CN103937731A - 风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法。本发明从15种优势菌中选取三种菌株，其中细菌、丝状真菌和放线菌个一种，将其培养后应用于草坪植物建植体系中。根据对这15种菌株作用分析，最终选定假单胞菌、木霉和链霉菌这三种。它们都能产生活性物质或改善矿质营养直接促进植物的生长，还可以产生代谢物质或通过竞争作用来抑制或阻挠根区病原微生物的发展，间接促进植物的生长。
Description
技术领域
本发明属于环境保护技术领域，涉及风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法。
背景技术
复合微生物菌剂由两种或两种以上且互不拮抗的微生物菌种按合适比例共同培养，充分发挥群体的联合作用优势，取得较佳应用效果的一种微生物制剂，此类菌剂一般具有有种类全、配伍合理、见效快、投资少、操作简单、不造成二次污染等优点，现已广泛应用于农业、工业、医药和环保等各个领域。
施肥是农业生产及草坪养护管理中很重要的措施之一。在目前大部分选用的是无机肥。无机肥虽然能够及时补充土壤养分，但是大量使用却能对地表水、地下水以及空气造成污染，对环境构成威胁。施加微生物肥料是在较低的生态影响条件下维持较高产量的更加和谐的一种施肥方式。比如最经典的菌根真菌、根瘤菌、根际促生细菌等。它的优点主要表现在：1.创造良好的根际生态环境。2.提高土壤以及空气造成污染的供肥能力3.对环境资源的有效利用。4.降低作物对化肥的依赖。5.抑制病虫害的发生。其原因一是有益细菌的大量繁殖大植物根隙区域形成优势种群，抑制了病原微生物生长繁殖，降低了植物酶、多酚氧化酶等，参与植物的防御反应，提高植物的抗病虫害能力。6.减少农药污染等具有重要作用。同时，以城乡有机废弃物为基质，采用现代化的工业技术，制造成具有多种功能(如固氮、解磷、活钾等)再生型复合生物肥料，将对资源的循环利用，实现生态经济、社会效益一体化同样具有重要意义。
自20世纪70年代以来，欧美日本等国家或地区都相继研制成功了一些复合菌剂，很多已经开始进行大规模的生产，并形成了系列化的产品，主要用于处理生活污水，工农业废水以及其他一些化合物污染的治理。我国国内微生物发展状况经历了从50年代到90年代，从理论到实践，从单一菌种的利用到多个的混合应用，产品也从根瘤菌剂发展到复合微生物菌剂，相继取得了一些成果。
目前多数研究已表明，微生物制剂应用于农业生产，能促进植物生长，且无毒、无公害、无污染，能持久均衡地供给农作物氮磷钾元素的，被广泛开发用作生物肥料。目前研发的生物菌肥的热点产品主要包括：有机物料腐熟菌剂（也称发酵菌剂）、土壤修复菌剂、根瘤菌剂和溶磷菌剂、烟草等经济作物专用的功能菌剂、生物有机肥、抗旱菌剂等。美国哥斯达黎加大学应用EM技术来种植香蕉，有效减小了香蕉叶斑病的发生和线虫类的侵袭，大大提高了其营养价值和生产效率。
另外，复合微生物菌剂在畜禽养殖和水产养殖方面也有很明显的作用。复合微生物菌剂能防病抗病，提高成活率，提高生产性能，降低饲养成本，增加经济效， 改善产品品质，生产绿色食品。倪永珍等对鸡进行400d的EM饲喂结果表明，与对照组比较鸡的死亡率平均下降了35.5%。据石专林报道，在饲粮中添加5%的EM发酵饲料，可使肉仔鸡增重提高10.3%，料肉比下降7.8%。刘华周等试验也表明，蛋鸡日粮中 EM发酵饲料占20%时，蛋壳厚度增加6.99%，蛋白哈 氏单位提高10.31%，蛋黄颜色提高1.5罗氏级。
城市污泥是城市污水处理厂在各级污水处理净化后所产生的含水量75%-99%的固体或者流体状物质。它包括污水中的泥砂、纤维、动植物残体等固体颗粒及其凝结的絮状物，各种胶体、有机物及吸附的金属元素、微生物、病菌、虫卵、杂草种子等综合固体物质。城市污泥中出现的微生物主要由细菌、放线菌、 真菌以及原生动物和后生动物等，其中细菌是最主要成分，细菌主要有菌胶团细菌和丝状菌，数量可占污泥中微生物总量的90% ~ 95%左右。
20世纪80年代之前，活性污泥菌群的研究主要以传统分离培养法为主。该方法从活性污泥中发现的主要优势菌群有：动胶杆菌属、丛毛单胞菌属、不动杆菌属、螺菌属、产碱杆菌属、短杆菌属、黄杆菌属和假单胞菌属等。但是后来大量研究发现，在活性污泥中经典纯培养方法能够培养的细菌数量只占活性污泥微生物总数的 1% ～15%。
20 世纪80年代后期，随着以16 S r RNA 为主要基石的细菌分子分类学的发展，PCR 技术、电泳技术、克隆库技术、荧光原位杂交和流式细胞术逐渐成为研究活性污泥菌群的主要手段，活性污泥中菌群的复杂性和多样性也以惊人的速度被人们认识，大量传统检测方法未能发现却在活性污泥中起关键作用的微生物陆续被发现，如具有除磷作用的类红环菌、小月菌、类Tetr asphaera 的棒状菌、俊片菌等；具有脱氮作用的反硝化生丝微菌属、固氮弧菌属相关菌、类硝化螺菌等；与污泥泡沫有关的诺卡氏菌形放线菌、丝状菌和等。
城市污泥是污水处理过程中产生的沉淀物质，污水处理厂产生的污泥量约为处理水体积的0.15%~1.00%。它是一种以有机成分为主、组分复杂的混合物，其中包含有潜在利用价值的有机质、氮、磷、钾以及各种微量元素，其pH值为6~7，总碱度约为200 mg/l，很适合微生物的繁殖与生长。因次，其微生物含量相当丰富。并且，污泥作为一个高渗环境，对其中的微生物存在一个自然驯化的过程。但是有关城市污泥有益微生物的分类鉴定方面的研究还很少，对城市污泥微生物的利用更是尚无文献报道。本技术从污泥原液中取出菌液，在适合不同菌种生长的固体培养基中分别培养分离，从而鉴定污泥有效微生物的组成，以便后期将其应用于草坪建植方面的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法。本发明15种优势菌中选取三种菌株，其中细菌、丝状真菌和放线菌个一种，将其培养后应用于草坪植物建植体系中。根据对这15种菌株作用分析，最终选定假单胞菌、木霉和链霉菌这三种。它们都能产生活性物质或改善矿质营养直接促进植物的生长，还可以产生代谢物质或通过竞争作用来抑制或阻挠根区病原微生物的发展，间接促进植物的生长。为实现此述目的，本发明提供如下的技术方案：
一种风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）材料的选择：城市污泥来自污水处理厂；
（2）菌株的培养：称取污泥10g，放入盛有90 g无菌水的锥形瓶中加入玻璃珠，放在摇床上振摇20 min，采用稀释分离法制备10－2、 10－3、10－4、10－5、10－6的污泥悬浮液； 根据所分离的微生物，取不同浓度的污泥悬浮液，摇匀后吸取0.2 mL加入到预先倒好的平板中；其中
1）真菌用马丁氏琼脂平板，此培养液1000 ml加1%孟加拉红水溶液3.3 ml，临用时每100 ml培养基中加1%链霉素液0.3 ml;放线菌用高氏一号琼脂平板，临用时每100 ml培养基中加入10%苯酚2滴；细菌用牛肉膏蛋白胨平板；用灭菌的涂布器涂抹均匀，每处理重复3次，28℃培养；
2）根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度特点，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化，依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量；
3）每种培养基上确定5种优势菌，进行编号保存，待进一步鉴定；
（3）菌种的鉴定
1）将分离到的优势细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃ 培养，观察 18 － 24 h菌龄的菌落形态、细菌的形态特征、培养特性，采用革兰氏染色法、芽孢染色法和荚膜染色法进行染色；挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版，采用通用引物 27f/1492r(27F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
3’;1492R:5’GGTTACCTTGT TACGACTT 3’)进行 PCR 扩增 16SrRNA 基因，
PCR 反应程序如下：
94℃ 2 min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min，扩增产物送至上海美吉基因公司测序，测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较；
2)优势真菌的鉴定：将分离到的优势真菌接种到马丁氏培养基上，28℃ 培养 7 天后，描述菌落质地、形状、大小、隆起形状和颜色等，同时在光学显微镜(10 × 40 倍)下观察菌株的分生孢子和分生孢子梗形态，参照有关资料进行形态学鉴定；
3)挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体 ，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版，采用通用引物通用引物ITS1(5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3’)和ITS4 (5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’）
进行 PCR 扩增 18SrDNA 基因，PCR 反应程序如下：94℃ 2min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min。扩增产物送至上海美吉基因公司测序，测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较；
4)优势放线菌的鉴定
将分离到的优势放线菌接种到高是一号培养基上，28℃ 培养 7-10 天后，采用印片法观察放线菌形态, 将分离到的优势细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃ 培养，观察 18-24 h菌龄的菌落形态、细菌的形态特征、培养特性，采用革兰氏染色法、芽孢染色法和荚膜染色法进行染色；挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体 ，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版,采用通用引物 27f/1492r(27F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’;1492R:5’GGTTACCTTGT TACGACTT 3’)
进行 PCR 扩增 16SrRNA 基因,PCR 反应程序如下：94℃ 2 min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min，扩增产物送至上海美吉基因公司测序，测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较。其中步骤(2)所述的真菌取10－2、10－3、10－4，放线菌取10－3、10－4、10－5，细菌取10－4、10－5、10－6。
本发明所述的优势菌定义为：在最高稀释度上，菌落数占总菌落数的比例为10%以上的菌称之为优势菌。每个样品中最多的菌落数达不到10%的，取菌落数最多的前两种作为该样品的优势菌。
本发明更加详细的制备方法如下:
1 研制材料与方法
1.1 材料
城市污泥来自天津纪庄子污水处理厂。
1.2 菌株的培养
称取污泥10 g，放入盛有90 g无菌水的锥形瓶中加入玻璃珠，放在摇床上振摇20 min。采用稀释分离法制备10－2、 10－3、10－4、10－5、10－6的污泥悬浮液。根据所分离的微生物，取不同浓度的污泥悬浮液 (真菌取10－2、10－3、10－4，放线菌取10－3、10－4、10－5，细菌取10－4、10－5、10－6)，摇匀后吸取0.2 mL加入到预先倒好的平板中。真菌用马丁氏琼脂平板，此培养液1000 ml加1%孟加拉红水溶液3.3 ml。临用时每100 ml培养基中加1%链霉素液0.3 ml;放线菌用高氏一号琼脂平板，临用时每100 ml培养基中加入10%苯酚2滴;细菌用牛肉膏蛋白胨平板。用灭菌的涂布器涂抹均匀。每处理重复3次，28℃培养。
根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度等特点，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化。依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量。每种培养基上确定5种优势菌，进行编号保存，待进一步鉴定。优势菌定义为：在最高稀释度上，菌落数占总菌落数的比例为10%以上的菌称之为优势菌。每个样品中最多的菌落数达不到10%的，取菌落数最多的前两种作为该样品的优势菌。
1.3 菌种的鉴定
1.3.1 优势细菌的鉴定
将分离到的优势细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃ 培养，观察 18 － 24 h菌龄的菌落形态、细菌的形态特征、培养特性，采用革兰氏染色法、芽孢染色法和荚膜染色法进行染色。
挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体 ，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版。采用通用引物 27f/1492r(27F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’;1492R:5’GGTTACCTTGT TACGACTT 3’)进行 PCR 扩增 16SrRNA 基因。PCR 反应程序如下：94℃ 2 min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min。扩增产物送至上海美吉基因公司测序。测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较。
1.3.2 优势真菌的鉴定
将分离到的优势真菌接种到马丁氏培养基上，28℃ 培养 7 天后，描述菌落质地、形状、大小、隆起形状和颜色等，同时在光学显微镜(10 × 40 倍)下观察菌株的分生孢子和分生孢子梗形态。参照有关资料进行形态学鉴定。
挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体 ，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版。采用通用引物 通用引物ITS1(5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3’)和ITS4 (5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’）进行 PCR 扩增 18SrDNA 基因。PCR 反应程序如下：94℃ 2min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min。扩增产物送至上海美吉基因公司测序。测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较。
1.3.3优势放线菌的鉴定
将分离到的优势放线菌接种到高是一号培养基上，28℃ 培养 7-10 天后，采用印片法观察放线菌形态。分子鉴定同 1. 3. 1 优势细菌的分子鉴定。
2 研制结果分析
2.1 牛肉膏蛋白胨培养基上微生物的形态及菌落计数
2.1.1 污泥微生物在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数统计
表1培养基上细菌菌落数情况
| 污泥 | 原液 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 菌落数 | 菌落数>300，无法计数 | 992×104 | 402×105 | 170×106 |
2.1.2 牛肉膏蛋白胨培养基上5种优势菌的形态特征
表2 牛肉膏蛋白胨培养基的细菌情况
| 编号 | 颜色 | 表面形态 | 形状 |
| 1 | 黄色 | 表面光滑，边缘有细小皱褶，菌落较小 | 圆形为主 |
| 2 | 橘红 | 表面圆润，光滑，菌落较小 | 圆形为主 |
| 3 | 浅黄 | 粗糙，颗粒状 | 圆形 |
| 4 | 透明 | 光滑透亮，菌落中等 | 不规则 |
| 5 | 乳白 | 不光滑，略光亮，边缘呈锯齿状 | 圆形为主 |
注：编号1、2、3、4、5为牛肉膏蛋白胨培养基上的物种优势菌种，编号6、7、8、9、10为马丁氏培养基上的五种优势菌种，编号11、12、13、14、15为高氏一号培养基上的物种优势菌种。
2.1.3牛肉膏蛋白胨培养基上5种优势菌染色结果
表3 牛肉膏蛋白胨培养基的细菌染色结果
| 编号 | 革兰氏染色 | 芽孢染色 | 荚膜染色 |
| 1 | + | — | — |
| 2 | — | — | + |
| 3 | — | — | + |
| 4 | + | — | — |
| 5 | — | — | — |
注：+表示阳性，—表示阴性。
2.1.4牛肉膏蛋白胨培养基上5种优势菌纯化结果
2.1.5 牛肉膏蛋白胨培养基上5中菌株的PCR结果
表4 牛肉膏蛋白胨培养基上菌株PCR结果
| 编号 | 相关属 | 相关种 | 拉丁名 | 相似度 |
| 1 | 节杆菌属 | Soli | Arthrobacter soli | 99% |
| 2 | 金黄杆菌属 | Haifense | Chryseobacterium haifense | 98% |
| 3 | 假单胞菌属 | 施氏假单胞菌 | Pseudomonas stutzeri | 99% |
| 4 | 微杆菌属 | 乳微杆菌 | Microbacterium lacticum | 99% |
| 5 | 苍白杆菌属 | 根际苍白杆菌 | Ochrobactrum rhizosphaerae | 98% |
2.1.6牛肉膏蛋白胨培养基上5种优势菌鉴定结果
将5种优势菌的菌落形态，染色结果对比《伯杰细菌鉴定手册》及PCR结果相结合，分析鉴定其相应的种属。鉴定结果如下：菌株1为节杆菌属的Arthrobacter soli ，菌株2为金黄杆菌属的Chryseobacterium haifense ，菌株3为假单胞菌属的施氏假单胞菌，菌株4为微杆菌的乳微杆菌，菌株5为苍白杆菌属根际苍白杆菌。
2.2 马丁氏培养基上微生物的形态及菌落计数
2.2.1 污泥微生物在马丁氏培养基上的菌落数统计
表5培养基上细菌菌落数情况
| 污泥 | 原液 | 10-2 | 10-3 | 10-4 |
| 菌落数 | 菌落数>300，无法计数 | 480×102 | 173×103 | 62×104 |
2.2.2 马丁氏培养基上5种优势菌的形态特征
表6 马丁氏培养基的细菌情况
| 编号 | 颜色 | 表面形态 | 形状 | 菌落直径 |
| 6 | 黑色 | 菌丝绒毛状 | 圆形 | 10mm |
| 7 | 绿色 | 菌丝棉絮状 | 不规则 | 19mm |
| 8 | 黄绿色 | 菌丝棉絮或绒毛状 | 不规则 | 15mm |
| 9 | 白色 | 菌丝蜘蛛网状 | 圆形 | 7mm |
| 10 | 青黄色 | 菌丝 | 不规则 | 13mm |
2.2.3 5种优势菌显微镜下观察结果
将分离纯化得到的5种优势菌置于光学显微镜(10 × 40 倍)下观察，得到结果如下：菌株6菌丝绒毛状，初期白色，后灰白色至黑色。菌丝无隔、多核、分枝状，分枝顶端着生球形孢子囊。菌株7木呈不定型棉絮状，其表面的颜色多呈绿色。菌丝有隔分枝。分生孢子梗是菌丝的短侧枝，在分枝末端形成瓶状小梗。菌株8菌丝棉絮或绒毛状有隔，分枝，分生孢子梗分枝。菌株9菌丝蜘蛛网状，白色，无隔而分枝。菌株10菌丝鹦鹉绿色，菌丝各细胞之间有横隔膜，孢子梗发生于气生菌丝，顶端明显膨大，帚状枝双轮生，梗颈明显，孢子球形。
2.2.4马丁氏培养基上5种优势菌纯化结果
2.2.5 马丁氏培养基培养基上5中菌株的PCR结果
表7 牛肉膏蛋白胨培养基上菌株PCR结果
| 编号 | 相关属 | 相关种 | 拉丁名 | 相似度 |
| 6 | 毛霉属 | 梨形毛霉 | Mucor piriformis | 97% |
| 7 | 木霉属 | 里氏木霉 | Trichoderma reesei | 98% |
| 8 | 曲霉属 | 黄曲霉 | Aspergillus flavus | 99% |
| 9 | 水霉属 | 寄生水霉 | S.arasitica coker | 98% |
| 10 | 镰刀菌属 | keratoplasticum | Fusarium keratoplasticum | 99% |
2.2.6马丁氏培养基上5种优势菌鉴定结果
将5种优势菌的菌落形态、镜下观察结果及PCR结果相结合，分析鉴定其相应的种属。鉴定结果如下：菌株6属于毛霉属的梨形毛霉，菌株7属于木霉属的里氏木霉，菌株8属于曲霉属的黄曲霉 ，菌株9属于水霉属的 寄生水霉，菌株10属于镰刀菌属的keratoplasticum。
2.3 高氏一号培养基上微生物的形态及菌落计数
2.3.1 污泥微生物在高氏一号培养基上的菌落数统计
表8培养基上细菌菌落数情况
| 污泥 | 原液 | 10-3 | 10-4 | 10-5 |
| 菌落数 | 菌落数>300，无法计数 | 789×103 | 248×104 | 83×105 |
2.3.2 高氏一号培养基上5种优势菌的形态特征
表9高氏一号培养基的细菌情况
| 编号 | 颜色 | 表面形态 | 形状 | 菌落直径 |
| 11 | 灰白色 | 粗糙，有干粉，有细小皱褶，菌落较小 | 圆形为主 | 5mm |
| 12 | 白色 | 粗糙，有干粉，有细小皱褶，菌落较小 | 圆形为主 | 3mm |
| 13 | 橘红 | 光滑，干燥，难以挑取，规则， | 圆形 | 1mm |
| 14 | 橘黄 | 光滑透亮，菌落中等 | 不规则 | 2mm |
| 15 | 黄 | 圆润光滑，透亮， | 不规则 | 4mm |
2.3.3高氏一号培养基上5种优势菌纯化结果
2.3.4 高氏一号培养基上5中菌株的PCR结果
表10 牛肉膏蛋白胨培养基上菌株PCR结果
| 编号 | 相关属 | 相关种 | 拉丁名 | 相似度 |
| 11 | 链霉菌属 | 灰黄链霉菌 | Streptomyces griseoflavus | 98% |
| 12 | 链霉菌属 | 白色链霉菌 | Streptomyces albus | 98% |
| 13 | 链霉菌属 | 极暗黄链霉菌 | Streptomyces fulvissimus | 99% |
| 14 | 涅斯捷连科氏菌属 | 嗜盐涅斯捷连科氏菌 | Nesterenkonia halophila | 97% |
| 15 | 新鞘脂菌属 | 新鞘氨醇杆菌 | Novosphingobium sp. | 97% |
2.3.5高是一号培养基上5种优势菌鉴定结果
将5种优势菌的菌落形态及PCR结果相结合，分析鉴定其相应的种属。鉴定结果如下：菌株11为链霉菌属的灰黄链霉菌，菌株12为链霉菌属的白色链霉菌，菌株13为链霉菌属的极暗黄链霉菌，菌株14为涅斯捷连科氏菌，菌株15为新鞘脂菌属的新鞘氨醇杆菌。
3 研制结论
4
在本技术研制中，细菌、丝状真菌、放线菌个选取数量最多的5组菌株为目标菌株，首先进行菌株形态、菌落形态的观察，其中细菌还要经过革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色，在对比《伯杰细菌鉴定手册》可以初步得出：五种细菌分别为：菌株1为节杆菌属的Arthrobacter soli，菌株2为金黄杆菌属的Chryseobacterium haifense ，菌株3为假单胞菌属的施氏假单胞菌，菌株4为微杆菌的乳微杆菌，菌株5为苍白杆菌属根际苍白杆菌，菌株6属于毛霉属的梨形毛霉，菌株7属于木霉属的里氏木霉，菌株8属于曲霉属的黄曲霉 ，菌株9属于水霉属的 寄生水霉，菌株10属于镰刀菌属的keratoplasticum，菌株11为链霉菌属的灰黄链霉菌，菌株12为链霉菌属的白色链霉菌，菌株13为链霉菌属的极暗黄链霉菌，菌株14为涅斯捷连科氏菌，菌株15为新鞘脂菌属的新鞘氨醇杆菌。
从以上15种优势菌中选取三种菌株，其中细菌、丝状真菌和放线菌个一种，将其培养后应用于草坪植物建植体系中。根据对这15种菌株作用分析，最终选定假单胞菌、木霉和链霉菌这三种。它们都能产生活性物质或改善矿质营养直接促进植物的生长，还可以产生代谢物质或通过竞争作用来抑制或阻挠根区病原微生物的发展，间接促进植物的生长。但是以污泥为菌种来源的微生物菌剂应用对植物生长和生理特性影响方面的研究较少。
附图说明：
图1 牛肉膏蛋白胨培养基上分离纯化出的五中优势菌；
图2 马丁氏培养基上分离纯化出的五中优势菌；
图3 高氏一号培养基上分离纯化出的五中优势菌。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。其中所用到的化学试剂均有市售。其中施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌均由市售，也可以根据实施例1的方法加以配制。所述的马丁氏琼脂平板培养基、高氏一号琼脂平板培养基、牛肉膏蛋白胨平板培养基均有市售。孟加拉红水溶液、链霉素液也有市售。
实施例1
一种风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）材料的选择：城市污泥来自污水处理厂；
（2）菌株的培养：称取污泥10g，放入盛有90 g无菌水的锥形瓶中加入玻璃珠，放在摇床上振摇20 min，采用稀释分离法制备10－2、 10－3、10－4、10－5、10－6的污泥悬浮液； 根据所分离的微生物，取不同浓度的污泥悬浮液，摇匀后吸取0.2 mL加入到预先倒好的平板中；其中
1）真菌用马丁氏琼脂平板，此培养液1000 ml加1%孟加拉红水溶液3.3 ml，临用时每100 ml培养基中加1%链霉素液0.3 ml;放线菌用高氏一号琼脂平板，临用时每100 ml培养基中加入10%苯酚2滴；细菌用牛肉膏蛋白胨平板；用灭菌的涂布器涂抹均匀，每处理重复3次，28℃培养；
2）根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度特点，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化，依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量；
3）每种培养基上确定5种优势菌，进行编号保存，待进一步鉴定；
（3）菌种的鉴定
1）将分离到的优势细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃ 培养，观察 18 － 24 h菌龄的菌落形态、细菌的形态特征、培养特性，采用革兰氏染色法、芽孢染色法和荚膜染色法进行染色；挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版，
采用通用引物 27f/1492r27F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ (SEQ ID NO:1);1492R:5’GGTTACCTTGT TACGACTT 3’ (SEQ ID NO:2);进行 PCR 扩增 16SrRNA 基因，
PCR 反应程序如下：
94℃ 2 min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min，扩增产物送至上海美吉基因公司测序，测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较；
2)优势真菌的鉴定：将分离到的优势真菌接种到马丁氏培养基上，28℃ 培养 7 天后，描述菌落质地、形状、大小、隆起形状和颜色等，同时在光学显微镜(10 × 40 倍)下观察菌株的分生孢子和分生孢子梗形态，参照有关资料进行形态学鉴定；
3)挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体 ，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版，采用通用引物
通用引物ITS1(5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3’) (SEQ ID NO:3)
和ITS4 (5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’） (SEQ ID NO:4)
进行 PCR 扩增 18SrDNA 基因，PCR 反应程序如下：
94℃ 2min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min。扩增产物送至上海美吉基因公司测序，测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较；
4)优势放线菌的鉴定
将分离到的优势放线菌接种到高是一号培养基上，28℃ 培养 7-10 天后，采用印片法观察放线菌形态, 将分离到的优势细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃ 培养，观察 18-24 h菌龄的菌落形态、细菌的形态特征、培养特性，采用革兰氏染色法、芽孢染色法和荚膜染色法进行染色；挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体 ，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版,
采用通用引物 27f/1492r27F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ (SEQ ID NO:5);1492R:5’GGTTACCTTGT TACGACTT 3’ (SEQ ID NO:6)进行 PCR 扩增 16SrRNA 基因,PCR 反应程序如下：94℃ 2 min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min，扩增产物送至上海美吉基因公司测序，测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津师范大学
<120> 风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (5)
1.一种风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）材料的选择：城市污泥来自污水处理厂；
（2）菌株的培养：称取污泥10g，放入盛有90 g无菌水的锥形瓶中加入玻璃珠，放在摇床上振摇20 min，采用稀释分离法制备10－2、 10－3、10－4、10－5、10－6的污泥悬浮液； 根据所分离的微生物，取不同浓度的污泥悬浮液，摇匀后吸取0.2 mL加入到预先倒好的平板中；其中
1）真菌用马丁氏琼脂平板，此培养液1000 ml加1%孟加拉红水溶液3.3 ml，临用时每100 ml培养基中加1%链霉素液0.3 ml;放线菌用高氏一号琼脂平板，临用时每100 ml培养基中加入10%苯酚2滴；细菌用牛肉膏蛋白胨平板；用灭菌的涂布器涂抹均匀，每处理重复3次，28℃培养；
2）根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度特点，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化，依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量；
3）每种培养基上确定5种优势菌，进行编号保存，待进一步鉴定；
（3）菌种的鉴定
1）将分离到的优势细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃ 培养，观察 18 － 24 h菌龄的菌落形态、细菌的形态特征、培养特性，采用革兰氏染色法、芽孢染色法和荚膜染色法进行染色；挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版，
采用通用引物 27f/1492r27F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ (SEQ ID NO:1);1492R:5’GGTTACCTTGT TACGACTT 3’ (SEQ ID NO:2);进行 PCR 扩增 16SrRNA 基因，
PCR 反应程序如下：
94℃ 2 min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min，扩增产物送至上海美吉基因公司测序，测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较；
2)优势真菌的鉴定：将分离到的优势真菌接种到马丁氏培养基上，28℃ 培养 7 天后，描述菌落质地、形状、大小、隆起形状和颜色等，同时在光学显微镜(10 × 40 倍)下观察菌株的分生孢子和分生孢子梗形态，参照有关资料进行形态学鉴定；
3)挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体 ，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版，采用通用引物
通用引物ITS1(5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3’) (SEQ ID NO:3)
和ITS4 (5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’） (SEQ ID NO:4)
进行 PCR 扩增 18SrDNA 基因，PCR 反应程序如下：
94℃ 2min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min；扩增产物送至上海美吉基因公司测序，测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较；
4)优势放线菌的鉴定
将分离到的优势放线菌接种到高是一号培养基上，28℃ 培养 7-10 天后，采用印片法观察放线菌形态, 将分离到的优势细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃ 培养，观察 18-24 h菌龄的菌落形态、细菌的形态特征、培养特性，采用革兰氏染色法、芽孢染色法和荚膜染色法进行染色；挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体 ，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版,
采用通用引物 27f/1492r27F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ (SEQ ID NO:5);1492R:5’GGTTACCTTGT TACGACTT 3’ (SEQ ID NO:6)进行 PCR 扩增 16SrRNA 基因,PCR 反应程序如下：94℃ 2 min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min，扩增产物送至上海美吉基因公司测序，测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较。
2.权利要求1所述风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法，其中步骤(2)所述的真菌取10－2、10－3、10－4，放线菌取10－3、10－4、10－5，细菌取10－4、10－5、10－6。
3.权利要求1所述风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法，其中步骤(2)菌株培养所述的优势菌定义为：在最高稀释度上，菌落数占总菌落数的比例为10%以上的菌称之为优势菌。
4.权利要求3所述风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法，其中每个样品中最多的菌落数达不到10%的，取菌落数最多的前两种作为该样品的优势菌。
5.权利要求1所述风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法，其中所述的优势菌指的是施氏假单胞菌、里氏木霉各和链霉菌。
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|---|---|---|---|
| CN201410191171.7A CN103937731A (zh) | 2014-05-08 | 2014-05-08 | 风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法 |
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|---|---|---|---|
| CN201410191171.7A CN103937731A (zh) | 2014-05-08 | 2014-05-08 | 风干污泥有益微生物组分的分离、提取及鉴定方法 |
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| CN102815853A (zh) * | 2011-06-10 | 2012-12-12 | 湖北中科博策新材料研究院 | 污水处理厂污泥无害化处理方法 |
-
2014
- 2014-05-08 CN CN201410191171.7A patent/CN103937731A/zh active Pending
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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