KR20090112719A - Ｌ-아미노산을 생산하는 미생물 및 ｌ-아미노산의 제조법 - Google Patents

Ｌ-아미노산을 생산하는 미생물 및 ｌ-아미노산의 제조법 Download PDF

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Abstract

L-아미노산 생산능을 가지며, kdp 시스템이 증강하도록 개변된 장내세균과에 속하는 미생물을 배지에서 배양하여 L-아미노산을 당해 배지중 또는 균체내에 생성 축적시키고, 당해 배지 또는 균체로부터 L-아미노산을 회수함으로써, L-아미노산을 제조한다.
L-아미노산의 제조법, L-아미노산 생산균, L-아미노산 생산능, kdp 시스템, kdp 오페론

Description

Ｌ-아미노산을 생산하는 미생물 및 Ｌ-아미노산의 제조법{Microorganism capable of producing L-amino acid, and method for production of L-amino acid}
본 발명은 미생물을 사용한 L-아미노산의 제조법, 특히 L-글루탐산, L-리신, L-트레오닌, L-트립토판 등의 L-아미노산의 제조법에 관한 것이다. L-글루탐산은 조미료로서, L-리신, L-트레오닌, L-트립토판은 동물 사료용의 첨가물, 건강 식품의 성분 또는 아미노산 수액 등으로서, 산업상 유용한 L-아미노산이다.
L-아미노산은, 여러 가지 미생물을 사용한 발효법에 의해 공업 생산되고 있다. 예를 들면, L-글루탐산은, 주로 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 마이크로박테리움속에 속하는 소위 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산균 또는 이들의 변이주를 사용한 발효법에 의해 제조되고 있다[참조: 비특허문헌 1]. 그 밖의 미생물을 사용한 발효법에 의한 L-글루탐산의 제조법으로서는, 바실러스속, 스트렙토마이세스속, 페니실리움속 등의 미생물[참조: 특허문헌 1], 슈도모나스속, 아스로박터속, 세라티아속, 칸디다속 등의 미생물[참조: 특허문헌 2], 바실러스속, 슈도모나스속, 세라티아속, 아에로박터 아에로게네스(현 엔테로박터 아에로게네스) 등의 미 생물[참조: 특허문헌 3], 에세리키아 콜라이의 변이주[참조: 특허문헌 1] 등을 사용하는 방법이 알려져 있다. 또한, 클렙시엘라속, 에르비니아속 또는 판토에아속, 엔테로박터속에 속하는 미생물을 사용한 L-글루탐산의 제조법도 개시되어 있다[참조: 특허문헌 2 내지 4].
상기와 같은 미생물을 사용한 발효법에 의해서 L-아미노산 등의 목적 물질을 제조하기 위해서는, 야생형 미생물(야생주)을 사용하는 방법, 야생주로부터 유도된 영양 요구주를 사용하는 방법, 야생주로부터 여러 가지 약제 내성 변이주로서 유도된 대사 조절 변이주를 사용하는 방법, 영양 요구주와 대사 조절 변이주의 양자의 성질을 가진 주를 사용하는 방법 등이 있다.
또한, 최근에는 목적 물질의 발효 생산에, 재조합 DNA 기술을 사용하는 것이 이루어지고 있다. 예를 들면, L-아미노산 생합성계 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증강시키는 것[참조: 특허문헌 5, 특허문헌 6], 또는 L-아미노산 생합성계로의 탄소원의 유입을 증강시키는 것[참조: 특허문헌 7]에 의해, 미생물의 L-아미노산 생산성을 향상시키는 것이 이루어지고 있다.
kdp 시스템은 칼륨이온 도입에 작용하는 P형 ATPase이다[참조: 비특허문헌 2]. kdp 시스템은, kdp 오페론에 의해 암호화되고, 배지 중의 칼륨 이온이 저농도일 때, 또는 고침투압 하에서 배양했을 때에, 그 발현이 유도된다[참조: 비특허문헌 3]. 또한 본 발명은 2성분 제어계의 하나인 KdpD, KdpE에 의해 제어되는 것이 알려져 있다[참조: 비특허문헌 4]. 그러나 지금까지 kdp 시스템 강화와 L-아미노산 생산의 관계에 관해서는 조사되고 있지 않다.
특허문헌 1: 일본 공개특허공보 제(평)5-244970호
특허문헌 2: 미국 특허 제3,563,857호 명세서
특허문헌 3: 일본 특허공보 제(소)32-9393호
특허문헌 4: 일본 공개특허공보 2000-189175호
특허문헌 5: 미국 특허 제5168056호 명세서
특허문헌 6: 미국 특허 제5776736호 명세서
특허문헌 7: 미국 특허 제5906925호 명세서
비특허문헌 1: 아카시 쿠니히코저, 아미노산 발효, 학회출판센터, 195~215페이지, 1986년
비특허문헌 2: Laimonis A. Laimins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978 July; 75(7): 3216-19.
비특허문헌 3: Laimonis A. Laimins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981 Jan; 78(1): 464-68.
비특허문헌 4: Mark O. Walderhaug, J. Bacteriol., 1992 Apr.; 174(7): 2152-59.
[발명의 개시]
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은 L-아미노산을 효율적으로 생산할 수 있는 장내세균과에 속하는 미생물을 제공하는 것, 및 당해 미생물을 사용하여 L-아미노산을 효율적으로 생산하 는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, kdp 시스템이 증강된 미생물을 사용함으로써, L-아미노산을 효율적으로 제조할 수 있는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) L-아미노산 생산능을 가지며, kdp 시스템이 증강하도록 개변된 장내세균과에 속하는 미생물.
(2) kdp 오페론 또는 당해 오페론을 구성하는 1 또는 2 이상의 유전자의 발현량을 증대시키는 것, 및/또는, kdp 오페론 또는 상기 유전자의 해독량을 증대시킴으로써, kdp 시스템이 증강된 상기 미생물.
(3) kdp 오페론 또는 당해 오페론을 구성하는 1 또는 2 이상의 유전자의 카피수를 높이는 것, 당해 오페론의 발현 조절 서열을 개변함으로써, kdp 시스템이 증강된 상기 미생물.
(4) kdp 오페론이, 적어도 kdpA 유전자, kdpB 유전자, 및 kdpC 유전자를 포함하는, 상기 미생물.
(5) kdpA 유전자가, 서열번호 2 또는 8에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열번호 2 또는 8에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, kdp 시스템의 A 서브유니트를 암호화하는 유전자인, 상기 미생물.
(6) kdpB 유전자가, 서열번호 3 또는 9에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열번호 3 또는 9에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, kdp 시스템의 B 서브유니트를 암호화하는 유전자인, 상기 미생물.
(7) kdpC 유전자가, 서열번호 4 또는 10에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열번호 4 또는 10에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, kdp 시스템의 C 서브유니트를 암호화하는 유전자인, 상기 미생물.
(8) 상기 kdp 오페론이, 하기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에 기재된 DNA인, 상기 미생물:
(a) 서열번호 1의 염기 번호 546 내지 4871에 나타내는 염기 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호 1의 염기 번호 546 내지 4871에 나타내는 염기 서열 또는 당해 염기 서열로부터 조제될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, kdp 시스템을 암호화하는 DNA.
(c) 서열번호 7의 염기 번호 543 내지 4853에 나타내는 염기 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호 7의 염기 번호 543 내지 4853에 나타내는 염기 서열 또는 당해 염기 서열로부터 조제될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, kdp 시스템을 암호화하는 DNA.
(9) 상기 L-아미노산이 L-글루탐산, L-리신, L-트레오닌, L-아르기닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-발린, L-류신, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판, 및 L-시스테인으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 L-아미노산인 상기 미생물.
(10) 상기 장내세균과에 속하는 미생물이, 에세리키아속 세균, 엔테로박터속 세균 또는 판토에아속 세균인 상기의 미생물.
(11) 상기 미생물을 배지에서 배양하고, L-아미노산을 당해 배지 중 또는 균체 내에 생성 축적시키고, 당해 배지 또는 균체로부터 L-아미노산을 회수하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 제조법.
(12) 상기 L-아미노산이 L-글루탐산, L-리신, L-트레오닌, L-아르기닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-발린, L-류신, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판, 및 L-시스테인으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 L-아미노산인, 상기 방법.
도 1은 헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER의 구조를 도시하는 도면.
도 2는 헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER의 구축을 도시하는 도면.
도 3은 LacZ 유전자의 상류의 피.아나나티스(P. ananatis)의 염색체 영역의 구조를 도시하는 도면.
도 4는 kdp 오페론 프로모터 치환주의 산성 조건에서의 시험관 배양에 있어 서의 생육을 도시하는 도면.
도 5는 kdp 오페론 프로모터 치환주의 L-글루탐산 생산성을 도시하는 도면.
도 6은 판토에아 아나나티스(서열번호 8)와 에세리키아 콜라이(서열번호 2)의 KdpA의 아미노산 서열의 정렬과, 이들의 공통 서열(서열번호 57)을 도시하는 도면.
도 7은 판토에아 아나나티스(서열번호 9)와 에세리키아 콜라이(서열번호 3)의 KdpB의 아미노산 서열의 정렬과, 이들의 공통 서열(서열번호 58)을 도시하는 도면.
도 8은 판토에아 아나나티스(서열번호 10)와 에세리키아 콜라이(서열번호 4)의 KdpC의 아미노산 서열의 정렬과, 이들의 공통 서열(서열번호 59)을 도시하는 도면.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
<1> 본 발명의 미생물
본 발명의 미생물은, L-아미노산 생산능을 가지며, kdp 시스템이 증강하도록 개변된 장내세균과에 속하는 미생물이다. 여기에서, L-아미노산 생산능이란, 본 발명의 미생물을 배지 중에서 배양하였을 때에, 배지 중 또는 균체 내에 L-아미노산을 생성하고, 배지 중 또는 균체로부터 회수할 수 있을 정도로 축적하는 능력을 말한다. 또한, 본 발명의 미생물은 복수의 L-아미노산의 생산능을 갖는 것이라도 양호하다. L-아미노산의 생산능을 갖는 미생물로서는, 본래 L-아미노산의 생산능을 갖는 것이라도 양호하지만, 하기와 같은 미생물을, 변이법이나 재조합 DNA 기술을 이용하여, L-아미노산의 생산능을 갖도록 개변한 것이라도 양호하다.
L-아미노산의 종류는 특별히 제한되지 않지만, L-리신, L-오르니틴, L-아르기닌, L-히스티딘, L-시트룰린과 같은 염기성 아미노산, L-이소류신, L-알라닌, L-발린, L-류신, L-글리신과 같은 지방족 아미노산, L-트레오닌, L-세린과 같은 하이드록시모노아미노카복실산인 아미노산, L-프롤린과 같은 환식 아미노산, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판과 같은 방향족 아미노산, L-시스테인, L-시스틴, L-메티오닌과 같은 황 함유 아미노산, L-글루탐산, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-아스파라긴 등과 같은 산성 아미노산을 들 수 있고, 특히 L-글루탐산, L-리신, L-트레오닌, L-트립토판이 바람직하다. 본 발명의 미생물은 2종류 이상의 아미노산의 생산능을 갖는 것이라도 양호하다.
<1-1> L-아미노산 생산능의 부여
이하에, 미생물에 L-아미노산 생산능을 부여하는 방법 및 본 발명에서 사용할 수 있는 L-아미노산 생산능이 부여된 미생물을 예시한다. 단, L-아미노산 생산능을 갖는 한, 이들에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용하는 미생물로서는, 에세리키아속, 엔테로박터속, 판토에아속, 클렙시엘라속, 세라티아속, 에르비니아속, 살모네라속, 모르가넬라속 등, 장내세균과에 속하는 미생물로서, L-아미노산을 생산하는 능력을 갖는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터 베이스에 기재되어 있는 분류에 의해 장내세균과에 속하는 것을 이용할 수 있다 [참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347]. 개변에 사용하는 장내세균과의 친주로서는, 이 중에서도 에세리키아속 세균, 엔테로박터속 세균, 판토에아속 세균, 에르비니아속, 엔테로박터속, 또는 클렙시엘라속을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 에세리키아속 세균을 수득하기 위해서 사용하는 에세리키아속 세균의 친주로서는, 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는 Neidhardt 등의 저서[참조: Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p.2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt(ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.]에 열거한 것을 이용할 수 있다. 이 중에서는, 예를 들면 에세리키아 콜라이를 들 수 있다. 에세리키아 콜라이로서는 구체적으로는, 프로토 타입의 야생주 K12주 유래의 에세리키아 콜라이 W3110(ATCC 27325), 에세리키아 콜라이 MG1655(ATCC 47076) 등을 들 수 있다.
이들을 입수하기 위해서는, 예를 들면 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(주소 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)로부터 분양을 받을 수 있다. 즉 각 균주에 대응하는 등록번호가 부여되어 있고, 이 등록번호를 이용하여 분양을 받을 수 있다[참조: http://www.atcc.org/]. 각 균주에 대응하는 등록번호는, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션의 카탈로그에 기재되어 있다.
엔테로박터속 세균으로서는, 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) 등, 판토에아속 세균으로서는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)를 들 수 있다. 또한, 최근, 엔테로박터 아글로메란스는, 16S rRNA의 염기 서열 해석 등에 의해, 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans) 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis), 판토에아 스튜아르티(Pantoea stewartii)로 재분류되어 있는 것이 있다. 본 발명에 있어서는, 장내세균과로 분류되는 것이면, 엔테로박터속 또는 판토에아속 중 어느 것에 속하는 것이라도 양호하다.
특히, 판토에아속 세균, 에르비니아속 세균, 엔테로박터속 세균은, γ-프로테오박테리아로 분류되는 세균이고, 분류학적으로 매우 근연(近緣)하다[참조: J Gen Appl Microbiol 1997 Dec; 43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, p 1061-1067]. 최근, DNA-DNA 하이브리드화 실험 등에 의해, 엔테로박터속에 속하는 세균에는, 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans) 또는 판토에아 디스퍼사(Pantoea dispersa) 등으로 재분류되어 있는 것이 있다[참조: International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989; 39(3). p.337-345]. 또한, 에르비니아속에 속하는 세균에는 판토에아 아나나스(Pantoea ananas), 판토에아 스튜아르티로 재분류되어 있는 것이 있다[참조: International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993; 43(1), p.162-173].
엔테로박터속 세균으로서는, 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 유럽특허출원공개 952221호 명세서에 예시된 균주를 사용할 수 있다.
엔테로박터속의 대표적인 주로서, 엔테로박터 아글로메란스 ATCC12287주를 들 수 있다.
판토에아속 세균의 대표적인 균주로서, 판토에아 아나나티스, 판토에아 스튜아르티(Pantoea stewartii), 판토에아 아글로메란스, 판토에아 시트레아(Pantoea citrea)를 들 수 있다. 구체적으로는, 하기의 균주를 들 수 있다.
판토에아 아나나티스 AJ13355주(FERM BP-6614)[참조: 유럽특허출원공개 0952221호 명세서]
판토에아 아나나티스 AJ13356주(FERM BP-6615)[참조: 유럽특허출원공개 0952221호 명세서]
판토에아 아나나티스 AJ13601주(FERM BP-7207)[참조: 유럽특허출원공개 0952221호 명세서]
이러한 주는 분리된 당시에는 엔테로박터 아글로메란스라고 동정되었고, 엔테로박터 아글로메란스로서 기탁되었지만, 상기한 대로, 16S rRNA의 염기 서열 해석 등에 의해, 판토에아 아나나티스로 재분류되어 있다.
에르비니아속 세균으로서는, 에르비니아 아밀로보라, 에르비니아 카로토보라를 들 수 있고, 클렙시엘라속 세균으로서는, 클렙시엘라 플란티콜라를 들 수 있다. 구체적으로는, 하기의 균주를 들 수 있다.
에르비니아 아밀로보라 ATCC 15580주
에르비니아 카로토보라 ATCC 15713주
클렙시엘라 플란티콜라 A13399주(FERM BP-6600)[참조: 유럽특허출원공개 955368호 명세서]
클렙시엘라 플란티콜라 AJ13410주(FERM BP-6617)[참조: 유럽특허출원공개 955368호 명세서]
이하, 장내세균과에 속하는 미생물에 L-아미노산 생산능을 부여하는 방법, 또는 이들 미생물에 L-아미노산 생산능을 증강시키는 방법에 관해서 말한다.
L-아미노산 생산능을 부여하기 위해서는, 영양 요구성 변이주, 유사체 내성주 또는 대사 제어 변이주의 취득이나, L-아미노산의 생합성계 효소의 발현이 증강된 재조합주의 창제 등, 종래, 코리네형 세균 또는 에세리키아속 세균 등의 육종에 채용되어 온 방법을 적용할 수 있다[참조: 아미노산 발효, (주)학회출판센터, 1986년 5월 30일 초판 발행, 제77-100페이지]. 여기에서, L-아미노산 생산균의 육종에 있어서, 부여되는 영양 요구성, 유사체 내성, 대사 제어 변이 등의 성질은, 단독이라도 양호하며, 2종 또는 3종 이상이라도 양호하다. 또한, 발현이 증강되는 L-아미노산 생합성계 효소도, 단독이라도, 2종 또는 3종 이상이라도 양호하다. 또한, 영양 요구성, 유사체 내성, 대사 제어 변이 등의 성질의 부여와, 생합성계 효소의 증강이 조합되어도 양호하다.
L-아미노산 생산능을 갖는 영양 요구성 변이주, L-아미노산의 유사체 내성주, 또는 대사 제어 변이주를 취득하기 위해서는, 친주 또는 야생주를 통상의 변이 처리, 즉 X선이나 자외선의 조사, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 에틸메탄설포네이트(EMS) 등의 변이제 처리 등에 의해서 처리하여, 수득된 변이주 중에서, 영양 요구성, 유사체 내성, 또는 대사 제어 변이를 나타내고, L-아미노산 생산능을 갖는 것을 선택함으로써 수득할 수 있다.
이하, L-아미노산 생산균 또는 그 구축 방법을 예로서 나타낸다.
L-글루탐산 생산균
우선, L-아미노산 생산균으로서, L-글루탐산 생산균에 관해서 예시한다.
본 발명의 L-글루탐산 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 이.콜라이(E. coli) VL334thrC+[참조: EP 1172433] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이.콜라이 VL334(VKPM B-1641)는, thrC 유전자 및 ilvA 유전자에 변이를 갖는 L-이소류신 및 L-트레오닌 요구성주이다[참조: 미국특허 제4,278,765호]. thrC 유전자의 야생형 대립유전자는, 야생형 이.콜라이 K12주(VKPM B-7)의 세포에서 증식한 박테리오파지 P1를 사용하는 일반적 형질 도입법에 의해 도입되었다. 이 결과, L-이소류신 요구성의 L-글루탐산 생산균 VL334thrC+(VKPM B-8961)이 수득되었다.
세균에 L-글루탐산 생산능을 부여하는, 또는 세균의 L-글루탐산 생산능을 증강시키기 위한 개변 방법으로서는, 예를 들면, L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증강하도록 세균을 개변하는 방법을 들 수 있다.
L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소로서는, 예를 들면, 글루탐산 데하이드로게나제(이하, 「GDH」라고도 한다)(gdhA), 글루타민 신테타제(glnA), 글루탐산 신타제(gltAB), 이소시트르산 데하이드로게나제(icdA), 아코니트산 하이드라타제(acnA, acnB), 시트르산 신타제(이하, 「CS」라고도 말한다)(gltA), 메틸시트르산 신타제(이하「PRPC」라고도 한다)(prpC), 포스포에놀피루브산 카르복실라제(이하, 「PEPC」라고도 한다)(ppc), 피루브산 카르복실라제(pyc), 피루브산 데하이드로게나제(aceEF, lpdA), 피루브산 키나제(pykA, pykF), 포스포에놀피루브산 신타제(ppsA), 에놀라제(eno), 포스포글리세르 뮤타제(pgmA, pgmI), 포스포글리세린산 키나제(pgk), 글리세르알데히드-3-인산 데하이드로게나제(gapA), 트리오스인산 이소머라제(tpiA), 프럭토스비스인산 알돌라제(fbp), 포스포프럭토키나제(pfkA, pfkB), 글루코스인산 이소머라제(pgi) 등을 들 수 있다. 한편, 효소명 뒤의 괄호 안은 유전자명이다(이하의 기재에 있어서도 동일). 이러한 효소 중에서는, CS 또는 PRPC, PEPC 및 GDH 중 어느 1종 이상이 바람직하고, 3종 모두가 보다 바람직하다[참조: WO2006/051660호 팜플렛].
이하에, 목적 유전자의 발현이 증강하도록 세균을 개변하는 방법을 예시한다.
첫번째 방법은, 목적 유전자의 카피수를 높이는 방법이다. 예를 들면, 목적 유전자를 적당한 플라스미드 위에 클로닝하여, 수득된 플라스미드를 사용하여 숙주 세균을 형질전환함으로써, 당해 유전자의 카피수를 높일 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자로서 CS를 암호화하는 유전자(gltA 유전자) 또는 PRPC을 암호화하는 유전자(prpC 유전자), PEPC를 암호화하는 유전자(ppc 유전자), 및 GDH를 암호화하는 유전자(gdhA 유전자)를 사용하는 경우, 이들 유전자는 에세리키아속 세균, 및 코리네박테리움속 세균에 있어서, 이미 염기 서열이 밝혀져있기 때문에[참조: Biochemistry, 제22권, 5243 내지 5249페이지, 1983년; J. Biochem., 제95권, 909 내지 916페이지, 1984년; Gene, 제27권, 193 내지 199페이지, 1984년; Microbiology, 제140권, 1817 내지 1828페이지, 1994년; Mol. Gen. Genet., 제218권, 330 내지 339페이지, 1989년; Molecular Microbiology, 제6권, 317 내지 326페이지, 1992년], 각각의 염기 서열에 기초하여 프라이머를 합성하여, 장내세균과에 속하는 세균으로부터 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR법에 의해 취득하는 것이 가능하다.
형질전환에 사용하는 플라스미드로서는, 장내세균군에 속하는 세균 중에서 자율 복제 가능한 플라스미드, 예를 들면 pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29(pHSG, pSTV는 타카라바이오사로부터 입수 가능), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218(pMW는 닛폰진사로부터 입수 가능) 등을 들 수 있다. 또한, 플라스미드 대신에 파지 DNA를 벡터로서 사용해도 양호하다. 상기 CS 또는 PRPC, PEPC 및 GDH의 활성을 동시에 증강시키기 위한 플라스미드로서, gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자가 편입된 RSFCPG[참조: 유럽특허출원공개 제0952221호 명세서], 및 RSFCPG의 gltA 유전자를 prpC로 치환한 RSFPPG(실시예 참조)를 들 수 있다.
형질전환법으로서는, 예를 들면, 에세리키아 콜라이 K-12에 관해서 보고되어 있는 바와 같은, 수용균 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증가시키는 방법[참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159(1970)], 바실러스 서브틸리스에 관해서 보고되어 있는 바와 같은, 증식 단계의 세포로부터 컴피턴트 세포를 조제하여 DNA를 도입하는 방법[참조: Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E., Gene, 1, 153(1977)] 등을 들 수 있다.
또는, 바실러스 서브틸리스, 방선균류 및 효모에 관해서 알려져 있는 바와 같은, DNA 수용균의 세포를, 재조합 DNA를 용이하게 도입하는 프로토플라스트 또는 스페로플라스트의 상태로 하여 재조합 DNA를 DNA 수용균에 도입하는 방법[참조: Chang, S. and Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111(1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., Nature, 274, 398(1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929(1978)]도 응용할 수 있다. 또한, 전기펄스법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-207791호]에 의해서도, 미생물의 형질전환을 실시할 수도 있다.
유전자의 카피수를 높이는 것은, 목적 유전자를 미생물의 염색체 DNA 위에 다카피 도입함으로써도 달성할 수 있다. 미생물의 염색체 DNA 위에 유전자를 다카피로 도입하기 위해서는, 염색체 DNA 위에 다카피 존재하는 서열을 표적으로 이용하여, 상동 재조합법[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)]에 의해 실시할 수 있다. 염색체 DNA 위에 다카피 존재하는 서열로서는, 반복성 DNA, 전이 인자의 말단부에 존재하는 역반복(inverted repeat)을 이용할 수 있다. 또는, 일본 공개특허공보 제(평)2-109985호에 개시되어 있는 바와 같이, 목적 유전자를 트랜스포존에 탑재하고 이것을 전이시켜 염색체 DNA 위에 다카피 도입하는 것도 가능하다. 또한, Mu 파지를 사용하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-109985호]으로 숙주 염색체에 목적 유전자를 도입할 수도 있다.
두번째 방법은, 염색체 DNA 위 또는 플라스미드 위에 있어서, 목적 유전자의 프로모터 등의 발현 조절 서열을 보다 강력한 것으로 치환함으로써 목적 유전자의 발현을 증강시키는 방법이다. 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, PR 프로모터, lacUV 프로모터 등의 강력한 프로모터로서 알려져 있다. 또한, 국제공개 WO00/18935에 개시되어 있는 바와 같이, 유전자의 프로모터 영역에 수 염기의 염기 치환을 도입하여, 보다 강력한 것으로 개변하는 것도 가능하다. 프로모터 강도의 평가법 및 강력한 프로모터의 예는, Goldstein 등의 논문[참조: Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128] 등에 기재되어 있다.
발현 조절 서열의 치환은, 예를 들면, 온도 감수성 플라스미드를 사용한 유전자 치환과 동일하게 하여 실시할 수 있다. 본 발명의 장내세균과에 속하는 세균에 사용할 수 있는 할 수 있는 온도 감수성 복제 기점을 갖는 벡터로서는, 예를 들면 WO99/03988호 국제공개 팜플렛에 기재된 플라스미드 pMAN997 등을 들 수 있다.
또한, 리보솜 결합 부위(RBS)와 개시 코돈간의 스페이서, 특히 개시 코돈의 바로 상류의 서열에 있어서의 수개의 뉴클레오타이드의 치환이 mRNA의 해독 효율에 매우 영향을 미치는 것이 알려져 있고, 이들을 개변함으로써, 해독량을 향상시키는 것이 가능하다.
또한, 발현 조절 서열의 개변은, 상기한 바와 같은 유전자의 카피수를 높이는 방법과 조합해도 양호하다.
상기와 같은 유전자 치환을 실시하는 방법으로서는, 예를 들면「Red 드리븐 통합(Red-driven integration)」이라고 불리는 방법[참조: Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645(2000)]이나, Red 드리븐 통합법과 λ파지 유래의 절단 시스템[참조: Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203(2002)]을 조합한 방법[참조: WO2005/010175호] 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법이나, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드, 접합 전달 가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주 내에서 복제 기점을 갖지 않는 자살 벡터를 이용하는 방법 등이 있다[참조: 미국특허 제6303383호 명세서, 또는 일본 공개특허공보 제(평)05-007491호].
또한, Red 드리븐 통합에는, 참고예 1에 나타낸 바와 같이, λRed 유전자 산물에 내성인 균주, 예를 들면 판토에아 아나나티스 SC17(0)주를 적합하게 사용할 수 있다. 당해 주는, 2005년 9월 21에 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika)(주소: Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1)에 수탁번호 VKPM B-9246 하에 기탁되어 있다.
이상과 같은 방법에 의해 시트르산 신타제 유전자, 메틸시트르산 신타제 유전자, 포스포에놀피루베이트카르복실라제 유전자, 및/또는 글루탐산 데하이드로게나제 유전자의 발현이 증강되도록 개변된 미생물로서는, 일본 공개특허공보 제(평)2001-333769호, 일본 공개특허공보 2000-106869호, 일본 공개특허공보 2000-189169호, 일본 공개특허공보 2000-333769호, 일본 공개특허공보 2006-129840호, 국제공개 2006/051660호 팜플렛 등에 기재된 미생물을 예시할 수 있다.
또한, L-글루탐산 생산능은, 6-포스포글루콘산 데하이드라타제 활성 또는 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루콘산 알돌라제 활성, 또는 이들 양자의 활성을 증강시킴으로써도 부여할 수 있다. 6-포스포글루콘산 데하이드라타제 활성, 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루콘산 알돌라제 활성을 상승시킨 미생물로서는, 일본 공개특허공보 2003-274988호에 개시된 미생물을 들 수 있다.
L-글루탐산 생산능을 부여 또는 증강시키기 위한 개변은, L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기하여 다른 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 저하 또는 결손시킴으로써 실시해도 양호하다. L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기하여 L-글루탐산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로서는, 2-옥소글루타르산 데하이드로게나제(α-케토글루타레이트 데하이드로게나제)(sucA), 이소시트르산 리아제(aceA), 인산아세틸 트랜스퍼라제(pta), 아세트산 키나제(ack), 아세트하이드록시산 신타제(ilvG), 아세트락트산 신타제(ilvI), 포름산아세틸 트랜스퍼라제(pfl), 락트산 데하이드로게나제(ldh), 글루탐산 데카르복실라제(gadAB), 1-피롤린-5-카르복실레이트 데하이드로게나제(putA) 등을 들 수 있다. 이 중에서는 특히, 2-옥소글루타르산 데하이드로게나제 활성을 저하 또는 결손시키는 것이 바람직하다.
상기와 같은 효소의 활성을 저하 또는 결손시키기 위해서는, 통상의 변이 처리법에 의해서, 또는 유전자 공학적 수법에 의해서, 상기 효소의 유전자에, 세포 중의 당해 효소의 활성이 저하 또는 결손되는 변이를 도입하면 양호하다. 변이 처리법으로서는, 예를 들면 X선이나 자외선을 조사하는 방법, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등의 변이제로 처리하는 방법 등이 있다. 유전자에 변이가 도입되는 부위는, 효소 단백질을 암호화하는 암호화 영역이라도 양호하며, 프로모터 등의 발현 제어 영역이라도 양호하다. 또한, 유전자 공학적 수법에는, 예를 들면 유전자 재조합법, 형질 도입법, 세포 융합법 등을 사용하는 방법이 있다.
세포 중의 목적 효소의 활성이 저하 또는 결손되어 있는 것, 및 활성의 저하의 정도는, 후보주의 균체 추출액 또는 정제 분획의 효소 활성을 측정하여, 야생주와 비교함으로써 확인할 수 있다. 예를 들면, 2-옥소글루타르산 데하이드로게나제 활성은, Reed 등의 방법[참조: L. J. Reed and B. B. Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61]에 따라서 측정할 수 있다.
2-옥소글루타르산 데하이드로게나제 활성이 결손된, 또는, 2-옥소글루타르산 데하이드로게나제 활성이 저하된 에세리키아속에 속하는 세균으로서는, 이하의 균주를 들 수 있다[참조: 미국특허 제5,378,616호 및 제5,573,945호].
에세리키아 콜라이 W3110sucA::Kmr
에세리키아 콜라이 AJ12624(FERM BP-3853)
에세리키아 콜라이 AJ12628(FERM BP-3854)
에세리키아 콜라이 AJ12949(FERM BP-4881)
에세리키아 콜라이 W3110sucA::Kmr는, 에세리키아 콜라이 W3110의 2-옥소글루타르산 데하이드로게나제 유전자(sucA 유전자)를 파괴함으로써 수득된 주이다. 당해 주는 2-옥소글루타르산 데하이드로게나제를 완전히 결손하고 있다.
2-옥소글루타르산 데하이드로게나제 활성이 결손 또는 저하된 다른 세균으로서는, 구체적으로는 다음과 같은 주를 들 수 있다.
판토에아 아나나티스 AJ13601(FERM BP-7207 유럽특허공개 명세서 1078989)
판토에아 아나나티스 AJ13356(FERM BP-6615 미국특허 6,331,419호)
판토에아 아나나티스 SC17sucA(FERM BP-8646 국제공개 팜플렛 WO2005/085419호]
클렙시엘라 플란티콜라 AJ13410(FERM BP-6617 미국특허 6,197,559호]
또한, SC17sucA 주는, 낮은 pH에서 L-글루탐산 및 탄소원을 포함하는 배지에서 증식할 수 있는 주로서 자연계로부터 분리된 AJ13355주로부터, 점액질 저생산 변이주(SC17)를 취득하여, 당해 주의 2-옥소글루타르산 데하이드로게나제 유전자(sucA)를 파괴함으로써 수득된 주이다. AJ13601는, 당해 SC17sucA 주에, 에세리키아 콜라이유래의 gltA, ppc, gdhA의 각 유전자를 포함하는 플라스미드 RSFCPG, 및 브레비박테리움 락토퍼멘텀 유래의 gltA 유전자를 포함하는 플라스미드 pSTVCB를 도입하여 수득한 주 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 주로부터, 또한, 낮은 pH에서의 고농도 L-글루탐산 내성주의 선택, 및 증식도 및 L-글루탐산 생산능이 높은 주의 선택에 의해서, 취득된 균주이다[참조: 유럽특허출원공개 0952221호 명세서]. AJ13356는, AJ13355주의 α KGDH-E1 서브유니트 유전자(sucA)를 결손시킨 주이다. 또한, 실시예에 기재한 NP106주는, AJ13601주로부터 플라스미드 RSFCPG+pSTVCB를 탈락시킨 주이다.
AJ13355주 및 AJ13356주는, 평성 10년 2월 19일에, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현명칭, 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 주소 우편번호 305-8566 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 츄오 다이6)에, 각각 수탁번호 FERM P-16644, 및 FERM P-16645로서 기탁되었고, 평성 11년 1월 11일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되어, 수탁번호 FERM BP-6614, 및 FERM BP-6615가 부여되어 있다. SC17sucA 주는, 개별번호 AJ417이 부여되었고, 평성 16년 2월 26일에 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(우편번호 305-8566 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 츄오 다이6)에 수탁번호 FERM BP-08646으로서 기탁되어 있다. AJ13601주는, 1999년 8월 18일에, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현명칭, 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 주소 우편번호 305-8566 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 츄오 다이 6)에 수탁번호 FERM P-17516으로서 기탁되었고, 2000년 7월 6일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되어 수탁번호 FERM BP-7207이 부여되어 있다.
상기 판토에아 아나나티스 AJ13355주, AJ13356주, AJ13601주, 및 상기의 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399주는, 산성 조건하에서 배양했을 때에 액체 배지 중에 L-글루탐산의 포화 농도를 초과하는 양의 L-글루탐산을 축적하는 능력을 갖는다.
또한, 장내세균과의 L-글루탐산 생산능을 향상시키기 위해서는, arcA 유전자를 결손시키는 방법[참조: 미국특허 7,090,998호], 글루탐산 배출 유전자인 yhfK 유전자를 증폭시키는 방법[참조: WO2005/085419 팜플렛]도 사용할 수 있다.
상기의 효소 활성을 증강 또는 결손시키는 방법은, 이하에 나타내는 다른 아미노산의 생산균에 관해서도, 동일하게 적용할 수 있다.
L-트레오닌 생산균
본 발명의 L-트레오닌 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 이.콜라이 TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)[참조: 미국특허 제5,175,107호, 미국특허 제5,705,371호], 이.콜라이 472T23/pYN7(ATCC 98081)[참조: 미국특허 제5,631,157호], 이.콜라이 NRRL-21593[참조: 미국특허 제5,939,307호], 이.콜라이 FERM BP-3756[참조: 미국특허 제5,474,918호], 이.콜라이 FERM BP-3519 및 FERM BP-3520[참조: 미국특허 제5,376,538호], 이.콜라이 MG442[참조: Gusyatiner et al., Genetika(in Russian), 14, 947-956(1978)), 이.콜라이 VL643 및 VL2055[참조: EP 1149911 A] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
TDH-6주는 thrC 유전자를 결손하고, 수크로스 자화성이고, 또한, 그 ilvA 유전자가 리키(leaky) 변이를 갖는다. 당해 주는 또한, rhtA 유전자에, 고농도의 트레오닌 또는 호모세린에 대한 내성을 부여하는 변이를 갖는다. B-3996주는, RSF1010 유래 벡터에, 변이 thrA 유전자를 포함하는 thrA*BC 오페론을 삽입한 플라스미드 pVIC40를 보유한다. 당해 변이 thrA 유전자는, 트레오닌에 의한 피드백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화한다. B-3996주는, 1987년 11월 19일, 올유니온 사이언티픽 센터 오브 안티비오틱스[Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia]에, 수탁번호 RIA 1867로 기탁되어 있다. 당해 주는, 또한, 1987년 4월 7일, 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈[Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika)(1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia]에, 수탁번호 VKPM B-3996으로 기탁되어 있다.
이.콜라이 VKPM B-5318[참조: EP 0593792B]도, 본 발명의 L-트레오닌 생산균을 유도하기 위한 친주로서 사용할 수 있다. B-5318주는, 이소류신 비요구성이고, 플라스미드 pVIC40 중의 트레오닌 오페론의 제어 영역이, 온도 감수성 람다 파지 C1리프레서 및 PR 프로모터에 의해 치환되어 있다. VKPM B-5318는, 1990년 5월 3일, 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(VKPM)에, 수탁번호 VKPM B-5318로 기탁되어 있다.
바람직하게는, 본 발명의 세균은, 또한 하기의 유전자의 1종 이상의 발현이 증대하도록 개변된 것이다.
트레오닌에 의한 피드백 저해에 내성의 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화하는 변이 thrA 유전자
호모세린 키나제를 암호화하는 thrB 유전자
트레오닌 신타제를 암호화하는 thrC 유전자
추정 막관통 단백질을 암호화하는 rhtA 유전자
아스파르테이트-β-세미알데히드 데하이드로게나제를 암호화하는 asd 유전자
아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(아스파르테이트 트랜스아미나제)를 암호화하는 aspC 유전자
이.콜라이의 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화하는 thrA 유전자는 밝혀져 있다(뉴클레오타이드 번호 337 내지 2799, GenBank accession NC_000913.2, gi:49175990). thrA 유전자는, 이.콜라이 K-12의 염색체에 있어서, thrL 유전자와 thrB 유전자간에 위치한다. 이.콜라이의 호모세린 키나제를 암호화하는 thrB 유전자는 밝혀져 있다(뉴클레오타이드 번호 2801 내지 3733, GenBank accession NC_000913.2, gi:49175990). thrB 유전자는, 이.콜라이 K-12의 염색체에 있어서, thrA 유전자와 thrC 유전자간에 위치한다. 이.콜라이의 트레오닌 신타제를 암호화하는 thrC 유전자는 밝혀져 있다(뉴클레오타이드 번호 3734 내지 5020, GenBank accession NC_000913.2, gi:49175990). thrC 유전자는, 이.콜라이 K-12의 염색체에 있어서, thrB 유전자와 yaaX 개방 판독 프레임간에 위치한다. 이들 3가지 유전자는, 모두 단일 트레오닌 오페론으로서 기능한다. 트레오닌 오페론의 발현을 증대시키기 위해서는, 전사에 영향을 주는 어테뉴에이터 영역을, 바람직하게는, 오페론으로부터 제거한다[참조: WO2005/049808, WO2003/097839].
트레오닌에 의한 피드백 저해에 내성의 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화하는 변이 thrA 유전자, 및, thrB 유전자 및 thrC 유전자는, 트레오닌 생산주 이.콜라이 VKPM B-3996에 존재하는 주지의 플라스미드 pVIC40으로부터 하나의 오페론으로서 취득할 수 있다. 플라스미드 pVIC40의 상세한 것은, 미국특허 제5,705,371호에 기재되어 있다.
rhtA 유전자는, 글루타민 수송계의 요소를 암호화하는 glnHPQ 오페론에 가까운 이.콜라이 염색체의 18분에 존재한다. rhtA 유전자는, ORF1(ybiF 유전자, 뉴클레오타이드 번호 764 내지 1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)와 동일하고, pexB 유전자와 ompX 유전자간에 위치한다. ORF1에 의해 암호화되는 단백질을 발현하는 유니트는, rhtA 유전자라고 불리고 있다(rht: 호모세린 및 트레오닌에 내성). 또한, rhtA23 변이가, ATG 개시 코돈에 대하여 -1위치의 G→A 치환인 것이 판명되어 있다[참조: ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457, EP1013765 A].
이.콜라이의 asd 유전자는 이미 밝혀져 있고(뉴클레오타이드 번호 3572511 내지 3571408, GenBank accession NC-000913.1, gi:16131307), 그 유전자의 염기 서열에 기초하여 제작된 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수득할 수 있다[참조: White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)]. 다른 미생물의 asd 유전자도 동일하게 수득할 수 있다.
또한, 이.콜라이의 aspC 유전자도 이미 밝혀져 있고(뉴클레오타이드 번호 983742 내지 984932, GenBank accession NC-000913.1, gi:16128895), PCR에 의해 수득할 수 있다. 다른 미생물의 aspC 유전자도 동일하게 수득할 수 있다.
L-리신 생산균
에세리키아속에 속하는 L-리신 생산균의 예로서는, L-리신 유사체에 내성을 갖는 변이주를 들 수 있다. L-리신 유사체는 에세리키아속에 속하는 세균의 생육을 저해하지만, 이러한 저해는, L-리신이 배지에 공존할 때에는 완전히 또는 부분적으로 해제된다. L-리신 유사체의 예로서는, 옥사리신, 리신하이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC), γ-메틸리신, α-클로로카프로락탐 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 리신 유사체에 대하여 내성을 갖는 변이주는, 에세리키아속에 속하는 세균을 통상의 인공변이처리로 처리함으로써 수득할 수 있다. L-리신의 생산에 유용한 세균주의 구체예로서는, 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) AJ11442[참조: FERM BP-1543, NRRL B-12185; 미국특허 제4,346,170호] 및 에세리키아 콜라이 VL611를 들 수 있다. 이러한 미생물에서는, 아스파르토키나제의 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제되어 있다.
WC196주는, 에세리키아 콜라이의 L-리신 생산균으로서 사용할 수 있다. 당해 균주는, 에세리키아 콜라이 K-12에 유래하는 W3110주에 AEC 내성을 부여함으로써 육종되었다. 당해 주는, 에세리키아 콜라이 AJ13069라고 명명되어, 1994년 12월 6일, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 우편 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 츄오 다이6)에 수탁번호 FERM P-14690으로서 기탁되었고, 1995년 9월 29일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되고, 수탁번호 FERM BP-5252가 부여되어 있다[참조: 미국특허 제5,827,698호].
본 발명의 L-리신 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-리신 생합성계 효소를 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대하고 있는 주도 들 수 있다. 이러한 유전자의 예로서는, 디하이드로디피콜린산 신타제 유전자(dapA), 아스파르토 키나제 유전자(lysC), 디하이드로디피콜린산 리덕타제 유전자(dapB), 디아미노피멜산 데카르복실라제 유전자(lysA), 디아미노피멜산 데하이드로게나제 유전자(ddh)[참조: 미국특허 제6,040,160호], 포스포에놀피루브산 카르복실라제 유전자(ppc), 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd) 및 아스파르타제 유전자(aspA)[참조: EP 1253195 A]를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 친주는, 에너지 효율에 관여하는 유전자(cyo)[참조: EP 1170376 A], 니코틴아미드 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제를 암호화하는 유전자(pntAB)[참조: 미국특허 제5,830,716호], ybjE 유전자[참조: WO2005/073390], 또는, 이들의 조합의 발현 수준이 증대하고 있어도 양호하다.
본 발명의 L-리신 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-리신의 생합성 경로로부터 분기하여 L-리신 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 저하 또는 결손되어 있는 주도 들 수 있다. L-리신의 생합성 경로로부터 분기하여 L-리신 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 예로서는, 호모세린 데하이드로게나제, 리신 데카르복실라제[참조: 미국특허 제5,827,698호], 및, 말산 효소[참조: WO2005/010175]를 들 수 있다.
L-시스테인 생산균
본 발명의 L-시스테인 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 피드백 저해 내성의 세린 아세틸 트랜스퍼라제를 암호화하는 복수종의 cysE 대립유전자로 형질전환된 이.콜라이 JM15[참조: 미국특허 제6,218,168호, 러시아특허출원 제2003121601호],세포에 독성의 물질을 배출하는 데 적합한 단백질을 암호화하는 과잉 발현 유전자를 갖는 이.콜라이 W3110[참조: 미국특허 제5,972,663호], 시스테인 데설포하이드라제 활성이 저하된 이.콜라이 주[참조: JP11155571A2], cysB 유전자에 의해 암호화되는 시스테인 레귤론의 양의 전사 제어 인자의 활성이 상승된 이.콜라이 W3110[참조: WO0127307A1] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
L-류신 생산균
본 발명의 L-류신 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 류신 내성의 E.coil 주(예를 들면, 57주(VKPM B-7386, 미국특허 제6,124,121호]) 또는 β-2-티에닐알라닌, 3-하이드록시류신, 4-아자류신, 5,5,5-트리플루오로류신 등의 류신 유사체 내성의 이.콜라이 주[참조: 일본 특허공보 제(소)62-34397호 및 일본 공개특허공보 제(평)8-70879호], WO96/06926에 기재된 유전자 공학적 방법으로 수득된 이.콜라이 주, 이.콜라이 H-9068[참조: 일본 공개특허공보 제(평)8-70879호] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 세균은, L-류신 생합성에 관여하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대되는 것에 의해 개량되어 있어도 양호하다. 이러한 유전자의 예로서는, 바람직하게는 L-류신에 의한 피드백 저해가 해제된 이소프로필말레에이트 신타제를 암호화하는 변이 leuA 유전자[참조: 미국특허 제6,403,342호]로 대표되는, leuABCD 오페론의 유전자를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은, 세균의 세포로부터 L-아미노산을 배출하는 단백질을 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대됨으로써 개량되어 있어도 양호하다. 이러한 유전자의 예로서는, b2682 유전자 및 b2683 유전자(ygaZH 유전자)[참조: EP1239041 A2]를 들 수 있다.
L-히스티딘 생산균
본 발명의 L-히스티딘 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 이.콜라이 24주(VKPM B-5945, RU2003677), 이.콜라이 80주(VKPM B-7270, RU2119536), 이.콜라이 NRRL B-12116-B12121[참조: 미국특허 제4,388,405호], 이.콜라이 H-9342(FERM BP-6675) 및 H-9343(FERM BP-6676)[참조: 미국특허 제6,344,347호], 이.콜라이 H-9341(FERM BP-6674)[참조: EP1085087], 이.콜라이 AI80/pFM201[참조: 미국특허 제6,258,554호] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 L-히스티딘 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-히스티딘생합성계 효소를 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대된 주도 들 수 있다. 이러한 유전자의 예로서는, ATP 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(hisG), 포스포리보실 AMP 사이클로하이드로라제 유전자(hisI), 포스포리보실 ATP 피로포스포하이드로라제 유전자(hisIE), 포스포리보실 포름이미노-5-아미노이미다졸 카르복사미드 리보타이드 이소머라제 유전자(hisA), 아미드 트랜스퍼라제 유전자(hisH), 히스티디놀포스페이트아미노트랜스퍼라제 유전자(hisC), 히스티디놀 포스파타제 유전자(hisB), 히스티디놀 데하이드로게나제 유전자(hisD) 등을 들 수 있다.
hisG 및 hisBHAFI로 암호화되는 L-히스티딘 생합성계 효소는 L-히스티딘에 의해 저해되는 것이 알려져 있고, 따라서, L-히스티딘 생산능은, ATP 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(hisG)에 피드백 저해에 대한 내성을 부여하는 변이를 도입함으로써 효율적으로 증대시킬 수 있다[참조: 러시아특허 제2003677호 및 제2119536호].
L-히스티딘 생산능을 갖는 주의 구체예로서는, L-히스티딘 생합성계 효소를 암호화하는 DNA를 유지하는 벡터를 도입한 이.콜라이 FERM-P 5038 및 5048[참조: 일본 공개특허공보 제(소)56-005099호], 아미노산 수송의 유전자인 rht를 도입한 이.콜라이 주[참조: EP1016710A], 설파구아니딘, DL-1,2,4-트리아졸-3-알라닌 및 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여한 이.콜라이 80주(VKPM B-7270, 러시아특허 제2119536호] 등을 들 수 있다.
L-페닐알라닌 생산균
본 발명의 L-페닐알라닌 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 이.콜라이 AJ12739(tyrA::Tn10, tyrR)(VKPM B-8197), 변이형 pheA34 유전자를 보유하는 이.콜라이 HW1089(ATCC 55371)[참조: 미국특허 제5,354,672호], 이.콜라이 MWEC101-b[참조: KR8903681], 이.콜라이 NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 및 NRRL B-12147[참조: 미국특허 제4,407,952호] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 친주로서, 이.콜라이 K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566), 이.콜라이 K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659), 이.콜라이 K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662) 및 AJ 12604라고 명명된 이.콜라이 K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB](FERM BP-3579)도 사용할 수 있다[참조: EP488424 B1]. 또한, yedA 유전자 또는 yddG 유전자로 암호화되는 단백질의 활성이 증대된 에세리키아속에 속하는 L-페닐알라닌 생산균도 사용할 수 있다[참조: 미국특허출원공개 2003/0148473 A1 및 2003/0157667 A1].
L-트립토판 생산균
본 발명의 L-트립토판 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 변이 trpS 유전자에 의해 암호화되는 트립토파닐 tRNA 신테타제가 결손된 이.콜라이 JP4735/pMU3028(DSM10122) 및 JP6015/pMU91(DSM10123)[참조: 미국특허 제5,756,345호], 세린에 의한 피드백 저해를 받지 않는 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 serA 대립유전자 및 트립토판에 의한 피드백 저해를 받지 않는 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 trpE 대립유전자를 갖는 이.콜라이 SV164(pGH5)[참조: 미국특허 제6,180,373호], 트립토파나제가 결손된 이.콜라이 AGX17(pGX44)(NRRL B-12263) 및 AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)[참조: 미국특허 제4,371,614호], 포스포에놀피루브산 생산능이 증대된 이.콜라이 AGX17/pGX50, pACKG4-pps[참조: WO9708333, 미국특허 제6,319,696호] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. yedA 유전자 또는 yddG 유전자로 암호화되는 단백질의 활성이 증대된 에세리키아속에 속하는 L-트립토판 생산균도 사용할 수 있다[참조: 미국특허출원공개 2003/0148473 A1 및 2003/0157667 A1].
본 발명의 L-트립토판 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 안트라닐레이트 신타제(trpE), 포스포글리세레이트 데하이드로게나제(serA), 및, 트립토판 신타제(trpAB)로부터 선택되는 효소의 활성의 1종 이상이 증대된 주도 들 수 있다. 안트라닐레이트 신타제 및 포스포글리세레이트 데하이드로게나제는 모두 L-트립토판 및 L-세린에 의한 피드백 저해를 받기 때문에, 피드백 저해를 해제하는 변이를 이들 효소에 도입해도 양호하다. 이러한 변이를 갖는 주의 구체예로서는, 탈감작형 안트라닐레이트 신타제를 보유하는 이.콜라이 SV164, 및, 피드백 저해가 해제된 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 변이 serA 유전자를 포함하는 플라스미드 pGH5[참조: WO94/08031]를 이.콜라이 SV164에 도입함으로써 수득된 형질전환주를 들 수 있다.
본 발명의 L-트립토판 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 해제형 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 트립토판 오페론이 도입된 주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)57-71397호, 일본 공개특허공보 제(소)62-244382호, 미국특허 제4,371,614호]도 들 수 있다. 또한, 트립토판 오페론(trpBA) 중의 트립토판 신타제를 암호화하는 유전자의 발현을 증대시킴으로써 L-트립토판 생산능을 부여해도 양호하다. 트립토판 신타제는, 각각 trpA 및 trpB 유전자에 의해 암호화되는 α 및 β 서브유니트로 이루어진다. 또한, 이소시트레이트 리아제-말레에이트 신타제 오페론의 발현을 증대시킴으로써 L-트립토판 생산능을 개량해도 양호하다[참조: WO2005/103275].
L-프롤린 생산균
본 발명의 L-프롤린 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, ilvA 유전자가 결손되고, L-프롤린을 생산할 수 있는 이.콜라이 702ilvA(VKPM B-8012)[참조: EP 1172433] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 세균은, L-프롤린 생합성에 관여하는 유전자의 1종 이상의 발현을 증대시킴으로써 개량해도 양호하다. L-프롤린 생산균에 바람직한 유전자의 예로서는, L-프롤린에 의한 피드백 저해가 해제된 글루타메이트 키나제를 암호화하는 proB 유전자[참조: 독일특허 제3127361호]를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은, 세균의 세포로부터 L-아미노산을 배출하는 단백질을 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대됨으로써 개량해도 양호하다. 이러한 유전자로서는, b2682 유전자 및 b2683 유전자(ygaZH 유전자)[참조: EP1239041 A2]를 들 수 있다.
L-프롤린 생산능을 갖는 에세리키아속에 속하는 세균의 예로서는, NRRL B-12403 및 NRRL B-12404[참조: 영국특허 제2075056호], VKPM B-8012[참조: 러시아특허출원 2000124295], 독일특허 제3127361호에 기재된 플라스미드 변이체, Bloom F. R. et al(The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)에 기재된 플라스미드 변이체 등의 이.콜라이 주를 들 수 있다.
L-아르기닌 생산균
본 발명의 L-아르기닌 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 이.콜라이 237주(VKPM B-7925)[참조: 미국특허출원공개 2002/058315 A1], 및, 변이 N-아세틸글루타메이트 신타제를 보유하는 이의 유도주[참조: 러시아특허출원 제2001112869호], 이.콜라이 382주(VKPM B-7926)[참조: EP1170358A1], N-아세틸글루타메이트 신테타제를 암호화하는 argA 유전자가 도입된 아르기닌 생산주[참조: EP1170361A1] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 L-아르기닌 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-아르기닌 생합성계 효소를 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대된 주도 들 수 있다. 이러한 유전자의 예로서는, N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제 유전자(argC), 오르니틴아세틸 트랜스퍼라제 유전자(argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제 유전자(argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제 유전자(argD), 오르니틴카르바모일 트랜스퍼라제 유전자(argF), 알기노석신산 신테타제 유전자(argG), 알기노석신산 리아제 유전자(argH), 카르바모일포스페이트 신테타제 유전자(carAB)를 들 수 있다.
L-발린 생산균
본 발명의 L-발린 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, ilvGMEDA 오페론을 과잉 발현하도록 개변된 주[참조: 미국특허 제5,998,178호]를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 어테뉴에이션에 필요한 ilvGMEDA 오페론의 영역을 제거하여, 생산되는 L-발린에 의해 오페론의 발현이 감쇠하지 않도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 오페론의 ilvA 유전자가 파괴되고, 트레오닌 데아미나제 활성이 감소되는 것이 바람직하다.
본 발명의 L-발린 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 아미노아실 t-RNA 신테타제의 변이를 갖는 변이주[참조: 미국특허 제5,658,766호]도 들 수 있다. 예를 들면, 이소류신 tRNA 신테타제를 암호화하는 ileS 유전자에 변이를 갖는 이.콜라이 VL1970을 사용할 수 있다. 이.콜라이 VL1970는, 1988년 6월 24일, 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(VKPM)[참조: 1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia]에, 수탁번호 VKPM B-4411로 기탁되어 있다.
또한, 생육에 리포산을 요구하는, 및/또는, H+-ATPase를 결실하고 있는 변이주[참조: WO96/06926]를 친주로서 사용할 수 있다.
L-이소류신 생산균
본 발명의 L-이소류신 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 6-디메틸아미노푸린에 내성을 갖는 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-304969호], 티아이소류신, 이소류신 하이드록사메이트 등의 이소류신 유사체에 내성을 갖는 변이주, 또한 DL-에티오닌 및/또는 아르기닌 하이드록사메이트에 내성을 갖는 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-130882호]를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 트레오닌 데아미나제, 아세트하이드록시산 신타제 등의 L-이소류신 생합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합주도 또한 친주로서 사용할 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-458호, FR 0356739, 및 미국특허 제5,998,178호].
<1-2> kdp 시스템의 증강
본 발명의 미생물은, 상기한 바와 같은 L-아미노산의 생산능을 갖는 장내세균과에 속하는 미생물을, kdp 시스템이 증강하도록 개변함으로써 수득할 수 있다. 단, kdp 시스템이 증강되도록 개변을 한 후에, L-아미노산의 생산능을 부여해도 양호하다.
또한, kdp 시스템의 증강은, 후술하는 바와 같이, kdp 오페론 또는 당해 오페론을 구성하는 1 또는 2 이상의 유전자의 발현량을 증대시키도록 개변함으로써 달성할 수 있고, 이러한 발현량의 증대는 프로모터 개변을 비롯한 발현 조절 영역 개변 등에 의한 내인성 유전자의 발현 증강이라도 양호하고, 오페론 또는 각 유전자를 포함하는 플라스미드의 도입 등에 의한 외인성 유전자의 발현 증강이라도 양호하다. 또한, 이들을 조합해도 양호하다. 또한, kdp 오페론 또는 당해 오페론을 구성하는 각 유전자의 해독량을 증대시킴으로써도, kdp 시스템을 증강시킬 수 있다.
본 발명에 있어서「kdp 시스템」이란, 칼륨 이온 도입계(high-affinity potassium transport system)에 작용하는 P형 ATPase(potassium-transporting P-type ATPase)을 의미한다(EC 3.6.3.12).
또한, 「kdp 시스템이 증강하도록 개변되었다」란, 상기 P형 ATPase에 의한 칼륨 이온 도입이 증강되는 것을 의미하고, 보다 구체적으로는 상기 P형 ATPase의 활성이 증강하도록 미생물이 개변된 것을 의미한다. 예를 들면, 야생주 또는 비개변주와 비교하여, 세포당의 P형 ATPase 분자의 수가 증가한 경우나, P형 ATPase 분자당의 활성이 상승한 경우가 해당한다. P형 ATPase 활성은 야생주 또는 비개변주와 비교하여, 균체당 150% 이상, 바람직하게는 200% 이상, 더욱 바람직하게는 균체당 300% 이상으로 향상되도록 개변되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 비교 대상이 되는 야생형의 장내세균과에 속하는 미생물이란, 예를 들면 에세리키아 콜라이MG1655(ATCC 47076)나, 판토에아 아나나티스 AJ13355(FERM BP-6615) 등을 들 수 있다.
kdp 오페론의 발현량이 상승된 것의 확인은, kdp 오페론의 mRNA의 양을 야생형, 또는 비개변주와 비교함으로써 확인할 수 있다. 발현량의 확인방법으로서는, 노던 하이브리드화, RT-PCR를 들 수 있다[참조: Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor(USA), 2001)]. 발현량에 관해서는, 야생주 또는 비개변주와 비교하여, 상승하고 있으면 어느 것이라도 양호하지만, 예를 들면 야생주, 비개변주와 비교하여 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 2배 이상, 더욱 바람직하게는 3배 이상 상승하고 있는 것이 바람직하다.
P형 ATPase 활성은, 예를 들면 kdp 시스템을 갖는 미생물로부터, kdp 시스템을 추출, 정제하고[참조: Siebers, A. et al., Eur. J. Biochem. 178, 131(1988)], 이의 ATPase 활성을 측정하는 방법[참조: Arnold, A. et al., Anal. Biochem. 71, 209(1976)]로, P형 ATPase 활성을 측정할 수 있다.
kdp 시스템은, kdp 오페론에 의해서 암호화되는 3개의 서브유니트로 이루어지고, 각 서브유니트 유전자는, 이.콜라이에서는 이하의 주석이 부여되어 있다.
kdpA ATPase of high-affinity potassium transport system, A chain
kdpB ATPase of high-affinity potassium transport system, B chain
kdpC P-type ATPase, high-affinity potassium transport system, C chain
본 발명에 의한「kdp 오페론」이란, 상기 P형 ATPase의 A 서브유니트, B 서브유니트, C 서브유니트를 암호화하는 유전자군이고, A 서브유니트는 kdpA 유전자, B 서브유니트는 kdpB 유전자, C 서브유니트는 kdpC 유전자에 의해 암호화된다. 본 발명에 있어서, kdp 오페론은, kdpA, kdpB, 및 kdpC 유전자 이외의 유전자를 포함하고 있어도 양호하다.
에세리키아 콜라이의 kdp 오페론의 염기 서열을 서열번호 1에 나타낸다. 당해 오페론은 하기의 6개의 유전자를 포함하고, 각각의 서열번호 1에 있어서의 암호화 영역(종결 코돈을 포함한다)의 위치는 이하와 같다. kdpA, kdpB, kdpC, kdpD, 및 kdpE에 의해서 암호화되는 아미노산 서열을, 각각 서열번호 2 내지 6에 나타낸다.
kdpF: 457 내지 546
kdpA: 546 내지 2219
kdpB: 2242 내지 4290
kdpC: 4299 내지 4871
kdpD: 4864 내지 7548
kdpE: 7545 내지 8222
판토에아 아나나티스의 kdp 오페론의 염기 서열을 서열번호 7에 나타낸다. 당해 오페론은 하기의 4개의 유전자를 포함하고, 각각의 서열번호 7에 있어서의 암호화 영역(종결 코돈을 포함한다)의 위치는 이하와 같다. kdpA, kdpB, kdpC, kdpD에 의해서 암호화되는 아미노산 서열을, 각각 서열번호 8 내지 11에 나타낸다.
kdpA: 543 내지 2225
kdpB: 2228 내지 4273
kdpC: 4284 내지 4853
kdpD: 4867 내지 7542
또한, 판토에아 아나나티스의 kdpE 유전자의 염기 서열 및 당해 유전자가 암호화하는 아미노산 서열을, 각각 서열번호 12, 13에 나타낸다.
본 명세서에 있어서, kdpA, kdpB, kdpC, kdpD, 및 kdpE에 의해서 암호화되는 단백질을, 각각 KdpA, KdpB, KdpC, KdpD, 및 KdpE라고 기재하는 경우가 있다.
판토에아 아나나티스와 에세리키아 콜라이의 각각의 KdpA, KdpB, KdpC의 아미노산 서열의 정렬을 도 6 내지 8에 도시한다. 판토에아 아나나티스와 에세리키아 콜라이에서 공통하는 서열을 정렬의 하단에 나타낸다. 또한, KdpA, KdpB, KdpC의 각각의 컨센서스 서열을 서열번호 57 내지 59에 나타낸다.
판토에아 아나나티스와 에세리키아 콜라이의 각각의 KdpA, KdpB, KdpC의 상동성은, 각각 75.36%, 81.35%, 59.57%이다.
에세리키아의 kdpA 유전자는, GenBank NP_415226.1 Reports potassium-transpo...[gi:16128674]에, kdpB 유전자는, NP_415225. Reports potassium-transpo...[gi:16128673]에, kdpC 유전자는, NP_415224. Reports potassium-transpo...[gi:16128672]에, kdpD 유전자는, NP_415223. Reports fused sensory his...[gi:16128671]에, kdpE 유전자는, NP_415222. Reports DNA-binding respo...[gi:16128670]에, 등록되어 있다.
또한, kdp 오페론은, 상기로 예시된 유전자와의 상동성에 기초하여, 에세리키아속, 판토에아속, 엔테로박터속, 클렙시엘라속, 세라티아속, 에르비니아속, 에르시니아속 등의 장내세균과에 속하는 미생물로부터 클로닝되는 것이라도 양호하다.
본 발명에 사용할 수 있는 kdp 오페론은, 이미 서열이 밝혀져 있는 장내세균과에 속하는 미생물의 염기 서열에 기초하여 제작한 프라이머를 사용하여, 장내세균과에 속하는 미생물의 염색체 DNA를 주형으로 하는 PCR법(PCR: polymerase chain reaction; White, T. J. et al., Trends Genet. 5, 185(1989)]에 의해서, kdp 오페론과 그 상류 영역의 발현 제어 영역을 포함하는, 그 인접 영역을 취득할 수 있다. 다른 미생물의 kdp 오페론의 동족체도 동일하게 하여 취득될 수 있다.
kdp 오페론 동족체란, 다른 미생물 유래로, 에세리키아 콜라이 또는 판토에아 아나나티스의 kdp 오페론과 높은 유사성을 나타내고, 칼륨이온을 도입하는 P형 ATPase를 암호화하는 유전자를 말한다. 다른 미생물 유래의 kdpA 유전자, kdpB 유전자, 및 kdpC 유전자는, 서열번호 2, 3, 4, 8, 9 및 10의 아미노산 서열 전체의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지며, 칼륨을 도입하는 P형 ATPase 활성을 갖는 단백질을 구성하는 서브유니트를 암호화하는 것을 의미한다.
각 서브유니트는, 이들에 의해서 구성되는 P형 ATPase 활성이 손상되지 않는 한, 서열번호 2, 3, 4, 8, 9 및 10의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 위치에서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 보존적 변이체를 암호화하는 것이라도 양호하다. 여기에서, 수개란, 아미노산 잔기의 단백질의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서도 다르지만, 바람직하게는 2 내지 20개, 보다 바람직하게는 2 내지 10개, 특히 바람직하게는 2 내지 5개이다. 또한, 이러한 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위 등에는, kdp 오페론을 보유하는 미생물의 개체차, 종의 차이에 근거하는 경우 등의 천연적으로 발생하는 변이에 의해서 발생하는 것도 포함된다.
상기 치환은 기능적으로 변화하지 않는 중성 변이인 보존적 치환이 바람직하다. 보존적 변이란, 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에는, phe, trp, tyr 간에, 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우에는, leu, ile, val 간에, 극성 아미노산인 경우에는, gln, asn 간에, 염기성 아미노산인 경우에는, lys, arg, his 간에, 산성 아미노산인 경우에는, asp, glu 간에, 하이드록실기를 갖는 아미노산인 경우에는, ser, thr 간에 서로 치환하는 변이이다. 보다 구체적으로는, 보존적 치환으로서는, ala에서 ser 또는 thr로의 치환, arg에서 gln, his 또는 lys로의 치환, asn에서 glu, gln, lys, his 또는 asp로의 치환, asp에서 asn, glu 또는 gln로의 치환, cys에서 ser 또는 ala로의 치환, gln에서 asn, glu, lys, his, asp 또는 arg로의 치환, glu에서 gly, asn, gln, lys 또는 asp로의 치환, gly에서 pro로의 치환, his에서 asn, lys, gln, arg 또는 tyr로의 치환, ile에서 leu, met, val 또는 phe로의 치환, leu에서 ile, met, val 또는 phe로의 치환, lys에서 asn, glu, gln, his 또는 arg로의 치환, met에서 ile, leu, val 또는 phe로의 치환, phe에서 trp, tyr, met, ile 또는 leu로의 치환, ser에서 thr 또는 ala로의 치환, thr에서 ser 또는 ala로의 치환, trp에서 phe 또는 tyr로의 치환, tyr에서 his, phe 또는 trp로의 치환, 및, val로부터 met, ile 또는 leu로의 치환을 들 수 있다.
또한, kdp 오페론은, 숙주 미생물에 의해, 유전자의 축중성이 상이하기 때문에, kdp 오페론이 도입되는 숙주에서 사용하기 쉬운 코돈으로 치환한 것이라도 양호하다. 동일하게 kdp 오페론은, 증폭됨으로써 L-아미노산의 생산을 향상시킬 수 있는 한, 암호화되는 각 서브유니트의 N 말단측, 및/또는, C 말단측이 연장 또는 삭제되고 있어도 양호하다. 예를 들면 연장·삭제하는 길이는, 아미노산 잔기에서 50 이하, 바람직하게는 20 이하, 보다 바람직하게는 10 이하, 특히 바람직하게는 5이하이다. 보다 구체적으로는, 서열번호 2, 3, 4, 8, 9 및 10의 아미노산 서열의 N 말단측 50 아미노산으로부터 5 아미노산, C 말단측 50 아미노산으로부터 5 아미노산연장 또는 삭제되어 있어도 양호하다.
kdp 오페론은, 또한 서열번호 1 또는 7의 염기 서열, 또는 당해 염기 서열중의 각 암호화 영역의 염기 서열에 상보적인 서열을 갖는 DNA 또는 이들의 염기 서열을 갖는 DNA로부터 조제될 수 있는 프로브와, 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, kdp 시스템, 즉 칼륨이온을 도입하는 P형 ATPase의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA라도 양호하다.
여기에서 말하는 「엄격한 조건」이란 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 이러한 조건을 명확하게 수치화하는 것은 곤란하지만, 일례를 나타내면, 상동성이 높은 DNA끼리, 예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리가 하이브리드화하고, 이것보다 상동성이 낮은 DNA끼리가 하이브리드화하지 않는 조건, 또는, 통상의 서던 하이브리드화의 세정 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1%SDS, 바람직하게는 0.1×SSC, 0.1%SDS에 상당하는 염 농도로 하이브리드화하는 조건을 들 수 있다.
프로브는, kdp 오페론의 일부의 서열을 갖는 것이라도 양호하다. 이와 같은 프로브는, 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해, 각 유전자의 염기 서열에 기초하여 제작한 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, 각 유전자를 포함하는 DNA 단편을 주형으로 하는 PCR 반응에 의해 제작할 수 있다. 또한, 프로브에 300bp 정도의 길이의 DNA 단편을 사용하는 경우에는, 상기의 조건으로 하이브리드화시킨 후의 세정의 조건으로서는, 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS로 1회 또는 2 내지 3회 세정하는 조건을 들 수 있다.
이러한 kdp 오페론과 상동인 유전자는, 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해서, 암호화되는 단백질의 특정한 부위의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하도록 서열번호 1 또는 7의 염기 서열 중의 암호화 영역을 개변함으로써 취득할 수 있다. 또한, 이하와 같은 종래 알려져 있는 변이 처리에 의해서도 취득될 수 있다. 변이 처리로서는, 서열번호 1 또는 7의 염기 서열, 또는 이들의 염기 서열 중의 암호화 영역의 서열을 하이드록실아민 등으로 시험관내 처리하는 방법, 및 당해 유전자를 보유하는 미생물, 예를 들면 장내세균과에 속하는 미생물을, 자외선 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 에틸메탄설포네이트(EMS) 등의 통상 변이 처리에 사용되고 있는 변이제에 의해서 처리하는 방법, 에러 프론 PCR[참조: Cadwell, R. C. PCR Meth. Appl. 2, 28(1992)], DNA shuffling[참조: Stemmer, W. P. Nature 370, 389(1994)], StEP-PCR[참조: Zhao, H. Nature Biotechnol. 16, 258(1998)]에 의해서, 유전자 재조합에 의해 인공적으로 kdp 오페론에 변이를 도입하여 활성이 높은 kdp 시스템을 암호화하는 오페론을 취득할 수 있다. 이러한 kdp 오페론의 동족체가 P형 ATPase를 암호화하고 있는지 여부는, 예를 들면, 이들 유전자를 L-아미노산 생산능을 갖는 장내세균과에 속하는 미생물에 도입하여, L-아미노산의 생산능이 향상되는지 여부, 또는 상기의 방법으로 P형 ATPase 활성을 측정함으로써, 확인할 수 있다.
한편, 상기 변이체 및 동족체에 관한 기술은, 후술의 kdpD 유전자 및 kdpE 유전자에도 적용된다.
kdp 오페론 또는 당해 오페론을 구성하는 1 또는 2 이상의 유전자의 발현량이 증대하도록 장내세균과에 속하는 미생물을 개변하는 것은, 상기의 목적 유전자의 발현이 증강하도록 세균을 개변하는 방법에 의해서 실시할 수 있다. 즉, kdp 오페론 또는 당해 오페론을 구성하는 각 유전자의 발현의 카피수를 높이는 것, 및/또는, 당해 오페론의 프로모터 등의 발현 조절 서열을 강력한 것으로 치환하는 것, 또는 당해 오페론을 구성하는 각 유전자를 강력한 발현 조절 서열의 제어하에 둠으로써, 당해 오페론 또는 각 유전자의 발현을 증강시킬 수 있다. kdp 오페론을 구성하는 각 유전자의 발현의 증강은, 오페론 단위로 실시해도 양호하고, 또한, 각 유전자마다 별개로 실시해도 양호하지만, 오페론 단위로 실시하는 것이 바람직하다. 각 유전자마다 발현을 증강시키는 경우, 증강되는 유전자는 kdp 오페론을 구성하는 어느 유전자라도 양호하지만, 적어도 kdpA, kdpB, 및 kdpC 유전자 중 어느 1종 또는 2종 이상인 것이 바람직하고, kdpA, kdpB, 및 kdpC 유전자의 모든 발현을 증강시키는 것이 보다 바람직하다.
또한, kdp 오페론을 구성하는 각 유전자의 해독량이 증대하도록, 각 유전자의 리보솜 결합 부위(RBS)와 개시 코돈간의 스페이서의 서열을 개변함으로써도, kdp 시스템을 증강시킬 수 있다.
또한, kdp 오페론의 발현은, kdpD 유전자 및 kdpE 유전자에 의해서 암호화되는 2성분 제어계 KdpDE에 의해서 제어되는 것이 알려져 있고[참조: J. Bacteriol., 1992 Apr., 74(7):2152-59.], kdpD 유전자 및 kdpE 유전자의 발현량을 증대시킴으로써도, kdp 오페론의 발현량을 증대시킬 수 있다.
<2> 본 발명의 L-아미노산의 제조법
본 발명의 미생물을 배지에서 배양하여, L-아미노산을 당해 배지 중에 생성 축적시키고, 당해 배지로부터 L-아미노산을 채취함으로써, L-아미노산을 제조할 수 있다.
배양에 사용하는 배지는, 탄소원, 질소원, 무기염류, 기타 필요에 따라 아미노산, 비타민 등의 유기 미량 영양소를 함유하는 통상의 배지를 사용할 수 있다. 합성 배지 또는 천연 배지 중 어느 것이나 사용 가능하다. 배지에 사용되는 탄소원 및 질소원은 배양하는 균주가 이용 가능한 것이면 어느 종류를 사용해도 양호하다.
탄소원으로서는, 글루코스, 글리세롤, 프럭토스, 수크로스, 말토스, 만노스, 갈락토스, 전분 가수분해물, 당밀 등의 당류를 사용할 수 있고, 기타, 아세트산, 시트르산 등의 유기산, 에탄올 등의 알콜류도 단독 또는 다른 탄소원과 병용하여 사용할 수 있다. 질소원으로서는, 암모니아, 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 아세트산암모늄 등의 암모늄염 또는 잘산염 등을 사용할 수 있다. 유기 미량 영양소로서는, 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 또한 이러한 것을 함유하는 펩톤, 카자미노산, 효모 추출물, 대두 단백 분해물 등을 사용할 수 있고, 생육에 아미노산 등을 요구하는 영양 요구성 변이주를 사용하는 경우에는 요구되는 영양소를 보첨하는 것이 바람직하다.
특히 L-글루탐산이 석출되는 조건으로 조정된 액체배지를 사용하는 경우, 배지 중에 판토텐산을 첨가하면, 보다 효율적으로 결정 석출할 수 있다[참조: WO2004/111258호 팜플렛]. 무기염류로서는 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등을 사용할 수 있다.
배양은 바람직하게는, 발효 온도 20 내지 45℃, pH를 3 내지 9로 제어하고, 통기 배양을 실시한다. 배양 중에 pH가 저하되는 경우에는, 예를 들면, 탄산칼슘을 가하거나 암모니아가스 등의 알칼리로 중화한다. 이러한 조건하에서, 바람직하게는 10시간 내지 120시간 정도 배양함으로써, 배양액 중에 목적 아미노산이 축적된다.
또한, L-글루탐산이 석출되는 조건으로 조정된 액체 배지를 사용하여, 배지 중에 L-글루탐산을 석출시키면서 배양을 실시할 수도 있다. L-글루탐산이 석출되는 조건으로서는, 예를 들면, pH 5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH 4.5 내지 4.0, 더욱 바람직하게는 pH 4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 pH 4.0을 들 수 있다.
또한, L-글루탐산을 배지 중에 석출시키는 경우에는, 미리 L-글루탐산, L-리신의 결정을 종정으로 하여 첨가해 두면 보다 효율적으로 결정 석출할 수 있다[참조: 유럽특허 1233069호, 유럽특허출원공개 1624069호].
배양 종료 후의 배양액으로부터 L-아미노산을 채취하는 방법은, 공지의 회수방법에 따라서 실시하면 양호하다. 예를 들면, 배양액으로부터 균체를 제거한 후에 농축 결정 석출하는 방법 또는 이온 교환 크로마토그래피 등에 의해서 채취된다. L-글루탐산이 석출되는 조건하에서 배양한 경우, 배양액 중에 석출된 L-글루탐산은, 원심분리 또는 여과 등에 의해 채취할 수 있다. 이 경우, 배지 중에 용해되어 있는 L-글루탐산을 결정 석출한 후에, 더불어 분리해도 양호하다.
또한, 염기성 아미노산을 제조할 때는, 배양 중의 pH가 6.5 내지 9.0, 배양 종료시의 배지의 pH가 7.2 내지 9.0이 되도록 제어하여, 발효 중의 발효조 내압력이 양이 되도록 제어하거나, 또는, 탄산 가스 또는 탄산 가스를 포함하는 혼합 가스를 배지에 공급하여, 배지 중의 중탄산이온 및/또는 탄산이온이 적어도 2g/L 이상 존재하는 배양기가 있도록 하여, 상기 중탄산이온 및/또는 탄산이온을 염기성 아미노산을 주로 하는 양이온의 카운터 이온으로 하는 방법으로 발효하여, 목적의 염기성 아미노산을 회수하는 방법으로 제조를 실시해도 양호하다[참조: 일본 공개특허공보 2002-065287호, 미국특허출원공개 제2002025564호].
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.
〔참고예 1〕λRed 유전자 산물에 내성인 판토에아 아나나티스 균주의 구축
판토에아 아나나티스에 있어서 kdp 오페론 증폭을 실시하기 위해서, 「Red-driven integration」또는「Red-mediated integration」이라고 불리는 방법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97. 6640-6645(2000)]을 고효율로 실시하기 위한 수용균을 구축하였다.
우선, λ의 gam, bet 및 exo의 각 유전자(이하, 「λRed 유전자」)를 발현하는 신규 헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER를 구축하였다(도 1). 상세한 것은, 참고예 2에 기재한다
당해 플라스미드는, 상이한 유전자 배경을 갖는 넓은 범위의 숙주에 사용할 수 있다. 그 이유는, 1) 이것은, 많은 그람 음성균 및 그람 양성균, 및 식물에 있어서조차도 안정적으로 유지될 수 있는 RSF101O 광숙주역 플라스미드의 레플리콘을 가지고 있고[참조: Scholz, et al., 1989; Buchanan-Wollaston et al.,1987], 2) λRed 유전자, gam, bet 및 exo 유전자는, 많은 세균의 RNA 폴리머라제에 의해서 인식되는, PlacUV5 프로모터의 조절화에 있고[참조: Brunschwig, E. and Darzins, A., Gene, 111, 1, 35-41(1992); Dehio, M. et al, Gene, 215, 2, 223-229(1998)], 3) 자기 조절 인자 PlacUV5-lacI, 및 에세리키아 콜라이의 rrnB 오페론의 ρ 비의존성 전사 터미네이터(TrrnB)는, λRed 유전자의 기저 발현 수준을 낮게 하기[참조: Skorokhodova, A. Yu et al, Biotekhnologiya(Rus), 5, 3-21(2004)]때문이다. 또한, RSF-Red-TER 플라스미드는, 레반수크라제(levansucrase) 유전자(sacB)를 포함하고 있고, 이러한 유전자에 의해, 수크로스를 포함하는 배지에서 세포로부터 플라스미드를 회수할 수 있다.
에세리키아 콜라이에서는, RSF-Red-TER 플라스미드에 의해 제공되는 짧은 플랭킹 영역과 함께, PCR에서 생성된 DNA 단편이 통합하는 빈도는, pKD46 헬퍼 플라스미드[참조: Datsenko, K. A., Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645,(2000)]를 사용한 경우와 같은 정도로 높다. 그러나, λRed 유전자의 발현은, 판토에아 아나나티스에 있어서 독성을 나타낸다. RSF-Red-TER 헬퍼 플라스미드로 형질전환된 세포는, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드, 1mM) 및 적당한 항생 물질(클로람페니콜 25㎍/ml 또는 카나마이신 40㎍/ml)을 포함하는 LB 배지에서 매우 낮은 생육 속도를 나타내고, λRed 개재 재조합(λRed-mediated recombination)의 효율은, 관찰되었다고 해도 극단적으로 낮다(10-8).
λRed 유전자의 3개 유전자 모든 발현에 내성인 판토에아 아나나티스의 변이 주를 선택하였다. 이로 인해, 판토에아 아나나티스 SC17주[참조: 미국특허 제6,596,517호]를, RSF-Red-TER 플라스미드로 전기천공에 의해 도입하였다. 18시간 배양후, 약 106개의 형질전환주가 수득되고, 10 클론까지는 콜로니가 큰 사이즈이고, 나머지는 전부 매우 작았다. 18시간 배양후, 큰 콜로니는 약 2mm이고, 작은 콜로니는 약 0.2mm이었다. 배양을 24시간까지 연장하더라도, 작은 콜로니는 그 이상 생육하지 않았지만, 큰 콜로니는 생육을 계속하였다. λRed 유전자의 3개 유전자 전부(gam, bet 및 exo)의 발현에 내성인, 큰 콜로니의 판토에아 아나나티스 변이주의 하나를, 또 다른 분석에 사용하였다.
RSF-Red-TER 플라스미드 DNA를, 큰 콜로니의 클론 1개, 및 몇개의 작은 콜로니의 클론으로부터 분리하여, 에세리키아 콜라이 MG1655를 재형질전환하여, Red 유전자의 활성인 산물을 합성하는 플라스미드의 능력을 조사하였다. 수득된 형질전환체에 있어서의 Red 의존적 통합의 대조 실험에 의해, 큰 콜로니의 클론으로부터 분리된 플라스미드만이, Red 의존적 통합에 필요한 λRed 유전자의 발현을 가져오는 것이 나타났다. 선택된 큰 콜로니의 클론에 있어서, Red 매개 통합이 일어나는지를 조사하기 위해서, KmR 마커 및 hisD 유전자에 상동인 40bp의 플랭킹 영역을 포함하고, 판토에아 아나나티스의 hisD 유전자의 SmaI 인식 부위에 통합하도록 디자인된, PCR에서 생성된 직쇄상의 DNA 단편을 사용하여, 전기천공을 실시하였다. 2개의 작은 콜로니의 클론을 대조로서 사용하였다. 판토에아 아나나티스의 hisD 유전자의 염기 서열을 서열번호 14에 나타낸다. PCR에는, 서열번호 15 및 16의 올리 고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여, pMW118-(λattL-Kmr-λattR) 플라스미드를 주형으로서 사용하였다. λRed 유전자에 내성이 아닌 2개의 작은 콜로니의 클론을 대조로서 사용하였다. pMW118-(λattL-Kmr-λattR) 플라스미드의 구축은, 참고예 3에서 상세하게 기술한다.
RSF-Red-TER 플라스미드는, 당해 플라스미드 위에 있는 lacI 유전자에 의해서, Red 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 2개의 유도 조건에 관해서 조사하였다. 제1 그룹에서는, IPTG(1mM)을 전기천공의 1시간 전에 첨가하고, 제2 그룹에서는, IPTG는 전기천공 가능한 세포의 조제를 위한 배양 개시시에 첨가하였다. 큰 콜로니의 클론으로부터의 RSF-Red-TER를 보유하는 세포의 후대(後代)의 생육 속도는, SC17 플라스미드를 갖지 않는 균주보다도 유의적으로 낮지는 않았다. IPTG의 첨가에 의해, 이러한 배양물의 생육 속도는 약간 저하되었을 뿐이었다. 한편, 작은 콜로니의 클론의 후대는, IPTG 비첨가에서 매우 천천히 생육되고, 유도하자 생육은 사실상 정지하였다. 큰 콜로니의 클론의 후대의 세포를 전기천공한 후, 많은 KmR 클론(짧은 유도 시간에서 18 클론, 유도 시간을 연장하면 약 100 클론)이 생육되었다. 조사한 100 클론 전체는, His- 표현형을 가지며, 20 클론에 관해서 PCR로 확인한 결과, 이들 세포의 염색체의 구조가 기대한 대로인 것이 확인되었다. 한편, 작은 콜로니의 클론의 후대의 세포를 전기천공하더라도, 통합된 주는 수득되지 않았다.
수득된 큰 콜로니의 클론을, 7% 수크로스를 포함하는 플레이트에서 생육시켜 플라스미드를 탈락시키고, RSF-Red-TER에서 재형질전환하였다. 플라스미드를 갖지 않는 주를 SC17(0)라고 명명하였다. 당해 주는, 2005년 9월 21에 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈[참조: Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika](주소: Russia, 117545 Moscow, 1Dorozhny proezd. 1)에 수탁번호 VKPM B-9246하에 기탁되어 있다.
상기 재형질전환후에 생육된 모든 클론은, 친주 클론 SC17(0)과 동일하게 큰 콜로니 사이즈를 갖고 있었다. RSF-Red-TER 플라스미드로 재형질전환한 SC17(0)주에 있어서의 Red 매개 통합의 실험을 실시하였다. 수득된 3개의 독립된 형질전환주에 관해서, 앞의 실험에 사용한 것과 동일한 DNA 단편을 사용하여 조사하였다. 짧은 유도 시간(전기천공 1시간 전)을 채용하였다. 각각의 실험에서, 10개를 초과하는 KmR 클론이 생육되었다. 시험한 모든 클론은, His-표현형을 갖고 있었다. 이렇게 해서, λRed 유전자의 발현에 내성인 SC17(0)라고 명명한 변이주가 선택되었다. 이러한 균주는, 판토에아 아나나티스 염색체로의 Red 의존적 통합을 위한 적합한 수용균으로서 사용할 수 있다.
[참고예 2] 헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER의 구축
헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER의 구축을 도 2에 도시한다.
구축의 최초의 공정으로서, RSFsacBPlacMCS 벡터를 디자인하였다. 이로 인해, pACYC184 플라스미드의 cat 유전자, 및 바실러스 서브틸리스의 sacB 유전자의 구조 부분을 포함하는 DNA 단편을, 각각 서열번호 17, 18, 19, 20의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, PCR에 의해 증폭시켰다. 이러한 올리고 뉴클레오타이드는 각각 추가 클로닝에 필요한, 적절한 BglII, SacI, XbaI, 및 BamHI 제한 효소 부위를 5'말단에 포함하고 있다. 수득된 1.5kb의 sacB 단편을, 앞서 수득한 pMW119-PlaclacI 벡터의 XbaI-BamHI 부위에 클로닝하였다. 당해 벡터는, pMW118-PlaclacI 벡터에 관한 기재[참조: Skorokhodova, A. Yu et al, Biotekhnologiya(Rus), 5, 3-21(2004))와 동일하게 하여 구축하였다. 단, 당해 벡터는, pMW218 플라스미드 대신에 pMW219로부터의 폴리링커 부위를 포함하고 있다.
다음에, 상기의 1.0kb의 cat 단편을 BglII 및 SacI로 처리하여, 앞선 공정에서 수득한 RSF-PlaclacIsacB 플라스미드의 BamHI-SacI 부위에 클로닝하였다. 수득된 플라스미드 pMW-PlaclacIsacBcat는, PlacUV5-lacI-sacB-cat 단편을 포함하고 있다. 당해 단편을 RSF1010 벡터에 서브 클론하기 위해서, pMW-PlaclacIsacBcat를 BglII로 분해하고, DNA 폴리머라제I 클레노우 단편으로 처리하여 평활 말단화하고, 계속해서 SacI로 절단하였다. pMWPlaclacIsacBcat 플라스미드의 3.8kb의 BglII-SacI 단편을 1% 아가로스겔로부터 용출시켜, PstI, 및 SacI로 처리한 RSF1010 벡터에 연결하였다. 연결 혼합액으로 에세리키아 콜라이 TG1를 형질전환하여, 클로람페니콜(50mg/L)을 포함하는 LB 배지에 플레이트하였다. 생육한 클론으로부터 분리한 플라스미드의 제한 효소 해석을 실시하여, RSFsacB 플라스미드를 수득하였다. RSFsacBPlacMCS 벡터를 구축하기 위해서, 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, pMW119-PlaclacI 플라스미드를 주형으로서 사용하여, PlacUV5 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 수득된 146bp의 단편을 SacI 및 NotI로 분해하여, RSFsacB 플라스미드의 SacI-NotI 대단편과 연결하였다. 그 후, 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, pKD46 플라스미드[참조: Datsenko, K. A., Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645,(2000)]를 주형으로 하여 사용한 PCR에 의해, λRedαβγ유전자, 및 전사 터미네이터 tL3를 포함하는 2.3kb의 DNA 단편을 증폭시켰다. 수득된 단편을 RSFsacBPlacMCS 벡터의 PvuI-NotI 부위에 클로닝하였다. 이렇게 해서, RSFRed 플라스미드를 디자인하였다.
Red 유전자의 리드스루(read through) 전사를 배제하기 위해서, 에세리키아 콜라이의 rrnB 오페론의 ρ-의존성 전사 터미네이터를, cat 유전자와 PlacUV5 프로모터간에 삽입하였다. 이로 인해, 서열번호 25 및 22의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, 에세리키아 콜라이 BW3350의 염색체를 주형으로서 사용한 PCR에 의해, PlacUV5 프로모터와 TrrnB 터미네이터를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 수득된 이들 단편을 KpnI로 처리하여, 연결하였다. 그 후, 서열번호 22 및 26의 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 하는 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR에 의해, PlacUV5 및 TrrnB의 양자를 포함하는 0.5kb 단편을 증폭시켰다. 수득된 DNA 단편을 EcoRI로 분해하여, DNA 폴리머라제I 클레노우 단편으로 처리하여 평활 말단화하여, BamHI로 절단하여, RSFsacBPlacMCS 벡터의 Ecl136II-BamHI 대단편과 연결하였다. 수득된 플라스미드를 RSF-Red-TER라고 명명하였다.
[참고예 3] pMW118-(λattL-Kmr-λattR) 플라스미드의 구축
pMW118-(λattL-Kmr-λattR) 플라스미드는, pMW118-attL-Tc-attR[참조: WO2005/010175) 플라스미드로부터, 테트라사이클린 내성 마커 유전자를 pUC4K 플라스미드의 카나마이신 내성 유전자로 치환함으로써 구축하였다. 이로 인해, pMW118-attL-Tc-attR 플라스미드의 EcoRI-HindIII 대단편을, pUC4K 플라스미드의 HindIII-PstI(676bp) 및 EcoRI-HindIII(585bp)의 2개의 단편에 연결하였다. 기본이 되는 pMW118-attL-Tc-attR는, 이하의 4개의 단편을 연결함으로써 수득하였다.
1) 에세리키아 콜라이 W3350(λ프로파지를 포함한다)의 염색체의 attL에 상당하는 영역으로부터, 프라이머 P1(서열번호 27) 및 P2(서열번호 28)를 사용한 PCR 증폭에 의해 수득한 attL(서열번호 29)를 갖는 BglII-EcoRI 단편(114bp). 이들 프라이머는, BglII 및 EcoRI를 위한 부차적인 인식 부위를 포함하고 있다.
2) 에세리키아 콜라이 W3350(λ프로파지를 포함한다)의 염색체의 attR에 상당하는 영역으로부터, 프라이머 P3(서열번호 30) 및 P2(서열번호 31)를 사용한 PCR 증폭에 의해 수득한 attR(서열번호 32)를 갖는 PstI-HindIII 단편(182 bp). 이들 프라이머는, PstI 및 HindIII를 위한 부차적인 인식 부위를 포함하고 있다.
3) pMW118-ter_rrnB의 BglII-HindIII 대단편(3916 bp). 플라스미드 pMW118-ter-rrnB는, 다음 3개의 DNA 단편을 연결함으로써 수득하였다.
·pMW118의 AatII-EcoRI 단편을 갖는 대단편(2359 bp). 당해 단편은, pMW118을 EcoRI로 분해하여, DNA 폴리머라제I 클레노우 단편으로 처리하고, 이어서 AatII로 분해함으로써 수득하였다.
·암피실린 내성(ApR)의 유전자 bla를 갖는 pUC19의 AatII-BglII 소단편(1194bp). 당해 단편은, pUC19 플라스미드의 상당하는 영역을 프라이머 P5 및 P6(서열번호 33 및 34)을 사용하여 PCR 증폭시킴으로써 수득하였다. 이들 프라이머는, PstI 및 AatII 및 BglII를 위한 부차적인 인식 부위를 포함하고 있다.
·전사 터미네이터 ter_rrnB의 BglII-PstI 소단편(363 bp). 당해 단편은, 에세리키아 콜라이 MG1655 염색체의 상당하는 영역을 프라이머 P7 및 P8(서열번호 35 및 36)을 사용하여 PCR 증폭시킴으로써 수득하였다. 이들의 프라이머는, PstI 및 BglII 및 PstI를 위한 부차적인 인식 부위를 포함하고 있다.
4) 테트라사이클린 내성 유전자 및 ter_thrL 전사 터미네이터를 갖는 pML-Tc-ter_thrL의 EcoRI-PstI 소단편(1388bp)(서열번호 37). pML-Tc-ter_thrL 플라스미드는, 다음 2공정에서 수득하였다.
·pML-MCS 플라스미드[참조: Mashko, S. V. et al., Biotekhnologiya(in Russian), 2001, no. 5, 3-20]를 XbaI 및 BamHI로 분해하고, 이어서 대단편(3342bp)을, ter_thrL 터미네이터를 포함하는 XbaI-BamHI 단편(68bp)과 연결하였 다. 당해 ter_thrL 터미네이터를 포함하는 단편은, 에세리키아 콜라이 MG1655 염색체의 상당하는 영역을, 프라이머 P9 및 P10(서열번호 38 및 39)을 사용한 PCR에 의해 수득하였다. 이렇게 해서 pML-ter_thrL 플라스미드를 수득하였다. 이들의 프라이머는, PstI 및 XbaI 및 BamHI를 위한 부차적인 인식 부위를 포함하고 있다.
·pML-ter_thrL 플라스미드를 KpnI 및 XbaI로 분해하고, 이어서 DNA 폴리머라제I 클레노우 단편으로 처리하여, 테트라사이클린 내성 유전자를 갖는 pBR322의 EcoRI-Van91I 소단편(1317bp)과 연결하여, pML-Tc-ter_thrL 플라스미드를 수득하였다. 한편, pBR322은, EcoRI 및 Van91I로 분해하고, 이어서 DNA 폴리머라제I 클레노우 단편으로 처리하였다.
[실시예 1] kdp 오페론의 프로모터 치환주의 취득
(1) 글루탐산 생산 플라스미드 RSFPPG의 구축
L-글루탐산 생합성계 유전자, prpC 유전자[참조: 국제공개 2006/051660호 팜플렛], ppc 유전자, gdhA[참조: 유럽출원공개 0999282호 명세서] 유전자를 증폭시킨 플라스미드 RSFPPG를 구축하였다.
RSFCPG[참조: 유럽출원공개 1233068호 명세서]의 gltA 유전자의 ORF 이외의 부분을 증폭시키는 프라이머 1(서열번호 40)와 프라이머 2(서열번호 41)를 설계하였다. 당해 프라이머를 사용하여, RSFCPG를 주형으로 PCR를 실시하고, 약 14.9kb의 단편을 취득하였다. 한편, prpC에 관해서는 프라이머 3(서열번호 42)과 프라이머 4(서열번호 43)를 사용하고, 이.콜라이 W3110주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하여, 약 1.2kb의 단편을 취득하였다. 양 PCR 산물을 각각 BglII, KpnI로 처리하고, 연결 후, 이.콜라이 JM109주를 형질전환하였다. 출현한 콜로니를 모두 집균하여, 혼합물로 하여 플라스미드를 추출하였다. 당해 플라스미드 혼합물로 시트르산 신타제(CS) 결손주인 이.콜라이 ME8330주를 형질전환하여, 50mg/L 우라실, 5mg/L 티아민-HCl을 함유하는 M9 최소 배지(글루코스 5g, 황산마그네슘 2mM, 인산1칼륨 3g, 염화나트륨 0.5g, 염화암모늄 1g, 인산2나트륨 6g을 순수 1L에 포함하는 배지)에 도포하였다. 출현한 주로부터 플라스미드를 추출하고, 이것을 RSFPPG로 하였다. L-글루탐산 생산균인 판토에아 아나나티스 NP106주에 상기 플라스미드 RSFPPG를 도입하여, L-글루탐산 생산균 NP106/RSFPPG(본 균주를「NA1주」라고 부른다)를 구축하였다.
NP106주는, 이하와 같이 하여 수득되었다. 먼저 예시한 판토에아 아나나티스 AJ13601주를, LBGM9 액체 배지에서 34℃에서 밤새 진탕 배양을 실시하여, 1플레이트당 100 내지 200콜로니가 되도록 희석하고, 테트라사이클린 12.5mg/L을 포함하는 LBGM9 플레이트에 도포하였다. 출현한 콜로니에 관해서, 테트라사이클린 12.5mg/L, 및 클로람페니콜 25mg/L을 포함하는 LBGM9 플레이트에서 복제시켜, 클로람페니콜 감수성으로 된 주를 선택하여, pSTVCB가 탈락된 균주를 취득하고, G106S라고 명명하였다. 또한, G106S 주를, LBGM9 액체 배지에서 34℃에서 밤새 진탕 배양을 실시하여, 1플레이트당 100 내지 200콜로니가 되도록 희석하여, 약제를 포함하지 않은 LBGM9 플레이트에 도포하였다. 출현한 콜로니에 관해서, 테트라사이클린 12.5mg/L을 포함하는 LBGM9 플레이트 및 약제를 포함하지 않는 LBGM9 플레이트 에서 복제시켜, 테트라사이클린 감수성으로 된 주를 선택하여, RSFCPG가 탈락된 균주를 취득하여, NP106이라고 명명하였다. 이렇게 해서 수득된 NP106주는 AJ13601주가 보유하는 2개의 플라스미드 RSFCPG와 pSTVCB의 양자를 갖지 않는 주이다.
(2) kdp 오페론의 프로모터를 tac 프로모터로 치환한 주의 취득
i) λattL-Kmr-λattR의 하류에 Ptac 프로모터가 연결된 서열(λattL-Kmr-λattR-Ptac)이 lacZ 유전자의 상류에 통합한 피.아나나티스 SC17(0)주의 구축
Ptac 프로모터를, 피.아나나티스 SC17(0)주의 염색체 위의 lacZ 유전자의 상류에 통합시켰다. LacZ 유전자의 상류의 피.아나나티스의 염색체 영역의 구조를 도 3에 도시한다. 판토에아 아나나티스의 yghU, scrK, 및 lacZ 유전자의 염기 서열을 서열번호 44, 45 및 46에 도시한다. Ptac 프로모터의 -35 영역의 서열은 ttgaca이다.
Ptac 프로모터에 대응하는 5'측 프라이머 1(서열번호 47) 및 3'측 프라이머 2(서열번호 48), 및 주형으로서 pDR540 플라스미드(파마시아사, Sweden)을 사용하여, PCR에 의해 Ptac 프로모터 단편을 증폭시켰다. 양 프라이머 모두 5' 말단에 BglII 인식 서열을 포함하고 있다. 또한, 프라이머 2는, Ptac의 3' 말단 부위의 46 뉴클레오타이드, SD 서열, 및 lacZ 유전자의 암호화 영역의 최초 부분을 포함하고 있다.
동시에, λ의 attL 및 attR 부위에 인접하는 제거 가능한 Km 내성 유전자를 포함하는 DNA 단편을, pMW118-(λattL-Kmr-λattR)을 주형으로 하여, 프라이머 3(서열번호 49) 및 프라이머 4(서열번호 50)를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 수득된 단편은, 한쪽 말단에, tac 프로모터 단편과의 연결을 위한 BglII 인식 부위를, 다른쪽의 말단에, 판토에아 아나나티스 염색체에 상동이고, 세균 게놈으로 통합시키기 위해서 scrK 유전자의 상류에 위치하는 서열에 상당하는 부위를 갖고 있다(도 3). 2개의 PCR 생성 단편을 BglII로 처리하여, T4 DNA 리가제로 시험관내에서 연결하였다.
연결 반응액을, 판토에아 아나나티스 염색체로의 λ의존적 통합에 사용하였다. 헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER를, λ파지 Red 유전자의 담체로서 사용하였다. 판토에아 아나나티스의 일렉트로컴피턴트(electro-competent) 세포를 수득하기 위해, RSF-Red-Ter 플라스미드로 형질전환하여 SC17(0)주를 50㎍/ml 클로람페니콜을 포함하는 LB 배지로 34℃에서 하룻밤 배양하였다. 계속해서, 배양액을 50㎍/ml의 클로람페니콜을 포함하는 신선한 LB 배지에서 100배로 희석시키고, OD600가 0.3이 될 때까지 34℃에서 통기하에서 생육시켰다. 그 후, IPTG를 1mM 첨가하고, OD600가 0.7이 될 때까지 배양을 계속하였다. 10mM의 샘플을 등량의 탈이온수로 3회 세정하여, 40㎕의 냉 10% 글리세롤에 현탁시켰다. 전기천공 직전에, 5㎕의 탈이온수에 용해시킨 시험관내 증폭 DNA 단편 100-200ng을 세포 현탁액에 가하였다. 작업은, 세균 전기천공 장치(「BioRad」미국, 카탈로그 번호 165-2089, 버전 2-89)를 사용하여 실시하였다. 사용한 펄스의 파라미터는, 전계 강도: 20kV/cm, 펄스 시간: 5m 초이었다.
전기천공 후, 즉시 글루코스(0.5%)를 보충한 1ml의 LB 배지를 세포 현탁액에 가하였다. 그리고, 세포를 34℃에서 2시간 통기하에서 생육시켜 40㎍/ml의 클로람페니콜을 포함하는 mLB 고체 배지에 플레이트하여, 34℃에서 하룻밤 항온배양하였다. 선택된 KmR의 통합체를, IPTG(1mM) 및 수크로스(5g/L)를 첨가한 LB 배지 플레이트에 스트리킹(streaking)하여, 34℃에서 생육시켜 단일 콜로니를 형성시켰다. RSF-Red-TER 헬퍼 플라스미드를 통합체로부터 제거하기 위해, KmR, CmS 변이체를 분리하였다.
선택된 KmR, CmS 콜로니의 염색체 구조를, 염기 서열 결정에 의해 확인하였다.
ii) kdp 오페론 프로모터의 tac 프로모터에 의한 치환
서열번호 51 및 52에 나타내는 합성 DNA 프라이머 2개를 통상의 방법으로 합성하였다.
서열번호 51에 나타내는 프라이머는, 판토에아 아나나티스의 kdp 오페론 상류의 상동 서열에 λattL-Kmr-λattR-Ptac의 5' 말단의 상동 서열이 계속되는 구성으로 되어 있다. 서열번호 52의 프라이머는, 판토에아 아나나티스의 kdp 오페론의 최초의 개시 코돈을 포함하는 5' 말단의 상보 서열에, λattL-Kmr-λattR-Ptac의 3' 말단의 상보 서열이 계속되는 구성으로 되어 있다. 이들의 프라이머 및 i)에서 선택된 주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR를 실시함으로써, λattL-Kmr-λattR-Ptac의 서열의 5' 말단에 kdp 오페론 상류의 상동 서열이 이어지고, λattL-Kmr-λattR-Ptac의 서열의 3' 말단에 kdp 오페론의 최초의 개시 코돈을 포함하는 5' 말단의 상동 서열이 이어지는, 약 1.6kbp의 단편을 증폭시켰다.
상기 PCR 단편을 정제하여, 통상적인 방법에 따라서, 전기천공에 의해 SC17(0)/RSF-Red-TER에 도입하였다.
PCR 단편을 도입한 SC17(0)/RSF-Red-TER 주를, 40mg/L 카나마이신을 포함하는 L 배지(박토트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 한천 15g을 순수 1L에 포함하는 배지, pH 7.0)에서 선택하고, 약 20개의 콜로니를 형질전환체로서 취득하였다. kdp 오페론 상류에 상기의 단편이 삽입된 것을, 서열번호 53과 서열번호 54에 나타내는 합성 DNA 프라이머 2개를 사용한 PCR에 의해 확인하고, 단편의 삽입을 확인할 수 있었던 균주를 SC17(0)::Ptac-kdp라고 명명하였다. 당해 균주로부터 게놈 DNA를 추출하여, 전기천공에 의해 NA1/pSTV-yhfK 주를 형질전환하였다. NA1/pSTV-yhfK 주는, AJ13601 주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2001-333769호]로부터, RSFCPG 및 pSTVCB의 2개의 플라스미드를 제거하고, L-글루탐산 생산용 플라스미드 RSFPPG 및 pSTV-yhfK[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2005-278643호]의 2개의 플라스미드를 도입함으로써 취득하였다.
RSFCPG 및 pSTVCB의 양 플라스미드는, 일본 공개특허공보 제(평)2001-333769 호에 기재되어 있다. RSFCPG는, 에세리키아 콜라이 유래의 gltA, ppc, gdhA의 각 유전자를 포함하는 플라스미드이다. pSTVCB는, pSTV29[참조: 타카라슈조(주)]에 브레비박테리움 락토퍼멘텀 유래의 gltA 유전자가 삽입된 플라스미드이다. 또한, pSTV-yhfK는, pSTV29[참조: 타카라슈조(주)]에 판토에아 아나나티스 유래의 yhfK 유전자가 삽입된 플라스미드이다.
SC17(0)::Ptac-kdp의 게놈 DNA를 도입한 NA1/pSTV-yhfK 주를, L 배지(박토트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 한천 15g을 순수 1L에 포함하는 배지, pH 7.0)에, 최소 배지 성분(글루코스 0.5g, 황산마그네슘 2mM, 인산1칼륨 3g, 염화나트륨 0.5g 염화암모늄 1g, 인산2나트륨 6g을 순수 1L에 포함하는 배지), 및, 40mg/L의 카나마이신, 12.5mg/L의 테트라사이클린염산염과 25mg/L의 클로람페니콜을 첨가한 플레이트에서 선택하여, 약 20개의 콜로니를 형질전환체로서 취득하였다. 이러한 주는 전부 kdp 오페론 상류에 λattL-Kmr-λattR-Ptac의 단편이 삽입되어 있고, 이 중의 1 클론을 선택하여, NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK라고 명명하였다.
(3) kdp 오페론 프로모터 치환주의 시험관 배양 평가
다음에, kdp 오페론의 강화가, 생육에 주는 영향을 검토하기 위해, 시험관 배양을 실시하였다. NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK 주와 대조의 NA1/pSTV-yhfK 주를 사용하여, 산성 조건에 있어서의 생육에 관해서 검토하였다.
[시험관 배양용 배지 조성]
D-글루코스 0.5%
Na2HPO4 6.0g/L
KH2PO4 3.0g/L
NaCl 0.5g/L
NH4Cl 1.0g/L
MgSO4·7H2O 2.0mM
ε-디아미노피멜산 200mg/L
L-리신염산염 200mg/L
DL-메티오닌 200mg/L
L-글루탐산 30g/L
테트라사이클린염산염 12.5mg/L
클로람페니콜 25mg/L
암모니아수로 pH 4.5 또는 pH 4.9로 조정후, 필터 여과하였다.
NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK 주와 NA1/pSTV-yhfK 주를 L 배지(박토트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 한천 15g을 순수 1L에 포함하는 배지 pH 7.0)에, 최소 배지 성분(글루코스 0.5g, 황산마그네슘 2mM, 인산1칼륨 3g, 염화나트륨 0.5g, 염화암모늄 1g, 인산2나트륨 6g을 순수 1L에 포함하는 배지)와 12.5mg/L의 테트라사이클린염산염, 25mg/L의 클로람페니콜을 첨가한 배지에서 전배양하여, 1/8 플레이트의 균체를 긁어 모아 생리식염수로 2회 세정하고, 마지막에 생리식염수 1ml에 현탁한 것 20㎕을, 시험관 배양용 배지를 5mL 가득 채운 시험관에 식균하여, 34℃에서 진탕 배양을 실시하면서, 자동 OD 측정기(TN1506 BIO PHOTORECORDER ADVANTEC사 제조)를 사용하여, 30분마다 OD(660nm)를 측정하였다. 결과를 도 4에 도시한다.
대조의 NA1/pSTV-yhfK 주와 비교하여, kdp 강화주인 NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK 주에서는, pH 4.5 및 pH 4.9의 산성 조건하에서, 생육의 개선을 볼 수 있었다. 따라서, 이들의 결과로부터 kdp 오페론의 강화에 의한, 생육 개선 효과와 L-글루탐산 생산 속도의 향상 효과가 분명해졌다.
(4) kdp 오페론 프로모터 치환주의 S-jar 배양 평가
다음에 kdp 오페론의 증강이, L-글루탐산 생산에 주는 영향을 검토하기 위해서, NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK 주와 NA1/pSTV-yhfK 주를 사용하여, L-글루탐산 생산배양을 실시하였다.
배양은 균체를 형성시키는 종배양과 L-글루탐산을 생성하는 본 배양의 2단계로 나누어 실시하였다.
종배양은 이하의 배지 조성으로 실시하였다.
[종배양 배지 조성]
수크로스 50g/L
MgSO4·7H20 0.4g/L
GD113(소포제) 0.1mL/L
(NH4)2SO4 4.0g/L
KH2PO4 2.0g/L
효모 추출물 4.0g/L
FeSO4·7H20 0.01g/L
MnSO4·5H20 0.01g/L
시트르산 0.02g/L
L-리신염산염 0.4g/L
DL-메티오닌 0.4g/L
ε-디아미노피멜산 0.4g/L
판토텐산칼슘 18mg/L
테트라사이클린염산염 12.5mg/L
클로람페니콜 25mg/L
120℃, 20분간 증기 멸균을 실시하였다.
NA1:Ptac-kdp/pSTV-yhfK 주와 NA1/pSTV-yhfK 주를 L 배지(박토트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 한천 15g을 순수 1L에 포함하는 배지, pH 7.0)에, 최소 배지 성분(글루코스 0.5g, 황산마그네슘 2mM, 인산1칼륨 3g, 염화나트륨 0.5g 염화 암모늄 1g, 인산2나트륨 6g을 순수 1L에 포함하는 배지) 및, 12.5mg/L 테트라사이클린과 25mg/L 클로람페니콜을 가한 배지에서 전배양하여, 플레이트 1장분을 상기의 조성의 배지를 300mL 가득 채운 1L용 미니 jar에 식균하고, 34℃, pH 6.0에서 통기 1/1vvm, 산소 농도가 3% 이상이 되도록 약 12시간 교반 제어를 실시하였다. 배양 중의 pH는 6.0이 되도록 암모니아 가스를 첨가함으로써 조정을 실시하였다. 배지 중의 당의 고갈을 지표로 종배양을 종료하였다.
본 배양 배지 조성은 이하에 나타낸다.
[배양 배지 조성] (20% 종배양액을 식균한 후의 농도)
수크로스 100g/L
MgSO4·7H2O 0.4g/L
GD113 0.1mL/L
(NH4)2SO4 5.0g/L
KH2PO4 6.0g/L
효모 추출물 6.0g/L
FeSO4·7H2O 0.02g/L
MnSO4·5H20 0.02g/L
시트르산 0.02g/L
베타인* 2.0g
L-리신염산염 0.8g/L
DL-메티오닌 0.6g/L
ε-디아미노피멜산 0.6g/L
판토텐산칼슘 18mg/L
테트라사이클린염산염 25mg/L
클로람페니콜 25mg/L
*: N-N-N-트리메틸글리신
종배양에서 수득된 균체 60mL을 상기 조성의 배지를 240mL 가득 채운 1L용 미니 jar에 주입하고, pH 4.7에서 배양을 실시하였다. 본 배양 개시 16시간후에 배양을 종료하였다. 배양액 중의 균체 농도 및 L-글루탐산 농도는 경시적으로 측정하였다. 균체 농도는 101배로 물로 희석한 배양액을 사용하여, 620nm의 탁도를 분광 광도계(U-2000A 히타치세사쿠쇼)로 측정함으로써 조사하였다. L-글루탐산 농 도는, 배양액 상청을 적당 배율로 물로 희석한 후에, 바이오텍애널라이저(AS-210 사쿠라에스아이(주))에 의해 측정하였다.
결과를, 표 1 및 도 5에 나타낸다. kdp 오페론 강화주인 NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK 주는, 비교 대조주 NA1/pSTV-yhfK와 비교하여, 생육이 향상되고, L-글루탐산의 축적, L-글루탐산의 생산 속도 모두 향상되는 것이 판명되었다.
NA1/pSTVyhfK NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK
생성 L-글루탐산 (g/Jar) 15.8 19.0
L-글루탐산 생산 속도 (g/L/hr) 3.30 3.96
[실시예 2] L-트레오닌을 축적하는 에세리키아 콜라이에 있어서의 kdp 오페론의 증폭
(1) kdp 오페론 증폭용 플라스미드의 구축
에세리키아속 세균에 kdp 오페론을 도입하기 위해서, 공지의 플라스미드 pMW218[참조: 타카라슈조(주)]를 사용하여, kdp 오페론 증폭용 플라스미드를 구축한다.
우선 pMW218을 제한 효소 HindIII와 BamHI로 분해하여, 페놀·클로로포름 용액을 가하고, 혼합하여 반응을 정지시킨다. 반응액을 원심분리한 후, 상층을 회수하여, 에탄올 침전으로 DNA를 회수한다. 한편, kdp 오페론은, 에세리키아 콜라이MG1655로부터 추출한 염색체를 주형으로 하여, 서열번호 55 및 56에 나타내는 DNA 프라이머를 사용하여 PCR(변성 94℃-10초, 어닐링 60℃-30초, 신장 반응 72℃-120초)에 의해 증폭시킨다. PCR 반응에는 Pyrobest DNA 폴리머라제[참조: 타카라슈조(주)]를 사용한다. 수득된 kdp 오페론 단편을 제한 효소 HindIII와 BamHI로 분해하여, 페놀·클로로포름 용액을 가하고, 혼합하여 반응을 정지시킨다.
상기한 바와 같이 조정한 pMW218 분해물과 kdpABC 유전자 영역 단편을, DNA Ligation Kit Ver.2[참조: 타카라슈조(주)]를 사용하여 연결시켰다. 이러한 연결 반응 용액으로 에세리키아 콜라이(이.콜라이 JM109 컴피턴트 세포, 타카라슈조(주))를 형질전환하여, 50mg/L의 카나마이신을 포함하는 LB 한천 배지에 도포하여, 37℃에서 하룻밤 보온한다. 한천 배지 위에 출현한 콜로니를 50mg/L의 카나마이신을 포함하는 LB 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 8시간 동안 진탕 배양한다. 알칼리-SDS법으로 각 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하여, 제한 효소에서의 분해에 의해, 구조를 확인하여, pMW218kdp를 수득한다.
(2) 트레오닌을 축적하는 에세리키아 콜라이 B-3996으로의 pMW218kdp의 도입과 아미노산 제조
상기한 바와 같이 하여 수득된 pMW218kdp를 전기천공법[참조: Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)]에 의해 VKPM B-3996에 도입한다.
수득된 형질전환주(본 균주를「B-3996/pMW218kdp」라고 한다), 및 대조로서 pMW218를 도입한 주(본 균주를「B-3996/pMW218」라고 한다)에 관해서, 이하와 같이 배양하여, 배양 상청 중의 L-트레오닌 농도를 조사한다.
각 형질전환주를, 50mg/L의 카나마이신 및 20mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 LB 액체 배지 3mL에 식균하고, 37℃에서 하룻밤, 시험관 배양한 후, 배양액 200㎕을 50mg/L의 카나마이신 및 20mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 트레오닌 생산 배지(20ml)에 식균하여, 37℃에서 24시간 동안 진탕 배양한다. 배양 종료후, 균체를 원심분리에 의해 제거하여, 배양 상청 중에 포함되는 L-트레오닌 농도를 아미노산 분석 장치(L-8500 히타치세사쿠쇼)를 사용하여 측정한다. kdp 오페론 증폭주 B-3996/pMW218kdp에서는, 대조인 B-3996/pMW218주와 비교하여, 배지 중의 L-트레오닌 축적량이 향상되는 것을 알 수 있다.
[트레오닌 생산 배지]
D-글루코스 40g/L
(NH4)2SO4 16g/L
KH2PO4 1.0g/L
MgSO4·7H2O 1.0g/L
FeSO4·7H2O 0.01g/L
MnSO4·7H2O 0.01g/L
L-이소류신 50mg/L
DL-메티오닌 500mg/L
탄산칼슘 0.6g/L
스트렙토마이신 20mg/L
카나마이신 50mg/L
수산화칼륨으로 pH 7.5로 조정하였다.
115℃, 10분간 증기 멸균을 실시하였다.
[서열표의 설명]
서열번호 1: 에세리키아 콜라이의 kdp 오페론의 염기 서열(kdpA, kdpB, kdpC의 아미노산 서열 병기)
kdpF: 457 내지 546
kdpA: 546 내지 2219
kdpB: 2242 내지 4290
kdpC: 4299 내지 4871
kdpD: 4864 내지 7548
kdpE: 7545 내지 8222
서열번호 2: KdpA의 아미노산 서열
서열번호 3: KdpB의 아미노산 서열
서열번호 4: KdpC의 아미노산 서열
서열번호 5: KdpD의 아미노산 서열
서열번호 6: KdpE의 아미노산 서열
서열번호 5: KdpD 오페론의 염기 서열(SDHC의 아미노산 서열 병기)
서열번호 7: 판토에아 아나나티스 kdp 오페론의 염기 서열(kdpA, kdpB, kdpC, kdpD의 아미노산 서열 병기)
kdpA: 543 내지 2225
kdpB: 2228 내지 4273
kdpC: 4284 내지 4853
kdpD: 4867 내지 7542
서열번호 8: KdpA의 아미노산 서열
서열번호 9: KdpB의 아미노산 서열
서열번호 10: KdpC의 아미노산 서열
서열번호 11: KdpD의 아미노산 서열
서열번호 12: 판토에아 아나나티스 kdpE 유전자의 염기 서열
서열번호 13: KdpE의 아미노산 서열
서열번호 14: 판토에아 아나나티스의 hisD 유전자의 염기 서열
서열번호 15: Kmr 유전자의 hisD 유전자로의 편입을 위한 단편의 증폭용 프라이머
서열번호 16: Kmr 유전자의 hisD 유전자로의 편입을 위한 단편의 증폭용 프라이머
서열번호 17: cat 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 18: cat 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 19: sacB 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 20: sacB 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 21: PlacUV5 프로모터를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 22: PlacUV5 프로모터를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 23: λRedαβγ유전자 및 tL3을 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 24: λRedαβγ유전자 및 tL3을 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 25: PlacUV5 프로모터 및 TrrnB를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 26: PlacUV5 프로모터 및 TrrnB를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 27: attL 증폭용 프라이머
서열번호 28: attL 증폭용 프라이머
서열번호 29: attL의 염기 서열
서열번호 30: attR 증폭용 프라이머
서열번호 31: attR 증폭용 프라이머
서열번호 32: attR의 염기 서열
서열번호 33: bla 유전자를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 34: bla 유전자를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 35: ter_rrnB를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 36: ter_rrnB를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 37: ter_thrL 터미네이터를 포함하는 DNA 단편의 염기 서열
서열번호 38: ter-thrL 터미네이터를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 39: ter_thrL 터미네이터를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 40: gltA 유전자의 ORF 이외의 부분을 증폭시키기 위한 프라이머
서열번호 41: gltA 유전자의 ORF 이외의 부분을 증폭시키기 위한 프라이머
서열번호 42: prpC 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 43: prpC 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 44: 판토에아 아나나티스의 yghU 유전자의 염기 서열
서열번호 45: 판토에아 아나나티스의 scrK 유전자의 염기 서열
서열번호 46: 판토에아 아나나티스의 lacZ 유전자의 염기 서열
서열번호 47: Ptac 프로모터를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 48: Ptac 프로모터를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 49: Km 내성 유전자를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 50: Km 내성 유전자를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 51: tac 프로모터에 연결한 kdp 오페론 상류 서열 증폭용 프라이머
서열번호 52: tac 프로모터에 연결한 kdp 오페론 상류 서열 증폭용 프라이머
서열번호 53: kdp 오페론 상류 구조 확인용 프라이머
서열번호 54: kdp 오페론 상류 구조 확인용 프라이머
서열번호 55: kdp 오페론 증폭용 프라이머
서열번호 56: kdp 오페론 증폭용 프라이머
서열번호 57: 판토에아 아나나티스와 에세리키아 콜라이의 KdpA의 아미노산 서열의 공통 서열
서열번호 58: 판토에아 아나나티스와 에세리키아 콜라이의 KdpB의 아미노산 서열의 공통 서열
서열번호 59: 판토에아 아나나티스와 에세리키아 콜라이의 KdpC의 아미노산 서열의 공통 서열
본 발명의 미생물을 사용함으로써, 효율이 양호하고, L-글루탐산, L-리신, L-트레오닌, L-아르기닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-발린, L-류신, L-트레오닌, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판, 또는 L-시스테인, L-글루탐산 등의 L-아미노산을 발효 생산할 수 있다. 본 발명의 미생물은, 바람직한 형태로서는, L-아미노산의 생산량 및 생산 속도 모두 우수하다.
<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Microorganism capable of producing L-amino acid, and method for production of L-amino acid <130> C874-C7269 <150> JP 2007-011392 <151> 2007-01-22 <150> JP 2007-131763 <151> 2007-05-17 <160> 59 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8501 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (546)..(2219) <220> <221> CDS <222> (2242)..(4290) <220> <221> CDS <222> (4299)..(4871) <400> 1 cgaccagacg cgatgcaggt agctgtaaaa gcgggcgcgg tctttccaga aaagcatgaa 60 aggcagcgcc agaacgcccg ctgcaaccgc ataagtacgg cgtaaaaaga taagccatgc 120 aggatattct ctgtagagtt ccatactttt ctcccccttt tgtatctacc cggtgaatgg 180 caccggaaaa atgaatttgt ttatctgatg aaaatagtac cgccttttgt gtaattttac 240 tactcatccg accacttatt tttgcttatt gatggtttat ttacattcat cctgtaatta 300 agttacacaa aagttaaatt aatactaaac attagttaaa tcatggcttt tgccattttt 360 atactttttt tacaccccgc ccgcagattt ttgcgaaatc tttgcagcca gaattctacc 420 cttccggtat cacttttagg ccactggagg tgcactgtga gtgcaggcgt gataaccggc 480 gtattgctgg tgtttttatt actgggttat ctggtttatg ccctgatcaa tgcggaggcg 540 ttctg atg gct gcg caa ggg ttc tta ctg atc gcc acg ttt tta ctg gtg 590 Met Ala Ala Gln Gly Phe Leu Leu Ile Ala Thr Phe Leu Leu Val 1 5 10 15 tta atg gtg ctg gcg cgt cct tta ggc agc ggg ctg gcg cgg ctg att 638 Leu Met Val Leu Ala Arg Pro Leu Gly Ser Gly Leu Ala Arg Leu Ile 20 25 30 aat gac att cct ctt ccc ggt aca acg ggc gtt gag cgc gta ctt ttt 686 Asn Asp Ile Pro Leu Pro Gly Thr Thr Gly Val Glu Arg Val Leu Phe 35 40 45 cgc gca ctt ggc gtc tct gac cgt gag atg aac tgg aag caa tat ctt 734 Arg Ala Leu Gly Val Ser Asp Arg Glu Met Asn Trp Lys Gln Tyr Leu 50 55 60 tgt gcc att ctc ggc ctg aac atg ctg ggg ctg gcg gtg ctg ttt ttt 782 Cys Ala Ile Leu Gly Leu Asn Met Leu Gly Leu Ala Val Leu Phe Phe 65 70 75 atg ttg ctc ggt cag cac tat ctg ccg ctt aat cca cag cag ttg cca 830 Met Leu Leu Gly Gln His Tyr Leu Pro Leu Asn Pro Gln Gln Leu Pro 80 85 90 95 ggg ctg tcg tgg gat ctg gcg ctg aat acc gcc gtc agc ttt gtc acc 878 Gly Leu Ser Trp Asp Leu Ala Leu Asn Thr Ala Val Ser Phe Val Thr 100 105 110 aat acc aac tgg caa tct tat agc ggt gaa acc acg ttg agc tat ttc 926 Asn Thr Asn Trp Gln Ser Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Leu Ser Tyr Phe 115 120 125 agc cag atg gcg ggc tta acg gtg caa aac ttt ctt tct gcc gcc agc 974 Ser Gln Met Ala Gly Leu Thr Val Gln Asn Phe Leu Ser Ala Ala Ser 130 135 140 ggg att gcg gtg att ttt gcc ctc atc cgt gcg ttt acc cgc cag agc 1022 Gly Ile Ala Val Ile Phe Ala Leu Ile Arg Ala Phe Thr Arg Gln Ser 145 150 155 atg agc acg ctc ggg aat gcc tgg gtc gat ctg cta cgc atc acg tta 1070 Met Ser Thr Leu Gly Asn Ala Trp Val Asp Leu Leu Arg Ile Thr Leu 160 165 170 175 tgg gtg cta gtc cct gtg gcg ttg ttg att gca ctg ttt ttt att caa 1118 Trp Val Leu Val Pro Val Ala Leu Leu Ile Ala Leu Phe Phe Ile Gln 180 185 190 caa ggt gcg ctg caa aac ttt ctg cct tat cag gct gtg aat acc gtt 1166 Gln Gly Ala Leu Gln Asn Phe Leu Pro Tyr Gln Ala Val Asn Thr Val 195 200 205 gaa gga gcg caa cag ctg tta ccc atg ggg cct gta gct tct cag gaa 1214 Glu Gly Ala Gln Gln Leu Leu Pro Met Gly Pro Val Ala Ser Gln Glu 210 215 220 gcg atc aag atg ctc ggt act aac ggc ggt ggc ttc ttt aat gcc aac 1262 Ala Ile Lys Met Leu Gly Thr Asn Gly Gly Gly Phe Phe Asn Ala Asn 225 230 235 tcg tcg cat ccg ttt gaa aac cca acc gca ctg acc aac ttc gtg cag 1310 Ser Ser His Pro Phe Glu Asn Pro Thr Ala Leu Thr Asn Phe Val Gln 240 245 250 255 atg ctg gcg atc ttc ttg atc cca acg gcg ctg tgc ttt gcc ttt ggt 1358 Met Leu Ala Ile Phe Leu Ile Pro Thr Ala Leu Cys Phe Ala Phe Gly 260 265 270 gaa gtg atg ggc gat cgc cgc cag ggg cgc atg ttg ctg tgg gcg atg 1406 Glu Val Met Gly Asp Arg Arg Gln Gly Arg Met Leu Leu Trp Ala Met 275 280 285 tca gtg att ttt gtc atc tgc gta ggc gtg gtg atg tgg gca gaa gtt 1454 Ser Val Ile Phe Val Ile Cys Val Gly Val Val Met Trp Ala Glu Val 290 295 300 cag ggt aat cct cat ctg ctg gca ctg ggc acg gac agc agc atc aat 1502 Gln Gly Asn Pro His Leu Leu Ala Leu Gly Thr Asp Ser Ser Ile Asn 305 310 315 atg gaa ggt aaa gag agc cgt ttc ggc gtg ctg gtc agt agc ctg ttt 1550 Met Glu Gly Lys Glu Ser Arg Phe Gly Val Leu Val Ser Ser Leu Phe 320 325 330 335 gcg gtc gtg acg acg gcg gct tcc tgt ggc gcg gtg att gcg atg cat 1598 Ala Val Val Thr Thr Ala Ala Ser Cys Gly Ala Val Ile Ala Met His 340 345 350 gat tcg ttt acc gct ctc ggt ggc atg gtg ccg atg tgg ctg atg caa 1646 Asp Ser Phe Thr Ala Leu Gly Gly Met Val Pro Met Trp Leu Met Gln 355 360 365 att ggt gaa gtg gtg ttc ggc ggt gtc ggt tct ggt ctt tac ggc atg 1694 Ile Gly Glu Val Val Phe Gly Gly Val Gly Ser Gly Leu Tyr Gly Met 370 375 380 atg ctg ttt gtc ctg ctg gcg gtg ttt att gcc ggg ctg atg att ggt 1742 Met Leu Phe Val Leu Leu Ala Val Phe Ile Ala Gly Leu Met Ile Gly 385 390 395 cgt aca ccg gaa tat ctg ggt aaa aaa atc gac gta cgc gag atg aaa 1790 Arg Thr Pro Glu Tyr Leu Gly Lys Lys Ile Asp Val Arg Glu Met Lys 400 405 410 415 ctg act gca ctg gca att ctg gtt acc ccg acg ctg gtg ctg atg ggc 1838 Leu Thr Ala Leu Ala Ile Leu Val Thr Pro Thr Leu Val Leu Met Gly 420 425 430 gcg gcg ttg gcg atg atg acc gac gcc gga cgt agc gcc atg ctc aac 1886 Ala Ala Leu Ala Met Met Thr Asp Ala Gly Arg Ser Ala Met Leu Asn 435 440 445 cct ggc ccg cat ggt ttt agc gaa gtg ctg tac gcc gtg tca tcc gcc 1934 Pro Gly Pro His Gly Phe Ser Glu Val Leu Tyr Ala Val Ser Ser Ala 450 455 460 gct aac aac aac ggc agc gcc ttt gcc gga tta agc gcc aac tct ccg 1982 Ala Asn Asn Asn Gly Ser Ala Phe Ala Gly Leu Ser Ala Asn Ser Pro 465 470 475 ttc tgg aac tgt tta ctg gcg ttc tgc atg ttt gtc ggt cgc ttc ggg 2030 Phe Trp Asn Cys Leu Leu Ala Phe Cys Met Phe Val Gly Arg Phe Gly 480 485 490 495 gtg att atc ccg gtg atg gca att gcc ggt tcg ctg gtg agt aaa aag 2078 Val Ile Ile Pro Val Met Ala Ile Ala Gly Ser Leu Val Ser Lys Lys 500 505 510 agc caa gcc gcc agc tcc ggc acg ctg cca acg cac ggc ccg ctg ttt 2126 Ser Gln Ala Ala Ser Ser Gly Thr Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Phe 515 520 525 gtt ggc ctg tta atc ggc acc gtg ttg ctg gtt ggc gca ctg acc ttt 2174 Val Gly Leu Leu Ile Gly Thr Val Leu Leu Val Gly Ala Leu Thr Phe 530 535 540 atc cct gcc ctg gcg ctt ggt ccg gtg gcg gaa tat ctc tcc tga 2219 Ile Pro Ala Leu Ala Leu Gly Pro Val Ala Glu Tyr Leu Ser 545 550 555 tgatattgag tgagcactga at atg agt cgt aaa caa ctg gcg cta ttc gaa 2271 Met Ser Arg Lys Gln Leu Ala Leu Phe Glu 560 565 cca aca ctt gtc gtt cag gcg ctg aaa gaa gcg gtg aaa aaa tta aac 2319 Pro Thr Leu Val Val Gln Ala Leu Lys Glu Ala Val Lys Lys Leu Asn 570 575 580 ccg cag gcg caa tgg cgc aat ccg gtg atg ttt atc gtc tgg atc ggc 2367 Pro Gln Ala Gln Trp Arg Asn Pro Val Met Phe Ile Val Trp Ile Gly 585 590 595 agt ctg ctg acc acc tgt att agc atc gcg atg gca agc ggt gcg atg 2415 Ser Leu Leu Thr Thr Cys Ile Ser Ile Ala Met Ala Ser Gly Ala Met 600 605 610 615 ccc ggc aat gcg ctg ttt agc gcg gcc att agc ggt tgg ctg tgg atc 2463 Pro Gly Asn Ala Leu Phe Ser Ala Ala Ile Ser Gly Trp Leu Trp Ile 620 625 630 acc gta ctg ttc gct aat ttc gcc gag gcg ctg gca gaa ggc cgc agt 2511 Thr Val Leu Phe Ala Asn Phe Ala Glu Ala Leu Ala Glu Gly Arg Ser 635 640 645 aaa gcg cag gcc aac agt ctg aaa ggg gtg aaa 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ggc gca cag cga cgc aaa acg ccg aac gaa 2895 Met Ile Ala Met Val Glu Gly Ala Gln Arg Arg Lys Thr Pro Asn Glu 760 765 770 775 att gcc ctg acc att ctg ctg att gcc ctg act atc gtc ttt tta ctg 2943 Ile Ala Leu Thr Ile Leu Leu Ile Ala Leu Thr Ile Val Phe Leu Leu 780 785 790 gca acc gcc acg ctg tgg ccg ttt tcc gcg tgg ggc ggt aat gca gtc 2991 Ala Thr Ala Thr Leu Trp Pro Phe Ser Ala Trp Gly Gly Asn Ala Val 795 800 805 agc gta acg gta ctg gtg gcg ctg ctg gtc tgt ctg atc cca acc act 3039 Ser Val Thr Val Leu Val Ala Leu Leu Val Cys Leu Ile Pro Thr Thr 810 815 820 att ggc ggc ctg ttg tca gcg atc ggc gtc gcc ggg atg agc cgg atg 3087 Ile Gly Gly Leu Leu Ser Ala Ile Gly Val Ala Gly Met Ser Arg Met 825 830 835 cta ggc gcg aat gtg att gcc acc agc gga cgt gca gtt gaa gcg gca 3135 Leu Gly Ala Asn Val Ile Ala Thr Ser Gly Arg Ala Val Glu Ala Ala 840 845 850 855 ggt gac gtt gac gtt ctg cta ctg gat aaa acc ggc acc atc aca ctc 3183 Gly Asp Val Asp Val Leu Leu Leu Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr Leu 860 865 870 ggt aac cgt cag gcg tcg gag ttt atc ccc gcg cag ggc gtg gat gaa 3231 Gly Asn Arg Gln Ala Ser Glu Phe Ile Pro Ala Gln Gly Val Asp Glu 875 880 885 aaa acg ctg gct gac gcc gca caa ctg gct tcg ctg gct gat gaa acg 3279 Lys Thr Leu Ala Asp Ala Ala Gln Leu Ala Ser Leu Ala Asp Glu Thr 890 895 900 ccg gaa ggc cgc agt att gtg atc ctc gcc aag cag cgt ttt aac ctg 3327 Pro Glu Gly Arg Ser Ile Val Ile Leu Ala Lys Gln Arg Phe Asn Leu 905 910 915 cgc gag cgc gat gtg cag tcg ctc cat gcc acc ttt gta ccg ttt act 3375 Arg Glu Arg Asp Val Gln Ser Leu His Ala Thr Phe Val Pro Phe Thr 920 925 930 935 gcg caa agc cgg atg agc ggg atc aac atc gac aac cgc atg atc cgt 3423 Ala Gln Ser Arg Met Ser Gly Ile Asn Ile Asp Asn Arg Met Ile Arg 940 945 950 aaa ggt tct gtc gat gcc att cgt cgc cat gtt gag gct aac ggt ggt 3471 Lys Gly Ser Val Asp Ala Ile Arg Arg His Val Glu Ala Asn Gly Gly 955 960 965 cac ttc cct acc gat gtt gat caa aaa gtc gat cag gtt gcg cgt cag 3519 His Phe Pro Thr Asp Val Asp Gln Lys Val Asp Gln Val Ala Arg Gln 970 975 980 gga gcc acg ccg ctg gtg gtg gtg gaa ggt tct cgt gtg ctg ggc gtt 3567 Gly Ala Thr Pro Leu Val Val Val Glu Gly Ser Arg Val Leu Gly Val 985 990 995 att gcg ctg aaa gat atc gtc aaa ggc ggt att aaa gag cgc ttc 3612 Ile Ala Leu Lys Asp Ile Val Lys Gly Gly Ile Lys Glu Arg Phe 1000 1005 1010 gcc cag ctg cgc aaa atg ggc att aaa acg gtg atg att acc ggc 3657 Ala Gln Leu Arg Lys Met Gly Ile Lys Thr Val Met Ile Thr Gly 1015 1020 1025 gat aac cgt ctg act gcc gcc gcg att gct gcg gaa gcg ggt gtc 3702 Asp Asn Arg Leu Thr Ala Ala Ala Ile Ala Ala Glu Ala Gly Val 1030 1035 1040 gat gat ttt ctc gcc gaa gcg aca ccg gag gcc aag ctg gca ttg 3747 Asp Asp Phe Leu Ala Glu Ala Thr Pro Glu Ala Lys Leu Ala Leu 1045 1050 1055 atc cgt cag tat cag gcg gaa ggt cgt ttg gta gcg atg acc ggc 3792 Ile Arg Gln Tyr Gln Ala Glu Gly Arg Leu Val Ala Met Thr Gly 1060 1065 1070 gac ggc acc aac gat gct ccg gcg ctg gcg cag gca gat gtc gcg 3837 Asp Gly Thr Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ala Gln Ala Asp Val Ala 1075 1080 1085 gtg gcg atg aac tcc ggc acc cag gcg gcg aaa gag gcg ggc aat 3882 Val Ala Met Asn Ser Gly Thr Gln Ala Ala Lys Glu Ala Gly Asn 1090 1095 1100 atg gtc gat ctc gac tct aac ccg acc aag ttg atc gag gtg gtg 3927 Met Val Asp Leu Asp Ser Asn Pro Thr Lys Leu Ile Glu Val Val 1105 1110 1115 cac att ggc aaa cag atg ctg atg acc cgt ggc tcg ctg acc acc 3972 His Ile Gly Lys Gln Met Leu Met Thr Arg Gly Ser Leu Thr Thr 1120 1125 1130 ttc agc att gcc aac gat gtg gcg aaa tac ttc gcc att att ccg 4017 Phe Ser Ile Ala Asn Asp Val Ala Lys Tyr Phe Ala Ile Ile Pro 1135 1140 1145 gcg gca ttc gcg gca acg tat ccg cag tta aat gcg ctg aac atc 4062 Ala Ala Phe Ala Ala Thr Tyr Pro Gln Leu Asn Ala Leu Asn Ile 1150 1155 1160 atg tgc ctg cat tcg ccc gac tcc gca atc ctc agt gcg gtg att 4107 Met Cys Leu His Ser Pro Asp Ser Ala Ile Leu Ser Ala Val Ile 1165 1170 1175 ttc aac gcc ttg att atc gtc ttt ttg att ccc ctg gcg tta aaa 4152 Phe Asn Ala Leu Ile Ile Val Phe Leu Ile Pro Leu Ala Leu Lys 1180 1185 1190 ggc gtg agt tat aaa ccg ctt acc gct tct gcc atg ttg cgc cgt 4197 Gly Val Ser Tyr Lys Pro Leu Thr Ala Ser Ala Met Leu Arg Arg 1195 1200 1205 aac tta tgg att tac ggt ctg ggt ggg ctg ctg gtg ccg ttt atc 4242 Asn Leu Trp Ile Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Leu Val Pro Phe Ile 1210 1215 1220 ggt atc aaa gtc att gat tta ctg ctg acc gtt tgc ggt ctg gtg 4287 Gly Ile Lys Val Ile Asp Leu Leu Leu Thr Val Cys Gly Leu Val 1225 1230 1235 tga ggtttacc atg agt gga tta cgt ccg gca tta tca aca ttt atc 4334 Met Ser Gly Leu Arg Pro Ala Leu Ser Thr Phe Ile 1240 1245 1250 ttt ctg tta ttg att act ggc ggc gtt tac ccg ctg ctg acc acc 4379 Phe Leu Leu Leu Ile Thr Gly Gly Val Tyr Pro Leu Leu Thr Thr 1255 1260 1265 gta ctg ggg caa tgg tgg ttt ccc tgg cag gcc aat ggt tcg ttg 4424 Val Leu Gly Gln Trp Trp Phe Pro Trp Gln Ala Asn Gly Ser Leu 1270 1275 1280 att cgt gaa ggt gat acg gtg cgc ggt tcg gca tta atc ggg cag 4469 Ile Arg Glu Gly Asp Thr Val Arg Gly Ser Ala Leu Ile Gly Gln 1285 1290 1295 aat ttt acc ggc aac ggc tat ttt cat ggt cgc ccg tcg gca acg 4514 Asn Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Phe His Gly Arg Pro Ser Ala Thr 1300 1305 1310 gca gaa atg ccc tat aat cca cag gct tct ggc ggg agc aat ctg 4559 Ala Glu Met Pro Tyr Asn Pro Gln Ala Ser Gly Gly Ser Asn Leu 1315 1320 1325 gcg gtc agt aac cct gag ctg gat aaa cta ata gcc gca cgc gtt 4604 Ala Val Ser Asn Pro Glu Leu Asp Lys Leu Ile Ala Ala Arg Val 1330 1335 1340 gct gca tta cgg gcc gct aac ccg gat gcc agc gcg agc gtt ccg 4649 Ala Ala Leu Arg Ala Ala Asn Pro Asp Ala Ser Ala Ser Val Pro 1345 1350 1355 gtt gaa ctg gtg acg gca tcg gca agc ggg ctg gac aat aat atc 4694 Val Glu Leu Val Thr Ala Ser Ala Ser Gly Leu Asp Asn Asn Ile 1360 1365 1370 acc ccg caa gcg gcg gcc tgg caa atc cca cgc gtg gcg aaa gcg 4739 Thr Pro Gln Ala Ala Ala Trp Gln Ile Pro Arg Val Ala Lys Ala 1375 1380 1385 cgt aat ctc agc gtt gaa cag ctc acg caa ctg atc gca aaa tac 4784 Arg Asn Leu Ser Val Glu Gln Leu Thr Gln Leu Ile Ala Lys Tyr 1390 1395 1400 agc caa caa ccg ctg gtg aaa tat atc ggc cag ccg gtt gtc aac 4829 Ser Gln Gln Pro Leu Val Lys Tyr Ile Gly Gln Pro Val Val Asn 1405 1410 1415 att gtt gaa ctc aat ctg gcg ctg gat aaa ctt gat gaa taa 4871 Ile Val Glu Leu Asn Leu Ala Leu Asp Lys Leu Asp Glu 1420 1425 cgaaccctta cgtcccgacc ccgatcgtct gctggaacaa actgccgcgc cgcatcgggg 4931 gaagctgaaa gttttcttcg gtgcctgtgc aggcgtcggg aagacctggg cgatgctggc 4991 agaagcccag cgactgcggg cgcaagggct ggatattgtg gttggcgtgg tagaaaccca 5051 cgggcgaaaa gataccgccg ccatgctgga agggctggct gttctgccgt taaaacgcca 5111 ggcgtaccgt gggcggcata tcagcgagtt tgatctcgat gccgccctcg cccgccgccc 5171 ggcgctgatc ttaatggacg aactggcgca cagtaatgcg ccaggttccc gtcatcccaa 5231 acgctggcag gatatcgaag aactgctgga agctggcatt gatgttttca ctaccgtcaa 5291 cgttcagcat ctggaaagtc tgaatgatgt ggtcagcggc gtcaccggaa ttcaggtacg 5351 ggaaaccgtg cccgatcctt ttttcgatgc cgccgacgac gtggtgctgg tggacttgcc 5411 cccggacgat ctgcgccagc ggctgaaaga aggcaaagtc tatattgccg ggcaggcgga 5471 gcgcgccatt gaacattttt tccgcaaagg taatctgatc gccctgcgcg aactggcact 5531 gcgccgtact gccgatcgcg ttgatgagca aatgcgcgcc tggcgggggc atcctggcga 5591 agagaaagtg tggcacacgc gcgacgcgat ccttttatgc atcggccata acaccggcag 5651 cgaaaaactg gtccgcgcag cggcgcggct ggcgtcacgg ctgggtagcg tctggcacgc 5711 ggtgtatgtt gaaacccctg ccctgcaccg cttaccggaa aaaaaacgtc gggcaattct 5771 cagcgcctta cgtctggcgc aggaactggg cgcggagacg gcaacacttt ctgatccagc 5831 ggaagagaaa gcggtagtgc gttatgcccg tgaacataat ctcggcaaga ttattctcgg 5891 tcgcccggcc tcgcgccgct ggtggcgtcg ggaaacgttt gctgaccgac tggcgcgcat 5951 cgcccccgat ctcgatcagg tgctggtcgc gcttgatgaa ccacccgccc gcacgattaa 6011 caacgcgccg gataaccgct cttttaaaga caagtggcgt gtacaaattc agggatgcgt 6071 ggttgccgcc gcgttatgcg ccgttatcac cttaattgcc atgcagtggc tgatggcgtt 6131 tgatgccgcc aacctggtga tgctgtatct gcttggcgtg gtggtggtgg cgctatttta 6191 tggacgctgg ccttcagtgg ttgccaccgt cattaatgta gtgagtttcg atctcttttt 6251 tatcgcccca cgcggcacgc tcgccgtctc tgatgtgcaa tatctgctga ccttcgcggt 6311 gatgttaacc gtcgggctgg tgatcgggaa ccttactgct ggcgtgcgtt atcaggcgcg 6371 ggtagcccgt taccgcgagc 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tgaaatatgc gggtgcgcag gccgaaattg gtatcgatgc 7271 ccacgttgag ggcgaaaatc tacaactgga tgtctgggat aacggccccg gtcttccgcc 7331 aggccaggag cagacgatat ttgataagtt tgctcgcggg aataaagagt cggcagtacc 7391 gggggtaggg cttggactgg caatttgtcg ggcgatagtg gatgtacacg ggggcactat 7451 taccgcgttc aaccgaccgg aaggtggtgc ctgttttcgt gttacacttc cccagcaaac 7511 tgcccctgaa cttgaagaat ttcatgagga tatgtgacaa acgttctgat tgttgaagat 7571 gaacaggcta ttcgtcgctt tctgcgcacg gcgctggagg gcgacgggat gcgcgtcttt 7631 gaggccgaaa cgctgcaacg cggcttgctg gaagcggcaa cccgtaagcc agatttgatt 7691 attctcgatc tcggcctgcc cgatggtgat gggattgagt ttatccgcga cctgcgccag 7751 tggagcgcgg tgccggtgat tgtgctttcc gcacgcagcg aagagagcga caaaatcgcc 7811 gcgctggatg ccggagcgga tgattatctg agtaagccgt ttggcattgg cgaattgcag 7871 gcccgtctgc gcgtcgcatt acgccgccac tctgccacca ccgcgcccga tccgctggta 7931 aaattttccg atgttaccgt cgatttagcc gcccgcgtga ttcaccgggg tgaggaagag 7991 gtgcatctca caccaattga gttccgcctg ctggcggtgc tgctcaacaa tgccggaaaa 8051 gtactcaccc agcgccagct 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gaa gat att gtc ctg 7170 Lys Gly Arg Glu Val Glu Leu Asp Leu Pro Glu Asp Ile Val Leu 2185 2190 2195 atc aaa ggc gac agt acg ttg ctg gag cgg gta ttt acc aac ctg 7215 Ile Lys Gly Asp Ser Thr Leu Leu Glu Arg Val Phe Thr Asn Leu 2200 2205 2210 att gaa aac agc ctg aag tac gct ggc aac tgt gcg ccc cgc ggc 7260 Ile Glu Asn Ser Leu Lys Tyr Ala Gly Asn Cys Ala Pro Arg Gly 2215 2220 2225 ata cgt gcc tgg tgt gaa aat acc cgg ctg gaa atc gcc atc tgg 7305 Ile Arg Ala Trp Cys Glu Asn Thr Arg Leu Glu Ile Ala Ile Trp 2230 2235 2240 gac ggc ggg ccg ggc atc gcc caa aac gac ctg acg cgg att ttc 7350 Asp Gly Gly Pro Gly Ile Ala Gln Asn Asp Leu Thr Arg Ile Phe 2245 2250 2255 gac aaa ttt tca cgc ggt gat aaa gaa tcg gcc gta ccg ggc gtt 7395 Asp Lys Phe Ser Arg Gly Asp Lys Glu Ser Ala Val Pro Gly Val 2260 2265 2270 ggg ctg gga ctg gcg att tgt aaa acg att atc gaa agc cac ggc 7440 Gly Leu Gly Leu Ala Ile Cys Lys Thr Ile Ile Glu Ser His Gly 2275 2280 2285 ggt cag atc tgg gcg gaa aat cgt gct gaa ggc ggt gcc tgc ttt 7485 Gly Gln Ile Trp Ala Glu Asn Arg Ala Glu Gly Gly Ala Cys Phe 2290 2295 2300 cgt ctc tct tta cca ctt cca ccc gtt cct gaa att tct cct gaa 7530 Arg Leu Ser Leu Pro Leu Pro Pro Val Pro Glu Ile Ser Pro Glu 2305 2310 2315 ggc ttg aaa taa cttcacagat gatcggttat aatgcgcgac cttactgatt 7582 Gly Leu Lys 2320 atgattggga aattatggaa cgttttaccg aaaacctg 7620 <210> 8 <211> 560 <212> PRT <213> Pantoea ananatis <400> 8 Met Ala Ala Asn Ala Phe Leu Leu Ile Ala Val Tyr Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Met Val Met Ala Gln Pro Leu Gly Arg Gly Leu Ala Ala Leu Val Ala 20 25 30 Asp Lys Pro Leu Phe Ala Arg Ala Glu Ala Leu Leu Trp Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Val Gln Glu Gly Gly Met Arg Trp Gln His Tyr Leu Leu Ala Ile 50 55 60 Leu Val Phe Asn Leu Leu Gly Phe Val Val Leu Leu Ala Ile Leu Met 65 70 75 80 Phe Gln Gly Ala Leu Pro Leu Asn Pro Gln His Leu Pro Gly Leu Ser 85 90 95 Trp Asp Leu Ala Leu Asn Thr Ala Ile Ser Phe Val Thr Asn Thr Asn 100 105 110 Trp Gln Ser Tyr Ala Gly Glu Ser Thr Leu Ser Tyr Phe Ser Gln Met 115 120 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tggcggcgac catcgaaacc ctggcggccg ctgaacagct gcacgcccac 1260 aaaaatgccg tcacgttgcg cgttgccgca ctcaaggagc aagcatga 1308 <210> 15 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 15 ccatagcggt tggagatcgc aatgcattgc tgcatatccc tgaagcctgc ttttttatac 60 taagttgg 68 <210> 16 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 16 gcccgccagg cactggaaag cagccgcctg atcgtcgccc cgctcaagtt agtataaaaa 60 agctgaac 68 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 17 tagcgagatc tctgatgtcc ggcggtgctt ttg 33 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 18 aaaaagagct cttacgcccc gccctgccac tc 32 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 19 caggatctag aaggagacat gaacgatgaa catc 34 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 20 gataaggatc cgaaataaaa gaaaatgcca atagga 36 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 21 cctttgagct cgcgggcagt gagcgcaacg c 31 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 22 ctagagcggc cgccgatcgg gatcctcctg tgtgaaattg ttatccgc 48 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 23 ctctacgatc gaggaggtta taaaaaatgg atattaatac tg 42 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 24 tcaaagcggc cgcttcttcg tctgtttcta ctggta 36 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 25 cctttggtac cgcgggcagt gagcgcaacg c 31 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 26 aacaggaatt ctttgcctgg cggcagtagc gcgg 34 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer P1 <400> 27 ctagtaagat cttgaagcct gcttttttat actaagttgg 40 <210> 28 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer P2 <400> 28 atgatcgaat tcgaaatcaa ataatgattt tattttgact g 41 <210> 29 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA fragment containing attL <400> 29 agatcttgaa gcctgctttt ttatactaag ttggcattat aaaaaagcat tgcttatcaa 60 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agatcaaccc caactccaaa 300 atcccggcac tgtgcgatca ttcagccaca ccaccgattc gcgtatttga atccggtaac 360 atcctgctct atctggcgga aaaatacggt tatttcctgc cgaaagatcc ggccaaacgc 420 accgaaacgc tgaactggct gttctggctg caaggctcag ccccttacct tggcggcggc 480 tttggtcact tctatcatta cgcgccagaa aagattgaat acgccatcaa ccgcttctca 540 ctggaagcca aacgtcagtt tgacgtgctg gaccgtcagc ttgccgataa ccgttatctg 600 gcgggtgacg attacaccat cgccgatatc gccacctggc cgtggtacgg cagcatggtg 660 ctgtataacc agtacaatgc ggcagaattc ctcgaccttc agtcctacaa aaatgtggtg 720 cgctgggccg aagagatcgc tctgcgtccg gccgttatgc gcggccgcaa ggtgaaccgt 780 gtgatgggcg aacccgccga tcagctgcgc gagcgccatg acgcatcgga ctttgatacg 840 caaacccaag acaagcaagc ctga 864 <210> 45 <211> 918 <212> DNA <213> Pantoea ananatis <400> 45 atgtcagcac gagtctggtg tctgggtgat gccgtggtgg acctgcttcc ggacgggccg 60 gggcatttaa tacagtgtgc aggcggggcg cccgccaatg tggcggtggg cattgcccgc 120 ttacagggcc gcagcgggtt tattggccgg gttggggacg atccttttgg tcactttatg 180 cagcacacgc tggcgactga acaggttgat acccgctata tgacgctgga cagcgcccag 240 cgcacctcaa cggtggtggt ggcgctggat caggaaggtg agcggacttt tacctttatg 300 gtgcgcccca gtgcagatct gtttctggaa caaggcgatc tccccaggtt tgagcaaggt 360 gaatggcttc actgctgctc aattgccctg gcggcagaac cttcgcgctc caccaccttt 420 tctgccatgc agcagatcag cgatgccggt ggctttgtga gctttgatcc caatattcgt 480 cacgatctgt ggcacgacga tgcccaactg cgggactgtg tgaaccgggc gttacagctg 540 gccgatgtgg tcaagctgtc tgaggaagag ctggcttttc tgactccggg ggcgcaacac 600 gctgacagca tgcaggcgct ggcggaacgc tttgcgatta gcctgctgat ggtcacccag 660 ggcaaggcag gagtgaaagt ctggcatcag ggtaaacatt atcactatcc cacgctgcct 720 gtggtgagcg tggacaccac cggcgcaggg gatgcgtttg tcgccgggct gctatggggg 780 ctggcggaaa aggggatgcc cgctaatgag gccgagctgg cggcacgact cagcagcgca 840 cagcagtgtg gggcgctggc gacgacggca aaaggggcca tgaccgcgtt gccttatcgt 900 caccaaattg aaggatga 918 <210> 46 <211> 3095 <212> DNA <213> Pantoea ananatis <400> 46 agactgccat gaccctggac agagattcat tagcggccgt actcgcccgg cgcgactggg 60 aaaaccccgg cgtcagcgaa cataaccggc tggaagccca tccgccgttt tacagctggc 120 gcagcgctga ggcggcccat aacaacgcgc catcggcgca gcgaaaaagc ctgagcggcg 180 aatggacgtt tgcctttttc cctgcgcccg aggcggtgcc ggatagctgg cgcacccagg 240 atttgcaggc ggcagcgacg attaccgtgc cgtcagtctg gcaaatgcag ggctatgatg 300 ttccgattta caccaatgtt acctatccca ttccggttga tcccccgcgc gttccggctg 360 aaaatcctac gggatgttat tcgctcacat ttaatgtgga tgcagactgg ctgcaacatg 420 gacaaacccg aattattttt gacggcgtga attcagcctt ctatctctgg tgcaacggac 480 gctgggtggg ctacgggcag gacagccgct tgccgtctga atttgatctg agcgaatttc 540 tgcgcgaagg tgaaaatcgc ctggcggtga tggtgttgcg ctggagcgat ggcagctatc 600 tggaagatca ggatatgtgg cgcatgagtg gtattttccg cgatgtttcc ctgctgcata 660 agcctgccag ccatcttcgc gatctgcgca ttcgtacgca tttcaatgac gatttcagtc 720 gtgcgcggct ggaagctgag gtgcgggttg ccggagcact ggatgacgat ttacgggtca 780 gcgtgcagct cttcgcgggt gacacgctaa ccggagaagc gacgtcgccc ttgggcagcg 840 cgattattga cgagcgcggc gcgtggagcg atcggacaac gctgtgcatc aacgttgcta 900 accctgcgct gtggagtgcg gaaacgccgc atctctaccg ggcggttgtg cagttacacc 960 ggacggacgg tacgctgatt gaggcggagg cctgcgacgt gggattccgg cacgtcagca 1020 tcgaaaatgg cctgctgctg ctcaacggtc agccactgct catccgcggc accaaccgcc 1080 acgagcatca tcctgaacgc ggtcaggtga tggatcgtga cactatggtg caggatattt 1140 tgctgatgaa gcagaataac ttcaacgcgg tgcgctgctc ccattaccct aacgatcccc 1200 tgtggtatag cctgtgtgac cactacggct tgtacgtcgt ggatgaagcc aacatcgaaa 1260 cgcatggcat ggtgccgatg aatcgcctga gcgacgatcc cgtctggctt cccgccatga 1320 gccagcgcgt cacgcgcatg gtgcagcgcg atcgtaatca cccctgcatt attatctggt 1380 cactgggtaa cgaatcgggc cacggtgcta accatgatgc gctctaccgc tggctgaaaa 1440 gtgaagatcc ttcccgcccg gtccagtacg aaggtggcgg ggccaatacc gcagcgaccg 1500 atattatctg tccgatgtat gcgcgggtcg atgaggatca acctttcccg gccgtgccga 1560 aatggtccat taaaaaatgg ctgtctatgc caggcgagca gcgtccgctt attctctgtg 1620 aatatgctca tgccatggga aacagccttg gtggctacgc aaaatactgg caggcatttc 1680 gtcagtatcc tcgcctgcag ggcggttttg tctgggactg ggtcgatcag tcgctcataa 1740 aatatgacga taacggcgaa ccctgggctg cctacggtgg cgactttggt gatacgccta 1800 atgatcgcca gttctgcatg aacgggctgg tctttgccga ccggacgccc catccctcgc 1860 tctacgaagc ccgccatgcg cagcagttct tccagttcag gctgctaccg ggcagcgagc 1920 gcacgctgga agtgaccagc gaatacctgt tccgccacag tgataatgaa atcctgcact 1980 ggtcggtggc tcaggatggc aacctgctgg ccgccggtga agtcacgctg gatatcgcgc 2040 cacagggccg ccagcagatc gcactcccgg aggtgccgct gcctcaatct gcgggccagc 2100 tctggctgac ggtgcgggtg gaacagcctc agccgacggc ctggtcagaa gccggtcata 2160 tcagcgcctg gcagcagtgg ccactggagg cgatcctgaa tgtggccctg ccgcctcagg 2220 cggcgagtgc gccacagctc agccgcggcg aagacacctt cagcgtggcg gtgaacaacc 2280 agcgctgggc attcagccgt cagcagggcg tgctcacgca gtactggatc gacgatcagc 2340 cgcagctcct gtcgccgctg cgcgatcagt ttacccgtgc gccgctggat aacgatatcg 2400 gcgtcagcga agtcacgcgc atcgacccta atgcctgggt cgagcgctgg aaagcggcgg 2460 ggcactatca gtctgaggtc accaccctgc agtgcaccgc cgaagcgctc tccgacgccg 2520 tcgtgatcaa caccgttcat gcctggcagt tccagggcaa aacgctgttt attagccgta 2580 aagtgtaccg tattgatgga tttggcgaga tggcggtgac ggtgaacgta gagatcgcga 2640 gcggcacgcc ttatccggca cgcatcggta tgagctgtca gctcacccag atcgtcgagc 2700 gagtgaactg gctaggcctg gggccgcatg aaaattaccc ggatcgcctg acctcggcct 2760 gctttgaccg ctgggattta ccgctgagtg aaatgtacac cccgtatgtt ttccccaccg 2820 aaaacggcct gcgctgcggc acgcgtgaac tcaactatgg tgcgcaccag tggcgtggcg 2880 atttccagtt caacatcagt cgctacagcc agacacagct gatggaaacc tgccatcgcc 2940 acctgttacg gcctgaggcg ggcacgtggc tcaatattga tggcttccac atgggcgtcg 3000 gcggtgacga ttcctggagc ccgtcggtat caccggaatt cctgctcagt gcaggacgtt 3060 acagctacca gtttatctgg gggcaacaaa aataa 3095 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 47 gcttaagatc tccctgttga caattaatca tcgg 34 <210> 48 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 48 agtacggccg ctaatgaatc tctgtccagg gtcatggcag tctccttgtg tgaaattgtt 60 atccgctcac 70 <210> 49 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 49 ccgttagatc tcgctcaagt tagtataaaa aagctgaac 39 <210> 50 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 50 tagcgggctg atagtgttgt tcagacatga tgaggttcgc cttgaagcct gcttttttat 60 actaagttgg 70 <210> 51 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 51 cgttgggaca acgtcgatct gcgccgaatc tggttgctgg acgccgcctg tgaagcctgc 60 ttttttatac taagttgg 78 <210> 52 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 52 caacagcaga taaaccgcga tcagtaaaaa cgcattggcc gccatggcag tctccttgtg 60 tgaaattgtt atccgctcac 80 <210> 53 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 53 catgtcttct ggtcact 17 <210> 54 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 54 caagcaggtt gaacac 16 <210> 55 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 55 cccaagcttc cctgatcaat gaggaggcgt tc 32 <210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 56 cgggatccga cgatcggggt cgggacgtaa ggg 33 <210> 57 <211> 557 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus sequence of KdpA of P. anantis and E. coli <220> <221> variation <222> 4, 5, 11, 12, 15, 19, 21, 25. 29, 31, 32, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 47, 49, 50, 53, 54, 55, 56, 58, 60, 61, 64, 6, 69, 71, 74, 75, 78, 79, 80, 82, 83, 85, 86, 93, 107, 119, 122, 131, 139, 143, 148, 154, 156, 157, 158, 1690, 161, 168, 171, 176, 179, 182, 185, 190, 191, 194, 195, 202, 203, 205, 207, 213, 215, 238, 241, 251, 258, 264, 273, 274, 275, 281, 286, 288, 289, 290, 293, 294, 295, 296, 297, 303, 304, 309, 311, 314, 317, 325, 329,331, 338, 348, 364, 368, 378, 384, 404, 412, 416, 426, 430, 432, 434, 443, 446, 450, 475, 478, 483, 487, 496, 506, 512, 514, 528, 532, 555, 557 <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 57 Met Ala Ala Xaa Xaa Phe Leu Leu Ile Ala Xaa Xaa Leu Leu Xaa Leu 1 5 10 15 Met Val Xaa Ala Xaa Pro Leu Gly Xaa Gly Leu Ala Xaa Leu Xaa Xaa 20 25 30 Asp Xaa Pro Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Leu Xaa Arg 35 40 45 Xaa Xaa Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Met Xaa Trp Xaa Xaa Tyr Leu Xaa 50 55 60 Ala Ile Leu Xaa Xaa Asn Xaa Leu Gly Xaa Xaa Val Leu Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Leu Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Leu Pro Leu Asn Pro Gln Xaa Leu Pro Gly 85 90 95 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Leu Asn Thr Ala Xaa Ser Phe Val Thr Asn 100 105 110 Thr Asn Trp Gln Ser Tyr Xaa Gly Glu Xaa Thr Leu Ser Tyr Phe Ser 115 120 125 Gln Met Xaa Gly Leu Thr Val Gln Asn Phe Xaa Ser Ala Ala Xaa Gly 130 135 140 Ile Ala Val Xaa Phe Ala Leu Ile Arg Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Ser Xaa 145 150 155 160 Xaa Thr Leu Gly Asn Ala Trp Xaa Asp Leu Xaa Arg Ile Thr Leu Xaa 165 170 175 Val Leu Xaa Pro Xaa Xaa Leu Leu Xaa Ala Leu Phe Phe Xaa Xaa Gln 180 185 190 Gly Xaa Xaa Gln Asn Phe Leu Pro Tyr Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Glu 195 200 205 Gly Ala Gln Gln Xaa Leu Xaa Met Gly Pro Val Ala Ser Gln Glu Ala 210 215 220 Ile Lys Met Leu Gly Thr Asn Gly Gly Gly Phe Phe Asn Xaa Asn Ser 225 230 235 240 Xaa His Pro Phe Glu Asn Pro Thr Ala Leu Xaa Asn Phe Val Gln Met 245 250 255 Leu Xaa Ile Phe Leu Ile Pro Xaa Ala Leu Cys Phe Ala Phe Gly Glu 260 265 270 Xaa Xaa Xaa Asp Arg Arg Gln Gly Xaa Met Leu Leu Trp Xaa Met Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Phe Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Met Trp Ala Glu Xaa Xaa 290 295 300 Gly Asn Pro His Xaa Leu Xaa Leu Gly Xaa Asp Ser Xaa Ile Asn Met 305 310 315 320 Glu Gly Lys Glu Xaa Arg Phe Gly Xaa Leu Xaa Ser Ser Leu Phe Ala 325 330 335 Val Xaa Thr Thr Ala Ala Ser Cys Gly Ala Val Xaa Ala Met His Asp 340 345 350 Ser Phe Thr Ala Leu Gly Gly Met Val Pro Met Xaa Leu Met Gln Xaa 355 360 365 Gly Glu Val Val Phe Gly Gly Val Gly Xaa Gly Leu Tyr Gly Met Xaa 370 375 380 Leu Phe Val Leu Leu Ala Val Phe Ile Ala Gly Leu Met Ile Gly Arg 385 390 395 400 Thr Pro Glu Xaa Leu Gly Lys Lys Ile Asp Val Xaa Glu Met Lys Xaa 405 410 415 Thr Ala Leu Ala Ile Leu Val Thr Pro Xaa Leu Val Leu Xaa Gly Xaa 420 425 430 Ala Xaa Ala Met Met Thr Asp Ala Gly Arg Xaa Xaa Met Xaa Asn Pro 435 440 445 Gly Xaa His Gly Phe Ser Glu Val Leu Tyr Ala Val Ser Ser Ala Ala 450 455 460 Asn Asn Asn Gly Ser Ala Phe Ala Gly Leu Xaa Ala Asn Xaa Pro Phe 465 470 475 480 Trp Asn Xaa Leu Leu Ala Xaa Cys Met Phe Val Gly Arg Phe Gly Xaa 485 490 495 Ile Ile Pro Val Met Ala Ile Ala Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Lys Xaa 500 505 510 Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Thr Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Phe Xaa 515 520 525 Xaa Leu Leu Xaa Gly Thr Val Leu Leu Val Gly Ala Leu Thr Phe Ile 530 535 540 Pro Ala Leu Ala Leu Gly Pro Val Ala Glu Xaa Leu Xaa 545 550 555 <210> 58 <211> 681 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus sequence of KdpB of P. anantis and E. coli <220> <221> variation <222> 4, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 26, 28, 29, 31, 38, 40, 41, 44, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 66, 69, 70, 74, 81, 104, 107, 110, 111, 112, 113, 118, 119, 120, 122, 125, 131, 139, 147, 190, 193, 226, 227, 237, 248, 249, 251, 252, 305, 320, 321, 323, 326, 331, 332, 354, 359, 367, 368, 370, 371, 373, 375, 378, 381, 386, 388, 390, 392, 397, 401, 405, 408, 411, 414, 415, 417, 418, 419, 421, 422, 426, 426, 428, 434, 437, 438, 443, 459, 475, 492, 559, 604, 607, 609, 614, 627, 642, 645, 647, 648, 649, 655, 667, 671, 674, 677, 678, 679, 681 <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 58 Met Ser Arg Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Val Lys Lys Leu Xaa Pro Xaa Xaa Gln Xaa Arg 20 25 30 Asn Pro Val Met Phe Xaa Val Xaa Xaa Gly Ser Xaa Leu Thr Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Ile Xaa Met Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ala Xaa Phe 50 55 60 Xaa Xaa Ala Ile Xaa Xaa Trp Leu Trp Xaa Thr Val Leu Phe Ala Asn 65 70 75 80 Xaa Ala Glu Ala Leu Ala Glu Gly Arg Ser Lys Ala Gln Ala Asn Ser 85 90 95 Leu Lys Gly Val Lys Lys Thr Xaa Phe Ala Xaa Lys Leu Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Tyr Gly Ala Ala Xaa Xaa Xaa Val Xaa Ala Asp Xaa Leu Arg Lys 115 120 125 Gly Asp Xaa Val Leu Val Glu Ala Gly Asp Xaa Ile Pro Cys Asp Gly 130 135 140 Glu Val Xaa Glu Gly Gly Ala Ser Val Asp Glu Ser Ala Ile Thr Gly 145 150 155 160 Glu Ser Ala Pro Val Ile Arg Glu Ser Gly Gly Asp Phe Ala Ser Val 165 170 175 Thr Gly Gly Thr Arg Ile Leu Ser Asp Trp Leu Val Ile Xaa Cys Ser 180 185 190 Xaa Asn Pro Gly Glu Thr Phe Leu Asp Arg Met Ile Ala Met Val Glu 195 200 205 Gly Ala Gln Arg Arg Lys Thr Pro Asn Glu Ile Ala Leu Thr Ile Leu 210 215 220 Leu Xaa Xaa Leu Thr Ile Val Phe Leu Leu Ala Thr Xaa Thr Leu Trp 225 230 235 240 Pro Phe Ser Ala Trp Gly Gly Xaa Xaa Val Xaa Xaa Thr Val Leu Val 245 250 255 Ala Leu Leu Val Cys Leu Ile Pro Thr Thr Ile Gly Gly Leu Leu Ser 260 265 270 Ala Ile Gly Val Ala Gly Met Ser Arg Met Leu Gly Ala Asn Val Ile 275 280 285 Ala Thr Ser Gly Arg Ala Val Glu Ala Ala Gly Asp Val Asp Val Leu 290 295 300 Xaa Leu Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr Leu Gly Asn Arg Gln Ala Xaa 305 310 315 320 Xaa Phe Xaa Pro Ala Xaa Gly Val Xaa Glu Xaa Xaa Leu Ala Asp Ala 325 330 335 Ala Gln Leu Ala Ser Leu Ala Asp Glu Thr Pro Glu Gly Arg Ser Ile 340 345 350 Val Xaa Leu Ala Lys Gln Xaa Phe Asn Leu Arg Glu Arg Asp Xaa Xaa 355 360 365 Ser Xaa Xaa Ala Xaa Phe Xaa Pro Phe Xaa Ala Gln Xaa Arg Met Ser 370 375 380 Gly Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ile Arg Lys Gly Xaa Val Asp Ala 385 390 395 400 Xaa Arg Arg His Xaa Glu Ala Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Xaa Xaa Val 405 410 415 Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Val Ala Arg Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu Val 420 425 430 Val Xaa Glu Gly Xaa Xaa Val Leu Gly Val Xaa Ala Leu Lys Asp Ile 435 440 445 Val Lys Gly Gly Ile Lys Glu Arg Phe Ala Xaa Leu Arg Lys Met Gly 450 455 460 Ile Lys Thr Val Met Ile Thr Gly Asp Asn Xaa Leu Thr Ala Ala Ala 465 470 475 480 Ile Ala Ala Glu Ala Gly Val Asp Asp Phe Leu Xaa Glu Ala Thr Pro 485 490 495 Glu Ala Lys Leu Ala Leu Ile Arg Gln Tyr Gln Ala Glu Gly Arg Leu 500 505 510 Val Ala Met Thr Gly Asp Gly Thr Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ala Gln 515 520 525 Ala Asp Val Ala Val Ala Met Asn Ser Gly Thr Gln Ala Ala Lys Glu 530 535 540 Ala Gly Asn Met Val Asp Leu Asp Ser Asn Pro Thr Lys Leu Xaa Glu 545 550 555 560 Val Val His Ile Gly Lys Gln Met Leu Met Thr Arg Gly Ser Leu Thr 565 570 575 Thr Phe Ser Ile Ala Asn Asp Val Ala Lys Tyr Phe Ala Ile Ile Pro 580 585 590 Ala Ala Phe Ala Ala Thr Tyr Pro Gln Leu Asn Xaa Leu Asn Xaa Met 595 600 605 Xaa Leu His Ser Pro Xaa Ser Ala Ile Leu Ser Ala Val Ile Phe Asn 610 615 620 Ala Leu Xaa Ile Val Phe Leu Ile Pro Leu Ala Leu Lys Gly Val Ser 625 630 635 640 Tyr Xaa Pro Leu Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Leu Arg Arg Asn Leu Xaa Ile 645 650 655 Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Leu Val Pro Phe Xaa Gly Ile Lys Xaa Ile 660 665 670 Asp Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Gly Xaa 675 680 <210> 59 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus sequence of KdpC of P. anantis and E. coli <220> <221> variation <222> 3, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 28, 30, 32, 33, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 60, 61, 62, 66, 73, 74, 75, 80, 83, 89, 93, 97, 98, 100, 107, 111, 113, 114, 115, 123, 130, 131, 133, 135, 138, 141, 144, 146, 149, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 165, 168, 169, 170, 173, 175, 178, 178, 179, 180, 186, 187, 188, 189 <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 59 Met Ser Xaa Leu Arg Pro Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Gly Xaa Val Tyr Pro Leu Leu Thr Thr Xaa Leu Xaa Gln Xaa 20 25 30 Xaa Phe Pro Trp Gln Ala Asn Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Arg Gly Ser Ala Leu Ile Gly Gln Asn Phe Xaa Xaa Xaa Gly Tyr 50 55 60 Phe Xaa Gly Arg Pro Ser Ala Thr Xaa Xaa Xaa Pro Tyr Asn Pro Xaa 65 70 75 80 Ala Ser Xaa Gly Ser Asn Leu Ala Xaa Ser Asn Pro Xaa Leu Asp Lys 85 90 95 Xaa Xaa Ala Xaa Arg Val Ala Ala Leu Arg Xaa Ala Asn Pro Xaa Ala 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Val Pro Val Glu Leu Val Thr Xaa Ser Ala Ser Gly Leu 115 120 125 Asp Xaa Xaa Ile Xaa Pro Xaa Ala Ala Xaa Trp Gln Xaa Pro Arg Xaa 130 135 140 Ala Xaa Ala Arg Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Pro Leu Xaa Xaa Xaa Ile Gly Xaa Pro Xaa Val 165 170 175 Asn Xaa Xaa Xaa Leu Asn Leu Ala Leu Xaa Xaa Leu Xaa 180 185

Claims (12)

  1. L-아미노산 생산능을 가지며, kdp 시스템이 증강하도록 개변된 장내세균과에 속하는 미생물.
  2. 제1항에 있어서, kdp 오페론 또는 당해 오페론을 구성하는 1 또는 2 이상의 유전자의 발현량을 증대시키는 것, 및/또는, kdp 오페론 또는 상기 유전자의 해독량을 증대시킴으로써, kdp 시스템이 증강된 미생물.
  3. 제2항에 있어서, kdp 오페론 또는 당해 오페론을 구성하는 1 또는 2 이상의 유전자의 카피수를 높이는 것, 당해 오페론의 발현 조절 서열을 개변함으로써, kdp 시스템이 증강된 미생물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, kdp 오페론이, 적어도 kdpA 유전자, kdpB 유전자, 및 kdpC 유전자를 포함하는, 미생물.
  5. 제4항에 있어서, kdpA 유전자가, 서열번호 2 또는 8에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열번호 2 또는 8에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, kdp 시스템의 A 서브유니트를 암호화하는 유전자인, 미생물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, kdpB 유전자가, 서열번호 3 또는 9에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열번호 3 또는 9에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, kdp 시스템의 B 서브유니트를 암호화하는 유전자인, 미생물.
  7. 제4항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, kdpC 유전자가, 서열번호 4 또는 10에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열번호 4 또는 10에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, kdp 시스템의 C 서브유니트를 암호화하는 유전자인, 미생물.
  8. 제4항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 kdp 오페론이, 하기 (a) 내지 (d) 중의 어느 하나에 기재된 DNA인, 미생물.
    (a) 서열번호 1의 염기 번호 546 내지 4871에 나타내는 염기 서열을 포함하는 DNA,
    (b) 서열번호 1의 염기 번호 546 내지 4871에 나타내는 염기 서열 또는 당해 염기 서열로부터 조제될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, kdp 시스템을 암호화하는 DNA.
    (c) 서열번호 7의 염기 번호 543 내지 4853에 나타내는 염기 서열을 포함하는 DNA,
    (b) 서열번호 7의 염기 번호 543 내지 4853에 나타내는 염기 서열 또는 당해 염기 서열로부터 조제될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, kdp 시스템을 암호화하는 DNA.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 L-아미노산이 L-글루탐산, L-리신, L-트레오닌, L-아르기닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-발린, L-류신, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판, 및 L-시스테인으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 L-아미노산인 미생물.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 장내세균과에 속하는 미생물이, 에세리키아속 세균, 엔테로박터속 세균 또는 판토에아속 세균인 미생물.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따르는 미생물을 배지에서 배양하여, L-아미노산을 당해 배지 중 또는 균체 내에 생성 축적시키고, 당해 배지 또는 균체로부터 L-아미노산을 회수하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 제조법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 L-아미노산이 L-글루탐산, L-리신, L-트레오닌, L-아르기닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-발린, L-류신, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판, 및 L-시스테인으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 L-아미노산인, 방법.
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