KR20220038687A - 일반형 불활성 벡터 대장균 및 그 잠재적 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반형 불활성 벡터 대장균 및 그 응용을 제공한다. 불활성 벡터균 SE1을 LB 고체 및 액체 배지를 사용하여 연속적으로 체외에서 40대 이상 계대 배양하며, 40대 이상(41대 내지 60대 포함)에서 획득한 균주를 일반형 불활성 벡터 대장균 SE1H이라 명명하였다. 상기 일반형 불활성 특징은 다음과 같다. 즉, 작업 농도 세균 수량 하에서 사람 유래, 쥐 유래, 소 유래, 돼지 유래 및 조류 유래 혈청 및 전혈과 비특이적 응집 반응을 일으키지 않는다. 또한 인간 유래, 쥐 유래, 소 유래, 돼지 유래 및 조류 유래의 상이한 항원 인자를 휴대하고 발현하는 특성을 가진다. 이는 인간 및 다양한 유형의 동물 항원 또는 감염 항체를 간편하고 신속하게 검출하는 간접 응집 시험 검출법의 개발에 응용할 수 있다, 이는 종래의 응집 항원 항체 검출의 응집 시험의 특이성과 민감성을 개선하고 완성한다.

Description

일반형 불활성 벡터 대장균 및 그 잠재적 응용
본 발명은 생물의학 기술 검출 분야에 속하며, 더욱 상세하게는 일반형 불활성 벡터 대장균 및 그 잠재적 응용에 관한 것이다. 상기 일반형 불활성 벡터 대장균은 작업 농도 세균 수량 하에서 인간 유래, 쥐 유래, 소 유래, 돼지 유래 및 조류 유래(닭, 오리, 거위, 칠면조, 비둘기, 메추라기 포함)와 상이한 유전적 배경의 인간과 다양한 유형의 동물의 혈청 및 전혈에서 비특이적 응집 반응을 일으키지 않는다.
가축 및 조류 역병의 진단, 모니터링 및 예방 통제 작업에서 현재 일반적으로 사용되는 진단 기술에는 혈청학적 진단 기술과 병원성 검출 기술이 포함된다. 세균성 질환의 진단에 있어서, 세균의 분리 감정은 세균성 감염의 진단에 있어 가장 기본이 되는 방법이지만 배양 주기가 길고, 시료 채취 부위와 시료 채취 시간이 제한적이며, 검출율이 낮고, 조작이 번거롭고 복잡하다는 단점이 있다. 브루셀라균으로 대표되는 일부 인수공통 병원체의 경우 분리 감정 작업이 수행되면 잠재적인 실험실 생물 안전 위험 및 생물 안전 플랫폼 요구사항이 존재할 수 있다. 혈청학적 검출 기술은 조작이 간단하고 생물학적 위험성이 낮다는 장점이 있어, 동물의 감염 여부나 특정 병원체의 보유 여부를 진단하는 데 많이 이용되고 있으며, 그 중 응집 시험은 의약 및 동물의학 임상에서 널리 사용되는 고전적인 혈청학적 신속 진단법이다. 응집 시험의 원리는 전해질이 존재하고 적절한 온도 조건 하에서 세균 미립자 항원이 상응하는 혈청 항체와 결합한 후 몇 분 이내에 응집 및 응결 현상이 나타나 응집된 작은 조각 또는 입자를 형성하며, 육안으로 관찰하고 반응 결과를 판단할 수 있다. 우리는 반응에 관여하는 항원을 응집원이라고 부르고, 항체를 렉틴(lectin)이라고 부른다. 예를 들어, 평판 응집 시험은 응집 반응에서 비교적 널리 사용되는 정성적 방법으로, 깨끗한 투명 유리 평판에 진단 혈청(공지된 항체 함유)과 검사할 세균 현탁액 각각 한 방울을 놓고, 같은 양(부피)을 가볍고 균일하게 섞은 후 상온에서 2분간 기다린다. 육안으로 과립형 응집이 나타나면 양성 응집 반응으로, 세균의 감정 및 항원형 분리 등에 많이 사용된다. 반대로, 공지된 진단 항원을 사용하여 검사할 혈청 또는 전혈에서 상응하는 항체의 존재를 검출할 수도 있다. 응집 시험은 간단한 조작과 저렴한 비용으로 매우 광범위하게 사용된다. 예를 들어 의과 및 동물의학 임상에서는 장티푸스/파라티푸스의 위달 반응의 진단, 브루셀라 감염의 로즈-뱅갈(Rose-Bengal) 평판 응집 시험 진단과 풀로룸/장티푸스 살모넬라 감염 검출의 전혈 평판 응집 시험 등에 흔히 사용된다. 그러나 실제 적용에서 응집 진단 항원에 다양한 비특이적 교차 반응이 존재하고, 각 배치의 검출 결과가 불안정하고 반복성 결과가 좋지 않으며, 반응 중 약한 양성 결과는 판단이 어렵고 민감성이 좋지 않아 검사에서 놓친 다양한 요인 영향 등이 검출 결과에 영향을 미친다. 장티푸스/파라티푸스 살모넬라, 살모넬라 풀로룸, 브루셀라 전균 항원 응집 시험의 비특이성 교차 반응성과 균체 O 항원 표적 항체 검출의 민감도 한계를 근본적으로 해결하고, 응집 시험의 검출 정확도를 향상시키기 위해, 종래의 고전적인 응집 시험의 검출 시스템을 대체하기 위한 연구개발이 매우 시급하다. 그러나 전제는 인간, 가축, 가금류 등 다양한 동물 유래 배경의 혈청/전혈과 모두 비특이적 응집반응을 일으키지 않는 일반형 불활성 벡터균을 획득하는 것이다.
이전 연구에서 출원인이 연구한 불활성 벡터 대장균은 일정 농도 범위 내에서 배경이 다른 닭 혈청에 대해서만 비응집 기능을 가지며, 다른 동물에 대해서는 응집 정도가 다를 수 있다. 따라서 그 불활성 벡터균 대장균 SE1은 닭 응집 시험 및 그 응용 개발에만 사용할 수 있으므로, 그 응용에 일정한 제한이 있다.
현재 많은 과학자들이 세균 발현 및 이종 폴리펩타이드 또는 단백질의 표면 자가 발현 및 그 기능 영역에 대해 체계적으로 연구하고 있다. 그람 음성균에서, 특히 전형적인 세균인 대장균과 살모넬라에 대해 심도 있는 탐색과 연구가 진행되고 있는데, 예를 들어 Klause 등은 1990년 임균(Neisseria gonorrhoeae) IgA1 프로테아제가 해당 탑승객 도메인 중의 이종 폴리펩타이드-콜레라균 독소 B 서브유닛을 발현할 수 있으며, 단백질 수송 단위에 의해 외막으로 분비되어 대장균과 장티푸스 살모넬라의 표면에 나타나 그 기능을 나타난다고 보고하였다. 이와 유사하게, 일반형 불활성 벡터균이 표면에 단일 항원 인자를 운반 및 발현할 수 있고, 상이한 병원성 세균 감염(항체)을 특이성 표적으로 삼을 수 있다면, 응집 반응 결과가 직관적이고 신속하며 조작이 용이하고 현장 검출 등 이점을 보유한다는 전제 하에서, 응집 항원 반응의 특이성과 민감도를 정확하게 향상시킬 수 있으며, 이 일반형 불활성 벡터균을 벡터로 사용하는 응집 시험은 다양한 질병의 모니터링, 검출 및 진단 작업을 향상시킬 수 있다. 이러한 일반형 불활성 벡터균을 벡터로 사용하면 상이한 병원성 감염(항체)에 대한 특이적 표적을 개발할 수 있다. 이처럼 신규한 응집 항원 시험의 모니터링 및 검출 방법은 인류와 많은 동물 질병의 진단 및 검출에 모두 매우 큰 잠재적 응용 전망을 갖는다.
인류 및 동물 질병의 진단 및 검출 분야에서 널리 사용되는 응집 시험 특이성, 민감도, 반복 안정성 및 검출 결과 정확도의 개선 및 향상이 매우 시급하다. 따라서 본 발명자들은 불활성 벡터 대장균 SE1을 LB 한천과 액체 배지에서 교대로 40대 배양하여 일반형 불활성 벡터 특성을 갖는 대장균 SE1H를 획득하였다. 상기 일반형 불활성 벡터균 특징은 작업 농도 세균 수량 하에서 인간 유래 및 쥐 유래, 소 유래, 돼지 유래 및 조류 유래 등 다양한 동물의 혈청 및 전혈과 비특이적 응집 반응을 일으키지 않는다. 또한 특정 감염성 항체를 표적으로 하기 위해 표면에 특정 항원 인자를 발현 및 운반할 수 있으므로, 인간 및 다양한 동물을 감염시키는 항체의 신속한 현장 모니터링 및 검출을 위한 간접 응집 시험의 개발에서 일반형 불활성 벡터균으로 사용될 수 있으며 광범위한 응용 가능성이 있다. 상기 일반형 불활성 벡터 대장균 SE1H는 SE1균과 달리, 다양한 상이한 동물에 대한 비응집 기능을 가지고 있기 때문에 일반형 불활성 벡터로 불리며 그 적용 범위는 더 넓다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 일반형 불활성 벡터 대장균을 제공한다. 상기 일반형 불활성 벡터 대장균은 불활성 벡터균 SE1을 LB 액체와 고체 배지를 사용하여 연속적으로 체외에서 40대 이상 계대 배양하여 획득한 균주를 일반형 불활성 벡터 대장균 SE1H라고 명명한다. 40대 내지 60대는 동일한 일반형 불활성 벡터 특성을 갖는다.
본 발명의 내용은 상기 일반형 불활성 벡터 대장균의 획득 방법을 더 포함한다. 여기에는 불활성 벡터 SE1를 LB 액체와 고체 배지를 사용하여 연속으로 체외에서 40대 이상 계대 배양하여 일반형 불활성 벡터 대장균 SE1H를 획득할 수 있다.
여기에서 상기 일반형 불활성 벡터 대장균 SE1H는 LB 및 EMB(eosin methylene blue) 한천 배지에서 배양할 수 있다. 배양 조건은 다음과 같다. 보존된 균종에서 소량 골라 LB 또는 EMB 한천 배지에 선을 긋고 배양온도는 37℃이며 LB 한천 배지는 37℃에서 배양한 후 회백색의 원형 콜로니를 형성할 수 있다. EMB 한천 평판은 37℃ 배양 후 비금속 광택, 검은색 콜로니를 형성할 수 있다.
본 발명은 국가표준방법(GB4789.38-2012)에 따라 상기 일반형 불활성 벡터균 SE1H에 대해 인디고 매트릭스(인돌, I) 시험, 메틸레드(MR) 시험, VP 시험, 구연산염(C)을 수행하고 시험 및 5가지 당발효 시험을 이용해 생화학적 시험 검출 및 감별을 수행하였다. 결과는 국가표준법에 기재된 대장균 생화학적 특성과 일치하였다.
유리판 응집 시험은 상술한 일반형 불활성 벡터균 SE1H의 세균 현탁액에 자가 응집 현상이 존재하지 않으며 인간 유래, 쥐 유래, 소 유래, 돼지 유래 및 조류 유래(닭, 오리, 거위, 칠면조, 비둘기, 메추라기 포함) 등 다양한 혈청, 전혈은 비특이적 응집 반응을 일으키지 않는다.
여기에서 상기 일반형 불활성 벡터 대장균 SE1H는, 분자 생물학적 구축 수단을 통해 세균 표면에 각각 단일한 항원 인자를 발현하고 운반한다. 여기에는 조류 유래 살모넬라 P 인자, 돼지 유래 대장균 K88ac 항원 인자, 소 유래 대장균 K99 항원 인자, 인간 유래 살모넬라 I 항원 인자가 포함된다.
본 발명의 내용은 일반형 불활성 벡터 간접 응집 시험 검출 시스템을 더 포함한다. 상기 검출 시스템은 상기 일반형 불활성 벡터 대장균 및 그 균체 표면에 발현하고 특정 항원 인자를 휴대할 수 있는 복합체를 포함한다.
여기에서 상기 특정 항원 인자는 조류 유래 살모넬라 P 인자, 돼지 유래 대장균 K88ac 항원 인자, 소 유래 대장균 K99 항원 인자 또는 인간 유래 살모넬라 I 항원 인자 중 하나 이상이다.
본 발명의 내용은 일반형 불활성 벡터 간접 응집 시험 검출 시스템의 구축 방법을 더 포함하며, 여기에는,
1) 특정 항원 인자의 코딩 유전자를 획득하는 단계;
2) 특정 항원 인자의 코딩 유전자와 플라스미드를 연결하여 재조합 플라스미드를 획득하는 단계; 및
3) 재조합 플라스미드를 대장균 SE1H 전기형질전환 컴피턴트 세포로 형질전환시키고 수득한 재조합 균주를 일반형 불활성 벡터 간접 응집 시험 검출 시스템으로 감정하는 단계가 포함된다.
여기에서 상기 단계 1)에서 특정 항원 인자의 코딩 유전자는 조류 유래 살모넬라 P 인자의 코딩 유전자, 돼지 유래 대장균 K88ac 항원 인자의 코딩 유전자, 소 유래 대장균 K99 항원 인자의 코딩 유전자 또는 인간 유래 살모넬라 I 항원 인자의 코딩 유전자이다.
본 발명의 내용은 항원 검출 간접 응집 시험 중의 불활성 벡터 제조 또는 항원 검출 간접 응집 시험 중의 불활성 벡터 제조에서 상기 일반형 불활성 벡터 대장균 또는 상기 검출 시스템의 응용을 더 포함한다.
본 발명의 내용은 항원 또는 항체 검출의 간접 응집 시험용 시약 또는 키트 제조에서 상기 일반형 불활성 벡터 대장균 또는 상기 검출 시스템의 응용을 더 포함한다.
본 발명의 내용은 인간 유래, 소 유래, 돼지 유래, 쥐 유래 또는 조류 유래 관련 병원성 감염 검출용 시약 또는 키트 제조에서 상기 일반형 불활성 벡터 대장균 또는 상기 검출 시스템의 응용을 더 포함한다.
본 발명의 내용은 상기 일반형 불활성 벡터 대장균 또는 상기 검출 시스템을 포함하는 검출 키트를 더 포함한다.
본 발명의 유익한 효과는 다음과 같다. 즉, 본 발명은 LB 한천과 액체 배지를 이용하여 불활성 벡터 SE1를 40세대 교대로 계대하기 시작하여 41대 내지 60대까지 계속 계대한다. 수득한 균주는 모두 일반형 불활성 벡터의 특성을 가지며, 이를 일반형 불활성 벡터 대장균 SE1H로 명명한다. 이는 일반형 불활성 벡터균 특징을 가지며, 일반형 불활성 벡터 대장균 SE1H는 상이한 유래 배경의 인간 유래, 쥐 유래, 소 유래, 돼지 유래 및 조류 유래(닭, 오리, 거위, 칠면조, 비둘기, 메추라기 포함) 등 다양한 혈청, 전혈과 비특이적 응집 반응을 일으키지 않는 것으로 나타났다. 또한 조류 유래 살모넬라 P 인자, 돼지 유래 대장균 K88ac 항원 인자, 소 유래 대장균 K99 항원 인자, 인간 유래 살모넬라 I 항원 인자를 세균 표면에서 각각 발현시켜 운반할 수 있다. 이는 항원 또는 감염성 항체의 간편하고 신속한 검출을 위한 간접 응집 시험 검출 방법의 개발에 적용할 수 있으며, 종래의 응집 항원 항체 검출의 응집 시험의 특이도 및 민감도가 떨어지는 기술적 병목 현상을 개선 및 보완할 수 있으므로, 거대한 잠재적 응용 가치와 시장 전망을 갖는다.
도 1은 SE1H PCR 감정도이다. 트랙 M은 Trans 2K 마커이고, 트랙 1은 대장균 SE1H의 PCR 증폭 β-글루쿠로니다제(glucuronidase) 유전자 uidA이고, 트랙 2는 EDL933의 PCR 증폭 β-글루쿠로니다제 유전자 uidA이고, 트랙 3은 DH5α의 PCR 증폭 β-글루쿠로니다제 유전자 uidA이고, 트랙 4는 장염 살모넬라 C50336의 PCR 증폭 β-글루쿠로니다제 유전자 uidA이다.
도 2는 응집 반응도이다. 100억 CFU/mL 세균 농도의 일반형 불활성 벡터균 SE1H균 현탁액과 상이한 유래의 혈청 응집 반응 검출 시험 결과도이다. 1, 인간 유래 A형 혈청, 2, 인간 유래 B형 혈청, 3, 인간 유래 AB형 혈청 , 4, 인간 유래 O형 혈청, 5, 홀스타인 소(Holstein cow) 혈청, 6, 육우 혈청, 7, BALB/C 마우스 혈청, 8, 렌드레이스(Landrace) 돼지 혈청, 9, 닭 유래 혈청, 10, 오리 유래 혈청, 11, 칠면조 유래 혈청, 12, 비둘기 유래 혈청이다. 음성 대조군은 SE1H와 생리 식염수 반응이고, 양성 대조군은 SE1H-K88ac와 토끼 항-K88ac 항원 핌브리아의 다중 항체 혈청 반응이다.
도 3은 조류 유래 살모넬라 p 유전자 PCR 증폭 산물 아가로스 전기영동 이미지이며, 여기에서 M: Trans 2K Plus II, 1: p-PCR 산물이다.
도 4는 PMD19-T simple vector DNA 벡터 p 유전자 함유 재조합 플라스미드 PMD19T-p 효소 절단 동정의 전기영동 이미지이다. 여기에서 Ma: Trans 2K Plus II, Mb: Trans 2K Plus, 1~3: 19T-pNheI 단일 효소 절단이다. 4~6: 19T-pBamHI 단일 효소 절단, 8~10: 19T-p 이중 효소 절단이다.
도 5는 p 유전자 함유 재조합 플라스미드 p-pBR322 효소 절단 동정 전기영동 이미지이다. 여기에서 M: Trans 15K, 1: p-pBR322 재조합 플라스미드 대조군, 2: p-pBR322 재조합 플라스미드 NheI 단일 효소 절단, 3: p 유전자 삽입이 없는 pBR322 플라스미드이다.
도 6은 벡터균 SE1H 및 표면에 조류 유래 살모넬라 P 인자를 발현하는 재조합 벡터균 SE1H-P 음성 염색 투과 전자 현미경 이미지(26500×)이다. A는 벡터균 SE1H이고 B는 SE1H-P이다.
도 7은 재조합균 SE1H-pBR322-K99 응집 시험도이다. 1은 재조합균 SE1H-pBR322-K99 및 마우스 항-K99 항원 핌브리아(fimbriae) 다중 클론 항체 응집 반응이다. 2는 재조합균 SE1H-pBR322-K99 및 마우스 항-대장균 K88ac 다중 클론 항체이다. 3은 재조합균 SE1H-pBR322-K99 및 마우스 항-대장균 F18ab 항원 핌브리아 다중 클론 항체이다. 4는 재조합균 SE1H-pBR322-K99 및 대장균 F18ac 항원 핌브리아 다중 클론 항체이다. 5는 재조합균 SE1H-pBR322-K99 및 조류 장티푸스 U20 다중 클론 항체이다. 6은 재조합균 SE1H-pBR322-K99 및 장염 살모넬라 C50336 다중 클론 항체이다.
도 8은 벡터균 SE1H 및 표면에 소 유래 대장균 K99 항원 인자를 발현하는 재조합 벡터균 SE1H-K99 음성 염색 투과 전자 현미경 이미지(46000×)이다. A는 벡터균 SE1H-PBR322이고, B는 재조합균 SE1H-pBR322-K99이다.
도 9는 SE1H-K88ac 응집 시험 그래프이다. A는 SE1H-K88ac 및 마우스 항-K88ac 항원 핌브리아의 응집 시험 이미지이고, B는 SE1H-pBR322 마우스 항-K88ac 항원 핌브리아의 단일클론성 항체 응집 시험 이미지이다.
도 10은 벡터균 SE1H와 표면에 돼지 유래 대장균 항원 인자 K88ac 항원 인자를 발현하는 재조합 벡터균 SE1H-K88ac 음성 염색 투과 전자 현미경 이미지(26500x)이다. A는 벡터균 SE1H-PBR322이고 B는 SE1H-K88ac이다.
도 11은 SE1H-I 응집 시험의 그래프이다. A는 SE1H-I 및 마우스 항-I 항원 인자(I형 핌브리아) 다중 항혈청 응집 시험도이고, B는 장염 살모넬라 참고 균주 C50336 및 마우스 항-I 항원 인자(I형 핌브리아) 다중 항혈청 응집 시험도이고, C는 SE1H-PBR322 및 마우스 항-I 항원 인자(I형 핌브리아) 다중 항혈청 응집 시험도이다.
도 12는 벡터균 SE1H 및 표면에 인간 유래 살모넬라 항원 인자 I 인자를 발현하는 재조합 벡터균 SE1H-P 음성 염색 투과 전자 현미경 이미지(46000×)이다. A는 벡터균 SE1H-PBR322이고, B는 재조합 벡터균 SE1H-I이다.
본 발명의 구체적인 실시예를 추가로 설명하기 전에, 본 발명의 보호 범위는 다음의 특정한 구체적인 실시예로 제한되지 않는다. 또한 본 발명 실시예에서 사용된 용어는 특정한 구체적인 실시예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 보호 범위를 제한하려는 것은 아님을 이해한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 실시예에서 사용된 구체적인 방법, 장비 및 재료 이외에, 본 기술 분야의 당업자가 종래 기술에 대한 이해도 및 본 발명의 설명에 따라, 본 발명의 실시예에서 설명된 방법, 장비 및 재료와 유사하거나 동등한 종래 기술의 임의 방법, 장비 및 재료를 사용하여 본 발명을 구현할 수도 있다.
본 발명에 언급된 PBS 완충액은 pH 값이 7.4, 0.01M 인산염 완충염 용액이다.
본 발명에 사용된 불활성 벡터 대장균 SE1은 중국 CGMCC(China General Microorganism Culture Collection and Management Center)에 기탁되었으며 기탁 주소는 중국 베이징이고 기탁 번호는 CGMCC No. 17339이고, 기탁 일자는 2019년 3월 18일이며, 분류명은 대장균(Escherichia coli)이고, 균주 코드는 SE1이다. 상기 균주 기탁 증명은 출원 번호가 2019104243819인 특허출원을 참조한다. 본 발명에 사용된 불활성 벡터 대장균 SE1H는 중국 CGMCC(China General Microorganism Culture Collection and Management Center)에 기탁되었으며 기탁 주소는 중국 베이징이고 기탁 번호는 CGMCC No. 20914이고, 기탁 일자는 2020년 10월 19일이며, 분류명은 대장균(Escherichia coli)이고, 균주 코드는 SE1H이다.
실시예 1 일반형 불활성 벡터 대장균 SE1H 획득과 검증
불활성 벡터 대장균 SE1(기탁 번호는 CGMCC No. 17339)을 LB 액체 배지에 접종한 후 37℃에서 12시간 동안 진탕시킨 다음 30μL 균액을 LB 고체 배지에 흡입하여 선을 그어 배양하고, 37℃에서 16 내지 18시간 동안 배양한 후 2대 콜로니를 수득하였다. 2대 단일 콜로니를 LB 액체 배지에 접종하고, 이를 순환하여 LB 액체와 고체 배지를 사용하여 40대부터 교대로 배양하기 시작하며, 수득한 단일 콜로니는 일반형 불활성 벡터균 SE1H이다. 사실상 계속해서 41대 내지 60대까지 계대하며, 그 중 어느 1대는 모두 마찬가지로 일반형 불활성 벡터균 SE1H 특징을 갖는다.
표 1 불활성 벡터 SE1H균의 상이한 계대의 체외 배양 계대수와 100개의 상이한 동물과 인간 유래 혈청 음성 응집 반응 수량
Figure pct00001
상기 밤새 배양된 SE1H 균액 1mL를 취하여 비등법으로 DNA 템플릿을 제조한다. 대장균 β-글루쿠로니다제 유전자 uidA를 PCR로 증폭하여 1.5% 겔 전기영동으로 동정하였으며, 표적 단편의 크기는 162 bp였다. 참고문헌 합성 Suzhou Jinweizhi Company에서 합성한 프라이머 서열은 다음과 같다.
uidA-F: 5‘ TGGTAATTACCGACGAAAACGGC 3’ ;
uidA-R: 5‘ ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG 3’ ;
반응 시스템은 20μL이고, 2xTaq Master Mix(Dye Plus)(Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.에서 구입) 10μL를 포함하고, uidA-F/R(10μM)는 각 1μL이고, DNA 템플릿은 2μL이고, 멸균 초순수 6μL로 20μL을 구성한다. 최적화된 PCR 반응 조건은 94℃에서 5분, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30회 순환을 진행하며, 72℃에서 10분이다. 결과는 SE1H가 대장균 표준주 EDL933(O157:H7형 대장균 약화 균주, eae 및 stx 유전자 결실), 대장균 DH5α와 크기가 동일한 162bp 밴드를 증폭시킬 수 있는 것으로 나타났다(도 1).
상용 미량 생물화학관을 사용하여 불활성 벡터균 SE1H에 대해 인디고 매트릭스(인돌, I) 시험, 메틸레드(MR) 시험, VP 시험, 구연산염(C)을 수행하고 시험을 이용해 생화학적 감별을 진행하여 인디고 매트릭스 시험, MR-VP 시험 및 구연산염을 진행하고 시험을 이용해 생화학적 감별을 진행한다. 미량 생물화학관 설명서에 따라 결과 분석 판단을 진행한다. 결과는 국가표준방법(GB4789.38-2012)에 설명된 대장균 생물화학 특성(표 2)에 부합하였다.
표 2: SE1H균의 생물화학 특성
Figure pct00002
각주: "-"는 음성을 나타내며, "+"는 양성을 나타낸다.
실시예 2 일반형 불활성 벡터 대장균 SE1H와 상이한 배경의 인간 및 동물 유래 혈청, 전혈 비특이성 응집 현상의 시험
실시예 1에서 밤새 배양하여 수득한 대장균 SE1H 균액을 4℃ 4000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상청액을 버리고, 균성 슬러리를 멸균 식염수로 재현탁하고 원심분리하여 3회 세척한 후 상이한 농도 세균 수량 농도 구배까지 재현탁하였다. 시험 전 균액을 볼텍서(vortexer)로 혼합하고 멸균 식염수와 SPF 닭 혈청을 이용하여 응집 시험을 수행하여 시험 균액에 자가 응집 및 비특이적 응집 현상이 없는지 확인한다. 초클린벤치(super-clean bench)(20℃ 내지 25℃)에서 표면이 깨끗한 일반 유리판 몇 장을 취하여, 무균의 4℃로 예냉된 PBS를 이용해 벡터균을 원심분리하여 재현탁하고 3회 세척한 다음 재현탁하여 소정의 세균 농도로 희석한다. 마이크로파이펫을 사용하여 한 방울의(10μL 내지 50μL 상이한 부피) 상이한 농도 구배의 벡터균 현탁액 SE1H를 수평으로 거치된 유리판 표면 상에 수직으로 떨어뜨린 다음, 동일한 양의 시험할 혈청, 적혈구, 전혈을 신속하게 점적한다. 멸균된 피펫 팁을 이용하여 균 현탁액을 혈청, 적혈구, 전혈과 골고루 섞이도록 하여 직경 1cm 내지 2cm의 시트형으로 도포한 후 유리판을 안정적으로 흔들어주며, 반드시 2min 이내에 시험하고 시험 결과를 관찰한다. 표준 판단 상황은 상온에서 2분 이내에 균액과 피검사 혈청이 솜 형태 또는 입자 형태를 생성하여 육안으로 침전을 확인할 수 있으며 반응 결과 또는 피검사 적혈구, 전혈이 입자 형태 적혈구 응고 입자가 나타나면 양성으로 판단하고, 그렇지 않으면 음성으로 판단한다. 동일한 절차로 SE1 균 현탁액을 대조군으로 제조한다.
응집 시험 결과에 따르면, 벡터균 SE1은 상이한 농도 조건 하에서(5 내지 100억 CFU/mL) 모두 자가 응집 현상을 나타내지 않았다. 20억 cfu/mL 농도 하에서 상이한 유래 배경의 인간 유래, 쥐 유래, 소 유래, 돼지 유래 및 조류 유래(닭, 오리, 거위, 칠면조, 비둘기, 메추라기 포함) 등 다양한 혈청, 적혈구, 전혈 검출과의 응집 반응 결과는 모두 음성이었으나, SE1가 50억 cfu/mL에 도달한 후 벡터균 SE1와 일부 인간 유래 및 일부 상이한 동물 유래 혈청 및 전혈 샘플은 상이한 정도의 응집을 나타냈다. 상이한 농도 조건 하에서(5 내지 100억 CFU/mL) 대장균 SE1H는 모두 자가 응집 현상이 나타나지 않았으며, 상이한 유래 배경의 인간 유래, 쥐 유래, 소 유래, 돼지 유래 및 조류 유래(닭, 오리, 거위, 칠면조, 비둘기, 메추라기 포함) 등 다양한 혈청, 적혈구, 전혈 검출과의 응집 반응 결과는 모두 음성이었다. 이는 벡터균 대장균 SE1H와 상이한 유래 배경의 인간 유래, 쥐 유래, 소 유래, 돼지 유래 및 조류 유래 등 다양한 혈청, 적혈구, 전혈이 비특이적 응집 반응을 일으키지 않음을 설명한다. 상기 상이한 유래 배경의 인간 유래, 다양한 동물 유래 혈청, 적혈구, 전혈을 무작위로 채취한 사실을 감안할 때, 벡터균 대장균 SE1H와의 응집 반응 검출 결과는 모두 음성이다(도 2). 따라서 대장균 SE1H를 일반형 불활성 벡터 대장균으로 간주할 수 있다.
표 3 상이한 농도 벡터균 SE1H, SE1 균 세균 현탁액과 상이한 유래 전혈/혈청 응집 반응 시험 결과
Figure pct00003
Figure pct00004
각주: "-"는 음성을 나타내며, "+"는 양성을 나타낸다.
실시예 3 일반형 불활성 벡터균 대장균 SE1H 세균 표면에 조류 유래 살모넬라 항원 인자 P를 발현하고 운반하는 능력의 시험과 검증
(一) 조류 유래 살모넬라에 의해 발현되는 항원 인자 P의 코딩 유전자 p의 증폭
NCBI GenBank 중 살모넬라 풀로룸 ATCC 9120주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: CP012347.1), 살모넬라 풀로룸 S44987_1주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: LK931482.1), 살모넬라 풀로룸 S06004주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: CP006575.1), 살모넬라 풀로룸 QJ-2D-Sal주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: CP022963.1), 살모넬라 갈리나룸 287/91주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: AM933173.1), 살모넬라 갈리나룸 9184주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: CP019035.1)에서 공표된 전장 게놈 서열에 따라, 각각 항원 인자 P를 코딩하는 p 유전자의 전장 단편을 검색 및 비교하였고, Olige7 프라이머 소프트웨어를 사용해 PCR 증폭 p 유전자의 프라이머를 설계하였다. 업스트림 및 다운스트림 프라이머는 각각 다음과 같다.
p-F: 5'- ATG AAA CGT TCA CTT ATT CCT CCT T- 3'
p-R: 5' -TTA ATT ATA AGA TAC CACCAT TA- 3'
각각 업스트림 및 다운스트림 프라이머의 5' 말단에 NheI 및 BamHI 효소 절단 부위 및 보호 염기를 추가하고, 비등법을 이용해 조류 장티푸스 참고 균주 U20 템플릿을 제조하고, p 유전자(p-PCR) 시스템을 PCR 증폭한다. 5X pfu DNA 중합효소 buffer 10 μL, dNTP 5 μL, 업스트림 프라이머 2 μL, 다운스트림 프라이머 2 μL, 템플릿 2 μL, pfu 고충실도 DNA 중합효소(2.5units/uL) 2 μL, 탈이온수 27 μL이다(5X pfu DNA 중합효소 buffer, dNTP 및 pfu 고충실도 효소는 Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.에서 구입함). PCR 반응 매개변수: 94℃, 5분이다. 94℃ 1분, 52℃ 1분, 72℃ 1분, 30개 순환, 72℃ 10분, 4℃ 보관한다.
상기 p-PCR 반응이 완료된 후 시스템에 rTaq DNA 중합효소(5U/μL, Takara Bio에서 구입) 2.4μL를 첨가하고 72℃에서 20분간 다중 A 꼬리(Poly A tail)를 첨가하였다.
상기 PCR 증폭 산물에 6X Loading buffer 10 μL을 추가하고, 90V에서 1% 아가로스 겔에 전기영동을 1시간 동안 진행하고, UV 겔 이미저로 표적 밴드를 관찰한 결과는 예상에 부합하였다(도 3). 표적 밴드의 겔을 절단하고 설명서에 따라 조작하며, 아가로스 겔 회수 키트는 PCR 증폭 산물을 회수하는 데 사용되었으며, PCR 증폭된 DNA 유전자를 포함하는 회수 산물은 향후 사용을 위해 -20℃에 보관한다.
(二) p 유전자 함유 재조합 플라스미드 19T-p의 구축 및 확인
이전 단계에서 얻은 A-tailed PCR 증폭 산물을 PMD19-T simple vector DNA 벡터와 연결하며(이하, 19T 벡터로 약칭, 미국 Promega에서 구입), 10 μL의 연결 시스템은 다음과 같다. 19T 벡터 1μL, PCR 증폭 DNA 유전자를 포함하는 회수물 4μL, solution I 용액 5μL, 상기 반응계를 16℃ 금속욕에 넣고 연결하여 밤새 반응시켰다.
다음날, 연결 산물을 DH5α 컴피턴트 세포로 화학적으로 형질전환시켰고, 조작은 다음과 같다. 즉, 초저온 DH5α 컴피턴트 세포를 얼음 위에서 해동하고, 연결 산물 10 μL를 컴피턴트 세포에 첨가한다(컴피턴트 세포가 막 해동되었을 때 연결 산물을 첨가). 가볍게 혼합하고 얼음조에 30분간 두었다가 42℃에서 열 스트레스를 가하고 즉시 2분 동안 얼음 위에 거치한다. 실온으로 평형화된 LB 용액 250 μL를 추가하고, 37℃에서 2시간 동안 200rpm으로 인큐베이션하고 4000rpm에서 원심분리하며 1분 후에 상청액을 버리고 약간의 상청액(약 100μL)을 남겨 균체를 재현탁하며 암피실린 LB 고체 배지에 고르게 도포하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
P-PCR 감정: 암피실린 LB 고체 배지에서 콜로니 및 박테리아의 성장 유무를 관찰하고, 단일 콜로니를 선택하여 암피실린 액체 LB에서 16시간 동안 진탕하며, 템플릿으로 2μL를 취하여 균액 PCR 감정을 수행하였으며, 반응계는 2X taq DNA 중합효소 mix 10μL(Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.에서 구입), p 유전자 업스트림 프라이머 1μL, p 유전자 다운스트림 프라이머 1μL, 템플릿(균액) 2μL, 탈이온수 6μL이다. 반응 매개변수: 95℃에서 10분, 94℃에서 1분, 52℃에서 1분, 72℃에서 1분, 25개 순환, 72℃에서 10분, 4℃에서 보관한다. 1% 아가로스 겔 전기영동 90V 1시간 및 관찰 감정한다(도 4 참조).
플라스미드 소화 및 전기영동 감정: 상용 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 정제된 플라스미드를 NheI 단일 효소 절단하고, NheI 및 BamHI 이중 효소 절단(제한 엔도뉴클레아제 NheI 및 제한 엔도뉴클레아제 BamHI는 TakaraBio Company에서 구입)한 후 아가로스 겔 전기영동으로 동정하였다. NheI 단일 효소 절단 시스템: M buffer 5 μL, NheI 1 μL, 플라스미드 30 μL, 탈이온수 14 μL. 이중 효소 절단 시스템: BglI buffer 5μL, NheI 1μL, BamHI 1μL 플라스미드 30μL, 탈이온수 13μL. 37℃ 수조에서 3시간 후 1% 아가로스 겔에서 90V 전기영동 1시간 수행하며 관찰 및 감정하였다(도 4 참조).
(三) p 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 p-pBR322의 구축
이전 단계의 p-PCR 증폭 산물과 p 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 19T-p는 양성이었고, 효소 절단 플라스미드 크기는 예상 값과 일치하였다. DNA 시퀀싱을 통해 각각 pBR322 플라스미드와 19T-p에 대해 NheI와 BamHI 이중 효소 절단을 채택하였으며, 효소 절단 시스템은 전술한 (二)와 동일하다. 아가로스 겔 전기영동 및 관찰 감정을 거친 후, 각각 4361 bp 및 4845 bp 지점 표적 밴드의 DNA 겔 조각을 잘라내어 키트를 이용해 각각 두 표적 밴드 DNA를 회수하였다. DNA T4 리가제의 반응 시스템: 10X buffer 1 μL, 효소 절단 pBR322 회수 산물 2 μL, 효소 절단 pBR322 회수 산물 2 μL, T4 리가제 1μL(미국 Promega에서 구입), 탈이온수 4 μL이다. 16℃의 금속욕 장치에서 밤새 연결 반응을 수행하였다.
(四) p 유전자를 포함하는 불활성 벡터에 대한 SE1H-P 검출 시스템의 구축 및 감정
이전 단계에서 밤새 연결한 p-pBR322 재조합 플라스미드 연결 산물을 벡터균 SE1H 컴피턴트 세포로 전기형질전환시켰고, 구체적인 조작은 다음과 같다.
전기형질전환 컴피턴트 세포 SE1H의 제조: 밤새 성장한 LB 평판 상의 SE1H의 단일 콜로니를 선택하고, LB 액체 배지 4mL에 접종하며, 37℃에서 3 내지 5시간 동안 흔들어, 세균 성장 상황을 관찰한다. 균액을 1:100으로 4mL의 액체 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 OD600이 0.4 내지 0.6이 되도록 진탕한 후 얼음조에 30분 동안 놓고, 4℃에서 10분 동안 4000rpm으로 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 미리 냉각된 10% 글리세린을 추가하고 4℃에서 원심분리하여 3회 세척하며, 마지막으로 40μL의 10% 글리세린에 재현탁하고, 이후 사용을 위해 -70℃에서 잠시 보관한다.
전기형질전환 조작: 2μL p-pBR322 재조합 플라스미드를 40μL SE1H 전기형질전환 컴피턴트 세포와 혼합하고, 30분 동안 얼음조에 넣고, 상기 혼합물을 0.1cm의 Bio-Rad 전극컵에 넣고 전기 충격을 주며, 전기형질전환 후 신속하게 형질전환 산물을 1mL SOC 액체 배지로 옮기고, 37℃에서 4시간 동안 진탕한 후 4000rpm에서 10분간 원심분리하여 상청액을 버리고, 바닥에 약간의 액체를 남겨 재현탁시킨 후, 암피실린 평판에 균일하게 도포하고 37℃에서 밤새 배양하였다.
이튿날 세균 콜로니 성장 상태를 관찰하였고, 단일 콜로니를 암피실린 액체 LB 배지에 옮겨 16시간 동안 증폭 및 배양한 후, 재조합 플라스미드 p-pBR322를 추출하고 플라스미드를 NheI로 효소 절단하였으며, 아가로스 겔 전기영동 및 관찰 동정은 예상에 부합하였다(도 5 참조). DNA 시퀀싱 및 검증 후 SE1H-P균을 획득하였고, SE1H-P균을 선별하여 글리세린균의 형태로 -70℃에서 보관하였다.
(五) P 인자 발현의 불활성 벡터 검출 시스템 SE1H-P 감정
벡터균 SE1H 및 p 유전자 함유 불활성 벡터 검출 시스템 SE1H-P 균주를 LB 및 암피실린 내성 LB 한천 배지에 각각 접종하고, 37℃에서 24시간 거치한 후 성장한 단일 콜로니를 각각 LB 및 암피실린 내성 LB 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 12시간 진탕 배양하여 10대 블라인드 계대 후, 소량의 균액을 취하여 LB 및 암피실린 내성 LB 액체 배지에 각각 접종하였다. 37℃에서 48시간 동안 정치한 후 10,000rpm에서 2분 동안 원심분리하고 멸균 PBS로 침전물을 재현탁하고, 소량의 상청액을 취하여 구리 메쉬에 현탁하고, 5분 동안 인텅스텐산으로 음성 염색하였다. 네덜란드 Philips Tecnai 12형 투과전자현미경으로 수행한 관찰, 촬영 및 결과에 따르면, SE1H 표면에는 P 항원 인자 성분이 보이지 않는 반면, SE1H-P 표면에는 항원 성분(P 인자 성분)이 나타나서 운반되었고, 이는 도 6에 도시된 바와 같다.
실시예 4 벡터균 대장균 SE1H 균체 표면의 소 유래 대장균 K99 항원 인자 발현 및 운반 시험 검증
(一) PCR 프라이머의 설계 및 합성, fan 오페론 유전자의 증폭 및 클로닝
NCBI GenBank 중 대장균 CFS3246주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: CP026929.1), 대장균 H10407주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: NC_017633.1), 대장균 734/3주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: JPQX01000001.1), 대장균 UMNF18주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: NZ_AGTD 00000000.1) 공표된 전장 게놈 서열에 따라, 소 유래 대장균 K99 핌브리아 fan 오페론 각 단편 서열 정보를 검색하여 비교 및 정렬하고, K99 핌브리아 fan 오페론을 PCR 증폭하는 한 쌍의 프라이머를 설계했다. 업스트림 및 다운스트림 프라이머는 각각 BamHI 및 Sal I 효소 절단 부위를 포함한다. 프라이머는 Shanghai Jikang Bioengineering Co., Ltd.에서 합성하며, 업스트림 및 다운스트림 프라이머 서열은 다음과 같다.
FanBamUP (PBR): 5'- CAC GGA TCC TGG AGA ATC TAG ATG AAA AAA ACA CT -3';
FanSalLO (PBR): 5'- CGC GTC GAC TCA TAT AAA TGT TAC AGT CAC AGG AAG T-3'.
전체 세균 용해법으로 대장균 K99 프로토타입 균주 C83907의 템플릿 DNA를 제작하였고, 큰 단편 DNA를 PCR 증폭하는 PCR 방법에 따라 PCR 매개변수를 설계하고, 큰 단편 DNA 증폭을 수행하였다. PCR 증폭 산물은 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 거쳐 관찰 및 감정한 후, 키트를 이용해 표적 밴드 DNA를 회수하여 pMD-18T 벡터(미국 Promega에서 구입)와 연결하고, 컴피턴트 DH5α로 형질전환한 후, 암피실린 내성 LB 평판은 내성 가정 양성 클론을 스크리닝하고, DNA 시퀀싱 감정 및 검증을 수행하였다. BamHI 및 SalI를 이용해 fan 오페론 유전자를 포함하는 pMD-18T 및 벡터 pBR322 플라스미드를 효소 절단 소화하고, 두 소화 산물 DNA를 클로로포름으로 추출한 후 알코올 침전, 원심분리 및 정제를 수행한 다음, T4 DNA 리가제 작용 하에서 16℃에서 밤새 연결하며, 연결 산물을 벡터균 대장균 벡터균 SE1h 컴피턴트 세포로 형질전환하며, 수득한 재조합균은 알칼리 용해법으로 재조합 플라스미드를 소량 추출하여 감정하고, 이어서 단일 효소 절단과 이중 효소 절단 소화하고, 아가로스 겔 전기영동 및 관찰 감정하며, 재조합 플라스미드의 구성이 올바른지 여부를 감정하고, DNA 시퀀싱 감정 및 확인하였다. fan 오페론 유전자를 운반하는 양성 재조합균을 SE1H-pBR322-K99로 명명하였다. 동시에 pBR322 빈 플라스미드를 벡터균 SE1H로 형질전환하여 음성 대조균 SE1H-pBR322를 구축하였다.
(二) 마우스 항-K99 핌브리아 단일 클론 항체에 의해 매개되는 응집 반응 및 벡터균 대장균 SE1H 세포 표면의 소 유래 대장균 K99 항원 인자 발현 및 운반 시험 검증
대장균 K99 프로토타입 균주 C83907 단일 콜로니를 선택하여 Minimal 무기염 배지에 접종하고 벡터 재조합균 SE1H-pBR322-K99 단일 콜로니를 선택하고 SE1H-pBR322 단일 클로니를 암피실린 내성 LB 액체 배지에서 밤새 배양하고, 12,000rpm에서 원심분리하여 상청액을 버리고, PBS 완충액으로 2회 세척하며 적절한 양의 PBS에 재현탁한다. 5μL의 샘플을 취하여 상이한 희석도의 마우스 항-대장균 K88ac 핌브리아 단일 클론 항체, 다중 클론 항체, F18ab 핌브리아 다중 클론 항체, F18ac 핌브리아 다중 클론 항체, K99 핌브리아 단일 클론 항체 혈청과, 상기 단일 클론 항체 및 다중 클론 항체 혈청은 본 실험실 자체 제작하였으며, 구체적인 내용은 관련 보도를 참조할 수 있다(Ma Yan, Wang Yiting, Zhao Jing, et al. 대장균 F4 핌브리아 응집성 단일클론성 항체 제조 및 에피토프 차이[J]. 양저우대학학보(농업과 생명과학판), 2017, 38(01): 12-15+34., Yang Yang, Hou Huayan, Yu Lei, et al. 등 대장균 K99 핌브리아 fan 오페론의 클로닝, 발현 및 활성[J]. 미생물학보, 2012, 52(12): 1524-1530.). 유리 슬라이드 상표면에서 균일하게 혼합하고, 상온에서 2분간 이내로 인큐베이션한 후, 램프 아래에서 응집 반응 효과를 관찰 및 판단한다.
응집 반응 결과에 따르면, SE1H-pBR322-K99 재조합균과 마우스 항-K99 핌브리아 단일 클론 항체는 현저한 응집 반응을 보였으나, 본 실험실에 보존된 대장균 K88ac, F18ab, F18ac 및 조류 장티푸스 U20, 장염 살모넬라 C50336 다중 클론 항체와는 응집 반응을 일으킬 수 없었다. 상기 결과에 따르면, 벡터균 대장균 SE1H 균체는 표면에 소 유래 대장균 K99 항원 인자를 발현하고 운반하는 반면, SE1H-pBR322 음성 대조균은 표면에 K99 항원 인자를 발현하지 않았으며, 이는 도 7에 도시된 바와 같다.
(三) 투과전자현미경 관찰 및 벡터균 대장균 SE1H 균체 표면의 소 유래 대장균 K99 항원 인자 발현 및 운반 시험 검증
SE1H-pBR322-K99 재조합균, K99 핌브리아를 발현하지 않는 SE1H-pBR322 음성 대조균을 각각 16시간 동안 배양하고 원심분리하여 상청액을 버리며 PBS 완충액으로 3회 세척한 후 재현탁하였다. 이어서 적당량의 균액을 흡수하여 구리 메쉬에 현탁시키고, 인텅스텐산으로 5분간 음성 염색한다. Philips Tecnai12-twin 투과전자현미경으로 상기 세균 표면의 핌브리아 유무 및 분포를 관찰하였다.
전자현미경 관찰 결과, 재조합균 SE1H-pBR322-K99 세포 표면이 핌브리아로 덮여 있어, 재조합균 표면 핌브리아 발현량이 큰 반면, pBR322 플라스미드만을 함유한 재조합균 SE1H-pBR322 음성 대조균 표면에는 어떠한 핌브리아도 보이지 않았으며, 이는 도 8에 도시된 바와 같다.
(四) 핌브리아의 동정, SDS-PAGE, Western blot 분석 및 벡터균 대장균 SE1H 균체 표면의 소 유래 대장균 K99 항원 인자 발현 및 운반의 시험 검증
재조합 대장균 SE1H-pBR322-K99는 열추출법을 이용하여 60℃에서 30분간 처리하여 핌브리아 단백질을 분리 정제하였으며, 관련 문헌에 따라 12% SDS-PAGE를 수행하였고, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie bright blue) R250 염색으로 발현 핌브리아 주요 구조 단백질 밴드 크기를 관찰하였다. 대장균 K99 원형 균주 C83907을 양성 대조군으로 사용하였고, 재조합균 SE1H-pBR322를 음성 대조군으로 사용하였다. SDS-PAGE 결과에 따르면, 18.5KD 지점에서 주요 구조 단백질 밴드가 나타났으며, 분리 정제된 재조합균 SE1H-pBR322-K99와 fanC 발현된 K99 핌브리아 주요 구조 단백질 하위 단위 크기와 일치하였다. 또한 대장균 K99 프로토타입 균주 C83907의 열추출에 의해 분리 및 정제된 핌브리아의 주요 구조 단백질 밴드 크기와도 일치한 반면, 음성 대조군 균주 SE1H-pBR322의 열추출 산물 SDS-PAGE를 거쳐 18.5KD 지점에서 감정하였으며 상응하는 밴드가 없었다.
BIO-RAD 단백질 밴드 전사 시스템을 통해, 상기 열추출 분리 정제된 핌브리아 단백질 밴드를 니트로셀룰로오스 NC 멤브레인으로 옮기고 10% 탈지방 분유를 4℃에서 밤새 차단하였다. NC 멤브레인을 PBST 세척액으로 5회 세척한 후, 1:500 희석된 쥐 유래 k99 핌브리아 단일 클론 항체를 1차 항체로, 1:50 희석된 염소 항-마우스 IgG-HRP를 2차 항체로 순차적으로 첨가하여 인큐베이션하였고, DAB 기질을 발색하였다. 동시에 대장균 K99 프로토타입 균주 C83907는 동기적으로 핌브리아를 분리 정제하여 양성 대조군으로, 음성 대조군 균주 SE1H-pBR322 열추출 산물을 음성 대조군으로 설정하였다. Western blot 결과에 따르면, 마우스 항-K99 핌브리아 단일 클론 항체는 재조합균 SE1H-pBR322-K99와 대장균 K99 프로토타입 균주가 발현하는 핌브리아 주요 구조 단백질 밴드를 특이적으로 식별할 수 있었지만, 음성 대조군 균주 SE1H-pBR322의 열추출 산물은 식별할 수 없었다. 상기 결과는 마찬가지로 재조합 대장균 SE1H-pBR322-K99 균주 표면에 소 유래 대장균 K99 항원 인자가 발현 및 운반됨을 나타낸다.
실시예 5 대장균 벡터 SE1H 균체 표면의 돼지 유래 대장균 항원 인자 K88ac 발현 및 운반의 시험 검증
(一) PCR 증폭 프라이머 설계와 합성
NCBI GenBank 중 대장균 UMNK88 균주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: CP002729.1), 대장균 C83549 O149:K88ac 균주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: EU570252.1), 대장균 NCYU-25-82 균주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: CP042627.1) 중 공표된 전장 게놈 서열과 국내외 이미 발표된 돼지 유래 대장균 K88ac 핌브리아를 코딩하는 fae 유전자 오페론 서열 정보에 따라, DNAstar 소프트웨어를 이용하여 fae 유전자 오페론의 전체 길이의 한 쌍의 PCR 프라이머를 비교분석 및 설계하였다. 업스트림 및 다운스트림 프라이머는 각각 다음과 같다.
F: 5' -CAGGCTAGCATGAAAAAAGCATTCTTAT- 3'
R: 5' -CGGGATCCTCAGAAATACACCACCACCGGTGTC- 3'
업스트림 및 다운스트림 프라이머는 각각 Nhe1 및 BamH1 효소 절단 부위를 포함하며, 프라이머는 Shanghai Jikang Bioengineering Company에서 합성했다.
(二) PCR 증폭 템플릿 세균 염색체 DNA의 제조
전체 세균 용해법에 따라 세균 염색체 DNA를 제조하였다. 대장균 K88ac 참고 균주 C83902를 16 내지 18시간 동안 LB 액체 배양물과 진탕하고, 원심분리하고 멸균 초순수로 현탁 세척하였다. 100℃에서 10분간 수욕하고, 얼음조에 넣어 냉각한 후 4℃에서 7000rpm으로 원심분리하고 상청액을 PCR 증폭 템플릿으로 취했다. 프라이머 농도는 25pmol/L이고, 50μL 반응 시스템에는 Buffer 25μL, dNTP 4μL, 업스트림 프라이머 1μL, 다운스트림 프라이머 1μL, 템플릿 DNA 5μL, Long PCR 고충실도 DNA 중합효소 0.8μL(5U/μL, Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.에서 구입)이 포함된다. PCR 순환 매개변수는 템플릿 DNA 94℃ 변성 2분 후, 94℃(15s) -50℃(30s) -68℃(3min) 총 25개 순환을 수행한 다음, 68℃에서 다시 20분 연장하고, 4℃에서 보관하였다.
(三) PCR 증폭산물의 아가로스 겔 전기영동 및 관찰 동정
10μL의 PCR 증폭 산물을 취하여 2μL의 6x loading buffer와 균일하게 혼합하고 0.8% 아가로스겔(브로민화 에티듐(ethidium bromide) 0.5μg/ml 포함) 전기영동을 수행하며, 전기영동 완충액은 1x TAE이고, 정압 70V로 1시간 후 BIO-RAD 겔 이미저로 PCR 증폭 산물 크기를 관찰 감정하였다.
(四) fae 유전자 오페론을 함유하는 양성 재조합 플라스미드 pBR322-K88ac의 클로닝 구축
각각 Nhe1과 BamH1을 이용해 PCR 증폭 산물과 pBR322 발현 플라스미드를 소화시키고, 페놀/클로로포름으로 추출하며, 에탄올 침전 및 정제한 후, 3:1의 양에 따라 동시에 이중 효소 절단된 PCR 증폭 산물과 pBR322 플라스미드를 혼합한다. 16℃에서 T4 DNA 리가제를 이용해 밤새 연결하고 벡터균 SE1H로 형질전환시킨다. 먼저 암피실린 내성 평판을 통해 가정 양성 클론을 선별하고, 동시에 알칼리 용해법으로 가정 양성 클론 플라스미드 DNA를 소량 추출하고 단일 효소 절단, 이중 효소 절단 및 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 양성 클론 플라스미드 크기를 관찰 및 동정한다. 그 결과, fae 유전자 오페론을 포함하는 양성 재조합 플라스미드 pBR322-K88ac가 올바르게 구축되었으며 플라스미드 DNA 시퀀싱을 검증하였다.
PCR 증폭 산물의 0.8% 아가로스 겔 전기영동 결과에 따르면, 특이성 표적 밴드가 PCR에 의해 증폭되었으며 그 크기는 약 7.9kb로 예측한 fae 오페론 유전자의 크기와 일치하였다. 가정 양성 재조합 플라스미드 pBR322-K88ac를 암피실린 내성 LB 평판을 통해 선별하고, 정제된 재조합 플라스미드 DNA 효소 절단 산물은 아가로스 겔 전기영동하였으며, 표적 유전자를 함유한 fae 오페론이 삽입된 재조합 플라스미드로 확인되었다. Shanghai Jikang Gene Company의 시퀀싱 및 검증을 통해, 마지막으로 양성 재조합 플라스미드 pBR322-K88ac를 포함하는 재조합 벡터균 SE1H-K88ac를 구축 및 획득하였다.
(五) 마우스 K88ac 핌브리아 단일 클론 항체 매개의 응집 반응
pBR322-K88ac를 포함하는 재조합 벡터균 SE1H-K88ac 단일 콜로니를 선별 및 채취하여 100μg/mL 암피실린을 포함하는 LB 배지에 접종하고 37℃에서 진탕하며 밤새 배양하였다. 균액 10μL를 취하여 동일한 양의 토끼 항-K88ac 핌브리아 다중 항체 혈청과 마우스 항-K88ac 단일 클론 항체를 각각 혼합하고, 응집 시험 반응에 따라 램프 빛 아래에서 관찰하였다. 그 결과, 재조합균이 37℃에서 일정 기간 동안 밤새 배양한 대장균 K88ac 참고 균주 C83902와 같이 모두 토끼 항-K88ac 핌브리아 다중 항체 혈청 및 마우스 항-K88ac 핌브리아 단일 클론 항체와 현저한 응집 반응을 일으키는 것으로 나타났다(도 9 참조). 재조합균 SE1H-K88ac 열추출 및 정제된 핌브리아에 의해 제조된 마우스 항혈청은 재조합 벡터균 SE1H-K88ac와도 현저한 응집 반응을 일으킬 수 있으며, 유리판 응집 항체 값은 1:200에 이른다. 반면, 음성 대조군 균주 SE1H-pBR322는 응집 시험 반응에서 음성이었다. 요약하면, 결과는 벡터균 대장균 SE1H 균체가 표면에서 돼지 유래 대장균 K88ac 항원 인자를 발현하고 운반함을 보여준다.
(六) 투과전자현미경 관찰
재조합 벡터균 SE1H-K88ac를 LB 배지에서 24시간 동안 정배양한 후 원심분리하여 PBS 용액으로 2회 세척한 후, 소량의 균액을 흡입하여 구리 메쉬에 부유시키고, 인텅스텐산으로 5분 동안 음성 염색을 하였으며, Philips Tecnai12-twin 투과전자현미경으로 관찰 및 촬영하였다. 동시에 pBR322 빈 벡터를 운반하는 균주 SE1H-pBR322를 음성 대조군으로 설정했다.
재조합 벡터균 SE1H-K88ac를 음성 염색한 후 투과전자현미경에서 균체 표면에 많은 핌브리아가 발현하였고, 재조합 벡터균 핌브리아는 조밀하고 가늘어 재조합균 중 핌브리아 발현이 비교적 우수한 것으로 나타났다(도 10).
(七) 핌브리아의 확인
재조합 벡터균 SE1H-K88ac 및 대장균 K88ac 참고 균주 핌브리아의 추출: 열추출법을 이용하여 배양균액을 원심분리하고 PBS로 2회 세척하였다. 0.05M Tris-HCl(pH7.4)-1M NaCl(pH7.4 내지 7.6) 저염 용액으로 현탁하고, 60℃ 수욕에서 30분간 처리하였으며 8000rpm에서 20분간 원심분리하여 핌브리아 단백질을 분리하였다. 포화 황산암모늄을 최종 농도 25%로 첨가하여 핌브리아 단백질을 침전 및 정제하며, 4℃에서 보관하였다.
재조합 벡터균 SE1H-K88ac 및 대장균 K88ac 참고 균주 정제 핌브리아 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯: 관련 문헌에 따라 12% SDS-PAGE를 수행하여 12% 분리 겔 및 5% 농축 겔을 제조한다. 정제 핌브리아 상청액을 5×SDS 로딩 완충액과 혼합하고 끓는 물에 8분간 끓여 단백질을 변성시킨 후, 시료 20μL를 각 well에 로딩하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하며, 정전압 100V, 4시간 진행한다. 쿠마시 브릴리언트 블루 R250 염색을 이용하여 발현 핌브리아 주요 구조 단백질 밴드 크기를 관찰하였다. BIO-RAD 단백질 밴드 전사 시스템을 이용하여 겔 중의 단백질 밴드를 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮기고, 2시간 동안 정전류 300mA를 흘렸다. 전사 종료 후 NC 멤브레인을 10% 탈지유로 차단하고 4℃에서 밤새 유지했다. PBST로 3회 세척하고 PBST 세척한 NC 멤브레인을 1:400 희석된 마우스 항-K88ac 핌브리아 단일클론성 항체 혈청에 넣고 37℃에서 2시간 동안 작용하였다. PBST로 각각 5분씩 3회 세척한 다음 1:50 희석된 염소 항-마우스 IgG-HRP에 넣고, 37℃에서 2시간 작용하였다. PBST로 각각 5분씩 3회 세척하고 발색을 위해 어두운 곳에 새로 제조한 기질 DAB 발색액(10mL PBS, 9mg DAB, 20μL 30% H2O2)를 옮기며, 밴드가 깨끗해지면 증류수로 반응을 중지한다.
SDS-PAGE 결과에 따르면, 26KD 지점에서 주요 구조 단백질 밴드가 나타났으며, 분리 정제된 재조합균 SE1H-K88ac와 fae 발현된 K88ac 핌브리아 주요 구조 단백질 하위 단위 크기와 일치하였다. 또한 대장균 K88ac 프로토타입 균주 C83902의 열추출에 의해 분리 및 정제된 핌브리아의 주요 구조 단백질 밴드 크기와도 일치한 반면, 음성 대조군 균주 SE1H-pBR322의 열추출 산물은 SDS-PAGE를 거쳐 18.5KD 지점에서 감정하였으며 상응하는 밴드가 없었다. Western blot 결과에 따르면, 마우스 항-K88ac 핌브리아 단일 클론 항체는 재조합균 SE1H-K88ac와 대장균 K88ac 프로토타입 균주가 발현하는 핌브리아 주요 구조 단백질 밴드를 특이적으로 식별할 수 있었지만, 음성 대조군 균주 SE1H-pBR322의 열추출 산물은 식별할 수 없었다. 상기 결과는 마찬가지로 재조합균 SE1H-K88ac 균주 표면에 소 유래 대장균 K88ac 항원 인자가 발현 및 운반됨을 나타낸다.
실시예 6: 벡터균 대장균 벡터 SE1H 균체 표면의 인간 유래 살모넬라 항원 인자 I의 발현 및 운반 시험 검증
NCBI GenBank에 수록된 장염 살모넬라 NCTR380 균주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: NZ_NQWN00000000.1), 장염 살모넬라 219/11 균주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: NZ_QRCP00000000.1), 장염 살모넬라 BCW_4356 균주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: NZ_MYTC00000000.1), 장염 살모넬라 92-0392 균주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: NZ_CP018657.1) 및 장염 살모넬라 N152 균주 전체 게놈 서열(NCBI 등록 번호: NZ_PHGY00000000.1) 중 공표된 전장 게놈 서열에 따라, 항원 인자 I(I형 핌브리아)의 인간 유래 살모넬라 오페론 Fim 유전자의 전장 단편을 검색하여 PCR 증폭 프라이머를 설계하고, 업스트림 및 다운스트림 프라이머 5' 말단에 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 NheI 효소 절단 부위와 보호 염기를 추가하며, 이는 각각 FimA-H UP1: 5' -AT GAA AAT TAA AAC TCT GG- 3', FimA-H LO1: 5'- TTA TTG ATA AAC AAA AGT CAC- 3'，이다. 인간 유래 장염 살모넬라 참고 균주 C50336 염색체 DNA 템플릿으로, 독일 Roch사의 Long PCR 고충실도 DNA 중합효소를 사용하며, PCR 증폭 산물은 아가로스 겔 회수 키트로 회수 및 정제하였다. 플라스미드 추출 키트를 이용하여 pBR322 발현 플라스미드를 추출하고, 각각 pBR322 플라스미드 및 오페론 fim 유전자 증폭 산물에 대해 아가로스 겔 전기영동 및 관찰 동정을 수행하며, 아가로스 겔 회수 산물은 BamHI 및 NheI 이중 효소 절단하고, 페놀/클로로포름으로 추출하며, 에탄올 침전 및 정제를 수행한 후, 3:1의 비율로 동시에 이중 효소 절단된 PCR 증폭 산물을 pBR322 플라스미드와 혼합하고(pBR322 -I), 16℃에서 T4 DNA 리가제를 이용해 밤새 연결하고, 벡터균 대장균 SE1H 컴피턴트 세포로 전기형질전환하였다. 구체적인 조작은 다음과 같다. 즉, 2μL의 I-pBR322 플라스미드 혼합물을 취하여 40μL의 SE1H 전기형질전환 컴피턴트 세포와 혼합하고, 4℃ 얼음조에 30분 동안 거치하며, 상기 혼합물을 Bio-Rad 전극 컵에 넣고, 전기형질전환 후 신속하게 산물을 1 mL로 SOC 배지에 흡입시켰다. 37℃에서 4시간 동안 진탕한 후, 4000rpm으로 10분 동안 원심분리하고 상청액을 버리고 바닥에 약간의 액체를 남겨 암피실린 평판에 재현탁하고 37℃에서 배양하여 가정 양성 재조합 벡터균 대장암 SE1H-I 콜로니를 선별하였다. 재조합 플라스미드를 추출하여 BamHI 및 NheI 단일 효소 절단 및 이중 효소 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동 및 관찰 감정을 거치고, 재조합 플라스미드 pBR322-I DNA 시퀀싱 검증을 수행하였다.
pBR322-I를 포함하는 재조합 벡터균 SE1H-I 단일 콜로니를 선택하여 100μg/mL 암피실린 함유 LB 배지에 접종하고 37℃에서 밤새 진탕 배양하고 10μL 균액을 취하여 각각 동일한 양의 마우스 항-I 항원 인자(I형 핌브리아)의 다중 항체 혈청(실험실 자체 제작)과 잘 혼합하고, 응집 시험 반응에 따라 빛 아래에서 관찰하였다. 결과에 따르면, 재조합균 및 장염 살모넬라 참고 균주 C50336는 모두 마우스 항-I 항원 인자(I형 핌브리아) 다중 항체 혈청과 현저한 응집 반응을 일으킬 수 있는 것으로 나타났다. 음성 대조군 균주 SE1H-pBR322 응집 시험 반응은 음성이었다(도 11). 상기 응집 시험 반응 결과에 따르면, 재조합 벡터균 대장균 SE1H-I 균체는 표면에 인간 유래 살모넬라 항원 인자 I를 발현 및 운반하는 것으로 나타났다.
pBR322-I의 재조합 벡터 SE1H-I 단일 콜로니를 선택하여 100μg/mL 암피실린 함유 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 밤새 진탕 배양한 후 단일 콜로니를 선택하여 LB와 암피실린 내성 LB 액체 배지에 접종하였다. 37℃에서 12시간 동안 진탕 배양하고 블라인드 2대 계대 배양한 후, 소량 균액을 취하여 LB 및 암피실린 내성 LB 액체 배지에 접종하여 48시간 동안 정치시키고, 10,000rpm으로서 2분 동안 원심분리하고, 멸균 PBS로 재현탁 및 침전시키며, 소량의 균액을 흡인하여 음성 염색을 수행한 후 투과전자현미경으로 관찰하였다. 네덜란드 Philips Tecnai 12 투과전자현미경을 이용한 관찰, 촬영 및 결과에 따르면, 재조합 벡터균 SE1H-I가 표면에 I 항원 성분(I형 핌브리아)을 발현 및 운반하는 반면, 음성 대조군 균주 SE1H-PBR322 표면에는 I 항원 인자 성분(I형 핌브리아)이 거의 보이지 않았으며, 이는 도 12에 도시된 바와 같다.
중국미생물균종기탁관리위원회 일반미생물센터 CGMCC17339 20190318 중국미생물균종기탁관리위원회 일반미생물센터 CGMCC20914 20201019
SEQUENCE LISTING <110> YANGZHOU UNIVERSITY <120> GENERIC INERT CARRIER ESCHERICHIA COLI AND POTENTIAL USE THEREOF <160> 8 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> p-F(Artificial Sequence) <400> 1 atgaaacgtt cacttattcc tcctt 25 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> p-R(Artificial Sequence) <400> 2 ttaattataa gataccacca tta 23 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> FanBamUP (PBR)(Artificial Sequence) <400> 3 cacggatcct ggagaatcta gatgaaaaaa acact 35 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> FanSalLO (PBR)(Artificial Sequence) <400> 4 cgcgtcgact catataaatg ttacagtcac aggaagt 37 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> F(Artificial Sequence) <400> 6 caggctagca tgaaaaaagc attcttat 28 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> R(Artificial Sequence) <400> 6 cgggatcctc agaaatacac caccaccggt gtc 33 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> FimA-H UP1(Artificial Sequence) <400> 7 atgaaaatta aaactctgg 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> FimA-H LO1(Artificial Sequence) <400> 8 ttattgataa acaaaagtca c 21

Claims (10)

  1. 일반형 불활성 벡터 대장균에 있어서,
    상기 일반형 불활성 벡터 대장균은 불활성 벡터균 SE1을 LB 액체와 고체 배지를 사용하여 연속으로 체외에서 40대 내지 60대 계대 배양하여 획득한 균주를 일반형 불활성 벡터 대장균 SE1H라고 명명하며, 상기 SE1 기탁 번호는 CGMCC No.17339인 것을 특징으로 하는 일반형 불활성 벡터 대장균.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 획득 방법 단계는, 불활성 벡터 SE1를 LB 액체와 고체 배지를 사용하여 연속으로 체외에서 40대 내지 60대 계대 배양하여 일반형 불활성 벡터 대장균 SE1H를 획득할 수 있는 것을 특징으로 하는 일반형 불활성 벡터 대장균.
  3. 일반형 불활성 벡터 간접 응집 시험 검출 시스템에 있어서,
    상기 검출 시스템은 제1항에 따른 일반형 불활성 벡터 대장균 및 그 균체 표면에 발현하고 특정 항원 인자를 휴대할 수 있는 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 시스템.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 특정 항원 인자는 조류 유래 살모넬라 P 인자, 돼지 유래 대장균 K88ac 항원 인자, 소 유래 대장균 K99 항원 인자 또는 인간 유래 살모넬라 I 항원 인자 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 검출 시스템.
  5. 제3항 또는 제4항에 따른 일반형 불활성 벡터 간접 응집 시험 검출 시스템의 구축 방법에 있어서,
    1) 특정 항원 인자의 코딩 유전자를 획득하는 단계;
    2) 특정 항원 인자의 코딩 유전자와 플라스미드를 연결하여 재조합 플라스미드를 획득하는 단계; 및
    3) 재조합 플라스미드를 SE1H 전기형질전환 컴피턴트 세포로 형질전환시키고 수득한 재조합 균주를 일반형 불활성 벡터 간접 응집 시험 검출 시스템으로 감정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 일반형 불활성 벡터 간접 응집 시험 검출 시스템의 구축 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단계 1)에서 특정 항원 인자의 코딩 유전자는 조류 유래 살모넬라 P 인자의 코딩 유전자, 돼지 유래 대장균 K88ac 항원 인자의 코딩 유전자, 소 유래 대장균 K99 항원 인자의 코딩 유전자 또는 인간 유래 살모넬라 I 항원 인자의 코딩 유전자인 것을 특징으로 하는 일반형 불활성 벡터 간접 응집 시험 검출 시스템의 구축 방법.
  7. 항원 검출 간접 응집 시험 중의 불활성 벡터 제조 또는 항원 검출 간접 응집 시험 중의 불활성 벡터 제조에서 제1항에 따른 일반형 불활성 벡터 대장균 또는 제3항에 따른 검출 시스템의 응용.
  8. 항원 또는 항체 검출의 간접 응집 시험용 시약 또는 키트 제조에서 제1항에 따른 일반형 불활성 벡터 대장균 또는 제3항에 따른 검출 시스템의 응용.
  9. 인간 유래, 소 유래, 돼지 유래, 쥐 유래 또는 조류 유래 관련 병원성 감염 검출용 시약 또는 키트 제조에서 제1항에 따른 일반형 불활성 벡터 대장균 또는 제3항에 따른 검출 시스템의 응용.
  10. 제1항에 따른 일반형 불활성 벡터 대장균 또는 제3항에 따른 검출 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
KR1020227002867A 2020-05-19 2020-12-28 일반형 불활성 벡터 대장균 및 그 잠재적 응용 KR20220038687A (ko)

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