CN111303865A

CN111303865A - 荧光探针化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN111303865A
Application number: CN201811508750.4A
Authority: CN
Inventors: 邓涛; 刘芳; 胡世友
Original assignee: Guangzhou University of Chinese Medicine
Current assignee: Guangzhou University of Chinese Medicine
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2038-12-11
Also published as: CN111303865B

Abstract

本发明涉及一种荧光探针化合物及其制备方法和应用。该荧光探针化合物的结构式如下：

Description

荧光探针化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光成像检测领域，尤其是涉及一种荧光探针化合物及其制备方法和应用。

背景技术

众所周知，万古霉素(Vancomycin，简称Van)是一种糖肽类抗生素，通过与肽聚糖前体的D-Ala-D-Ala二肽(D-Ala：D-丙氨酸)结合来抑制细菌细胞壁的合成。Van通常用于治疗由革兰氏阳性菌(甲氧西林耐药株)引起的严重感染，并被认为是革兰氏阳性菌感染的“最后一道防线”。在体内，Van不易被代谢，常以原结构出现在尿液中，临床中较高剂量的Van会导致肾脏毒性。此外，Van和其他肾毒性药物之间也存在协同作用，导致肾小球损害。由于Van的毒性问题，医院通常需要对Van的用药剂量进行监测。另一方面，环境中残留的抗生素往往会导致抗药性细菌的产生，因此在水体等环境中对Van进行检测也非常重要。

目前已经报道的Van检测方法包括高效液相色谱(HPLC)法、基于ELISA的免疫测定法、放射免疫测定法、毛细管色谱法和光学方法等。其中，基于荧光的光学方法因其操作简单且易于可视化而引起了极大的关注。荧光偏振免疫分析法是最早用于Van测定的光学方法之一，早在几十年前就被开发出来且目前仍在使用。然而，该方法涉及抗体的制备和使用，操作复杂且成本较高。受Van抗菌机理的启发，Van和D-Ala-D-Ala短肽之间独特而强大的相互作用已被用于细菌和Van的检测等新技术的开发。然而，这些技术仍然存在一些缺点，例如单荧光信号输出可能导致结果不准确，并且检测高度依赖于探针浓度等。因此，发展高灵敏度且易于操作的检测产品和方法，在体液或体外环境中对Van进行定量具有迫切的需求。

发明内容

基于此，有必要提供一种荧光探针化合物及其制备方法和应用，以解决传统的荧光法检测Van时存在的灵敏度低、准确性差等问题。

一种荧光探针化合物，结构式如下：

其中，D-Ala是D-丙氨酸，L-Lys是L-赖氨酸，Linker是具有氨基和羧基的间隔基团，n为0或1，Coumarin是香豆素，F是荧光素。

在其中一个实施例中，所述荧光素是5-异硫氰酸酯。

在其中一个实施例中，所述荧光探针化合物的结构式是：

在其中一个实施例中，所述荧光探针化合物结构式是：

一种荧光探针化合物的制备方法，包括如下步骤：

合成短肽化合物(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)—(Linker)_n，其中，D-Ala是D-丙氨酸，L-Lys是L-赖氨酸，Linker是具有氨基和羧基的间隔基团，n为0或1；

将香豆素加入短肽化合物(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)—(Linker)_n中，进行缩合反应，生成化合物(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)—(Linker)_n—Coumarin，Coumarin是香豆素；

将化合物(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)—(Linker)_n—Coumarin与荧光素反应生成具有如下结构的荧光探针化合物：

F是荧光素。

在其中一个实施例中，合成短肽化合物时是使用基于Fmoc化学的固相多肽合成方法进行合成。

在其中一个实施例中，缩合反应时加入的香豆素是7-羟基香豆素-3-羧酸。

在其中一个实施例中，合成的短肽化合物是(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)，荧光素是5-异硫氰酸酯，最终合成的荧光探针化合物的结构式是：

在其中一个实施例中，合成的多肽化合物是(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)—(Linker)，Linker是6-氨基己酸，荧光素是5-异硫氰酸酯，最终合成的荧光探针化合物的结构式是：

上述任一实施例所述的荧光探针化合物在万古霉素检测中的应用。

上述荧光探针化合物将(D-Ala)—(D-Ala)与香豆素和荧光素组成FRET(荧光能量共振转移)对整合，首次合成了基于FRET的万古霉素荧光检测探针。该荧光探针化合物与传统的单荧光团的探针相比，FRET探针可以实现荧光信号的比率式检测。当有万古霉素存在时，通过激发香豆素以及共振能量转移，可以观察到来自荧光素的荧光；当没有万古霉素时，荧光素的初始荧光很弱，主要是因为部分荧光素分子在中性水溶液中以没有荧光的闭环内酯形式存在。万古霉素与(D-Ala)—(D-Ala)二肽结合，使得靠近二肽的荧光分子也被万古霉素的结合口袋包住，从而导致荧光分子的微环境变化。经过分子动力学模拟研究发现，上述机理可能是由于万古霉素和荧光素分子之间形成额外的氢键，稳定了开环的荧光形式。该荧光探针化合物在万古霉素检测时，灵敏度高，检测结果准确可靠。

附图说明

图1为万古霉素的结合导致荧光探针化合物荧光信号变化的示意图；

图2a、图2b和图2c分别为探针P1、P2和P3的合成路线图；

图3和图4分别为探针P1的ESI-MS谱和1H NMR结果；

图5和图6分别为探针P2的ESI-MS谱和1H NMR结果；

图7和图8分别为探针P3的ESI-MS谱和1H NMR结果；

图9为探针P1、P2与不同浓度的万古霉素的检测结果；其中，A表示探针P1与万古霉素(0,1,2,4,6,10,15,20,30,50,80,100μM)相互作用时的荧光光谱变化；B表示探针P2与万古霉素(0,6,10,15,20,30,50,80,100μM)相互作用的荧光光谱变化；C表示探针P1的强度比I₅₁₉/I₄₄₆与万古霉素浓度的曲线(0至100μM)；D表示探针P2的I₅₁₉/I₄₄₆和万古霉素浓度的曲线(0至100μM)；检测在含有30μM探针的PBS缓冲液(pH7.4)中进行检测，激发波长为400nm；

图10为探针P1和P2的分子动力学模拟结果；其中，A表示探针P1和万古霉素以及探针P2和万古霉素之间形成氢键的分子动力学模拟；B表示分子动力学模拟氢键距离分布；

图11为探针P1对不同抗生素的荧光反应结果以及pH对探针P1荧光响应性的影响；其中，A表示探针P1(30μM)对各种抗生素万古霉素(Van)(30μM)、红霉素(Ery)、青霉素(Pen)、粘菌素(Col)和四环素(Tet)的荧光反应，其他四种抗生素的浓度均为300μM；B表示pH对探针P1荧光响应性的影响；

图12为探针P1对人工尿液的检测结果；其中，A表示在人工尿液中探针P1(30μM)与万古霉素(0,1,2,4,6,10,15,20,30,50,80,100μM)相互作用时的荧光响应，插图显示P1以颜色变化的形式响应20μM万古霉素；B表示以探针P1(30μM)的荧光强度比率I₅₁₉/I₄₄₆对万古霉素的浓度(0至100μM)作图，插图显示万古霉素浓度从0至20μM时的线性关系；

图13为探针P1(30μM)在用于斑马鱼体内万古霉素的成像；在成像前用万古霉素(1mM)预处理鱼1小时，仅用探针P1和万古霉素处理的鱼作为对照，在右图中，沿左图中的红色选择线绘制荧光强度。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供了一种荧光探针化合物，其结构式如下：

荧光素可以是但不限于5-异硫氰酸酯，其可以发出绿色荧光。Linker可以是但不限于6-氨基己酸。

在一个具体示例中，荧光探针化合物的结构式是：

在另一个具体示例中，荧光探针化合物结构式是：

以上述不含有Linker基团的荧光探针化合物为例，请结合图1，当有万古霉素(Vancomycin)存在时，通过激发香豆素以及共振能量转移(FRET)，可以观察到来自荧光素(FITC，图中星形符号)的荧光；当没有万古霉素时，荧光素的初始荧光很弱，主要是因为部分荧光素分子在中性水溶液中以没有荧光的闭环(Off)内酯形式存在。万古霉素与(D-Ala)—(D-Ala)二肽结合，使得靠近二肽的荧光分子也被万古霉素的结合口袋包住，从而导致荧光分子的微环境变化。经过分子动力学模拟研究发现，上述机理可能是由于万古霉素和荧光素分子之间形成额外的氢键(hydrogen bond)，稳定了开环(On)的荧光形式。

本发明进一步还提供了一种荧光探针化合物的制备方法，请参图2，该制备方法包括如下步骤：

步骤一：合成短肽化合物(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)—(Linker)_n，其中，D-Ala是D-丙氨酸，L-Lys是L-赖氨酸，Linker是具有氨基和羧基的间隔基团，n为0或1；

步骤二：将香豆素加入短肽化合物(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)—(Linker)_n中，进行缩合反应，生成化合物(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)—(Linker)_n—Coumarin，Coumarin是香豆素；

步骤三：将化合物(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)—(Linker)_n—Coumarin与荧光素反应生成具有如下结构的荧光探针化合物：

F是荧光素。

荧光探针化合物的合成是采用固相也液相相结合的方法合成。具体在步骤一中，合成短肽化合物时是使用基于Fmoc化学的固相多肽合成方法(solid phase peptidesynthesis，SPPS)进行合成。在一个具体示例中，在步骤二中，缩合反应时加入的香豆素是7-羟基香豆素-3-羧酸。更具体地，在一个示例中，在步骤三中，合成的短肽化合物是(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)，荧光素是5-异硫氰酸酯，最终合成的荧光探针化合物的结构式是：

在另一个示例中，合成的多肽化合物是(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)—(Linker)，Linker是6-氨基己酸，荧光素是5-异硫氰酸酯，最终合成的荧光探针化合物的结构式是：

上述荧光探针化合物将(D-Ala)—(D-Ala)与香豆素和荧光素组成荧光能量共振转移对整合，首次合成了基于FRET的万古霉素荧光检测探针。该荧光探针化合物与传统的单荧光团的探针相比，在万古霉素检测时，灵敏度高，检测结果准确可靠。该荧光探针化合物可以广泛应用在万古霉素的检测中。

以下为具体实施例部分。

一、实验过程

1、实验材料

用于有机合成的无水溶剂购自Aladdin Bio-Chem(中国上海)，用活化的分子筛

保持干燥。用于多肽合成的2-氯三苯甲基氯树脂(2-Cl-(Trt)-Cl-resin)和Fmoc氨基酸购自GL Biochem(中国上海)。人工尿液(pH 6.8)购自Leagene Biotech Co Ltd(中国北京)。荧光素5-异硫氰酸酯(FITC)和其他化学品购自Adamas(中国上海)。所有试剂无需进一步纯化即可使用。溶液的配置使用来自Milli-Q Plus系统的去离子水。荧光信号在多功能酶标仪VICTOR TM X3(Thermo Fisher)上读取。24和96孔玻璃底细胞培养板购自NESTScientific(美国)。

2、基于多肽的荧光探针化合物的合成

请参图2，荧光探针化合物采用固相和液相相结合的方法合成：首先根据标准的基于Fmoc化学的固相多肽合成方法(SPPS)得到D-Ala-D-Ala-L-Lys短肽；然后将7-羟基香豆素-3-羧酸(7-Hydroxycoumarin-3-carboxylic acid)与赖氨酸侧链的胺基缩合；反应完成后将香豆素-多肽复合物从树脂中释放，最后与FITC反应形成探针P1。通过引入6-氨基己酸以在FRET供体和受体之间形成更长的连接可以制备探针P2。此外，作为对照，还制备另一种探针P3。P3只在三肽D-Ala-D-Ala-L-Lys的赖氨酸侧链氨基上连有荧光素。

3、具体合成过程

3.1探针P1的合成步骤：

1)取500mg树脂(2-chlorotrityl chloride resin，2-氯三苯甲基氯树脂，1.2mmol/mg)于多肽合成管中用无水DCM浸泡10分钟；将1.5当量FMOC-D-丙氨酸和1.5当量DIPEA用无水DCM溶解，然后滴加至树脂/DCM溶液中在摇床上反应两小时。抽滤，用DCM洗涤5次。

2)配置5mL DCM:MeOH(体积比)＝3:1溶液，加入1.5当量DIPEA，混匀后加入步骤1所述多肽反应管中在摇床上反应10分钟。抽滤，用DMF洗涤5次，每次洗涤混匀1分钟。

3)配置FMOC洗脱剂(5％哌嗪、2％DBU的DMF溶液)，洗脱2次，每次10分钟；用DMF洗涤5次，抽滤。

4)用DMF溶解1.5当量HBTU，1.5当量FMOC-D-丙氨酸并加入多肽反应管中，再加入1.5当量DIPEA，在摇床上反应2小时。抽滤，用DMF洗涤5次，每次洗脱1分钟，然后加入FMOC洗脱剂，洗脱2次，每次10分钟，用DMF洗涤5次，抽滤。

5)用DMF溶解1.5当量HBTU，1.5当量N-BOC-N'-FMOC-L-赖氨酸并滴加至多肽反应管中，再加入1.5当量DIPEA，在摇床上反应2小时。抽滤，用DMF洗涤5次，每次洗脱1分钟，然后加入FMOC洗脱剂，洗脱2次，每次10分钟，用DMF洗涤5次，抽滤。

6)取适量DMF溶解1.5当量7-羟基香豆素三羧酸和1.5当量HBTU并加入多肽反应管，再加入1.5当量DIPEA，在摇床上反应过夜。抽滤，用DCM洗涤3次。

7)配置含30％TFA、1％三异丙基硅烷的DCM溶液，加入上述步骤所述多肽反应管中，反应1小时。抽滤，收集滤液旋干，用适量乙醚析出，再用离心机离心，去掉上清液，再用乙醚洗涤一次。

8)加入1.2当量TEA，1.2当量FITC，用DMF做反应溶剂，反应过夜，加入适量乙醚析出，将析出的固体用甲醇溶解，HPLC纯化得到目标产物。

3.2探针P2的合成步骤：

1)重复探针P1合成步骤1-5。

2)用DMF溶解1.5当量HBTU，1.5当量Fmoc-6-氨基己酸至多肽反应管中，再加入1.5当量DIPEA，在摇床上反应2小时。抽滤，用DMF洗涤5次，每次洗脱1分钟，然后加入FMOC洗脱剂，洗脱2次，每次10分钟，用DMF洗涤5次，抽滤。

3)重复探针P1合成步骤6-8。

3.3探针P3的合成步骤：

1)重复探针P1合成步骤1-5。

2)加入1.2当量TEA，1.2当量FITC，用DMF做反应溶剂，反应过夜，抽滤，用DCM洗涤三次。

3)配置含30％TFA、1％三异丙基硅烷的DCM溶液，加入上述步骤所述多肽反应管中，反应1小时。抽滤，收集滤液旋干，用适量乙醚析出，再用离心机离心，去掉上清液，再用乙醚洗涤一次。加入适量乙醚析出，将析出的固体用甲醇溶解，HPLC纯化得到目标产物。

4、磷酸缓冲液中Van的检测

标准测量方法：先将荧光探针化合物(30μM)PBS溶液加入到玻璃底24孔板中，每孔400μL；然后将Van的水溶液用移液器加到探针溶液中。通过反复吸打将溶液充分混合，在避光条件下静置2分钟后用酶标仪对荧光信号进行检出。整个过程在室温(25℃)下进行，每个实验组设定三次重复。在人工尿液中采用同样的流程对Van进行检测。最低检出限LOQ＝3σ/B，其中σ是在没有Van的情况下，三次单独测量(I₅₁₉/I₄₄₆)获得的标准偏差，B是在线性拟合后获得的斜率。

5、分子动力学模拟

使用GROMACS(版本5.1.4)进行分子动力学模拟，荧光探针化合物和Van的3D结构由Chemoffice绘制，其力场参数使用在线服务器PRODRG(http：//davapc1.bioch.dundee.ac.uk/cgi-bin/prodrg/)计算。每个模拟系统由10个探针分子和10个Van分子组成，并置于十二面体盒的中心，溶质与盒边缘之间的最小距离为

加入适量Na⁺以保持电中性。

6、斑马鱼养殖

根据已报道的方法进行斑马鱼培养、育种、胚胎采集和胚胎培养。斑马鱼繁殖行为后，下一个光周期开始时收集所有受精胚胎。受精后3天的野生型斑马鱼在胚胎培养基(含13.7mM NaCl、540μM KCl、25μM Na₂HPO₄、44μM KH₂PO₄、300μM CaCl₂、100μM MgSO₄、420μMNaHCO₃，pH 7.4)中于28.0℃同步培养。为了进行Van的体内测定，使用3天龄的斑马鱼。向培养基中加入1.0mM Van以模拟抗生素污染。1小时后，除去培养基并将鱼洗涤两次，然后将鱼加入含有30μM P1的新鲜培养基中，培养30分钟后，除去培养基，用PBS缓冲液洗涤斑马鱼两次。洗涤后的斑马鱼用含三卡因(150μg/mL)的10％甘油水溶液固定在载玻片上，然后使用Leica正置荧光显微系统，在352-402nm的激发波长和FITC/EGFP滤光片存在下观察和摄取荧光图像。

二、实验结果和讨论

选用香豆素和荧光素分别用作FRET供体和受体，研究发现荧光素在开环的荧光构型和非荧光的内酯构型之间具有动态转化，这种转变很大程度上取决于周围环境。考虑到上述因素，将荧光素与D-Ala-D-Ala-L-Lys三肽中赖氨酸残基上的α-氨基结合使荧光响应基团足够接近Van的结合位点。FRET的荧光响应跟供体和受体之间的距离密切相关，因此，为了便于比较，特设计供体和受体之间具有更长连接的探针P2。另外，还合成了只含有一个荧光分子的探针P3。

所有的最终产物均经ESI-MS谱和1H NMR表征，结果依次见附图3-8及如下数据，表明构建的结构正确。

探针P1：

ESI[M+H]⁺m/z calcd.for[C44H42N5O12S]864.25,found 863.9[M+H]+.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.08(s,1H,COOH),10.18(d,J＝37.5Hz,3H,3×OH),8.78(s,1H,CH),8.64–6.54(m,16H,12×ArH,4×NH).4.95(s,1H,CH),4.38–4.34(m,1H,CH),4.20–4.17(m,1H,CH),1.78–1.15(m,12H,3×CH2,2×CH3).

探针P2：

ESI[M+H]⁺m/z calcd.for[C51H55N6O13S]991.35,found 991.32[M+H]+.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.08(s,1H,COOH),10.37–10.13(m,3H,3×OH),8.78(s,1H,CH),8.62–6.55(m,17H,12×ArH,5×NH),4.92(s,1H,CH),4.39–4.30(m,1H,CH),4.22–4.14(m,1H,CH),3.02–2.95(m,2H,CH2),2.07–1.18(m,22H,8×CH2,2×CH3).

探针P3：

ESI[M+H]⁺m/z calcd.for[C34H38N5O8S]676.24,found 676.20[M+H]+.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.26(d,J＝63.4Hz,2H,2×OH),8.68–6.56(m,12H,9×ArH,3×NH),4.44-4.40(m,2H,CH),4.22-4.19(m,1H,CH),3.83-3.78(m,2H,CH2),1.70–117(m,10H,2×CH2,2×CH3).

Van的荧光比率式检测首先在PBS缓冲液(pH7.4)中进行。如图9所示，当探针P1和P2分别与Van结合，在400nm激发下可以检测到增强的绿色荧光(峰值519nm)。同时，来自香豆素的蓝色荧光(峰值446nm)强度仅略微增加。对基于FRET的比率式检测来说，受体与供体的发射强度比是用于分析的关键参数。在本实施例中，荧光强度比率I₅₁₉/I₄₄₆定义为荧光素发射(I₅₁₉)与香豆素发射(I₄₄₆)强度之间的比率。结果表明来自探针P1的荧光信号确实可以响应Van。当Van的浓度从0增加到100μM时，I₅₁₉/I₄₄₆从2.86增强到10.50。当Van浓度在0至20μM之间时，I₅₁₉/I₄₄₆对Van浓度作图观察到很好的线性关系(R2＝0.99)。探针P2具有类似的趋势，当Van的浓度范围为6至30μM时，也具有良好的线性关系(R2＝0.99)。然而，P2的I₅₁₉/I₄₄₆在与同样浓度Van(100μM)相互作用后只表现出1.83倍的增加，要低于P1(3.67倍)。如表1所示，在400nm激发下，探针P1的I₅₁₉表现出5.06±0.17倍的增强；在相同条件下，探针P2的I₅₁₉增加2.12±0.11倍，这表明P2对Van响应能力弱于P1。P3在相同条件下表现出最低的响应性，荧光增强非常有限(1.27±0.07倍)。进一步，本实施例在470nm激发下观察到来自P1的I₅₁₉增加了2.03±0.10倍，这显著低于400nm激发(5.06±0.17倍)，这种现象存在于P1和P2中，但不存在于P3中，主要是因为P3上缺乏FRET。

结果证明，在本实施例的体系中，FRET策略比单荧光探针确实明显的优势。令人惊讶的是，尽管P1和P2结构变化较小，其对Van响应性却几乎显著不同。

表1荧光探针在检测中的荧光强度变化

备注：表中的荧光增强倍数I₃₀/I₀定义为当30μM Van存在时，探针的荧光强度除以当Van不存在时的荧光强度。λex＝400，λem＝519表示在400nm激发下记录到的519nm发射光的强度。

为了更深入地了解检测机理，本实施例对探针与Van的结合进行分子动力学模拟。在模拟的水环境中，每个模拟系统由10个探针分子和10个Van分子组成。通过定量测量氢键的数量及其分布来评估在测试的探针和Van之间形成氢键的能力。如图10所示，P1在动态相互作用中能与Van形成更多氢键，这表明相较于P2，P1与Van具有更强的结合能力。此外，P1-Van的氢键分布的平均距离比P2-Van之间的平均距离短，表明在结合时P1和Van在距离上更接近。在所有氢键中，P1唯一的羧基和Van之间形成的氢键对荧光素荧光的影响是最大的。更强的氢键作用意味着更有可能将荧光素稳定为开环的荧光形式。总之，分子动力学模拟显示P1与Van的相互作用要强于P2，这与实验观察结果一致。

本实施例进一步还检验了探针P1对Van的选择性。作为对照，另选择青霉素(Pen)、红霉素(Ery)、四环素(Tet)和粘菌素(Col)四种抗生素进行测试。与预期吻合，在30μM Van的情况下，I₅₁₉/I₄₄₆显著增加，而P1对其它几种抗生素均不响应，尽管它们的浓度10倍于Van(图11中A)。本实施例还探讨了P1在不同pH条件下(3.0至10.0)对Van的检测能力。如图11中B所示，P1在中性和弱碱条件(pH 7.4至pH 10)下对Van表现出优异的响应性。pH降低显著影响P1的响应，其中I₅₁₉/I₄₄₆在pH 6.0和pH 5.0下分别仅显示1.88±0.13倍和1.29±0.11倍增强，说明酸性条件减弱了P1对Van的检测能力。然而大多数生物液体的pH值接近中性，即使对于酸性样品，也通过稀释将样品pH调成中性，以适用Van检测。

如上所述，Van在给药后主要通过尿液排出。因此，尿液中Van浓度的监测变得非常有意义，可以为临床方案的设计提供重要信息。在本实施例的研究中，使用pH 6.8的人工尿液代替真实尿液。从图12可以看到当Van存在下绿色荧光显著增强，其中I₅₁₉在30μM Van时能观察到8.75倍增强，蓝色荧光强度I₄₄₆也有增强，但程度有限。以I₅₁₉/I₄₄₆对Van浓度作图，观察到很好的线性关系(R²＝0.94)，其中Van范围为0至20μM。根据该线性关系，通过计算确定最低检出限(LOQ)为计算为92.8nM(S/N＝3)。根据已经报道的数据，Van通过单次1g静脉给药后，其在尿液中的浓度通常为数十至数百微克/升(μg/L)。因此，探针P1完全具备从临床尿样中监测Van的能力。更有趣的是，在手持紫外光下可以看到加入Van之前和之后，P1荧光颜色出现明显变化。当Van不存在时溶液呈蓝绿色，加入Van(20μM)后，荧光颜色变为绿色。因此，探针P1提供了一种有颇有应用前景的方法，通过比率式定量分析甚至裸眼观察，即可确定尿液中的Van的浓度。

本实施例进一步利用斑马鱼作为模式动物，探针利用P1对Van进行体内成像的可能性。将3天龄的鱼用含Van(1mM)的培养基预培养1小时，然后使用P1成像。未经Van预处理以及仅使用Van处理但是没有P1的斑马鱼组作为对照。如图13所示，仅用Van处理的鱼没有显示任何绿色荧光，表明来自鱼本身和Van的背景荧光很弱。在Van预处理的鱼体内，通过P1观察到明显的绿色荧光，荧光信号主要定位于鱼的胃肠道内。相反，在没有经过Van预处理的鱼上，P1处理仅显示出微弱的荧光。本实施例用Image J对荧光信号的强度进行定量，沿图像中的红色选择线绘制荧光强度曲线。定量数据显示来自Van+P1的峰值强度(I_max＝83.46)远高于来自P1的峰值强度(I_max＝9.44)。结果表明P1确实可以实现Van在斑马鱼体内的成像。

本实施例提出了一种新型的基于FRET的万古霉素(Van)荧光检测方法。响应性最好的探针P1由香豆素和荧光素以及用于Van识别的D-Ala-D-Ala短肽组成。其响应机理基于Van与D-Ala-D-Ala的特异性结合，随后改变荧光素的微环境，从而导致荧光增强。分子动力学模拟显示Van与短肽结合时可与荧光素形成氢键，从而稳定荧光素的开环荧光构型。数据表明，增加FRET供体和受体之间的距离可改变探针对Van的响应性。P1(30μM)不仅可以在PBS缓冲液中也可以在人工尿液中高灵敏度且高选择性地响应Van。在人工尿液中的最低检出限为92.8nM，说明该探针适用于临床相关药物浓度的检测。此外，P1还成功的应用于斑马鱼中的Van成像。P2虽然检测效果要比P1差，但相对传统的单荧光团的探针，其检测效果还是提升比较明显，在一定程度上也提高检测的灵敏度和准确性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种荧光探针化合物，其特征在于，结构式如下：

2.如权利要求1所述的荧光探针化合物，其特征在于，所述荧光素是5-异硫氰酸酯。

3.如权利要求1所述的荧光探针化合物，其特征在于，结构式是：

4.如权利要求1所述的荧光探针化合物，其特征在于，结构式是：

5.一种荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

F是荧光素。

6.如权利要求5所述的荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，合成短肽化合物时是使用基于Fmoc化学的固相多肽合成方法进行合成。

7.如权利要求6所述的荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，缩合反应时加入的香豆素是7-羟基香豆素-3-羧酸。

8.如权利要求7所述的荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，合成的短肽化合物是(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)，荧光素是5-异硫氰酸酯，最终合成的荧光探针化合物的结构式是：

9.如权利要求7所述的荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，合成的多肽化合物是(D-Ala)—(D-Ala)—(L-Lys)—(Linker)，Linker是6-氨基己酸，荧光素是5-异硫氰酸酯，最终合成的荧光探针化合物的结构式是：

10.如权利要求1～4任一项所述的荧光探针化合物在万古霉素检测中的应用。