CN102876734B

CN102876734B - 一种羰基还原酶、基因及其在不对称还原前手性羰基化合物中的应用

Info

Publication number: CN102876734B
Application number: CN201210423006.0A
Authority: CN
Inventors: 许建和; 许国超; 郁惠蕾; 潘江
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2012-10-30
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2032-10-30
Also published as: CN102876734A

Abstract

本发明公开了一种羰基还原酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物制备手性醇中的应用，以及所述羰基还原酶的基因、蛋白及其突变体。本发明还提供了包含所述羰基还原酶基因的重组表达载体和重组表达转化体。利用本发明所述的羰基还原酶催化不对称还原前手性羰基化合物反应时，所述不对称还原反应的反应条件温和，操作过程简便，易于放大；通过该不对称还原反应制备所得的手性醇产物浓度高，光学纯度高。因此，所述羰基还原酶在光学纯手性醇的制备中具有很好的工业应用开发前景。

Description

一种羰基还原酶、基因及其在不对称还原前手性羰基化合物中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶作为催化剂在催化不对称还原前手性羰基化合物制备手性醇中的应用，以及该羰基还原酶的蛋白及基因的突变体，包含所述羰基还原酶基因及其基因突变体的重组表达载体和重组表达转化体。

背景技术

(S)-2-氯-1-苯基乙醇(分子式为C₆H₅CH(OH)CH₂Cl，分子量为156.61，CAS号：70111-05-6)拥有三个活性官能团（氯基、苯基和光学纯羟基），是合成医药、农药及其它精细化学品的重要手性砌块。研究人员已开发出多种光学活性手性醇合成的方法，包括动力学拆分和不对称合成。其中，利用前手性羰基化合物的不对称还原合成光学活性手性醇的途径，可实现理论100%的产率，是生产光学活性(S)-2-氯-1-苯基乙醇的重要方法。化学家们已经发现手性金属衍生物可作为催化剂用于羰基的不对称还原，尽管该化学方法已被部分用于工业生产，然而该方法操作难度大，反应条件苛刻，且产物中可能会残留重金属，因此其应用受到限制。生物催化方法不仅反应条件温和、对环境友好，具有高度的区域选择性和立体选择性，而且避免了产物中重金属残留，恰好弥补了化学方法的不足之处，因此近几年来生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇不对称合成中的应用越来越受到重视。

生物催化的α-氯苯乙酮不对称合成较多的是用野生菌或重组工程菌的细胞或游离酶进行催化。在已报道的不对称合成方法中，底物浓度的最高水平是930mM(144g/L)，所用催化剂为重组表达的LSADH(来源于Leifsonia sp.S749,Genbank登录号：AB213459)，反应24h(35℃，2500rpm)，分离得率72%，产物光学纯度>99%(Appl.Microbiol.Biotechnol.2012,93,1075-1085)；本实验室前期筛选到了一株来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor A3(2)NRRL B-16638)的氧化还原酶(Genbank登录号NC 003888.3,REGION:8176680..8177471)，可以催化50g/L的2-氯苯乙酮的不对称还原，反应12h，转化率96.7%，ee值>99%(S)(中国专利CN102154377)。虽然也有很多其它报道可以实现α-氯苯乙酮的不对称还原，但由于苯乙酮类化合物对细胞的毒性，使得不对称合成反应存在光学活性偏低或底物上载量较低等问题,不具备规模化应用的可行性。林国强等考察了一株地霉(Geotrichum sp.38)分别在自来水和5%葡萄糖存在下催化α-氯苯乙酮还原的反应情况，反应15h得率分别为80%和86%，ee值为87%(Tetrahedron 1998,54,13059-13072)。Lavandera等从菌种库中筛选到泛氧副球菌(Paracoccus pantotrophusDSM11072)及丛毛单胞菌(Comamonas sp.DSM15091)可以催化0.9g/Lα-氯苯乙酮的不对称还原，转化率>96%，产物ee值分别为94%和71%(Tetrahedron:Asymmetry 2008,19,1945-1958)。Barbieri等筛选了22株真菌，发现一株白地霉(Geotrichum candidumCBS233.76)在离子交换树脂Amberlite XAD1180(2:1,w/w)的存在下可以催化1g/L的底物α-氯苯乙酮的还原，转化率>99%，产物ee值为85%(J.Mol.Catal.B:Enzym.2001,11,415-421)。Rocha等针对海洋水样进行了筛选，得到了一株海洋真菌(Penicillium miczynskiiG15)，底物浓度为3.2mM (0.5g/L)时，32℃反应48h后转化率95%，但产物ee值仅有50%(Biotechnol.Lett.2009,31,1559-1563)。朱敦明等对商品酶和蛋白质数据库进行了筛选，发现商品酶KRED112(Sigma-Aldrich Co.)在底物α-氯苯乙酮浓度为25mM(4g/L)，辅酶浓度为0.12mM(0.1g/L)时，可以催化不对称还原生成(S)-2-氯-1-苯基乙醇，分离得率72%，光学纯度>99%(Tetrahedron:Asymmetry 2005,16,3275-3278)；另外来源于赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor AKU4429)的醛还原酶SSCR(Genbank accessionNo.AF160799)可以转化12.5mM(1.9g/L)底物的转化，产物ee值为98%(Org.Biomol.Chem.2006,4,2690-2695)；来源于木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的羰基还原酶CMS1(Genbank登录号：AB036927)可以催化10g/L的底物α-氯苯乙酮的不对称还原，分离得率92%，产物ee值>99%(J.Org.Chem.2006,71,4202-4205)。Hidetoshi以2-氯苯乙酮为筛选底物，筛选了34株酵母和真菌，其中仅有Candida humicola CBS2774可以还原5g/L的2-氯苯乙酮生成(S)-2-氯苯乙酮，得率100%，光学纯度100%(欧洲专利EP0198440)。

然而，以上报道仅限于实验室规模，且存在产物浓度不够高，需要添加昂贵辅酶，反应时间长，产物分离纯化困难等问题。因此针对前手性羰基化合物，亟需筛选高效特异的生物催化剂，以满足工业需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有的生物催化不对称还原前手性羰基化合物制备手性醇反应中，羰基还原酶的催化活性偏低、底物耐受性差、产物浓度不够高，以及反应时间长，产物分离纯化困难等问题，提供一种羰基还原酶作为催化剂在催化不对称还原前手性羰基化合物制备手性醇中的应用、该羰基还原酶的基因和蛋白及其突变体，以及包含该羰基还原酶基因或基因突变体的重组表达载体和重组表达转化体。所述羰基还原酶催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：羰基还原酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物制备手性醇中的应用，其中所述羰基还原酶是如下（a）或（b）的羰基还原酶：

（a）其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示的羰基还原酶；

（b）在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有羰基还原酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明所述羰基还原酶的来源较佳地包括：提取自然界中天然存在的羰基还原酶，通过人工合成氨基酸全序列所得的羰基还原酶，通过基因工程方法克隆表达所得的羰基还原酶。本发明所述羰基还原酶较佳地来源于耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)CGMCC 2.1492。所述羰基还原酶通过基因组挖掘的方法获得，所述的基因组挖掘方法较佳地为，以来自木兰假丝酵母(Candida magnolia,Genbank登录号：AB036927)的羰基还原酶CMS1和来自于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis,Genbank登录号：FJ939565)的羰基还原酶SCR1作为模板，在NCBI数据库中进行pBLAST搜索，选定一批预测的羰基还原酶基因，将所选的羰基还原酶基因进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞。通过测定这些还原酶的活力及其对2-氯-苯乙酮的立体选择性等，对所克隆的酶进行反复比较和筛选，最终获得催化性能最佳的羰基还原酶。所述羰基还原酶的氨基酸序列较佳地为如序列表中SEQ ID NO:2所示。

本发明所述羰基还原酶的基因来源包括：通过基因克隆技术获得羰基还原酶基因，或者通过人工全基因合成的方法得到所述羰基还原酶基因。本发明所述羰基还原酶基因来源较佳地为：耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)CGMCC 2.1492。其具体制备方法较佳地包括：根据Genbank中收录的预测为还原酶的耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)基因(Genebank登录号：CAR23611.1)序列设计合成引物，所述引物优选地为：

上游引物：5’-CCGGAATTCATGCCCAAGACTATCGCCACA-3’；

下游引物：5’-CCGCTCGAGTCAGATGCTGCTGTACCCGC-3’；

其中，上游引物(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示)下划线部分为EcoRI酶切位点，下游引物(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示)下划线部分为XhoI酶切位点。然后以耐热克鲁维酵母CGMCC 2.1492的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得完整的羰基还原酶全长基因DNA片段。其中所述羰基还原酶全长基因（核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示），命名为KtCR，全长为846个核苷酸碱基。其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第846个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。该序列无内含子，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQID NO:2所示。

由于密码子的简并性，编码上述羰基还原酶（氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示）的核酸分子不仅仅局限于序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子。还可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加核苷酸来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示的核酸分子的一个或多个碱基在保持羰基还原酶活性范围内进行替换、缺失或增加来获得。所述羰基还原酶基因的突变优选地为4个碱基的突变，分别为将前述羰基还原酶基因编码序列的第72位的C突变为T，第318位的T突变为C，第510位的T突变为A，第629位的T突变为A，从而得到所述羰基还原酶基因的突变体，所述羰基还原酶基因突变体的核苷酸序列优选地如序列表中SEQ ID No:3所示。

SEQ ID NO:1的同系物也指启动子突变体。所述羰基还原酶基因的启动子可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或使用不同来源的更有效的启动子进行完全替换，可提高所述羰基还原酶的表达水平。

SEQ ID NO:1的同系物还指一种具有在标准条件下能够与SEQ ID NO:1所示序列的多聚核苷酸进行杂交的多聚核苷酸分子。在标准条件下进行杂交可根据“分子克隆”中描述的方式进行，所述方法为：将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1%（wt）SDS、5%（wt）硫酸右旋糖苷、1/20（v/v）稀释的抑制剂以及2～8×SSC。20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50～70℃。在杂交几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选地为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1%（wt）SDS溶液，更优选地为5×SSC+0.1%（wt）SDS。当杂交膜用这种清洗缓冲液清洗完毕后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。

本发明还提供了一种包含上述羰基还原酶基因的重组表达载体。所述重组表达载体可通过本领域常规方法将上述羰基还原酶基因克隆到各种表达载体上构建而成。所述的表达载体较佳地包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体优选地为pET28a质粒。

较佳的，可通过下述方法制得本发明所述重组表达载体：将通过PCR扩增所得的羰基还原酶基因产物用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切，同时将表达载体pET28a用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切，形成互补的粘性末端，回上述羰基还原酶基因酶切产物以及酶切后的pET28a质粒，利用T4DNA连接酶连接，构建包含所述羰基还原酶基因的重组表达载体pET-KtCR。

本发明还提供一种包含前述羰基还原酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。所述重组表达转化体可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，并且其所携带的羰基还原酶基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选地为：大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α。将前述重组表达载体pET-KtCR转化至大肠埃希氏菌Z(E.coli)BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-KtCR。

本发明所述羰基还原酶的制备方法较佳地为培养如上所述的重组表达转化体，获得重组表达的羰基还原酶。所述重组表达羰基还原酶的制备方法较佳地包括：培养本发明所述的重组表达转化体，获得重组羰基还原酶。其中，所述的重组表达转化体同上所述，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。其中所述的培养重组表达转化体所用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明的羰基还原酶的培养基。所述培养基优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生羰基还原酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。菌株培养方法优选地包括：将本发明所述的重组大肠杆菌(优选(E.coli BL21(DE3))接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5-0.7(优选0.6)时，在终浓度为0.1-1.0mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的羰基还原酶。

本发明所述的应用较佳地包括：在缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶和葡萄糖的存在下，在所述羰基还原酶的催化下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性醇。

本发明所述应用中，不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，其中所述的前手性羰基化合物较佳地为：芳基酮、α-酮酯或β-酮酯类化合物。本发明所述的前手性羰基化合物更佳地为：式1、式2或式3所示的前手性羰基化合物：

式1式2式3

其中，较佳地，R₁为苯基、带有取代基的苯基、吡啶基或噻吩基，取代基为卤素或烷基；

R₂为烷基或卤代烷基；

R₃为烷基、苯基或取代苯基；

R₄为烷基或卤代烷基。

更佳地，

R₁为苯基或带有取代基的苯基，取代基为卤素；

R₂为碳链长度为1-2的烷基或卤代烷基，较佳地，所述的卤素是Cl、Br或F；优选地，R₂为Cl、Br或F取代的甲基；

R₃为碳链长度为1-2的烷基，苯基或取代的苯基，优选的，所述的烷基为甲基；

R₄为卤代烷基，较佳地，所述的卤素是Cl、Br或F，优选地，R₄为一至三个氢被Cl、Br或F取代的甲基。

优选地，

R1为-C₆H₅、p-Cl-C₆H₄、m-Cl-C₆H₄、2’,4’-Cl-C₆H₃或3’,4’-Cl-C₆H₃；

R₂为-CH₂OH、-CH₂Cl、-CH₂Br、或-CF₃；

R₃为-CH₃；

R₄为-CH₃、-CH₂Cl、-CH₂Br或-CF₃。

其中所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度较佳的为1～1000mmol/L(2-氯-苯乙酮浓度较佳地为0.001～1mol/L)。其中所述羰基还原酶用量为本领域催化有效量，用量较佳的为0.01～120kU/L (以2-氯-苯乙酮作为底物时为0.01～120kU/L)。葡萄糖脱氢酶的用量较佳的为0.01～4kU/L(以2-氯-苯乙酮作为底物时为0.01～120kU/L)。葡萄糖的用量较佳的为5～50g/L(以2-氯-苯乙酮作为底物时为5～300g/L)。所述的缓冲液较佳地为本领域常规磷酸盐缓冲液，包括：磷酸-磷酸钠或磷酸-磷酸钾缓冲液。所述磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05～0.1mol/L，所述的缓冲液浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述不对称还原反应的温度较佳的为20～35℃，不对称反应的时间以反应完全为准，反应时间较佳地为2～24小时，优选地为4～12小时。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇产物。

本发明所述羰基还原酶在所述的不对称还原反应中的添加形式较佳地为所述羰基还原酶的粗酶液，本发明所述缓冲液中较佳地还包括辅酶NADP⁺，所述辅酶NADP⁺的添加量较佳地为0.1～0.5mmol/L，其添加量优选地为0.5mmol/L；所述羰基还原酶在所述不对称还原反应中的添加形式较佳地为表达该羰基还原酶的静息细胞。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案之二为：一种羰基还原酶基因，其中所述羰基还原酶基因是一种分离的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

其中所述羰基还原酶基因（核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示）为前述羰基还原酶基因（核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示）的突变体。所述突变体的突变位置分别为将前述羰基还原酶基因核苷酸序列的第72位的C突变为T，第318位的T突变为C，第510位的T突变为A，第629位的T突变为A，从而得到所述羰基还原酶基因的突变体。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案之三为：一种羰基还原酶，其中所述羰基还原酶是一种分离的蛋白质，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。

其中所述羰基还原酶（氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示）为前述羰基还原酶(氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示)的氨基酸序列第210位的Phe氨基酸残基突变为Tyr所得的突变体，该突变体仍然具有催化前手性羰基化合物不对称还原反应的活性，其中所述前手性羰基化合物较佳地为2-氯-苯乙酮。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供的羰基还原酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物制备手性醇的应用中，无需额外添加辅酶，而且所得的产物浓度高，光学纯度高（ee值达99%以上），反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大。因此，本发明所述羰基还原酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。

附图说明

图1为重组表达质粒pET-KtCR构建策略示意图。

图2为基因KtCR的PCR扩增电泳图谱；其中：1.DNAMarker；2～3.基因KtCR的PCR扩增产物。

图3为基因KtCR用EcoRI和XhoI双酶切后的电泳图谱；其中：1.DNAMarker (MarkerII，北京天根生化科技有限公司)；2～3.基因KtCR经EcoRI和XhoI双酶切的产物。

图4为质粒pET28a用EcoRI和XhoI酶切后的电泳图谱；其中：1.DNA Marker (MarkerII，北京天根生化科技有限公司)；2.pET28a经EcoRI和XhoI双酶切的产物。

图5为大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α/pET-KtCR的菌液PCR扩增电泳图；其中：1～4为大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α/pET-KtCR的菌液PCR扩增电泳图；5.DNA Marker。

图6为大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-KtCR的菌液PCR扩增电泳图；其中：1.DNA Marker(Marker II，北京天根生化科技有限公司)；2～4.大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-KtCR的菌液PCR扩增电泳图。

图7为重组羰基还原酶KtCR的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中：1.低分子量蛋白Marker（大连宝生物有限公司），2.大肠埃希氏菌(E.col)BL21(DE3)/pET-KtCR经诱导表达后的破碎上清；3.大肠埃希氏菌(E.col)BL21(DE3)/pET-KtCR经诱导表达后破碎所得碎片。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中所述室温为本领域常规室温，室温范围是20～40℃。

耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)CGMCC 2.1492。

表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，DNA Marker II，购自北京天根生化科技有限公司。

限制性内切酶EcoRI和XhoI购自大连宝生物有限公司。

实施例1羰基还原酶基因的克隆

根据Genbank收录的预测为耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)还原酶的基因序列(Genebank登录号：CAR23611.1)为依据，设计PCR引物如下：

上游引物:5’-CCGGAATTCATGCCCAAGACTATCGCCACA-3’；

下游引物:5’-CCGCTCGAGTCAGATGCTGCTGTACCCGC-3’。

其中，上游引物（核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示）下划线部分为EcoRI酶切位点，下游引物（核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示）下划线部分为XhoI酶切位点。

以耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)CGMCC 2.1492的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 10μl，上游引物和下游引物各1μl(0.3μmol/L)，DNA模板1μl(0.1μg)和ddH₂O7μl。PCR扩增程序为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性1min；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30个循环；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收700～900bp区间的目标条带(图2)。获得一条完整的的羰基还原酶全长基因序列，经DNA测序，全长846bp，命名为KtCR。所述基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述基因的重组表达载体构建策略如图1所示。

实施例2羰基还原酶重组质粒和重组表达转化体的制备

将实施例1所得的还原酶基因DNA片段及pET28a空质粒在37℃用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切12h，经琼脂糖凝胶电泳纯化(图3、图4)，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET-KtCR。

将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆(图5)。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-KtCR，菌落PCR验证阳性克隆(图6)。

实施例3羰基还原酶的表达

将实施例2所得的重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1%(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH 7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组羰基还原酶的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析(图7)，重组羰基还原酶以可溶的形式存在。

实施例4羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶活力的测定

通过检测340nm处吸光值变化的方式，利用分光光度计测定羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的活力。还原酶活力测定方法如下：于1ml反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 6.5)中，加入2mmol/L 2-氯苯乙酮，0.1mmol/L NADPH，30℃保温2分钟后加入适量实施例3制备的粗酶液，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。葡萄糖脱氢酶活力测定方法如下：于1ml反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)中，加入10mmol/L葡萄糖，1mmol/L NADP⁺，30℃保温2分钟后加入适量葡萄糖脱氢酶的粗酶液（制备方法参见：Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 2011,38,633641），迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。酶活力的计算公式为：酶活力(U)=EW×V×10³/(6220×l)；式中，EW为1min内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位mL；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位cm。每单位还原酶的定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol NADPH氧化所需的酶量。每单位葡萄糖脱氢酶的定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol NADP⁺还原所需的酶量。

实施例5–43羰基还原酶催化羰基化合物的不对称还原

在0.4ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中加入2U实施例3制备的粗酶液KtCR和2U的葡萄糖脱氢酶粗酶液（制备方法参见：Journal of Industrial Microbiology andBiotechnology 2011,38,633–641），分别加入终浓度为10mmol/L的芳基酮或酮酯(实施例5-45)，以及终浓度为0.5mmol/L的NADP⁺和5g/L的葡萄糖。在30℃，1100rpm振荡反应12h。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和还原产物的ee值。结果见表1。

产物ee值的具体分析条件如下：

实例5-10、12-17、19-35、38-43使用气相色谱仪进行分析，色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB(25m×0.25mm×0.39mm，Varian)或Beta DEXTM 120Capillary Column(30m×0.25mm×0.25μm,SupelcoTM)，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，其他条件如下：

实例5：Beta DEXTM 120Capillary Column，柱温130℃；

实例6、7、8、9、20、23、26：CP-Chirasil-Dex CB Capillary Column，初始柱温100℃，维持4min，5℃/min升至160℃，保持10min；

实例10、33、34：CP-Chirasil-Dex CB Capillary Column，柱温130℃

实例11使用液相色谱分析手性，手性柱Chiracel OB-H (250mm×4.6mm,Daicel Co.,Japan)，流动相：正己烷-异丙醇(90/10)，流速0.5ml/min，检测器波长254nm。

实例12：Beta DEXTM 120Capillary Column，柱温150℃；

实例13、19：CP-Chirasil-Dex CB Capillary Column，柱温180℃；

实例14-16、20-21、23-25、27-29：CP-Chirasil-Dex CB Capillary Column，柱温140℃；

实例17：CP-Chirasil-Dex CB Capillary Column，柱温160℃；

实例18使用液相色谱分析手性，手性柱Chiracel OD-H(250mm×4.6mm,Daicel Co.,Japan)，流动相：正己烷-异丙醇(90/10)，流速1.0ml/min，检测器波长254nm；

实例21、22、35：CP-Chirasil-Dex CB Capillary Column，柱温80℃；

实例30：Beta DEXTM 120Capillary Column，柱温110℃；

实例31、32：Beta DEXTM 120Capillary Column，柱温140℃；

实例36-37使用液相色谱分析手性，手性柱Chiracel OD-H (250mm×4.6mm,DaicelCo.,Japan)，流动相：正己烷-异丙醇(97/3)，流速1.0ml/min，检测器波长254nm；

实例38：CP-Chirasil-Dex CB Capillary Column，初始柱温90℃，维持2min，2℃/min升至120℃，保持5min；

实例39、40、43：CP-Chirasil-Dex CB Capillary Column，120℃；

实例41-42：CP-Chirasil-Dex CB Capillary Column，初始柱温110℃维持2min，2℃/min升至126℃，维持2min；

表1羰基还原酶催化制备光学活性手性醇

实施例44-47羰基还原酶催化2-氯苯乙酮的不对称还原

在10ml不同pH(5.5～7.0)的磷酸钠缓冲液(100mmol/L)中加入480U的实施例3制备的KtCR静息细胞和480U的葡萄糖脱氢酶粗酶液，分别加入终浓度为0.2mol/L的2-氯苯乙酮和60g/L的葡萄糖。反应在180rpm摇床，25℃下进行12h。反应后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。具体分析条件为：以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温140℃。结果见表2。

表2不同pH下KtCR催化2-氯苯乙酮不对称还原的结果

实施例48-51羰基还原酶催化2-氯苯乙酮的不对称还原

在10ml pH6.5磷酸钠缓冲液(100mmol/L)中加入480U的实施例3制备的KtCR静息细胞和480U的葡萄糖脱氢酶粗酶液，分别加入终浓度为0.2mol/L的2-氯苯乙酮和60g/L的葡萄糖。反应在180rpm摇床，不同温度(20～35℃)下进行12h。反应后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。具体分析条件为：以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温140℃，结果见表3。

表3不同温度下羰基还原酶催化2-氯苯乙酮不对称还原的结果

实施例52–53羰基还原酶催化2-氯苯乙酮的不对称还原

在10ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH6.5)中加入1.2kU的实施例3制备的KtCR静息细胞和1.2kU的葡萄糖脱氢酶粗酶液，分别加入终浓度为0.5mol/L的2-氯苯乙酮和150g/L的葡萄糖(实施例52)或1mol/L的2-氯苯乙酮和300g/L的葡萄糖(实施例53)。反应在25℃下进行，pH控制为6.5，反应至反应完全为止，即反应产物的量不再发生变化，此时反应时间实施例52为4小时，实施例53为12小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。结果见表4。

表4KtCR催化2-氯苯乙酮不对称还原的结果

实施例54羰基还原酶突变体的制备

将实施例1所得的耐热克鲁维酵母CGMCC 2.1492的羰基还原酶全长基因序列（SEQID NO:1）进行4个碱基的突变，分别是将羰基还原酶基因编码序列的第72位的C突变为T，第318位的T突变为C，第510位的T突变为A，第629位的T突变为A，得到的突变基因的序列如SEQ ID NO:3所示。所述羰基还原酶突变基因编码的蛋白质氨基酸序列出现了1个氨基酸残基的突变，突变后的羰基还原酶氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO:4所示，即将耐热克鲁维酵母CGMCC 2.1492的还原酶氨基酸序列（如序列表中SEQID NO:2所示）的第210位的Phe突变为Tyr。所述羰基还原酶的突变基因通过如实施例2-3所述的方法制备静息细胞和重组突变羰基还原酶粗酶。

实施例55羰基还原酶突变体催化2-氯苯乙酮反应

在10ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 6.5)中加入1.2kU的实施例54制备的突变KtCR的静息细胞和1.2kU的葡萄糖脱氢酶粗酶液，分别加入终浓度为1mol/L的2-氯苯乙酮和300g/L的葡萄糖。转化12h，转化率高于99%，产物ee>99.0%(S)。

对比实施例1-5不同羰基还原酶催化不对称还原2-氯苯乙酮结果

其中羰基还原酶1（LBADH）制备方法参见参考文献1（Bisogno F.R.;Lavandera I.;Kroutil W.;Gotor V.J.Org.Chem.2009,74,1730–1732.）；羰基还原酶2（CMCR）制备方法参见参考文献2（Zhu D.M.;Yang Y.;Hua L.J.Org.Chem.2006,71,4202-4205.）；羰基还原酶3（KRED112）制备方法参见参考文献3(Zhu D.M.;Mukherjee C.;Hua L.Tetrahedron:Asymmetry 2005,16,3275–3278.)；羰基还原酶4（LsADH）制备方法参见参考文献4(Itoh N.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.2012,93,1075–1085.)；羰基还原酶5为本发明所述实施例3制备所得。不对称还原结果如表5所示。

表5不同来源羰基还原酶不对称还原2-氯苯乙酮结果比较

从以上结果可以看出，本发明提供的羰基还原酶底物耐受度高，催化时间短，催化效率高，产物光学纯度高，同时不需要额外添加辅酶，从而节约了催化反应成本。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。