CN102559623B

CN102559623B - 一种还原酶及其基因、重组酶及制备方法和应用

Info

Publication number: CN102559623B
Application number: CN201210050842.9A
Authority: CN
Inventors: 许建和; 倪燕; 李春秀; 张�杰; 潘江; 王丽娟
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2030-10-29
Also published as: CN102559623A

Abstract

本发明公开了一类还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。本发明的还原酶或其重组酶可来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)CGMCC No.2549，可作为催化剂应用于不对称还原前手性羰基化合物以制备多种光学活性手性醇，其催化效率高、立体选择性强，且适用的反应条件温和、对环境友好。与野生型芽孢杆菌(Bacillus sp.)CGMCC No.2549的整细胞相比，本发明的还原酶催化效果更佳，底物适用性更广，具有很好的工业应用开发前景。

Description

一种还原酶及其基因、重组酶及制备方法和应用

本申请为发明名称为“一种还原酶及其基因、重组酶及制备方法和应用”、申请号为201010527409.0、申请日为2010年10月29日的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。

背景技术

含有特定功能基团的光学活性手性醇是合成医药、农药及其它精细化学品的重要手性砌块。研究人员已开发出多种光学活性手性醇合成的方法，包括动力学拆分和不对称合成。其中，利用前手性羰基化合物的不对称还原合成光学活性手性醇的途径，可实现理论100％的产率，是生产光学活性手性醇的重要方法。化学家们已经发现手性金属化合物可作为催化剂用于羰基的不对称还原，尽管该化学方法已被用于工业生产，然而该方法操作难度大，反应条件苛刻，且产物中可能会残留重金属，因此其应用受到限制。生物催化方法不仅反应条件温和、对环境友好，具有高度的区域选择性和立体选择性，而且避免了产物中重金属残留，恰好弥补了化学方法的不足之处，因此近几年来生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇不对称合成中的应用越来越受到重视。

氧化还原酶是催化生物氧化/还原反应的一大类酶，被广泛应用于不对称合成光学活性手性药物和功能性类固醇等化合物，因此开发具有实际应用价值的氧化还原酶一直是生物技术领域的一项重要内容。醛酮还原酶(AKR)和短链醇脱氢酶(SDR)是羰基还原酶家族的两大重要超家族。其中AKR超家族可分成15个家族，包含约150个成员。相比而言，SDR超家族成员数目较为庞大，目前已有46000多个成员。醛酮还原酶多为NADPH依赖型，通常为单亚基结构，亚基大小一般在35～40kDa左右；而短链醇脱氢酶多数由双亚基或四个亚基组成，亚基大小一般在27kDa左右。还原酶来源十分广泛，在微生物中普遍存在。例如，面包酵母全基因组中包含49个编码还原酶的开放读码框，其中18个还原酶的基因已被克隆表达并用于酮酯的不对称还原(J.Am.Chem.S℃.，2004，126：12827-12832)。另外，从许多其它微生物中也分离得到了具有立体选择性的还原酶，有些被进一步克隆表达，并应用于生物催化领域。例如，Kita等(J.Mol.Catal.B：Enzym.，1999，6：305-313)从掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)AKU4429中分离得到三种可催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原的还原酶；Itoh等(Appl.Microbiol.Biotehnol.，2004，66：53-62)对青霉菌(Penicillium citrinum)IF04631中的一种β-酮酯还原酶(AKR3E1)进行了异源表达，并应用于(S)-4-溴-3-羟基丁酸甲酯的生产中。

然而目前应用于工业的还原酶类催化剂所占的比率尚不足总量的14％。如何针对特定的底物找到具有高催化活性和选择性的生物催化剂是该领域至关重要的问题。将生物信息学和基因重组技术相结合，快速高效地开发性能优异的新型生物催化剂，是发展生物不对称还原技术的有效途径。Yamamoto等(Appl.Microbiol.Biotechnol.，2003，61：133-139)利用该手段克隆了来自枯草芽孢杆菌中的重组还原酶FabG以及其他多种微生物中的FabG结构类似酶，用以催化4-氯乙酰乙酸乙酯的不对称还原。另外，其它一些来自枯草芽孢杆菌的还原酶的结构和性质也已有研究报道。如枯草芽孢杆菌还原酶YtbE对多种醛类化合物有还原活性(Protein Science，2009，18：1792-1800)；还原酶YueD对联苯甲酰有还原活性(J.Biotechnol.，2002，96：157-169)。但这三种来自枯草芽孢杆菌的还原酶是否可以用于催化其他羰基化合物的不对称还原，迄今尚无文献报道。

目前已知芽孢杆菌(Bacillus sp.)ECU0013，即CGMCC No.2549可催化多种芳基酮不对称还原生成光学活性手性仲醇(Bioresour.Technol.，2010，101：1054-1059；发明专利CN101372677B)。但是以该野生菌株整细胞作为催化剂时，由于酶产量很低，导致总体催化活性不高，从而限制了生物催化剂的优势发挥。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以野生芽孢杆菌(Bacillus sp.)CGMCC No.2549整细胞作为芳基酮不对称还原催化剂时酶产量较低使总体催化活性不高，不对称还原底物谱较窄的缺陷，而提供一种具有优异的不对称催化活性、底物适用性广、对环境友好的还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该还原酶或其重组酶的应用。

本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：

本发明的还原酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示。本发明以来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)ECU0013的辅酶依赖类型为NADPH型的该还原酶为例进行说明。本发明中，所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)ECU0013现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.2549。该菌株从土壤中筛选得到，在发明专利(CN101372677B)中有详细说明。

本发明还涉及一种还原酶基因，其为(1)其碱基序列如序列表中SEQ IDNo.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示；或(2)其编码由序列表中SEQ IDNo.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明的还原酶基因可来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)CGMCC No.2549，具体制备方法可为：根据Genbank中收录的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的还原酶YtbE、FabG和YueD的基因序列设计合成引物，然后以芽孢杆菌(Bacillus sp.)CGMCC No.2549的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得三条完整的还原酶全长基因序列，分别为：

碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的基因，命名为BCR I，全长843bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第840个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

碱基序列如序列表中SEQ ID No.3所示的基因，命名为BCR II，全长741bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第738个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。

碱基序列如序列表中SEQ ID No.5所示的基因，命名为BCR III，全长732bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第729个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。

如本领域技术人员所知，本发明的还原酶基因的碱基序列也可以是编码由序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他任何碱基序列。

本发明另涉及包含本发明的还原酶基因的核苷酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的还原酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的还原酶基因产物与载体pMD-18T连接，形成克隆载体pBCRI-18T、pBCRII-18T或pBCRIII-18T，之后将克隆载体和表达载体pET28a用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切，形成互补的粘性末端，再经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的还原酶基因的重组表达质粒pET-BCRI、pET-BCRII或pET-BCRIII。

本发明进一步涉及包含本发明的还原酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α。将前述重组表达质粒pET-BCRI、pET-BCRII或pET-BCRIII转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-BCRI、大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-BCRII或大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-BCRIII。

本发明还进一步涉及一种重组还原酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组还原酶。其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物得到。

其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可本领域任何可使转化体生长并产生本发明的还原酶的培养基，对于菌株，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生还原酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。对于菌株，优选下述方法：将表达本发明的还原酶基因的重组大肠杆菌(优选本发明的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)重组表达转化体)接种至含氨苄青霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5-0.7(优选0.6)时，在终浓度为0.1-1mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组还原酶。

本发明再进一步涉及一种重组还原酶，其为(1)按上述方法制得的重组还原酶；或(2)氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ IDNo.6所示的重组还原酶。本发明的重组还原酶的辅酶依赖类型为NADPH型。

本发明更进一步涉及本发明的还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。

较佳的，所述的应用按下述方法进行：在pH 6-8的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺的存在下，在本发明的还原酶或重组还原酶的作用下，将前手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。

上述应用中，所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：

所述的前手性羰基化合物较佳的为芳基酮类化合物或酮酯类化合物。所述的芳基酮中的芳基较佳的为苯基或芳杂基，如含有1～2个选自N、S和O的杂原子的五元或六元芳杂基，优选吡啶基。本发明优选如式1、2、3或4所示的前手性羰基化合物：

式1 式2 式3 式4

其中，R₁为-H、-Cl或-Br，R₁取代的位置为苯基的邻位、间位或对位；

R₂为-CH₃、-CH₂Cl、-CH₂Br或-CF₃；

R₃为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；

R₄为-CH₃、-CH₂Cl、-CH₂Br或-CF₃；

R₅为-CH₃、o-Cl-C₆H₅-或-(CH₂)₂C₆H₅。

所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度较佳的为1～15mmol/L。本发明的还原酶或重组还原酶的用量为催化有效量，较佳的为1～10U/L(酶活测定方法及定义见实施例4)。葡萄糖脱氢酶的用量较佳的为10～100U/L(酶活测定方法及定义见实施例4)。葡萄糖的用量较佳的为5～50g/L。NADP⁺的用量较佳的为0.5～1.0mmol/L。所述的磷酸盐缓冲液可为本领域常规磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05～0.1mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的在振荡条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳的为20～35℃。所述的不对称还原反应的时间较佳的以反应完全为准，一般为1～12小时。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取(S)-或(R)-型手性醇产物。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的还原酶或其重组酶可作为催化剂应用于不对称还原前手性羰基化合物以制备多种光学活性手性醇，其催化效率高、立体选择性强，且适用的反应条件温和、对环境友好。与野生型芽孢杆菌(Bacillus sp.)CGMCC No.2549的整细胞相比，本发明的还原酶催化效果更佳，底物适用性更广，具有很好的工业应用开发前景。

附图说明

图1为基因BCRI、BCRII和BCRIII的PCR扩增电泳图谱，其中，1、DNA Marker(Marker II，北京天根生化科技有限公司)；2、基因BCRIII的PCR扩增产物；3、基因BCRI的PCR扩增产物；4、基因BCRII的PCR扩增产物。

图2为克隆质粒pBCRI-18T、pBCRII-18T和pBCRIII-18T的BamHI和XhoI的双酶切分析图谱，其中，1、pBCRI-18T/BamHI+XhoI；2、pBCRII-18T/BamHI+XhoI；3、pBCRIII-18T/BamHI+XhoI；4、DNA Marker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)。

图3为大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-BCRI、大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-BCRII的菌液PCR扩增电泳图，其中，1～6、大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-BCRI的菌液PCR扩增电泳图；7～12、大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-BCRII的菌液PCR扩增电泳图；13、DNA Marker(Marker II，北京天根生化科技有限公司)。

图4为大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-BCRIII的菌液PCR扩增电泳图，其中，1～6、大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-BCRIII的菌液PCR扩增电泳图；7、DNA Marker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)。

图5为重组表达质粒pET-BCRI的构建示意图。

图6为重组表达质粒pET-BCRII的构建示意图。

图7为重组表达质粒pET-BCRIII的构建示意图。

图8为重组还原酶BCRI、BCRII和BCRIII的聚丙烯凝胶电泳图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下列实施例中的材料来源为：

质粒pMD18-T购自大连TaKaRa公司。

表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

实施例1～2过程如图5～7所示。

实施例1还原酶基因的克隆

根据Genbank中已收录的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的还原酶YtbE、FabG和YueD的基因序列为依据，设计PCR引物如下：

引物1(扩增BCR I基因)：

上游引物：CGCGGATCCATGACAACACATTTACAAGCAAAAG

下游引物：CCGGTCGAGTTAAAAATCAAAGTTGTCCGGATC

引物2(扩增BCR II基因)：

上游引物：CGCGGATCCATGCTTAATGATAAAACGGCT

下游引物：CCGGTCGAGTTACATCACCATTCCGCC

引物3(扩增BCR III基因)：

上游引物：CGCGGATCCATGGAACTTTATATCATCACCGGAG

下游引物：CCGGTCGAGCTACAAAAACTCTTTAATATCATAAATGCG

其中，上游引物下划线部分为BmHI酶切位点，下游引物下划线部分为XhoI酶切位点。

以芽孢杆菌(Bacillus sp.)CGMCC No.2549的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 15μl，上游引物和下游引物各1μl(0.3μmol/L)，DNA模板1μl(0.1μg)和ddH₂O 12μl。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性5min；(2)94℃，变性45s；(3)60℃退火1min；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复35次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收700～900bp区间的目标条带(图1)。获得三条完整的芽孢杆菌(Bacillus sp.)CGMCC No.2549的还原酶全长基因序列，经DNA测序，分别如下：

基因1，命名为BCR I，全长843bp，碱基序列如序列表中SEQ ID No.1。

基因2，命名为BCR II，全长741bp，碱基序列如序列表中SEQ ID No.3。

基因3，命名为BCR III，全长732bp，碱基序列如序列表中SEQ ID No.5。

实施例2重组表达载体(质粒)和重组表达转化体的制备

将实施例1所得的还原酶基因与pMD-18T载体连接，分别构建克隆质粒pBCRI-18T、pBCRII-18T和pBCRIII-18T。之后分别转化至大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞，通过菌落PCR筛选阳性克隆，提取质粒，在37℃用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切12h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段，证明含有正确的插入片段(图2)。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经BamHI和XhoI酶切后的质粒pET28a，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET-BCRI、pET-BCRII和pET-BCRIII。

分别将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即分别获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-BCRI、大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-BCRII和大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pET-BCRIII，菌落PCR验证阳性克隆(图3和4)。

实施例3重组还原酶的表达

分别将实施例2所得的3种重组大肠杆菌，接种至含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有50ml LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)的250ml三角瓶中，置37℃、180rpm摇床培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，将所得的静息细胞悬浮于pH 7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组还原酶的粗酶液。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析(图8)，三个重组蛋白大部分以可溶性形式存在。聚丙烯酰胺凝胶电泳图分别经BandScan软件分析得，表达的目的蛋白还原酶BCRI约占粗酶液总蛋白的55％、表达的目的蛋白还原酶BCRII约占粗酶液总蛋白的58％，表达的目的蛋白还原酶BCRIII约占粗酶液总蛋白的63％。

实施例4重组还原酶和葡萄糖脱氢酶活力的测定

利用分光光度计检测340nm吸光值的变化计算还原酶和葡萄糖脱氢酶的活力。

重组还原酶活力测定方法如下：于1ml反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)中，加入2mmol/L2-氯苯乙酮，0.05mmol/L NADPH，30℃保温2分钟后加入适量酶液，迅速摇匀，检测340nm处吸光值的变化。

葡萄糖脱氢酶活力测定方法如下：于1ml反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)中，加入2mmol/L葡萄糖，0.05mmol/L NADP⁺，30℃保温2分钟后加入适量酶液，迅速摇匀，检测340nm处吸光值的变化。

酶活力的计算公式为：酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×l)；式中，EW为1min内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位mL；6220为摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位cm。

还原酶每单位酶活定义为在上述条件下，每分钟催化氧化1μmolNADPH所需的酶量。重组还原酶BCRI、BCRII和BCRIII的酶活分别为0.017U/mg蛋白、0.28U/mg蛋白和0.14U/mg蛋白。

每单位葡萄糖脱氢酶酶活定义为在上述条件下，每分钟催化还原1μmolNADP⁺所需的酶量。

实施例5-19重组还原酶BCR I催化羰基化合物的不对称还原

在0.4ml磷酸-磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中加入0.002U的BCR I酶液和0.04U的葡萄糖脱氢酶，分别加入终浓度为2mmol/L的芳香酮(实施例5-13)或终浓度为10mmol/L的酮酯(实施例14-19)，再加入终浓度为0.5mmol/L的NADP⁺和50g/L的葡萄糖。在30℃，1100rpm振荡反应一定时间。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEXCB或Beta-DEX 120)或液相色谱(手性OD-H柱)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。结果见表1。

产物ee值具体分析条件如下：

实施例5-17及19使用气相色谱分析手性，载气氮气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，其他条件如下：

实施例5：手性毛细管柱Beta-DEX 120，柱温130℃；

实施例6：手性毛细管柱Beta-DEX 120，柱温150℃；

实施例7：手性毛细管柱Beta-DEX 120，柱温160℃；

实施例8：手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，柱温130℃；

实施例9：手性毛细管柱Beta-DEX 120，柱温160℃；

实施例10：手性毛细管柱Beta-DEX 120，柱温170℃；

实施例11：手性毛细管柱Beta-DEX 120，柱温110℃；

实施例12和13：手性毛细管柱Beta-DEX 120，柱温140℃；

实施例14：手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，柱温90℃维持2min，1℃/min升至120℃；

实施例15：乙酰化产物，手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，柱温110℃维持2min，2℃/min升至126℃维持2min；

实施例16：手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，柱温130℃；

实施例17：手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，柱温70℃；

实施例19：手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，柱温160℃。

实施例18使用液相色谱分析手性，手性OD-H柱，流动相：正己烷/异丙醇＝97/3，流速1ml/min，检测器波长254nm。

表1重组还原酶BCR I催化羰基化合物不对称还原反应的结果

实施例20-33重组还原酶BCR II催化羰基化合物不对称还原

在0.4ml磷酸-磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中加入0.002U的BCR II酶液和0.04U的葡萄糖脱氢酶，分别加入终浓度为2mmol/L的芳香酮(实施例20-28)或终浓度为10mmol/L的酮酯(实施例29-33)，再加入终浓度为0.5mmol/L的NADP⁺和50g/L的葡萄糖。在30℃，1100rpm振摇反应一定时间。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEXCB)或液相色谱(手性OD-H柱)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。结果见表2。

产物ee值具体分析条件如下：实施例29：乙酰化产物，气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB)，柱温110℃维持2min，5℃/min升至180℃。其他产物ee值分析条件同实施例5～19中所述。

表2重组还原酶BCR II催化羰基化合物不对称还原的结果

实施例34-48重组还原酶BCR III催化羰基化合物的不对称还原

在0.4ml磷酸-磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中加入0.002U的BCR III酶液和0.04U的葡萄糖脱氢酶，分别加入终浓度为2mmol/L的芳香酮(实施例34-42)或终浓度为10mmol/L的酮酯(实施例43-48)，再加入终浓度为0.5mmol/L的NADP⁺和50g/L的葡萄糖。在30℃，1100rpm振摇反应一定时间。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEXCB)或液相色谱(手性OD-H柱)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。结果见表3。产物ee值分析条件同实施例5～33。

表3重组还原酶BCR III催化羰基化合物不对称还原的结果

Claims

1.一种还原酶，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。

2.一种还原酶基因，其特征在于：其编码由序列表中SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.如权利要求2所述的还原酶基因，其特征在于：其碱基序列如序列表中SEQ ID No.5所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于：其包含如权利要求2所述的还原酶基因的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体的骨架为pET28a。

6.一种非植物或动物品种的重组表达转化体，其特征在于：其包含如权利要求2所述的还原酶基因或如权利要求4或5所述的重组表达载体。

7.如权利要求6所述的重组表达转化体，其特征在于：其为将如权利要求5所述的重组表达载体转化至宿主微生物中制得的基因工程菌株；所述的宿主微生物为大肠杆菌。

8.一种重组还原酶的制备方法，其特征在于其包括如下步骤：培养如权利要求6或7所述的重组表达转化体，获得重组还原酶。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于其包括如下步骤：将如权利要求7所述的重组表达转化体接种至含氨苄青霉素的LB培养基中培养，培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5-0.7，在终浓度为0.1-1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，即得重组还原酶；所述的LB培养基包括蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L和NaCl10g/L，pH为7.0。

10.如权利要求1所述的还原酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用；所述的前手性羰基化合物为如式1、2、3或4所示的前手性羰基化合物：

其中，R₁为-H、-Cl或-Br，R₁取代的位置为苯基的对位；

R₂为-CH₃、-CH₂Cl、-CH₂Br或-CF₃；

R₃为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；

R₄为-CH₃、-CH₂Cl、-CH₂Br或-CF₃；

R₅为-CH₃或o-Cl-C₆H₅-。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于：所述的应用按下述方法进行：在pH6-8的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺的存在下，在如权利要求1所述的还原酶的作用下，将前手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于：所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度为1～15mmol/L；所述的还原酶或重组还原酶的用量为1～10U/L；葡萄糖脱氢酶的用量为10～100U/L；所述的葡萄糖的用量为5～50g/L；所述的NADP⁺的用量为0.5～1.0mmol/L；所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.1mol/L；所述的不对称还原反应的温度为20～35℃；所述的不对称还原反应的时间以反应完全为准。