CN117069794A - 一种糖肽类抗生素荧光探针化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种糖肽类抗生素荧光探针化合物及其制备方法与应用。所述探针化合物在无GPAs时，处于一个酰胺开环(荧光)和闭环(非荧光)的动态平衡，并主要以闭环形式存在，成像为弱荧光；当GPAs通过与本发明探针化合物的D‑Ala‑D‑Ala形成氢键时，可以稳定其开环形式，导致荧光显著增强，从而达到快速、灵敏、高效、准确地测定GPAs的效果。并且本发明探针化合物只含有一个荧光基团，可以避免外界其他生物分子吸附的影响，抗干扰性好，特异性强。

Description

一种糖肽类抗生素荧光探针化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域。更具体地，涉及一种糖肽类抗生素荧光探针化合物及其制备方法与应用。
背景技术
糖肽类抗生素(GPAs)是一类在结构上共具高度相似性的七肽骨架抗生素，在临床上用于治疗耐药性革兰氏阳性菌感染。第一代GPAs均是由土壤放线菌直接产生的天然抗菌成份，分别是万古霉素、去甲万古霉素和替考拉宁。第二代GPAs则是通过化学改造放线菌的糖肽产物获得的，如：达巴万星、特拉万星等。GPAs的共同作用机理在于：结合革兰氏阳性菌胞壁成分D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)，通过干扰细胞壁的合成从而实现抑菌的目的。在临床上广泛使用GPAs来应对非常严重的感染，但为了遏制细菌产生耐药性，GPAs的使用也受到了严格的监管。并且，万古霉素、去甲万古霉素等GPAs具有一定的肾脏毒性，临床应用过程中的浓度监测也是非常重要的。另一方面，有研究表明自然界中仍然存在大量未被发现的糖肽类抗菌物质，建立可靠的分析方法从成份复杂的放线菌发酵液中直接检出GAPs可以大大加速这类抗生素的发现过程。因此，从环境样品、血液和尿液中准确定量GPAs对于GPAs的使用和监管都具有重要意义。
GAPs的常规定量多采用高效液相色谱(HPLC)或者液质联用的方法(LC-MS)，但这些方法均依赖于高端仪器，操作相当复杂且缺乏实时分析能力。GPAs的荧光探针法检测是新兴的检测技术，通常要要求较高的分析通量和灵敏度。Shue Mei Ng等人利用D-Ala-D-Ala二肽作为万古霉素识别基团，构建了识别基团-荧光基团-荧光淬灭基团三组分体系，该体系可以实现万古霉素的荧光检测，其检测机理在于万古霉素与二肽的结合导致荧光基团与淬灭基团之间的光诱导电子转移(PET)的变化从而实现荧光增强(Ng SM,Wu X,Khyasudeen MF,et al.Vancomycin Determination by Disrupting Electron-Transferin a Fluorescence Turn-On Squaraine-Anthraquinone Triad.ACS Sens.2018，3:1156-1163)。Tao Deng等人公开了一种由D-Ala-D-Ala二肽作为识别基团，一个绿色荧光基团和一个蓝色荧光基团构成的荧光探针，该探针可以通过比率式荧光变化检测GPAs，其机理子在于GPAs与二肽的结合改变了两个荧光基团之间的荧光共振能量转移(FRET)效率从而导致比率式变化(Deng T,Hu S,Zhao L,et al.A ratiometric fluorescent probe forsensitive determination of the important glycopeptide antibioticvancomycin.Anal Bioanal Chem.2019，411:8103-8111)。可见上述GPAs荧光探针的设计通常都需要引入两个荧光基团或者一个荧光基团和一个淬灭基团；众所周知，荧光基团和淬灭基团通常都是较大的且相对疏水的共轭体系，这些基团与蛋白等生物分子很容易产生非特异性吸附，从而影响光学性能和荧光检测，显著降低荧光探针的抗干扰性和准确性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有GPAs荧光探针抗干扰性和准确性低的缺陷和不足，提供一种抗干扰性强、准确性高的糖肽类抗生素荧光探针化合物。
本发明的目的是提供所述糖肽类抗生素荧光探针化合物的制备方法。
本发明另一目的是提供所述糖肽类抗生素荧光探针化合物在糖肽类抗生素检测中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种糖肽类抗生素荧光探针化合物，具有式I结构：
其中，R1～R4各自独立地选自氢或卤素。
优选地，所述R1～R4各自独立地选自氢或氯。
更优选地，所述化合物具有以下任一结构：
本发明设计并制备了一类新型的GPAs荧光探针化合物，首次提出通过氢键相互作用调控荧光素螺环结构的开闭实现GPAs的荧光检测。具体的，所述探针化合物在无GPAs时，处于一个酰胺开环(荧光)和闭环(非荧光)的动态平衡，其中主要以闭环形式存在，因此成像为弱荧光。当GPAs通过与本发明探针化合物的D-Ala-D-Ala形成氢键时，可以稳定其开环形式，导致荧光显著增强，从而达到快速、灵敏、高效、准确地测定GPAs的效果。并且本发明探针化合物只含有一个荧光基团，可以避免外界其他生物分子吸附的影响，抗干扰性好，特异性强。
另外的，本发明还提供了所述糖肽类抗生素荧光探针化合物的制备方法，合成路线如下：
具体包括以下步骤：
S1、Fmoc-D-丙氨酸在催化剂与有机溶剂存在下，与2-氯三苯甲基树脂反应完全，脱Fmoc，得化合物1；
S2、Fmoc-D-丙氨酸在缩合剂、催化剂与有机溶剂存在下，与化合物1反应完全，脱Fmoc，得化合物2；
S3、化合物2和化合物4在缩合剂、催化剂与有机溶剂存在下反应完全，得化合物3；
S4、洗脱多肽，收集洗脱液浓缩，析出多肽，反相硅胶柱层析分离纯化，得式I化合物。
进一步地，步骤S1、S2、S3中，所述催化剂为DIPEA或TEA。
更进一步地，步骤S2、S3中，所述缩合剂为HATU、HBTU或EDC。
进一步地，步骤S1、S2、S3中，所述有机溶剂为DCM或DMF。
更进一步地，步骤S1、S2、S3均在惰性气体条件下反应；优选地，所述惰性气体为氮气。
进一步地，步骤S1中，所述反应完全后，减压挥干溶剂，用无水甲醇和无水二氯甲烷按1:3比例配制溶液封闭未反应的树脂；然后用DMF洗涤5次。
更进一步地，步骤S1、S2中，所述脱Fmoc用20％哌啶-DMF溶液在氮气条件下进行。
进一步地，步骤S4中，所述洗脱多肽的溶剂为5％～10％TFA-DCM溶液(含1％三异丙基硅烷Tis)。
更进一步地，步骤S4中，所述析出多肽采用乙醚进行。
进一步地，步骤S4中，所述反相硅胶柱层析分离纯化的洗脱体系为甲醇：水＝(3～1)：2。
另外的，本发明提供了所述糖肽类抗生素荧光探针化合物在抗生素检测中的应用，所述抗生素能与D-Ala-D-Ala结合，通过干扰细胞壁的合成达到抗菌效果。
进一步地，所述抗生素为糖肽类抗生素。
更进一步地，所述糖肽类抗生素包括万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁、达巴万星、特拉万星、奥利万星及上述糖肽类抗生素的前体药物。
因此，本发明还要求保护一种糖肽类抗生素荧光探针，含有所述糖肽类抗生素荧光探针化合物。
进一步地，所述糖肽类抗生素荧光探针可用于环境样本(如水、土壤、生物质等)、尿液、血清、发酵基体等可能含有糖肽类抗生素的复杂样品的检测中。例如可以用于从未知的细菌发酵液里发现是否存在GPAs。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一类新型的GPAs荧光探针化合物，所述探针化合物在无GPAs时，处于一个酰胺开环(荧光)和闭环(非荧光)的动态平衡，并主要以闭环形式存在，成像为弱荧光；当GPAs通过与本发明探针化合物的D-Ala-D-Ala形成氢键时，可以稳定其开环形式，导致荧光显著增强，从而达到快速、灵敏、高效、准确地测定GPAs的效果。并且本发明探针化合物只含有一个荧光基团，可以避免外界其他生物分子吸附的影响，抗干扰性好，特异性强。
附图说明
图1为实施例1制备得到的探针化合物P1的核磁氢谱图。
图2为实施例1制备得到的探针化合物P1的核磁碳谱图。
图3为实验例1中化合物P1、P2、P3与万古霉素结合的动力学测试数据统计图(a)，和化合物P1与不同浓度万古霉素在PBS 7.4溶液中的荧光动力学曲线图(b)。
图4为实验例1中化合物P1的作用机理示意图。
图5为实验例1中化合物P4与不同浓度万古霉素的荧光动力学曲线图。
图6为实验例2中化合物P1在PBS缓冲液(a)或人工尿液(b)与不同浓度的VAN的荧光强度变化中拟合得到的标准曲线图。
图7为实验例3中化合物P1对多种抗生素的荧光检测结果统计图(a)，和化合物P1对抗生素混合溶液的荧光检测结果统计图(b)。
图8为实验例3中化合物P5对GPAs检测的荧光结果统计图。
图9为实验例4中P1探针在SD大鼠血清中对VAN的测试流程示意图(a)，P1在空白血清中与VAN含量的标准曲线图(b)，和P1荧光探针法与HPLC法对多个实验组SD大鼠血清样本中VAN定量结果图。
图10为实验例4中Deming回归分析P1荧光探针法和HPLC法结果的一致性拟合线性图。
图11为实验例5中P1在放线菌发酵培养液中对VAN荧光检测的动力学曲线图(a)，和发酵培养液中荧光定量曲线的线性拟合图(b)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1一种糖肽类抗生素荧光探针化合物P1的制备
所述糖肽类抗生素荧光探针化合物P1的合成路线如下：
具体包括以下步骤：
S1、在多肽固相反应管中，用无水DCM溶解Fmoc-D-丙氨酸(OH-D-Ala-Fmoc，116.75mg，0.375mmol)，加入DIPEA(130μL，0.75mmol)，和DCM泡胀过的2-氯三苯甲基树脂(250.0mg，0.25mmol)在无水DCM的反应管中氮气鼓泡反应40min，压干反应液，DCM洗涤3次，每次鼓泡1min；压干溶剂后，无水甲醇和无水二氯甲烷按1:3比例配制溶液封闭未反应的树脂，氮气鼓泡30min，DMF洗涤5次；配制适量20％哌啶-DMF溶液加入到反应管中脱Fmoc，氮气鼓泡20min，压出反应液后加水检验Fmoc脱除情况(析出白色固体即有Fmoc脱下)，DMF洗涤5次；此时反应管中为化合物1。
S2、用无水DMF溶解Fmoc-D-丙氨酸(116.75mg，0.375mmol)和缩合剂HBTU(142.2mg，0.375mmol)，转移至步骤S1的反应管中，缓慢滴加DIPEA(130μL，0.75mmol)，氮气鼓泡进行缩合反应1.5h，压干反应液，DMF洗涤5次，参考步骤S1重复脱Fmoc步骤；此时反应管中为化合物2。
S3、用无水DMF溶解2,7-二氯荧光素(320.96mg，0.8mmol)和缩合剂HATU(304.18mg，0.8mmol)，滴加DIPEA(139.3μL，0.8mmol)，转移至反应管中氮气鼓泡进行缩合反应5h，压干反应液，DMF洗涤5次，DCM洗涤3次；此时反应管中为化合物3-1。
S4、配制5％TFA-DCM溶液(含1％三异丙基硅烷Tis)洗脱多肽，分3次洗脱，每次鼓泡1min，收集全部洗脱液；浓缩洗脱液，剩余少量时加入乙醚将多肽析出，超声洗涤离心弃上清，将所得析出产物通过反相硅胶柱层析进一步分离纯化，洗脱体系为甲醇：水＝3：2，真空蒸发浓缩得到白色固体粉末，即目标产物化合物P1(32.3mg)。
结构表征：对化合物P1进行核磁氢谱、碳谱和质谱检测，结果如图1～2所
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.97(s,2H),7.86–7.80(m,1H),7.76(d,J＝7.1Hz,1H),7.59–7.52(m,2H),7.07–7.00(m,1H),6.80(d,J＝15.4Hz,2H),6.55(d,J＝4.8Hz,2H),3.83(qd,J＝7.1,2.3Hz,2H),1.27(d,J＝7.3Hz,3H),1.04(d,J＝7.2Hz,3H)(图1)；
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ174.17,169.81,167.47,154.69,154.64,152.83,150.81,150.63,133.85,130.48,129.54,129.48,128.57,123.97,123.24,116.18,115.98,110.76,109.92,104.22,104.00,64.69,52.80,48.01,17.64,16.54(图2)。
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C26H20Cl2N2O7H+543.07203；Found543.07182.
数据一一对应，证明结构正确。
实施例2一种糖肽类抗生素荧光探针化合物P2的制备
与实施例1的区别仅在于，在步骤S3中，将化合物替换为化合物其余参数及操作参考实施例1，得到化合物P2：
结构表征：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.25(s,3H),7.79(dd,J＝6.2,2.6Hz,1H),7.54–7.46(m,2H),7.43(d,J＝6.8Hz,1H),7.06–6.99(m,1H),6.69(dd,J＝23.0,8.8Hz,2H),6.47(dd,J＝29.7,8.8Hz,2H),3.69(q,J＝6.9Hz,1H),3.44(d,J＝7.4Hz,1H),1.29(d,J＝7.3Hz,3H),1.08(d,J＝6.9Hz,3H).
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.22,167.40,156.01,153.11,148.14,147.88,133.66,130.72,129.29,127.61,126.83,124.23,123.07,113.08,108.58,107.59,107.16,65.88,53.83,49.66,19.15,16.03.
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C26H20Cl2N2O7H+543.07203；Found543.07152.
实施例3一种糖肽类抗生素荧光探针化合物P3的制备
与实施例1的区别仅在于，在步骤S3中，将化合物替换为化合物其余参数及操作参考实施例1，得到化合物P3：
结构表征：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.05(s,2H),7.80(dd,J＝6.0,2.8Hz,1H),7.56–7.45(m,3H),6.98(dd,J＝5.9,2.6Hz,1H),6.59(s,1H),6.55(d,J＝7.5Hz,2H),6.47(s,2H),6.37(d,J＝8.7Hz,1H),3.79(s,1H),3.55(s,1H),1.24(d,J＝7.3Hz,3H),1.09(d,J＝6.6Hz,3H).
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.77,167.48,159.09,159.05,153.57,152.52,152.35,133.53,130.93,130.23,129.50,129.05,124.08,122.97,112.76,112.64,109.41,108.64,102.76,102.56,65.56,53.31,18.24,15.95.
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C26H22N2O7H+475.14998；Found475.1495.
实施例4化合物P5的制备
与实施例1的区别仅在于，在步骤S1中，将加入的Fmoc-D-丙氨酸改为Fmoc-D-丝氨酸(tBu)-OH，使在步骤S4中所得析出化合物的结构为用95％TFA-2.5％H2O-2.5％Tis对该化合物脱叔丁基，室温搅拌30min，浓缩后乙醚洗涤，其余参数及操作参考实施例1，得到化合物P5：
结构表征：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.91(s,2H),7.88–7.81(m,1H),7.72(d,J＝7.7Hz,1H),7.60–7.53(m,2H),7.08–7.02(m,1H),6.83(s,1H),6.78(s,1H),6.58(d,J＝8.9Hz,2H),3.94(dt,J＝8.0,4.2Hz,1H),3.77(q,J＝7.3Hz,1H),3.61(dd,J＝10.7,4.0Hz,1H),3.37(d,J＝4.5Hz,1H),1.30(d,J＝7.3Hz,3H).
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.10,170.32,167.68,154.78,154.70,152.85,150.79,150.57,133.94,130.36,129.60,129.23,128.52,124.00,123.35,116.26,110.51,109.83,104.29,104.06,64.90,61.83,54.80,53.45,16.24.
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C26H20Cl2N2O8H+559.06695；Found559.06645.
对比例1化合物P4的制备
与实施例1的区别仅在于，在步骤S1、S2中，将加入的Fmoc-D-丙氨酸均改为Fmoc-L-丙氨酸，其余参数及操作参考实施例1，得到化合物P4：
结构表征：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.34(s,1H),10.93(s,2H),7.87–7.80(m,1H),7.76(d,J＝7.1Hz,1H),7.60–7.52(m,2H),7.06–7.00(m,1H),6.82(s,1H),6.78(s,1H),6.55(d,J＝5.1Hz,2H),3.83(qd,J＝7.1,2.8Hz,2H),1.27(d,J＝7.2Hz,3H),1.04(d,J＝7.2Hz,3H).
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ174.16,169.79,167.46,154.68,154.64,152.83,150.81,150.62,133.85,130.48,129.55,129.48,128.57,123.97,123.24,116.16,115.97,110.77,109.93,104.22,103.99,64.69,52.79,48.00,17.64,16.54.
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C26H20Cl2N2O7H+543.07203；Found543.07215.
实验例1GPAs检测的动力学测试
1、实验方法
用PBS缓冲液(pH＝7.4)分别制备探针化合物P1、P2、P3溶液(25μM)，用PBS缓冲液(pH＝7.4)制备万古霉素(VAN)溶液(250μM)用于比较探针化合物与VAN的荧光响应动力学；另外采用PBS缓冲液(pH＝7.4)分别制备探针化合物P1、P4溶液(25μM)和VAN溶液(25、50、100、250μM)，用于考察化合物对不同浓度VAN的荧光检测效果。在96微孔板中手动加入160μL化合物溶液，再利用多功能微孔板检测系统的自动进样程序，由仪器进样40μL VAN溶液，在510nm激发下，每2s监测记录530nm处的荧光值，结果如图3～5。
2、实验结果
探针化合物P1、P2、P3结果如图3所示：
在模拟生理条件PBS 7.4的环境中，本申请制备的探针P1、P2和P3均能以荧光开启的形式实现VAN的检测。实施例1制备得到的探针P1与VAN的响应结合十分迅速，荧光强度达到平衡的时间小于1分钟，且荧光开启后荧光值较理想，符合检测应用需求；而实施例2制备得到的探针P2响应VAN的荧光值虽然更高一些，但达到平衡的时间不如P1快且稳定；实施例3制备得到的探针P3在PBS 7.4缓冲液中对VAN响应较慢且荧光值低(图3a)。
另外的，实施例1制备得到的探针P1用于检测不同浓度VAN(终浓度5、10、20、50μM)时，其荧光值均能较快地达到平衡，并且荧光强度在30分钟内均保持稳定无明显波动(图3b)。
可见，实施例1制备得到的荧光探针P1对VAN响应具有响应快速、荧光信号稳定的优点，是本发明的最优实施例。其中，荧光探针P1的发光原理参见图4，可以应用在缓冲液、尿液、血清、发酵液等对象的GPAs检测中。
化合物P4结果参见图5，由图可见，在不同浓度VAN的存在下，将探针的二肽构型进行变换制备得到的L型二肽探针化合物P4均不能以荧光增强的方式检测VAN，进一步证明实施例1所得探针化合物P1对GPAs的检测具有高度特异性。
实验例2荧光探针P1用于PBS缓冲液和人工尿液中GPAs检测
1、实验方法
采用PBS 7.4缓冲液和人工尿液分别制备探针P1(40μM)和万古霉素(VAN)溶液(0.2、0.4、1、2、4、10、20、30、40、60、100、150、200、300、400μM)，在96微孔板中分别将100μL探针和100μL不同浓度的VAN混匀，同时设置三个复孔，在室温条件下孵育3min，在510nm激发下，记录530nm处的荧光值，结果如图6。
2、实验结果
如图6所示：实施例1制备得到的探针P1在PBS 7.4缓冲液中对0.1～200μM VAN响应的检测结果做线性拟合，可见探针对0.1～20μM范围内的VAN检测线性良好，R2＝0.997(图6a)。在人工尿液体系中，P1对0.2～150μM VAN检测结果做线性拟合，可见探针对0.2～20μM范围内的万古霉素检测线性良好，R2＝0.999(图6b)。GPAs的体内代谢有限，常以原药的形式从尿液排除，因此，探针P1的灵敏度完全能满足尿液临床相关浓度GPAs的检测。
实验例3荧光探针P1的选择性/抗干扰性测试
1、实验方法
采用PBS 7.4缓冲液分别制备探针P1(40μM)、5种糖肽类抗生素(万古霉素VAN、去甲万古霉素DEM、替考拉宁TEC、达巴万星DAL、特拉万星TEL，40μM)、7种非糖肽类抗生素(青霉素PEN、头孢曲松CRO、红霉素ERY、链霉素STR、左氧氟沙星LVX、利福平RIF、杆菌肽BAC，200μM)溶液用于选择性测试；另外采用PBS 7.4缓冲液分别制备探针P1(40μM)、万古霉素(VAN)溶液(40μM)、抗生素混合溶液(同时包含万古霉素VAN 40μM、青霉素PEN 200μM、甲氧西林MET 200μM、头孢曲松CRO 200μM、红霉素ERY 200μM、链霉素STR 200μM、左氧氟沙星LVX 200μM、杆菌肽BAC 200μM)用于抗干扰性测试，在96微孔板中将100μL探针P1和100μL各抗生素溶液分别混匀，设置三个复孔，在室温条件下孵育3min，在510nm激发下，记录530nm处的荧光值，结果如图7。
参考上述方法，测定化合物P5分别对5种GPAs的响应测试，结果参见图8。
2、实验结果
如图7所示：实施例1制备得到的探针P1在PBS 7.4缓冲液中对20μM的GPAs均具有较好的响应，对五倍浓度(100μM)的其它类型抗生素均无响应，说明探针P1对糖肽类抗生素具有高度选择性(图7a)；此外，P1对替考拉宁、达巴万星这类酯糖肽GPAs具有更高的响应性。在抗干扰性测试中，探针P1响应VAN的荧光值和响应抗生素混合溶液(含有VAN和其它多种抗生素)的荧光值接近，说明其它抗生素的存在对VAN的检测无影响，说明P1对VAN的检测具有较高的抗干扰能力(图7b)。
如图8所示：在与P1检测体系同样的条件下，P5探针对VAN的响应性大大降低，只有微弱的荧光增强，但是P5对替考拉宁和达巴万星这类酯糖肽GPAs仍然保持了较好的选择性(图8)。
实验例4荧光探针P1在复杂样品中定量分析VAN的应用
在临床治疗中需对患者进行万古霉素药物浓度监测，以达到疗效最大化的同时避免毒副作用的发生，因此常通过高效液相色谱法(HPLC)对患者血清标本做浓度监测。HPLC法灵敏度、特异性、重复性俱佳，但存在标本前处理复杂、分析时间长、对操作人员要求高、试剂具有一定毒性等弊端。
1、实验方法
本发明选择以实验SD大鼠为测试对象，设置空白组和实验组各8只，对实验组大鼠按150mg/kg的剂量单次尾静脉注射万古霉素，对空白组按相同体积注射生理盐水，给药2h后，对所有大鼠腹主动脉采血，离心取血清用于VAN的定量分析，利用动物含药血清来模拟患者含药血清进行测试，流程参见图9a。
采用来自空白组大鼠的血清制备含不同浓度VAN(2、4、10、20、30、40、60、100、200μM)的含药血清标准品。采用PBS 7.4缓冲液制备探针P1(40μM)，在96微孔板中将100μL探针和100μL加标血清混合制备标准曲线。同时，将100μL探针和100μL实验组血清混合。每组实验设置三个复孔，室温条件下孵育3min后进行荧光值得读取。HPLC法则采用蛋白沉淀剂(6％高氯酸：乙腈～6：1)对所有加标血清和实验组大鼠血清进行前处理，取400μL血清加入400μL沉淀剂，涡旋2min，14000r/min离心10min，取上清过0.45μm水系滤膜作为HPLC样品进行定量分析，流动相A为乙腈(有机相)，流动相B为超纯水(含0.1％TFA)(水相)，流速为1mL/min，按照如下条件进行梯度洗脱：0～1min：流动相A为10％；1～6min：流动相A为10％→30％；6～11min：流动相A为30％；11～12min：流动相A为30％→50％；12～16min：流动相A为50％；16～17min：流动相A为50％→10％；17～18min：流动相A为10％。VAN保留时间为7.8min。
2、实验结果
如图9b和图9c所示：实施例1制备得到的探针P1对加标血清样品中VAN响应的荧光值与VAN浓度存在线性相关，P1对1～100μM范围内的VAN检测线性良好，R2＝0.9987(图9b)。利用P1探针法和HPLC法分别对8只实验鼠血清VAN的浓度进行了定量分析，结果如图9c；利用Deming回归分析了两种方法所得结果的一致性，即：以P1荧光探针法所的VAN浓度为横坐标，HPLC法所测浓度为纵坐标作x-y散点图，拟合其线性关系，对两组数据进行皮尔逊相关性分析，相关系数P值＝0.972，结果参见图10。说明两组数据间相关性非常好，即两种方法对血清VAN的定量分析结果具有一致性。
在两法所测VAN浓度结果具有一致性的前提下，比较P1荧光探针法和HPLC法，实施例1制备得到的探针P1应用在检测血清VAN时，无需对血清进行蛋白沉淀等前处理，检测流程简便、检测时间短、通过酶标仪可以实现高通量分析，可见P1在GPAs检测中具有较好的应用潜力。
实验例5荧光探针P1从放线菌发酵培养基中直接检出GPAs
1、实验方法
以VAN作为模式GPAs进行相关研究，实验方法参考实验例4；其中，探针配制在PBS缓冲液里，VAN配制在放线菌发酵培养基里，然后各100μL进行混合，在96孔板里进行测试。
2、实验结果
图11a所示结果表明，实施例1制备得到的探针P1(20μM)在放线菌发酵培养基中保持较低的荧光信号，当培养基中存在40μM VAN时，荧光信号迅速开启并在1min内达到平衡。图11b结果表明，发酵培养基中VAN浓度处在0到75μM(0～108.7mg/L)之间时，P1的荧光强度与VAN浓度间存在较好的线性相关性。因此，P1可以用于成分复杂的发酵培养基中GPAs的直接检测。经过工程化的GPAs产生菌在发酵培养液中能产生超过1g/L的GPAs，本发明的P1探针法的灵敏度完全满足实际应用的检测需求。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种糖肽类抗生素荧光探针化合物，其特征在于，所述糖肽类抗生素荧光探针化合物具有式I结构：
其中，R1～R4各自独立地选自氢或卤素。
2.根据权利要求1所述糖肽类抗生素荧光探针化合物，其特征在于，所述R1～R4各自独立地选自氢或氯。
3.根据权利要求2所述糖肽类抗生素荧光探针化合物，其特征在于，所述化合物具有以下任一结构：
4.权利要求1～3任一所述糖肽类抗生素荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，合成路线如下：
具体包括以下步骤：
S1、Fmoc-D-丙氨酸在催化剂与有机溶剂存在下，与2-氯三苯甲基树脂反应完全，脱Fmoc，得化合物1；
S2、Fmoc-D-丙氨酸在缩合剂、催化剂与有机溶剂存在下，与化合物1反应完全，脱Fmoc，得化合物2；
S3、化合物2和化合物4在缩合剂、催化剂与有机溶剂存在下反应完全，得化合物3；
S4、洗脱多肽，收集洗脱液浓缩，析出多肽，反相硅胶柱层析分离纯化，得式I化合物。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S1、S2、S3中，所述催化剂为DIPEA或TEA。
6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S2、S3中，所述缩合剂为HATU、HBTU或EDC。
7.权利要求1～3任一所述糖肽类抗生素荧光探针化合物在抗生素检测中的应用，其特征在于，所述抗生素能与D-Ala-D-Ala结合，通过干扰细胞壁的合成达到抗菌效果。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述抗生素为糖肽类抗生素。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述糖肽类抗生素包括万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁、达巴万星、特拉万星、奥利万星及上述糖肽类抗生素的前体药物。
10.一种糖肽类抗生素荧光探针，其特征在于，含有权利要求1～3任一所述糖肽类抗生素荧光探针化合物。
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