生成し、整合する位置の数を比較窓内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列相同性の百分率を得ることにより算出することができる。任意に、百分率は、２つの配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が出現し、若しくは核酸塩基又はアミノ酸残基がギャップとアラインメントする位置の数を決定して整合する位置の数を生成し、整合する位置の数を比較窓内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列相同性の百分率を得ることにより算出することができる。
ここで、「基準配列」とは配列比較の基礎となる指定配列を指す。基準配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、全長遺伝子又はポリペプチド配列のセグメントであってもよい。
部位特異的突然変異:ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)などの方法を通じて目的ＤＮＡ断片(ゲノムでもプラスミドでもよい)に必要な変化(通常は有利な方向を特徴付ける変化)を導入することを指し、塩基の追加、削除、点突然変異などを含む。部位特異的突然変異は、ＤＮＡが発現する目的タンパク質の性状及び特徴を迅速且つ効率的に高めることができ、遺伝子研究における非常に有用な手段である。
より多くのケトン系化合物基質を、それに対応するキラルアルコール生成物に変換することを獲得するために、より多くのケトレダクターゼを開発する必要がある。酵素の合理的改造は酵素の三次元分子構造に基づいて酵素の基質結合部位、補酵素結合部位、表面及び他の部位を改変し、酵素の触媒特性を変更し、酵素活性、選択性等の特性を向上させる。
酵素の定方向進化は、タンパク質に対する不合理的設計であり、特別な進化条件を人為的に作成し、自然の進化メカニズムを模倣し、インビトロで遺伝子を改変し、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング(ＤＮＡ shuffling)等の技術を適用し、高効率のスクリーニングシステムと組み合わせて、所望の特性を有する新しい酵素を取得する。
本願は結合酵素に対する合理的改造及び定方向進化により、下記構造式(Ｉ)のケトン系化合物基質に対してそれを触媒してそれに対応するキラルアルコールに変換するケトレダクターゼを開発し、
上記構造式では、ｎは０、１、２又は３であり、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、置換又は非置換のＣ1-10のアルキル、置換又は非置換のＣ3-6のシクロアルキル、置換又は非置換のＣ6-12のアリール、置換又は非置換のＣ3-6のヘテロシクリルから選択され、あるいは、Ｒ１はベンゼン環であり、且つ結合した複素環と共に縮合環系を形成する。
本発明者らは、下記式(II)で示されるケトン系化合物を基質とし、当該種類の基質に対して、１７０個の異種由来の野生型のケトレダクターゼ及びその一部のケトレダクターゼの突然変異体を用いて触媒反応を行うことにより、異なる由来のケトレダクターゼの触媒活性及び選択性を検出した。検出により、野生型のケトレダクターゼ及びその一部の突然変異体は上記基質ケトンに対する選択性がいずれも低く、大量の光学異性体を生成し、且つ活性が一般的に低い。具体的には表１に示す。
活性上:＊＊は、５質量比の酵素を使用し、５０反応体積で１６時間触媒した後、転化率が８０％～９０％であることを示し、＊は、５質量比の酵素を使用し、５０反応体積で１６時間触媒した後、転化率が３０％～８０％であることを示し、－は、５質量比の酵素を使用し、５０反応体積で１６時間触媒した後、転化率が５％～３０％であることを示し、ＮＤは、５質量比の酵素を使用し、５０反応体積で１６時間触媒した後、転化率が５％未満又は製品が検出されないことを示す。
選択性上:－は選択性が５％未満であることを示し、＊は選択性が５％～３０％であることを示し、＊＊は選択性が３０％～６０％であることを示し、＊＊＊は選択性が６０％～９０％であることを示し、＊＊＊＊は選択性が９０％～９５％であることを示し、＊＊＊＊＊は選択性が９５％～１００％であることを示す。
上記表において、各異種由来のケトレダクターゼはいずれも野生型の酵素を意味し、その具体的な遺伝子ＩＤ番号はＮＣＢＩから検索することができる。また、各バリアントは、それぞれ、同じ種由来の野生型のケトレダクターゼが異なる部位で突然変異した突然変異体である。上記Acetobacter sp由来のバリアント１からバリアント１４とAcetobacter sp由来の野生ケトレダクターゼ変異部位との区別は具体的に以下の表に示す。
上記したように、Acetobacter pasteurianus由来のケトレダクターゼＡｃＣＲは、キラルアルコールを触媒合成することができるが、野生型のケトレダクターゼＡｃＣＲであってもその突然変異体であっても、上記類別の基質ケトンに対する選択性が低く、また活性が低く、大量の酵素を用いて触媒する必要があり、得られた製品はキラル純度が極めて低く、後処理の難度を増加し、収率が低く、ステップが複雑である。
本発明はケトレダクターゼＡｃＣＲの以上の不足に対し、さらに触媒活性及び/又は選択性がより高いケトレダクターゼを得るために、本願は上記Acetobacter pasteurianus由来のケトレダクターゼＡｃＣＲバリアント１を進化することにより、合理的設計によりＡｃＣＲタンパク質を改変し、ランダム突然変異により突然変異体タンパク質を得て、ハイスループットスクリーニング方法により有益突然変異体を定方向スクリーニングする。
本願はAcetobacter pasteurianus由来のケトレダクターゼバリアント１(本願において出発酵素又は開始酵素と呼ばれ、その具体的なアミノ酸配列は配列番号１である)を突然変異改造の基礎とし、合理的設計とランダム突然変異を結合する方法を採用してＡｃＣＲ出発酵素に対して合理的改造を行い、その選択性及び活性特性を改善する。前述した構造式(II)に示される基質ケトンを利用し、得られた突然変異体に対して触媒活性検証を行い、最終的に高選択性及び高活性の突然変異の菌株を得て、それを工業生産条件に適用させ、高キラル純度のキラルアルコールを生産する。
配列番号１:
配列番号１:
ＭＡＲＶＡＧＫＶＡＩＶＳＧＡＡＮＧＩＧＫＡＴＡＱＬＬＡＫＥＧＡＫＶＶＩＧＤＬＫＥＥＤＧＱＫＡＶＡＥＩＫＡＡＧＧＥＡＡＦＶＫＬＮＶＴＤＥＡＡＷＫＡＡＩＧＱＴＬＫＬＹＧＲＬＤＩＡＶＮＮＡＧＩＴＹＳＧＳＶＥＳＴＳＬＥＤＷＲＲＶＱＳＩＮＬＤＧＶＦＬＧＴＱＶＡＩＥＡＭＫＫＳＧＧＧＳＩＶＮＬＳＳＩＥＧＬＩＧＤＰMLＡＡＹＮＡＳＫＧＧＶＲＬＦＴＫＳＡＡＬＨＣＡＫＳＧＹＫＩＲＶＮＳＶＨＰＧＹＩＷＴＰＭＶＡＧＬＴＫＥＤＡＡＡＲＱＫＬＶＤＬＨＰＩＧＨＬＧＥＰＮＤＩＡＹＧＩＬＹＬＡＳＤＥＳＫＦＶＴＧＳＥＬＶＩＤＧＧＹＴＡＱ。
本発明の技術案は合理的設計とランダム突然変異を結合する技術によってＡｃＣＲ出発酵素タンパク質を改造し、突然変異体の触媒活性を顕著に向上させ(表３を参照)、また突然変異体の選択性を顕著に向上させ(表４を参照)、それを高純度のキラルアルコールの拡大生産に適するようにした。
上記表において、＊は、０.５質量比の酵素を使用し、５０反応体積で１６時間触媒した後、転化率が２０％未満であることを示し、＊＊は、０.５質量比の酵素を使用し、５０反応体積で１６時間触媒した後、転化率が３０％～５０％であることを示し、＊＊＊は、０.５質量比の酵素を使用し、５０反応体積で１６時間触媒した後、転化率が５０％より大きいことを示し、＊＊＊＊は、０.２質量比の酵素を使用し、２０反応体積で１６時間触媒した後、転化率が０％～５０％であることを示し、＊＊＊＊＊は、０.２質量比の酵素を使用し、５０反応体積で１６時間触媒した後、転化率が５０％～９０％であることを示し、＊＊＊＊＊＊は、０.２質量比の酵素を使用し、５０反応体積で１６時間触媒した後、転化率が９０％～１００％であることを示す。
上記表において、－は選択性が５％未満であることを示し、＊は選択性が５％～４０％であることを示し、＊＊＊は選択性が４０％～９０％であることを示し、＊＊＊＊は選択性が９０％～９５％であることを示し、＊＊＊＊＊は選択性が９５％～１００％であることを示す。
そのため、上記研究結果の上で、出願者は本願の技術案を提供する。本願の典型的な実施形態では、ケトレダクターゼ突然変異体を提供し、配列番号１に示されるアミノ酸配列に比べ、当該ケトレダクターゼ突然変異体のアミノ酸配列は、Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ/Ｉ/Ｌ/Ｖ、Ｍ１９４Ｌ、Ｌ１５２Ｇのうちの少なくとも１つの突然変異部位を含み、ここで、「/」は「あるいは」を表す。本発明の突然変異体は、構造式(Ｉ)に示すケトン系化合物を基質とし、立体選択的還元作用により、対応するキラルアルコール系化合物を効率的に生産することができ、且つ触媒活性が大幅に向上し、このようなキラルアルコールの工業生産に普及することに適する。
好ましい一実施例では、ケトレダクターゼ突然変異体のアミノ酸配列は、Ｑ２４Ｌ、Ｖ３４Ｍ、Ｉ３５Ｖ、Ａ７２Ｖ、Ｌ８０Ｒ、Ｔ９４Ｓ、Ｙ９５Ｆ、Ｖ９９Ｔ、Ｓ１０１Ｎ、Ｌ１０４Ｓ、Ｉ１４３Ｖ、Ｉ１４７Ｖ、Ａ１５３Ｔ、Ｙ１７８Ｃ、Ｖ１８５Ｉ、Ｙ１８９Ｆ/Ｗ、Ｉ１９０Ｔ、Ｐ１９３Ｈ、Ｖ１９５Ｉ、Ｔ１９９Ｉ、Ｅ２０１Ｇ/Ｄ/Ｈ、Ｄ２０２Ａ、Ａ２０３Ｇ/Ｓ、Ｒ２０６Ｑ、Ｄ２３４Ｖ、Ｋ２３７Ｅ及びＴ２４０Ｉの突然変異部位の１つをさらに含み、又はケトレダクターゼ突然変異体は突然変異が生じたアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異が生じたアミノ酸配列とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。上記ケトレダクターゼ突然変異体は酵素の触媒活性及び基質に対する立体選択性をさらに向上させることができる。
より好ましい一実施例では、ケトレダクターゼ突然変異体のアミノ酸配列は、Ｓ９６Ｗ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｙ１８９Ｆ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ、Ｔ９４Ｓ＋Ｓ９６Ｉ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｔ９４Ｓ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４７Ｖ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ａ１５３Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｑ２４Ｌ＋Ａ７２Ｖ＋Ｓ１０１Ｎ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｄ２３４Ｖ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｋ２３７Ｅ、Ｓ９６Ｗ＋Ｐ１９３Ｈ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｖ３４Ｍ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｈ、Ｌ８０Ｒ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｄ２３４Ｖ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｔ１９９Ｉ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｖ９９Ｔ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｌ１０４Ｓ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｉ３５Ｖ＋Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｖ１８５Ｉ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ＋Ｔ２４０Ｉ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１７８Ｃ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｒ２０６Ｑ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ａ２０３Ｓ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｒ２０６Ｑ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｄ２０１Ｇ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｙ１８９Ｗ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１７８Ｃ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｒ２０６Ｑ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ａ２０３Ｓ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１７８Ｃ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｄ２０２Ａ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１７８Ｃ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｄ２０２Ａ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｒ２０６Ｑのいずれかの組み合わせの突然変異部位を有する。
本願の第２の典型的な実施形態では、ＤＮＡ分子を提供し、当該ＤＮＡ分子は上記いずれかのケトレダクターゼ突然変異体をコードする。当該ＤＮＡ分子によりコードされた上記ケトレダクターゼは構造式(Ｉ)に示すケトン類基質に対して良好な触媒活性及び立体選択性を有する。
本発明の上記ＤＮＡ分子は、さらに、「発現カセット」の形態で存在してもよい。「発現カセット」とは、特定のヌクレオチド配列の適切な宿主細胞における発現を指示できるＤＮＡ及びＲＮＡ配列を包含する線状又は環状の核酸分子を言う。一般的に言えば、目標ヌクレオチドに有効に連結されたプロモーターを含み、それは、任意選択で、終止信号及び/又は他の調節エレメントに有効に連結されたものである。発現カセットは、さらに、ヌクレオチド配列の正確な翻訳に必要な配列を含んでもよい。
コード領域は、通常、目標タンパク質をコードするが、センス又はアンチセンス方向において、例えばアンチセンスＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡ等の目標機能ＲＮＡもコードする。目標ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってもよく、その成分の少なくとも１つが、少なくとも１つの他の成分と異種であることを意味する。発現カセットは、さらに、天然に存在するものであってもよいが、異種発現のための有効な組換えで形成して得られる。
本願の第３の典型的な実施形態では、上記いずれか１つのＤＮＡ分子を含有する組換えプラスミドを提供する。上記組換えプラスミドにおけるＤＮＡ分子を、組換えプラスミドの適切な位置に置くことにより、上記ＤＮＡ分子を正確且つスムーズに複製、転写又は発現することができる。
本発明が上記ＤＮＡ分子を限定するときに、限定用語として「含有」を使用したが、ＤＮＡ配列の両端にその機能と関連のない他の配列を任意に追加できることを意味するのではない。当業者であれば、組換え操作の要件を満たすために、ＤＮＡ配列の両端に、適切な制限酵素の切断部位を添加するか、又は開始コドン、終止コドン等を追加する必要があり、そのため、クローズド式記述で限定する場合、これらの状況を真にカバーすることはできないことを知っている。
本発明に使用される用語「プラスミド」には、二本鎖又は一本鎖の線状又は環状形態の任意のプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はアグロバクテリウム二元核酸分子が含まれ、組換え発現プラスミドが好ましく、原核発現プラスミドであっても、真核発現プラスミドであってもよいが、原核発現プラスミドが好ましく、一部の実施形態において、組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ａ(＋)、ｐＥＴ－２２ｂ(＋)、ｐＥＴ－３ａ(＋)、ｐＥＴ－３ｄ(＋)、ｐＥＴ－１１ａ(＋)、ｐＥＴ－１２ａ(＋)、ｐＥＴ－１４ｂ(＋)、ｐＥＴ－１５ｂ(＋)、ｐＥＴ－１６ｂ(＋)、ｐＥＴ－１７ｂ(＋)、ｐＥＴ－１９ｂ(＋)、ｐＥＴ－２０ｂ(＋)、ｐＥＴ－２１ａ(＋)、ｐＥＴ－２３ａ(＋)、ｐＥＴ－２３ｂ(＋)、ｐＥＴ－２４ａ(＋)、ｐＥＴ－２５ｂ(＋)、ｐＥＴ－２６ｂ(＋)、ｐＥＴ－２７ｂ(＋)、ｐＥＴ－２８ａ(＋)、ｐＥＴ－２９ａ(＋)、ｐＥＴ－３０ａ(＋)、ｐＥＴ－３１ｂ(＋)、ｐＥＴ－３２ａ(＋)、ｐＥＴ－３５ｂ(＋)、ｐＥＴ－３８ｂ(＋)、ｐＥＴ－３９ｂ(＋)、ｐＥＴ－４０ｂ(＋)、ｐＥＴ－４１ａ(＋)、ｐＥＴ－４１ｂ(＋)、ｐＥＴ－４２ａ(＋)、ｐＥＴ－４３ａ(＋)、ｐＥＴ－４３ｂ(＋)、ｐＥＴ－４４ａ(＋)、ｐＥＴ－４９ｂ(＋)、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８あるいはｐＵＣ－１９から選択される。より好ましくは、上記組換えプラスミドはｐＥＴ－２２ｂ(＋)である。
本願の第４の典型的な実施形態では、上記いずれか１つの組換えプラスミドを含有する宿主細胞を提供する。本発明に適用する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は真核細胞が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、原核細胞は、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌等の真正細菌である。より好ましくは、原核細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞である。
本願の第５の典型的な実施形態では、キラルアルコールの生産方法を提供する。当該方法は、上記いずれか１つのケトレダクターゼ突然変異体を用いて前述した構造式(Ｉ)に示すキラルケトン系化合物の還元反応を触媒してキラルアルコールを生産するステップを含む。本発明の上記ケトレダクターゼ突然変異体は、構造式(Ｉ)に示すキラルケトン系化合物に対して良好な触媒活性及び立体選択性を有するため、本発明のケトレダクターゼ突然変異体を用いて調製されたキラルアルコールは、反応速度を向上させ、基質濃度を向上させ、酵素使用量を減らし、後処理の難度を低下させることができる。
ここで、ｎは０、１、２又は３であり、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、置換又は非置換のＣ１－１０のアルキル、置換又は非置換のＣ３－６のシクロアルキル、置換又は非置換のＣ６－１２のアリール、置換又は非置換のＣ３－６のヘテロシクリルから選択され、あるいは、Ｒ１はベンゼン環であり、且つ結合した複素環と共に縮合環系を形成する。
いくつかの好ましい実施例では、式(Ｉ)に示すキラルケトン系化合物は
本願の上記ケトレダクターゼ突然変異体は上記キラルケトン系化合物に対する触媒活性及び立体選択性がより高い。
いくつかの好ましい実施例では、ケトレダクターゼ突然変異体とキラルケトン系化合物との質量比は０.１～１０:１である。当該質量比でキラルアルコール系化合物の生産を行うと、酵素の触媒活性及び立体選択性が高いため、酵素使用量が少なく、基質転化率が高く且つ後続生成物の分離が容易であり、そのため、生産効率が高い。
いくつかの好ましい実施例では、還元反応系におけるケトン系化合物の濃度は１g/L～１００g/Lである。当該基質濃度でキラルアルコール系化合物の生産を行うと、酵素の触媒活性及び立体選択性が高いため、単位質量の酵素は濃度が相対的に高い基質をキラルアルコール生成物に変換するように触媒することができ、そのため、生産効率が高い。
いくつかの好ましい実施例では、２０～４５℃で還元反応を行う。本願の還元酵素突然変異体は、相対的な室温の条件下で基質の触媒還元反応を行うことができるため、生産条件を緩和させ、生産効率を向上させることにより役立つ。
上記述べた還元反応は一般的に補因子を必要とし、それは通常ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨであり、且つ当該還元反応は当該補因子を再生するためのシステムを含むことができ、例えばＤ－グルコース、補酵素ＮＡＤ＋及びグルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨや、ギ酸根化合物、補酵素ＮＡＤ＋及びギ酸根デヒドロゲナーゼＦＤＨや、イソプロピルアルコール、補酵素ＮＡＤ＋及びアルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨが挙げられる。
精製されたケトレダクターゼを用いるいくつかの実施形態では、このような補因子及び任意選択的な補因子再生系は、通常、基質及びケトレダクターゼと共に反応媒体に添加される。補因子再生系を含む任意の酵素は、ケトレダクターゼと類似する様に、この類の細胞の抽出物又は溶解物の形態であってもよく、精製された酵素として反応混合物に添加されてもよい。
細胞抽出物又は細胞溶解物を用いる実施形態では、抽出物又は溶解物を生成するための細胞は、補因子再生系のみを含む酵素又は補因子再生系及びケトレダクターゼを含む酵素を発現するものであってもよい。全細胞を用いる実施形態では、当該細胞は、補因子再生系及びケトレダクターゼを含む酵素を発現させることができる。
全細胞、細胞抽出物、又は精製されたケトレダクターゼのいずれを使用する場合でも、単一のケトレダクターゼを使用してもよく、又は選択可能に、２つ以上のケトレダクターゼの混合物を使用してもよい。
ケトレダクターゼを使用してキラルケトン系化合物に対して還元反応を行ってキラルアルコールを生産する反応系は、補酵素、補酵素再生系及び緩衝液をさらに含む。ここで、緩衝液は、通常、リン酸塩緩衝液であり、実際に応じて、Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液、バルビタールナトリウム－塩酸緩衝液あるいはクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液であってもよい。
以下では具体的な実施例を参照して本願の有益な効果についてさらに説明する。
なお、以下の実施例におけるＰＢはリン酸緩衝液を表す。
(実施例１)
２５０mLの反応フラスコにおいて、原材料５００mgを秤量し、１６.７５mLのイソプロピルアルコールを加え、１２.５mLのＡｃＣＲ出発酵素の粗酵素液(２.５ｇの突然変異体ウェット細胞を加えて０.１ＭのＰＢ７.０に再懸濁し、総体積が１２.５mLであり、超音波破砕によって質量体積含有量が２０％の粗酵素液を調製し、ｐＨ＝７.０であった)、１００mMのＰＢ７.０を加えて体系の最終体積を２５mLにし、３０℃で１６ｈ恒温撹拌し、体系を１２０００rpmで５min遠心した後、２００uLサンプリングして２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５min遠心した後、ＨＰＬＣに送って製品のキラル値を検出した。
その結果、４０％の基質が製品に変換するが、製品のキラル純度が低く、選択性が３９％のみである。ＡｃＣＲ出発酵素は一定の触媒能力を有するが、選択性が悪く、キラル目標製品の含有量が低いことが分かる。光学異性体は従来の方法では分離できないため、ＡｃＣＲ出発酵素は、目標キラルアルコールの生産には適用できない。
(実施例２)
１００mLの反応フラスコにおいて、原材料５００mgを秤量し、６.７mLのイソプロピルアルコールを加え、０.５mLのＡｃＣＲ出発酵素の粗酵素液(０.１ｇのウェット細胞を超音波破砕して２０％の粗酵素液を調製し、ｐＨ＝７.０であった)、１００mMのＰＢ７.０を加えて体系の最終体積を１０mLにし、３０℃で１６ｈ恒温撹拌し、体系を１２０００rpmで５min遠心した後、２００uLサンプリングして２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５min遠心した後、ＨＰＬＣに送って製品の転化率及びｅｅ値を検出した。
１００mLの反応フラスコにおいて、原材料５００mgを秤量し、６.７mLのイソプロピルアルコールを加え、０.５mLのＡｃＣＲ突然変異体の粗酵素液(０.１ｇの突然変異体ウェット細胞を超音波破砕して２０％の粗酵素液を調製し、ｐＨ＝７.０であった)、１００mMのＰＢ７.０を加えて体系の最終体積を１０mLにし、３０℃で１６ｈ恒温撹拌し、体系を１２０００rpmで５min遠心した後、２００uLサンプリングして２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５min遠心した後、ＨＰＬＣに送って製品の転化率及びｅｅ値を検出した。
結果は表５に示すように、酵素量(即ち０.１ｇの菌体ウェット細胞)をさらに基質質量(５００mg)の五分の一まで低下させ、反応の体積をさらに１０mLまで縮小させ、ＡｃＣＲ出発酵素及び一部の突然変異体(突然変異体の数が多いため、一部のみを選択する)を選択して検証し、その結果、ＡｃＣＲ出発酵素はほとんど活性がなく、また選択性が高くなく、目標キラルアルコールは３７％のみを占め、改造後の突然変異体は選択性に極めて高い優位性を示すだけでなく、最適菌の選択性は９９％に達し、また活性が極めて大幅に向上し、基本的に転化が完全である。そのため、改造後の突然変異体は極めて大きな触媒特性の変化を発生し、極めて高い活性及び選択性を得た。
上記表において、選択性:＊は選択性が５％～４０％であることを示し、＊＊＊は選択性が４０％～９０％であることを示し、＊＊＊＊は選択性が９０％～９５％であることを示し、＊＊＊＊＊は選択性が９５％～１００％であることを示す。
活性:＊は転化率が１０％未満であることを示し、＊＊＊＊は転化率が１０％～７０％であることを示し、＊＊＊＊＊は転化率が８０％～９０％であることを示し、＊＊＊＊＊＊は転化率が９０％～１００％であることを示す。
(実施例３)
２５０mLの反応フラスコにおいて、原材料５００mgを秤量し、５mLのイソプロピルアルコールを加え、１２.５mLのＡｃＣＲ出発酵素の粗酵素液(２.５ｇの突然変異体ウェット細胞を超音波破砕して２０％の粗酵素液を調製し、ｐＨ＝７.０であった)、１００mMのＰＢ７.０を加えて体系の最終体積を２５mLにし、３０℃で１６ｈ恒温撹拌し、体系を１２０００rpmで５min遠心した後、２００uLサンプリングして２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５min遠心した後、ＨＰＬＣに送って製品のキラル値を検出した。
２５０mLの反応フラスコにおいて、原材料５００mgを秤量し、５mLのイソプロピルアルコールを加え、１２.５mLのＡｃＣＲ突然変異体の粗酵素液(２.５ｇの突然変異体ウェット細胞を超音波破砕して２０％の粗酵素液を調製し、ｐＨ＝７.０であった。)、１００mMのＰＢ７.０を加えて体系の最終体積を２５mLにし、３０℃で１６ｈ恒温撹拌し、体系を１２０００rpmで５min遠心した後、２００uLサンプリングして２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５min遠心した後、ＨＰＬＣに送って製品のキラル値を検出した。
結果は表６に示すように、ＡｃＣＲ出発酵素に比べて、改造後の突然変異体の選択性が極めて大幅に向上しており、予想外の効果が得られることが分かる。
上表において、＊は選択性が５０％～８０％であることを示し、＊＊は選択性が８０～９０％であることを示し、＊＊＊は選択性が９０％～１００％であることを示す。
(実施例４)
２５０mLの反応フラスコにおいて、原材料５００mgを秤量し、５mLのイソプロピルアルコールを加え、１２.５mLのＡｃＣＲ出発酵素の粗酵素液(２.５ｇの突然変異体ウェット細胞を超音波破砕して２０％の粗酵素液を調製し、ｐＨ＝７.０であった。)、１００mMのＰＢ７.０を加えて体系の最終体積を２５mLにし、３０℃で１６ｈ恒温撹拌し、体系を１２０００rpmで５min遠心した後、２００uLサンプリングして２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５min遠心した後、ＨＰＬＣに送って製品のキラル値を検出した。
２５０mLの反応フラスコにおいて、原材料５００mgを秤量し、５mLのイソプロピルアルコールを加え、１２.５mLのＡｃＣＲ突然変異体の粗酵素液(２.５ｇの突然変異体ウェット細胞を超音波破砕して２０％の粗酵素液を調製し、ｐＨ＝７.０であった。)、１００mMのＰＢ７.０を加えて体系の最終体積を２５mLにし、３０℃で１６ｈ恒温撹拌し、体系を１２０００rpmで５min遠心した後、２００uLサンプリングして２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５min遠心した後、ＨＰＬＣに送って製品のキラル値を検出した。
結果は表７に示すように、ＡｃＣＲ出発酵素に比べて、改造後の突然変異体の選択性が極めて大幅に向上しており、予想外の効果が得られることが分かる。
上表において、＊は選択性が４０％～６０％であることを示し、＊＊は選択性が６０～９０％であることを示し、＊＊＊は選択性が９０％～１００％であることを示す。
(実施例５)
２５０mLの反応フラスコにおいて、原材料５００mgを秤量し、１６.７５mLのイソプロピルアルコールを加え、１２.５mLのＡｃＣＲ出発酵素の粗酵素液(２.５ｇの突然変異体ウェット細胞を加えて０.１ＭのＰＢ７.０に再懸濁し、総体積が１２.５mLであり、超音波破砕によって２０％の粗酵素液を調製し、ｐＨ＝７.０であった。)、１００mMのＰＢ７.０を加えて体系の最終体積を２５mLにし、３０℃で１６ｈ恒温撹拌し、体系を１２０００rpmで５min遠心した後、２００uLサンプリングして２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５min遠心した後、ＨＰＬＣに送って製品のキラル値を検出した。
２５０mLの反応フラスコにおいて、原材料５００mgを秤量し、１６.７５mLのイソプロピルアルコールを加え、１２.５mLの突然変異体酵素の粗酵素液(２.５ｇの突然変異体ウェット細胞を加えて０.１ＭのＰＢ７.０に再懸濁し、総体積が１２.５mLであり、超音波破砕によって２０％の粗酵素液を調製し、ｐＨ＝７.０であった。)、１００mMのＰＢ７.０を加えて体系の最終体積を２５mLにし、３０℃で１６ｈ恒温撹拌し、体系を１２０００rpmで５min遠心した後、２００uLサンプリングして２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５min遠心した後、ＨＰＬＣに送って製品のキラル値を検出した。
その結果、突然変異を同一部位で行うと、異なる種類のアミノ酸を使用する場合、突然変異体は大きく異なる選択性と活性を示す。
上表において、＊は選択性が３０％～５０％であることを示し、＊＊は選択性が５０～６０％であることを示し、＊＊＊は選択性が６０～８０％であることを示す。
＋は転化率が０～３０％であることを示し、＋＋は転化率が３０～６０％であることを示し、＋＋＋は転化率が６０～８０％であることを示し、＋＋＋＋は転化率が８０～１００％であることを示し、ＮＤは活性が検出されなかったことを示す。
以上の説明から分かるように、本発明の上記の実施例によれば、次のような技術的効果を実現する。本願では、合理的設計とランダム突然変異とを組み合わせる方法によって、既存の還元酵素突然変異体のタンパク質を合理的に改造し、取得した突然変異体に本願の基質ケトンを使用して、触媒活性及び立体選択性スクリーニングを行い、最終的に、高い選択性及び高い活性の突然変異体の菌株を取得し、これらの突然変異体を含有する菌株を、本願に記載のケトン基質の触媒還元反応に使用すると、それに対応するキラルアルコール化合物の生産効率を向上させることができる。
上記の説明は、本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を限定することを意図するものではなく、当業者にとって、本発明は様々な修正及び変更が可能である。本発明の精神及び原則の範囲内で行われたいかなる修正、同価置換、改善等は、いずれも本発明の保護範囲に含まれるべきである。
Claims (10)
- ケトレダクターゼ突然変異体であって、前記ケトレダクターゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列を基に、Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ、Ｌ１５２Ｇ、Ｓ９６Ｗ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｙ１８９Ｆ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ、Ｔ９４Ｓ＋Ｓ９６Ｉ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｔ９４Ｓ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４７Ｖ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ａ１５３Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｑ２４Ｌ＋Ａ７２Ｖ＋Ｓ１０１Ｎ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｄ２３４Ｖ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｋ２３７Ｅ、Ｓ９６Ｗ＋Ｐ１９３Ｈ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｖ３４Ｍ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｈ、Ｌ８０Ｒ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｄ２３４Ｖ、Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｔ１９９Ｉ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｖ９９Ｔ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｌ１０４Ｓ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｉ３５Ｖ＋Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｖ１８５Ｉ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ＋Ｔ２４０Ｉ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１７８Ｃ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｒ２０６Ｑ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ａ２０３Ｓ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｒ２０６Ｑ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｄ２０１Ｇ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｙ１８９Ｗ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１７８Ｃ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｒ２０６Ｑ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ａ２０３Ｓ、Ｔ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１７８Ｃ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｄ２０２Ａ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｒ２０６Ｑ、あるいはＴ９４Ｓ＋Ｙ９５Ｆ＋Ｓ９６Ｗ＋Ｉ１４３Ｖ＋Ｙ１７８Ｃ＋Ｙ１８９Ｗ＋Ｉ１９０Ｔ＋Ｍ１９４Ｌ＋Ｖ１９５Ｉ＋Ｌ１９８Ｐ＋Ｅ２０１Ｄ＋Ｄ２０２Ａ＋Ａ２０３Ｇ＋Ｒ２０６Ｑという突然変異が発生して得られた、ことを特徴とするケトレダクターゼ突然変異体。
- 請求項１に記載のケトレダクターゼ突然変異体をコードする、ことを特徴とするＤＮＡ分子。
- 請求項２に記載のＤＮＡ分子が接続されている、ことを特徴とする組換えプラスミド。
- 請求項３に記載の組換えプラスミドを含有する、ことを特徴とする宿主細胞。
- 前記宿主細胞は原核細胞又は真核細胞を含む、ことを特徴とする請求項４に記載の宿主細胞。
- 前記原核細胞は大腸菌である、ことを特徴とする請求項５に記載の宿主細胞。
- キラルアルコールの生産方法であって、請求項１に記載のケトレダクターゼ突然変異体を用いてキラルケトン系化合物の還元反応を触媒してキラルアルコールを生産するステップを含み、
前記キラルケトン系化合物は、
ことを特徴とするキラルアルコールの生産方法。
- 前記ケトレダクターゼ突然変異体と前記キラルケトン系化合物との質量比は０．１～１０：１である、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記還元反応の系における前記ケトン系化合物の濃度は１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
- ２０℃～４５℃で前記還元反応を行う、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
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