CN105695425B - 一种环己酮单加氧酶及其在合成埃索美拉唑中的应用 - Google Patents
一种环己酮单加氧酶及其在合成埃索美拉唑中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种催化活性高、反应收率高、对环境友好的环己酮单加氧酶进行不对称氧化反应合成单一构型的拉唑类药物。本发明还提供了该环己酮单加氧酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及该环己酮单加氧酶的高效制备方法，以及该环己酮单加氧酶在催化前手性硫醚化合物成单一构型的亚砜中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种环己酮单加氧酶，生产该环己酮单加氧酶的基因工程菌的构建，该环己酮单加氧酶的生产及应用。
背景技术
质子泵抑制剂(proton pump inhibitors,PPIs)用于治疗酸相关性疾病，是近十几年来临床应用广泛、疗效最好的药物。PPIs即H+/K+-ATP酶抑制剂，其抑酸作用强，特异性高，持续时间长久。胃酸分泌的最后步骤是胃壁细胞内质子泵驱动细胞内H+与小管内K+交换。研究认为：血液中的PPIs进入胃壁细胞后聚集在强酸性的分泌小管中，转化为活性的次磺酰胺类化合物，与质子泵的半胱氨酸残基上的硫醚共价结合，形成二硫键，使质子泵失活，从而抑制中枢或外周介导的胃酸分泌。与以往临床应用的抑制胃酸药物H2受体拮抗剂相比较，作用位点不同且有着不同的特点，即夜间的抑酸作用好、起效快，抑酸作用强且时间长、服用方便，所以能抑制基础胃酸的分泌及组胺、乙酰胆碱、胃泌素和食物刺激引起的酸分泌。
PPIs已经成为治疗胃酸异常分泌及相关疾病的一线用药。传统的质子泵抑制剂为弱碱性的苯并咪唑化合物，如奥美拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑及泮托拉唑。后期的研究主要集中在延长单次给药的抑酸持续时间。埃索美拉唑是奥美拉唑的S异构体，是第一个发展为异构体的质子泵抑制剂。后来陆续发现了右兰索拉唑、左旋泮托拉唑。2010年，全球PPIs的销售额达到139亿美元，高居药物销售额第三位。
中国专利文献CN1157614中公开了一种在有机溶剂中在由钛(IV)化合物和手性支链或非支链烷基二元醇或芳族醇制得的手性钛配合物和有机碱存在下，用过氧化氢类衍生物氧化前手性硫醚而制得埃索美拉唑的方法。
中国专利文献CN101098867中公开了一种在碱和手性钛配合物存在下利用氢过氧化物氧化前手性硫醚制备艾普拉唑的方法。
中国专利文献CN1193971公开了将奥美拉唑、兰索拉唑或雷贝拉唑在水与有机溶剂的混合溶液中提纯出对映体含量高的S-或R-构型的方法。
上述合成单一构型的化合物制备工艺均存在利用拆分工艺收率较低、成本较高、或需要使用价格昂贵的贵金属催化剂等缺点。
硫醚单加氧酶是一类依赖于黄素的单加氧酶，可以活化利用三线态的氧气分子，使硫醚氧化成手性的亚砜。该过程需要还原态的黄素辅酶(FADH2或者FMNH2)，反应结束后辅酶转变为相应的氧化态FAD+或者FMN+，后者在NADPH的存在下转变成对应的还原型辅酶，实现辅酶再生。反应同时还产生了一个H2O2，对酶活不利，因此需要加入过氧化氢酶使之消除。机理如下：
采用生物氧化法制备亚砜具有立体选择性好，过度氧化副产物低，绿色环保等优点而受到关注。美国专利文献US5840552中披露了用微生物催化的不对称氧化合成S-奥美拉唑的方法，青霉菌和不动杆菌均表现出较好的转化能力和立体选择性；US20130017580披露了用不动杆菌来源的氧化酶催化的不对称合成S-奥美拉唑的方法，但是底物投料浓度仅有50g/L，且酶的热稳定性较差，25℃反应速度慢，40小时以上才能转化彻底，难以放大生产。
发明内容
针对现有技术中合成拉唑类药物采用的拆分工艺中收率较低，以及采用贵金属催化工艺中成本较高、收率较低及后处理难以进行等缺点，本发明提供一种催化活性高、反应收率高、对环境友好的环己酮单加氧酶进行不对称氧化反应合成单一构型的拉唑类药物。本发明还提供了该环己酮单加氧酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及该环己酮单加氧酶的高效制备方法，以及该环己酮单加氧酶在催化前手性硫醚化合物成单一构型的亚砜中的用途。
本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：
本发明的第一方面提供了一种分离的环己酮单加氧酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：
(a)由SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。
SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码，具有氧化硫醚的功能，是一种新的环己酮单加氧酶。
(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有环己酮单加氧酶活性的蛋白质。
其中，所述的“几个”是指2个至小于100个，更佳的是10个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明发现这样的融合蛋白同样具有环己酮单加氧酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有环己酮单加氧酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目的。根据本发明，在如SEQ ID No:2所示氨基酸序列的蛋白质分子中进行1～5个氨基酸残基的突变，仍然保持环己酮单加氧酶活性。
(c)和(a)的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有环己酮单加氧酶活性的蛋白质。
SEQ ID No:2所示的环己酮单加氧酶和已知的环己酮单加氧酶序列具有显著的差异性，例如与不动杆菌来源的CHMO之间的同一性为80％。
在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBIBlastp程序进行比对，默认参数。
本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的环己酮单加氧酶。优选地，所述核酸是由SEQ ID No:1所示核苷酸序列组成的。
SEQ ID No:1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于环境DNA，其可以从土壤样本中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。
本发明中，SEQ ID No:1所示的基因命名为BYKY-MO，全长1629bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1626个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo:2所示。
如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No:2的氨基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID No:1。本发明的环己酮单加氧酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或插入来提供多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核苷酸序列SEQ ID No:1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或添加来制得。
SEQ ID No:1的同系物也指启动子变体。在所述的核苷酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。
SEQ ID No:1的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID No:1所示序列的多聚核酸进行杂交的多聚核酸。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC；20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液；杂交温度为50～70℃；在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS；当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的环己酮单加氧酶基因的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的环己酮单加氧酶基因或其突变体的核酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒载体。较佳地，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的目的核酸片段与表达载体pET28a分别用NdeI和HindIII酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的环己酮单加氧酶基因的重组表达质粒pET28a-BYKY-MO或含有编码其突变体的核酸序列的重组表达质粒。
本发明的第四个方面是提供一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的环己酮单加氧酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌(E.coli)，更优选E.coli BL21(DE3)。将前述重组表达质粒BYKY-MO或其突变体转化至E.coli BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-BYKY-MO或其突变体。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法、热击法等，较佳地选择热击法进行转化即可，热击条件较佳的是：42℃，热击45秒。
本发明的第五个方面是提供一种重组环己酮单加氧酶的制备方法，其包括如下的步骤：培养本发明的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组环己酮单加氧酶。
本发明中催化硫醚进行氧化反应形成亚砜的催化剂，可以是上述产生重组环己酮单加氧酶的转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的环己酮单加氧酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。
本发明的第六个方面提供了一种本发明的环己酮单加氧酶或重组环己酮单加氧酶在催化奥美拉唑硫醚进行氧化反应形成埃索美拉唑中的应用。
所述的奥美拉唑硫醚如下式I所示：
所述的奥美拉唑硫醚化合物在环己酮氧化酶作用下与氧化剂发生不对称氧化反应，生成埃索美拉唑，即下式II所示的化合物：
本发明所述的氧化剂优选氧气。
本发明所述的不对称氧化反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳地，所述的应用包括下述步骤：本发明所述的奥美拉唑硫醚化合物在本发明所述的环己酮单加氧酶的催化下，在葡萄糖和葡萄糖脱氢酶存在下，并在过氧化氢酶存在下与氧气进行不对称氧化反应，形成埃索美拉唑。
其中所述的奥美拉唑硫醚化合物在反应液中的较佳浓度为40～60mmol/L。本发明的环己酮单加氧酶用量为催化有效量，较佳地为0.1～10g/L；过氧化氢酶的用量为催化有效量，较佳为0.1～10g/L；葡萄糖的用量较佳为0.1～10g/L；葡萄糖脱氢酶的用量较佳为0.1～10g/L。所述的水溶液可为本领域常规缓冲液，只要其pH范围在7.5～9.5即可，优选氢氧化钠溶液。氢氧化钠溶液的浓度较佳的为0.05～0.1mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的氧化反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述的氧化反应的温度较佳地为20～50℃，更佳地为30～40℃。所述的氧化反应的时间较佳地以底物剩余浓度低于5％为准。氧化反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取亚砜化合物。
本发明中，使用粗酶液做催化剂，较佳地应添加辅酶。如果用静息细胞做催化剂则不需要加辅酶，只需利用细胞内所含有的辅酶即可。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的环己酮单加氧酶可以催化硫醚化合物进行不对称氧化，生成相应手性亚砜化合物；本方法实现了价格低廉且收率高的制备亚砜化合物，更加适合工业化生产的进行。
附图说明
图1是环己酮单加氧酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。左侧泳道为CHMO；右侧泳道为DNA分子量标准。
图2是环己酮单加氧酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。左侧泳道为蛋白分子量标准；右侧泳道为CHMO蛋白表达全菌裂解液。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选环己酮单加氧酶
从上海市金山区化工园区采集土壤样本并提取DNA(提取方法参照Chroma SpinTE-1000，Clontech Laboratories，Inc.，USA)，用Sau3AI部分酶切，电泳收集0.5～3kb的片段，回收并连接到pWF-1的BamHI位点，得到质粒文库。将文库转化到E.coli DH5α并涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性克隆接种到加有500μL LB(含100μg/mL氨苄青霉素)的96深孔孔板，37℃培养4小时后加1mM IPTG诱导，30℃继续培养过夜；然后各取50μL深孔培养物到加有50mM磷酸钠缓冲液(pH8.5)和1mg/mL溶菌酶的新的96孔板，30度温浴培养30分钟，降至-80℃反复冻融使细菌裂解。
于新的96孔板中加入1mM奥美拉唑硫醚为底物、1单位过氧化氢酶、0.2mg/mL 4-氨基安替比林、1mg/mL苯酚，30℃培养4小时，于酶标仪上在505nm读数，挑取吸光度最强的孔所对应的深孔培养物，提取质粒并测序。用NCBI的ORF Finder分析其开放读码框(ORF)，得到ORF核苷酸序列SEQ ID NO:1，并进一步得到其编码的氨基酸序列SEQ ID NO:2。该序列与不动杆菌来源的CHMO具有80％的同一性。
实施例2环己酮单加氧酶的表达和发酵
实施例1中得到的环己酮单加氧酶基因克隆进pET28a，酶切位点为NdeI-HindIII。质粒转化到E.coli BL21(DE3)，在50μg/mL卡那霉素的LB平板筛选阳性菌落，接种到200mLLB培养基中，于37℃，180～220rpm培养10～16h。将上述培养好的种子按10％(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基(M9，含葡萄糖4g/L、磷酸氢二钠12.8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵1g/L、硫酸钠0.5g/L、氯化钙0.0152g/L、六水氯化镁0.41g/L)中，在25～35℃，300～800rpm，空气流量2～6L/min的条件下培养。培养6～10h后，以5～20mL/h的速率流加含60％甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD600达到20～40时，添加0.1～1mM IPTG开始诱导。诱导5～15h后，放罐，5000rpm离心收集菌体，均质后得到粗酶液。
实施例3酶活的测定方法
菌体按1:10的比例重悬到PBS缓冲液(pH 9.0)，高压破碎后取50μL粗酶液加到1.8mL PBS缓冲液(pH 9.0)，加入含有100mM环已酮的甲醇助溶，使环己酮终浓度为10mM；加入NADPH 0.1mM开始反应，340nm波长下检测紫外吸收的变化。
酶活的计算：U＝ΔA340×1000/(6220×20)，即每mL裂解液的比酶活力。
实施例4酶催化制备埃索美拉唑
将5-甲氧基-2-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲硫基)-1H-苯并[d]咪唑2.5g，N-甲基吡咯烷酮10mL，葡萄糖2g，葡萄糖脱氢酶20mL，过氧化氢酶(Sigma)10mL，以及环己酮单加氧酶粗酶液40mL混合，接着加水到200mL，用氢氧化钠水溶液调节pH至7.5～9.5，加装氧气气球，室温搅拌反应24小时，HPLC检测转化率，24小时后得到(S)-5-甲氧基-2-{[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)-甲基]-亚磺酰基}-1H-苯并咪唑2.49g，收率为98％。
HPLC条件：
流动相：乙腈与水梯度洗脱；
梯度洗脱条件为：35％乙腈，5min；35％～75％乙腈，5～20min；75％～35％乙腈，20～25min。
检测条件：
254nm处检测，210nm处可监测溶剂；
产物峰先出(10min左右)，硫醚底物17min左右出峰；
e.e.值的测定：Chiralpak AS-RH 150×4.6mm,流动相：35％乙腈+65％水；流速1mL，检测波长250nm，柱温35℃，进样10μL，洗脱时间30min，R-型保留时间7.47min，S-型为8.58min。
Claims (20)
1.一种分离的环己酮单加氧酶，其氨基酸序列为SEQ ID No:2所示。
2.编码权利要求1所述的环己酮单加氧酶的分离的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸，其核苷酸序列为SEQ ID No:1所示。
4.包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其选自质粒。
6.根据权利要求4所述的重组表达载体，其选自粘粒、噬菌体载体或病毒载体。
7.根据权利要求5所述的重组表达载体，其是pET系列质粒。
8.包含权利要求4-7任一项所述的重组表达载体的重组表达转化体。
9.根据权利要求8所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌(E.coli)。
10.根据权利要求9所述的重组表达转化体，其是E.coli BL21(DE3)。
11.一种重组环己酮单加氧酶的制备方法，包括如下的步骤：培养权利要求8-10任一项所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组环己酮单加氧酶。
12.一种催化硫醚进行氧化反应形成亚砜的催化剂，其选自权利要求8-10任一项所述的重组表达转化体的培养物，或通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品；所述加工的制品是由转化体细胞得到的提取物、或通过对提取物中的环己酮单加氧酶进行分离和/或纯化得到的分离产品、或通过固定化转化体细胞或提取物或提取物的分离产品而得到的固定化制品。
13.权利要求1所述的环己酮单加氧酶、权利要求11所述的方法制备的重组环己酮单加氧酶或权利要求12所述的催化剂在催化奥美拉唑硫醚进行氧化反应形成埃索美拉唑中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：式I所示的5-甲氧基-2-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲硫基)-1H-苯并[d]咪唑在权利要求1所述的环己酮单加氧酶、权利要求11所述的方法制备的重组环己酮单加氧酶或权利要求12所述的催化剂的催化作用下与氧化剂反应，生成式II所示的埃索美拉唑。
15.根据权利要求14所述的应用，其中所述的氧化剂为氧气。
16.根据权利要求14或15所述的应用，其中所述的氧化反应在pH值为7.5～9.5的碱性条件下进行。
17.根据权利要求14或15所述的应用，其中所述的奥美拉唑硫醚化合物在反应液中的浓度为40～60mmol/L。
18.根据权利要求14或15所述的应用，其中环己酮单加氧酶用量为0.1～10g/L的催化有效量。
19.根据权利要求14或15所述的应用，其中在反应液中还含有过氧化氢酶、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。
20.根据权利要求19所述的应用，其中所述过氧化氢酶的用量为0.1～10g/L催化有效量；葡萄糖的用量较佳为0.1～10g/L；葡萄糖脱氢酶的用量较佳为0.1～10g/L。
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