CN109085364A

CN109085364A - 一种牛流行热病毒中和抗体elisa检测试剂盒

Info

Publication number: CN109085364A
Application number: CN201810909046.3A
Authority: CN
Inventors: 刘博奇; 李其昌; 陈善真; 陈克宏; 王贵平
Original assignee: GUANGDONG HAID ANIMAL HUSBANDRY VETERINARY RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: GUANGDONG HAID ANIMAL HUSBANDRY VETERINARY RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2018-08-10
Publication date: 2018-12-25

Abstract

本发明公开了一种牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽，并将其定向耦联到非蛋白多聚体葡聚糖上，使用该耦联多肽可以实现牛流行热病毒中和抗体ELISA检测，显著提高了检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，操作简单，诊断速度快，在进行大规模检测中具有经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。另外，本发明所展示的检测方法，包被抗原用量可减至10ng/mL、或1ng/孔，显著降低了包被抗原成本，有利于市场技术推广使用。

Description

一种牛流行热病毒中和抗体ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种牛流行热病毒中和抗体ELISA检测试剂盒。

背景技术

牛流行热病是由牛流行热病毒(Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV)引起的牛和水牛的急性传染病，其特征是病牛突发高热、呼吸迫促、消化机能障碍、全身虚弱、僵硬、跛行甚至急性死亡。该病可导致奶牛产奶量急剧降低，乳品质下降，役用牛跛行或瘫痪，部分怀孕母牛流产，给养牛业造成了重大经济损失。

根据多年流行病学观察，牛流行热病周期性由过去的10～20年流行一次，到近年来周期缩短至3～5年或6～8年，有的地方甚至更短，如广东省从70年代以后，它的流行周期缩短到每间隔1～2年就有一次流行，对牛流行热病的防控问题也更加严峻。

目前世界各地对BEFV病毒疾病的诊断方法主要有：病毒分离、分子生物学诊断(RT－PCR)、间接免疫荧光试验(ILFT)、ELISA法抗体检测、中和试验(SN)等等。目前的诊断方法中，ELISA法抗体检测为非特异的混合多克隆抗体检测，因为ELISA包被抗原为全病毒抗原抑或为病毒的亚结构蛋白，其检测到的抗体为抗病毒蛋白不同免疫活性位点的混合抗体群。据报道，市场上个别BEFV ELISA试剂盒是以BEFV重组抗原包被酶标板来检测BEFV混合多克隆抗体，但由于其敏感性差或某些未知原因，使的该类ELISA试剂盒在已发病牛场检测抗体滴度很低或者检出结果多为阴性，因此对BEFV传染病防控以及BEFV疫苗免疫后对免疫效果的监测变得非常困难。

特异中和抗体检测ELISA是指使用能诱导宿主免疫系统产生中和抗体的病毒某种结构蛋白，或来自于该结构蛋白的中和位点特异多肽作为包被抗原，其检测到的抗体则为待测动物生物样本中特异中和抗体水平，与检测动物群体非特异的混合多克隆抗体相比，后者检测中和特异抗体水平变化对生产实践更具有指导意义。但是目前对于BEFV中和抗体的ELISA检测仍存在许多问题，难于同时满足快速、准确、高通量的需要。因而，目前，国内外对以多肽为包被抗原检测病原微生物中和抗体，尤其是牛流行性热病中和抗体的ELISA试剂盒研发滞后于市场需求。开发出一种用于快速，简便，特异且具有高灵敏度的BEFV特异中和抗体检测方法是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛流行热病毒中和抗体ELISA检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽，其特征在于：牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽为B1～B4中的任意一条，

B1：IRYEEDEKFKPVNLNPHEKSQC(SEQ ID No.1)；

B2：LQAHHNLAKDEHYNKIC(SEQ ID No.2)；

B3：SFRSELNDKERLWEAPDC(SEQ ID No.3)；

B4：FLTPCTINDSKTKGCPLKDITGT(SEQ ID No.4)。

一种耦联多肽，由上述牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽与非蛋白多聚体耦联得到。

进一步地，上述耦联多肽的制备方法包括以下步骤：

1)取牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽溶解，得到多肽溶液；

2)取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；

3)在非蛋白多聚体溶液中加入耦联剂，混合均匀；

4)将多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均匀，搅拌反应，使牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽耦联到非蛋白多聚体上；

5)除去未参与结合的耦联剂，纯化，冻干，得到耦联多肽。

进一步地，非蛋白多聚体为具有可耦联基团的非蛋白多聚体。

进一步地，可耦联基团为氨基、羧基、巯基中的至少一种。

进一步地，非蛋白多聚体为多糖、脂质体中的至少一种。

进一步地，非蛋白多聚体为多糖葡糖胺。

进一步地，耦联试剂为4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚基胺盐酸盐(EEDQ)、戊二醛中的至少一种。

上述耦联多肽在牛流行热病毒中和抗体ELISA检测中的应用。

一种牛流行热病毒中和抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于：试剂盒中含有上述耦联多肽。

本发明的有益效果是：本发明通过筛选特定的BEFV反应原性中和位点多肽，并将其定向耦联到非蛋白多聚体葡聚糖上，使用该耦联多肽可以实现牛流行热病毒中和抗体ELISA检测，显著提高了检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，操作简单，诊断速度快，在进行大规模检测中具有经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。另外，本发明所展示的检测方法，包被抗原用量可减至10ng/mL、或1ng/孔，显著降低了包被抗原成本，有利于市场技术推广使用。

附图说明

图1是不同耦联BEFV反应原性中和位点多肽反应的ELISA检定结果图。

图2是不同浓度的游离BEFV反应原性特异中和位点多肽和本发明耦联BEFV反应原性特异中和位点多肽的ELISA结果图。

图3是耦联BEFV反应原性特异中和位点多肽与不同抗血清的ELISA结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1

1.BEFV反应原性中和位点多肽的筛选

通过自有方法筛选出4条具有潜在BEFV反应原性的中和位点多肽，序列如下所示：

B1：IRYEEDEKFKPVNLNPHEKSQC(SEQ ID No.1)；

B2：LQAHHNLAKDEHYNKIC(SEQ ID No.2)；

B3：SFRSELNDKERLWEAPDC(SEQ ID No.3)；

B4：FLTPCTINDSKTKGCPLKDITGT(SEQ ID No.4)。

2.BEFV反应原性中和位点多肽的合成

BEFV反应原性中和位点多肽是由全自动多肽合成仪合成。

3.BEFV反应原性中和位点多肽的纯化

由HPLC仪完成，其基本过程是，使用反相柱(如C8，C18等)，214nm，缓冲体系为含TFA的溶剂，pH 2.0，缓冲液A为含0.1％TFA/双蒸水，缓冲液B为1％TFA/ACN/pH 2.0。多肽纯化前用缓冲液A溶解；如果溶解不好，先用缓冲液B溶解，然后用缓冲液A稀释；使用HPLC样本注射器将多肽溶液注射到HPLC仪内进行纯化(纯度大于95％)和质谱MS分析。

4.葡聚糖耦联BEFV反应原性中和位点多肽的制备

1)载体的活化

将葡聚糖作为载体，首先需将其活化，经NaIO₄活化的葡聚糖含有活性醛基官能团可通过N端氨基耦联氨基酸或多肽。具体步骤为：将新配制5mg/mL的NaIO₄溶液溶解葡聚糖(1％)，避光低速搅拌反应30分钟后，用蒸馏水透析2小时，然后冻干储存备用。

2)耦联步骤

室温下将8mg的赖氨酸与8mg活化的葡聚糖溶解于4mL的醋酸钠(0.1M，pH6.0)中，避光反应1小时，再加入20mg的NaCNBH₃，4反应过夜。将反应物多糖葡糖胺用250mL的PBS溶液透析48小时(透析温度：4℃，容器：500mL烧杯内置磁力搅拌子，置于磁力搅拌器上连续搅拌)，然后将多糖葡糖胺透析液装在15mL塑料试管内冻干。

分别从合成的4种多肽(B1、B2、B3、B4)中称取1mg的BEFV反应原性中和位点多肽，加50μL DMSO溶解，然后加入1mL PBS-EDTA(10mM EDTA)。称取1mg的冻干多糖葡糖胺，加1mLPBS溶解，在多糖溶液内加1mg赛默飞SMPB耦联试剂{Thermo-Fisher Scientific，Succinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate}。

耦联试剂SMPB与多糖葡糖胺混匀室温反应30分钟，然后与BEFV反应原性中和位点多肽溶液混合，室温搅拌反应1小时。使用透析袋(孔径MWCO 10000-12000)去除未参与结合的耦联试剂(SMPB)和游离的BEFV反应原性中和位点多肽，纯化、冻干，得到耦联BEFV反应原性中和位点多肽并在-20℃保存。

5.葡聚糖耦联BEFV反应原性中和位点多肽中和反应原性的ELISA检定

其基本过程如下：包被液：5.3g Na₂CO₃和4.2g NaHCO₃加1L双蒸水，pH9.6；稀释液：PBS/0.1％BSA；洗涤液：PBS/0.05％Tween-20(PBST)。在包被液中分别添加葡聚糖定向耦联BEFV反应原性中和位点多肽，使包被液中的耦联多肽浓度为1μg/mL；将含有耦联多肽的包被液加入抗原包被板中(100μl/孔)，37℃作用2小时，PBST洗涤5次，然后将BEFV阳性抗病毒中和血清(牛阴阳性病毒中和抗体血清是购于美国农业部动物制品标准实验室)用PBS/0.1％BSA倍比稀释后，加入每孔中，37℃作用30分钟，PBST洗涤5次，山羊抗牛的碱性磷酸酶标二抗用PBS进行1:4000稀释，加入每孔中，37℃作用30分钟，PBST洗涤5次，加入PNPP底物，37℃作用10分钟，然后在分光光度仪上读405nm值。ELISA检定结果如图1所示，与其它三种(B2、B3、B4)多肽相比，葡聚糖耦联后的BEFV反应原性中和位点多肽B1具有最强的中和反应原性。

6.灵敏性实验

按同样的浓度将未耦联游离B1多肽和葡聚糖耦联的B1多肽与包被液混合，同样条件下检测其与中和抗体反应，检测其吸附值。其结果如图2所示。图中，试验抗体来自牛BEFV中和抗体血清，抗血清按1:100稀释，山羊抗牛碱性磷酸酶按1:4000稀释。图2的图例中，左侧为游离B1多肽，右侧为耦联B1多肽,从左到右依次为以10⁴ng/mL、10³ng/mL、10²ng/mL、10ng/mL浓度包被的抗原。

从图2中可以看出，通过将B1多肽耦联后，在低浓度(100pg/mL)下，其反应活性明显高于游离多肽，可见，本发明的检测方法在保证检测结果的同时，可以显著降低多肽的用量。

7.特异性实验

将不同抗血清进行B1多肽ELISA反应，其结果如图3所示。图3的图例中，从左到右依次为1:100稀释的BEFV阴性牛血清、1:100稀释的BVD(牛病毒性腹泻)阳性血清、1:100稀释的IBR(牛传染性鼻气管炎)阳性血清；耦联B1多肽的包被浓度为10ng/mL。从图3中可以看出，本发明的检测方法具有很好的特异性。

8.BEFV感染牛群体样本使用传统BEFV病毒中和试验与本发明ELISA检测方法检出结果比较

经病毒中和试验鉴定的131份阳性血清和101份阴性血清，用试剂盒进行检测，验证该方法与病毒中和试验的符合率。由检测结果(表1)可知，用本发明中的ELISA方法和病毒中和试验分别检测上述血清，两种方法的符合率在87.3％，说明本发明涉及的以BEFV反应原性特异中和位点B1多肽所建立的ELISA检测方法可以代替传统病毒中和试验检测BEFV中和抗体水平，有力于生产实践的推广应用。

表1

SEQUENCE LISTING

<110> 广东海大畜牧兽医研究院有限公司

<120> 一种牛流行热病毒中和抗体ELISA检测试剂盒

<130> 2018.8.10

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ile Arg Tyr Glu Glu Asp Glu Lys Phe Lys Pro Val Asn Leu Asn Pro

1 5 10 15

His Glu Lys Ser Gln Cys

20

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Leu Gln Ala His His Asn Leu Ala Lys Asp Glu His Tyr Asn Lys Ile

1 5 10 15

Cys

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Ser Phe Arg Ser Glu Leu Asn Asp Lys Glu Arg Leu Trp Glu Ala Pro

1 5 10 15

Asp Cys

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Phe Leu Thr Pro Cys Thr Ile Asn Asp Ser Lys Thr Lys Gly Cys Pro

1 5 10 15

Leu Lys Asp Ile Thr Gly Thr

20

Claims

1.一种牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽，其特征在于：牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽为B1～B4中的任意一条，

B1：IRYEEDEKFKPVNLNPHEKSQC(SEQ ID No.1)；

B2：LQAHHNLAKDEHYNKIC(SEQ ID No.2)；

B3：SFRSELNDKERLWEAPDC(SEQ ID No.3)；

B4：FLTPCTINDSKTKGCPLKDITGT(SEQ ID No.4)。

2.一种耦联多肽，其特征在于：耦联多肽由权利要求1所述的牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽与非蛋白多聚体耦联得到。

3.根据权利要求2所述的耦联多肽，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：

2)取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；

3)在非蛋白多聚体溶液中加入耦联剂，混合均匀；

5)除去未参与结合的耦联剂，纯化，冻干，得到耦联多肽。

4.根据权利要求2或3所述的耦联多肽，其特征在于：非蛋白多聚体为具有可耦联基团的非蛋白多聚体。

5.根据权利要求4所述的耦联多肽，其特征在于：可耦联基团为氨基、羧基、巯基中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的耦联多肽，其特征在于：非蛋白多聚体为多糖、脂质体中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的耦联多肽，其特征在于：非蛋白多聚体为多糖葡糖胺。

8.根据权利要求2或3所述的耦联多肽，其特征在于：耦联试剂为4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚基胺盐酸盐(EEDQ)、戊二醛中的至少一种。

9.权利要求2所述的耦联多肽在牛流行热病毒中和抗体ELISA检测中的应用。

10.一种牛流行热病毒中和抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于：试剂盒中含有权利要求2所述的耦联多肽。