KR100664653B1

KR100664653B1 - Ｘｍｐ를 ｇｍｐ로 전환시킬 수 있으면서도, ｇｍｐ의분해에 관련되는 유전자가 불활성화되어 있는 대장균변이주 및 그를 이용하는 방법

Info

Publication number: KR100664653B1
Application number: KR1020050005863A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 김형석; 이진남; 오기훈; 김정환; 오윤석; 심재익; 최경오
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2005-01-21
Filing date: 2005-01-21
Publication date: 2007-01-04
Also published as: TW200637909A; CN101137743B; US7741101B2; KR20060084994A; DK1844135T3; JP2008543272A; EP1844135A1; EP1844135B1; EP1844135A4; JP4769255B2; ES2443099T3; US20080299620A1; WO2006078132A1; CN101137743A

Abstract

본 발명은 에스케리키아 종 (Escherichia sp.) GPU1114 (수탁번호 KCCM-10536)의 변이주로서, deoD, aphA, appA 및 hprt 유전자가 각각 누적적으로 불활성화되어 있는 미생물 및 그를 이용하는 방법을 제공한다.

GMP, deoD, aphA, appA, hprt

Description

ＸＭＰ를 ＧＭＰ로 전환시킬 수 있으면서도, ＧＭＰ의 분해에 관련되는 유전자가 불활성화되어 있는 대장균 변이주 및 그를 이용하는 방법{Escherichia coli strain capable of converting XMP to GMP and having inactivated genes for GMP degradation and method for using the same}

도1a는 본 발명의 실시예1에 기재된 재조합 플라스미드 pDEO의 작제 과정을 나타내는 도면이다.

도1b는 본 발명의 실시예1에 기재된 재조합 플라스미드 pTdeoD:loxpKAT의 작제 과정을 나타내는 도면이다.

도 2a는 본 발명의 실시예2에 기재된 재조합 플라스미드 pAPH의 작제 과정을 나타내는 도면이다.

도2b는 본 발명의 실시예2에 기재된 재조합 플라스미드 pTaph:loxpKAT의 작제 과정을 나타내는 도면이다.

도 3a는 본 발명의 실시예3에 기재된 재조합 플라스미드 pAPP의 작제 과정을 나타내는 도면이다.

도3b는 본 발명의 실시예3에 기재된 재조합 플라스미드 pTapp:loxpKAT의 작제 과정을 나타내는 도면이다.

도4a는 본 발명의 실시예4에 기재된 재조합 플라스미드 pHPRT의 작제 과정을 나타내는 도면이다.

도4b는 본 발명의 실시예4에 기재된 재조합 플라스미드 pThprt:loxpCAT의 작제 과정을 나타내는 도면이다.

본 발명은 XMP를 GMP로 전환시킬 수 있으면서도, GMP의 분해에 관련되는 유전자가 불활성화되어 있는 대장균 변이주 및 그를 이용하는 방법에 관한 것이다.

5'-구아닐산 (5'-guanilic acid, GMP)을 생산하는 방법은 효모의 RNA를 미생물 효소에 의하여 또는 화학적으로 분해하는 방법, 당, 질소원 및 인산원을 함유하는 배지에서 미생물의 변이주를 배양하고 뉴클레오티드를 직접 생산시키는 방법 (직접 발효법) 및 발효법으로 뉴클레오티드 합성의 중간체를 생산한 후 화학적 또는 효소적으로 뉴클레오티드로 변환하는 방법이 있으며, 현재 경제적으로 유리한 제조법으로서 발효와 화학합성 및 효소전환에 의한 복합 제조방법이 공업적으로 널리 사용되고 있다.

이 중 효소전환에 의한 복합 제조방법은 직접 발효에 의하여 5'-크산틸산 (XMP)을 생산하는 발효공정과 XMP를 효소적으로 5'-구아닐산 (GMP)로 전환하는 반응공정으로 이루어지며, 2종의 미생물이 사용된다. 즉 제 1공정 (발효 공정)에서는, XMP의 생산균으로서 육종된 변이주가 사용되며 제 2공정 (반응 공정)에서는 XMP 아미나제 활성을 코딩하는 유전자를 연속적으로 고발현시킬 수 있는 미생물이 사용된다. 이 경우 상기 반응 공정에 사용되는 전환 미생물은 배양 공정 초기에 비해 배양 공정 후기에 생존율이 현저히 감소하고, 그에 따라 5′구아닐산의 생성속도가 느려지게 된다. 5'-크산틸산 아미나제를 코딩하는 guaA 유전자는 숙주 세포에 대하여 치사적이며, 그 결과 상기 효소가 연속적으로 고발현이 배양 공정 후반부에 전환 미생물의 생육이 저해되는 것으로 알려져 있다. 또한, 전환 미생물에 내재적인 5′구아닐산 분해 유전자가 발현되고, 그에 따라 5′구아닐산의 분해가 촉진되는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위하여, XMP 아미나제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고 생육 상태에 따라 XMP 아미나제를 발현하고, 내재적 glnL 유전자가 불활성화된 에스케리키아 종 (Escherichia sp.) GPD1114 (수탁번호 KCCM-10543)을 개발한 바 있다. 또한, 상기 GPD1114 균주의 5'-구아닐산의 분해능을 제거하기 위해 5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 ushA 유전자가 불활성화된 대장균 GPU1114 (수탁번호 KCCM-10536)을 제조한 바 있다.

그러나, 대장균 GPU1114 균주는 5′뉴클레오티다제를 제외한 5'-구아닐산의 분해에 관련되는 내재적 유전자를 여전히 가지고 있어 5'-구아닐산을 구아노신 및 구아닌으로 분해시킬 수 있다. 따라서, 종래 기술에 의하더라도 5'-구아닐산에 관련되는 유전자가 동시에 불활성화된 미생물이 당업계에 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 XMP를 GMP로 전환할 수 있으면서도 GMP의 분해와 관련된 내재적 유전자가 불활성화된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 상기 미생물을 이용하여 배지 중에 GMP 합성 효소를 고농도로 축적하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 미생물을 이용하여 GMP, GDP 및 GTP를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 에스케리키아 종 (Escherichia sp.) GPU1114 (수탁번호 KCCM-10536)의 변이주로서, deoD 유전자가 불활성화된 에스케리키아 속 미생물을 제공한다.

본 발명에 사용된 모균주 대장균 GPU1114 (수탁번호 KCCM-10536)는 glnL 유전자가 불활성화되어 있고, 5′크산틸산 아미나제를 코팅하는 guaA 유전자로 형질전환되어 있고, 5′뉴클레오티다제를 코팅하는 내재적 ushA 유전자가 불활성화되어 있는 대장균의 변이주이다. 본 균주는 guaA 유전자를 발현시킬 수 있어 XMP를 GMP로 고효율로 전환시킬 수 있으면서도, ushA가 발현되지 않아 GMP의 분해 활성이 낮기 때문에 GMP 생산 효율이 높은 것이 특징이다.

본 발명에 있어서, deoD 유전자는 퓨린뉴클레오사이드 포스포릴라제 활성을 코딩하는 유전자이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, NCBI accession 번호 NP_418801인 것이 포함될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 따라서, deoD 유전자에는 야생형뿐만 아니라 천연 또는 인공 변이형의 유전자도 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 대장균 DKO-ud (수탁번호 KCCM- 10633)인 미생물이다.

본 발명은 또한, 에스케리키아 종 (Escherichia sp.) GPU1114 (수탁번호 KCCM-10536)의 변이주로서, deoD 유전자가 불활성화되어 있고, 여기에 aphA 유전자가 더 불활성화되어 있는 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, aphA 유전자는 산성 포스파타제 (acid phosphatase) 활성을 코딩하는 유전자이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, NCBI accession 번호 NP_418479인 것이 포함될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 따라서, aphA 유전자에는 야생형뿐만 아니라 천연 또는 인공 변이형의 유전자도 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 대장균 TKO-udh (수탁번호 KCCM-10631)인 미생물이다.

본 발명은 또한, 에스케리키아 종 (Escherichia sp.) GPU1114 (수탁번호 KCCM-10536)의 변이주로서, deoD 및 aphA 유전자가 불활성화되어 있고, 여기에 appA 유전자가 더 불활성화되어 있는 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, appA 유전자는 산성 포스파타제 (acid (poly)phosphatase) 활성을 코딩하는 유전자이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, NCBI accession 번호 NP_415500인 것이 포함될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 따라서, appA 유전자에는 야생형뿐만 아니라 천연 또는 인공 변이형의 유전자도 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 대장균 QKO-udhp (수탁번호 KCCM- 10632)인 미생물이다.

본 발명은 또한, 에스케리키아 종 (Escherichia sp.) GPU1114 (수탁번호 KCCM-10536)의 변이주로서, deoD, aphA 및 appA 유전자가 불활성화되어 있고, 여기에 hprt (hypoxanthine phosphoribosyltransferase) 유전자가 더 불활성화되어 있는 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, hprt 유전자는 하이포잔틴포스포리보실 트란스퍼라제 활성을 코딩하는 유전자이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, NCBI accession 번호 NP_414667인 것이 포함될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 따라서, appA 유전자에는 야생형뿐만 아니라 천연 또는 인공 변이형의 유전자도 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 대장균 QIKO (수탁번호 KCCM-10630)인 미생물이다.

본 발명에 있어서, "불활성화"란 해당 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 기능성이 있는 해당 유전자 산물을 생산하지 않는 것을 의미한다. 또한, "불활성화"란 해당 유전자가 완전하게 불활성화되어 있는 것뿐만 아니라 그 발현 수준이 현저하게 낮아 실질적으로 발현되지 않는 것도 포함되는 의미이다.

본 발명의 균주에 있어서, 불활성화된 유전자는 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면 위치특이적 돌연변이법 및 상동재조합법에 의하여 형성될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상동재조합법에 의하여 이루어지는 것이다. 또한, 유전자의 불활성화는 결실, 치환, 역위 및 이들의 조합에 의하 여 이루어진 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

불활성화 방법의 예인 상동 재조합법에 의한 불활성화는, 표적 게놈 DNA의 절편내에 외래 DNA 조각을 도입하여 불활성화 유전자 카세트를 형성하고, 상기 카세트를 균주 내에 도입하여 세포 내에서 내재적 유전자와 상기 불활성화 카세트 사이에 상동 재조합이 일어나도록 하고, 그 결과 얻어지는 상동 재조합체 중에서 불활성화된 유전자를 갖는 균주를 선별하는 과정을 포함한다. 선별의 편리상 표적 DNA 내로 클로닝된 외래 DNA는 선별 마커, 예를 들면 항생제 내성 유전자를 갖는 것이 바람직하다. 항생제 내성 유전자를 포함하는 카세트에 의하여 표적 유전자가 불활성화되는 경우, 항생물질이 함유된 한천 평판상에서 용이하게 선별될 수 있다. 또한, 재조합 이루어졌는지의 여부는 예를 들면 써던 블롯팅 및 PCR과 같은 방법에 의하여 확인될 수 있다.

본 발명의 균주를 제조하는 과정에 있어서, 항생제 내성 유전자가 포함된 불활성화 카세트를 사용하는 경우에는 선별과정이 완료된 후 상기 항생제 내성 유전자를 제거하는 것이 바람직하다. 선별된 균주로부터 상기 항생제 내성 유전자를 제거하는 과정은 예를 들면, 불활성화 카세트 내의 특정한 염기서열을 인식하여 항생제 내성 유전자를 제거시키는 유전자를 발현하는 플라스미드로 상기 선별된 균주에 도입하고 상기 항생제 내성 유전자를 제거시키고, 그 결과 얻어진 항생제 내성 유전자가 제거된 균주는 암피실린이 함유된 한천 평판상에서 선별될 수 있다. 표적 DNA상의 항생제 유전자의 제거 여부는 적절한 항생제를 함유한 한천 평판상에서 투스픽을 통해 콜리니가 형성되는지 여부를 통하여 확인할 수 있다.

본 발명의 균주의 제조과정을 예를 들어 설명하면 다음과 같다.

에스케리키아 종 (Escherichia sp.) GPU1114(KCCM-10536)로부터 게놈 DNA를 분리하고, 이를 주형으로 한 PCR에 의해 각 유전자를 증폭한다. 얻어진 deoD, aphA, appA 및 hprt 유전자를 플라스미드 또는 기타 벡터 내로 클로닝하여 형성된 재조합 벡터 (예, 재조합 플라스미드 pDEO, pAPH, pAPP, pHPRT)를 대장균과 같은 숙주 세포 내로 도입한다. 형질전환체를 배양 및 증식한 후 이들로부터 deoD, aphA, appA 및 hprt 유전자를 갖는 재조합 벡터를 추출하고, 추출된 재조합 벡터내의 deoD, aphA, appA 및 hprt 유전자에 loxp를 포함하는 항생제 내성 유전자 절편을 삽입하여 deoD, aphA, appA 및 hprt 유전자가 불활성화된 재조합 벡터 (예, pTdeoD:loxpKAT, pTaph:loxpKAT, pTapp:loxpKAT, pThprt:loxpCAT)를 제작한 다음, 숙주 세포 내로 도입하고 배양한다. 얻어진 형질전환체로부터 증식된 재조합 벡터를 분리하고 적절한 제한효소의 처리에 의해 deoD, aphA, appA 및 hprt 유전자의 불활성화 카세트 절편 (예, ΔdeoD:loxpKAT, Δaph:loxpKAT, Δapp:loxpKAT, Δhprt:loxpCAT)을 얻는다. 먼저 ΔdeoD:loxpKAT를 5'-구아닐산을 생산할 수 있는 균주 GPU1114에 전기충격법과 같은 기술에 의해 도입시킨 후 항생제 내성을 이용하여, 항생제 마커를 포함하는 deoD 유전자의 절편이 염색체 상의 야생 deoD 유전자와 재조합하며 생장을 거듭해도 계속 deoD 유전자의 불활성화 특성을 갖는 균주를 분리한다. 분리된 균주에 내재적인 aphA 유전자를 더 불활성화시키기 위해 항생제 마커를 제거하여야 하며, 이를 위해 항생제 내성 유전자 내의 loxp를 인식해서 항생제 내성 유전자를 제거시키는 유전자를 발현하는 재조합 백터를 위의 선별된 균 주에 전기충격법과 같은 기술에 의해 도입시킨다. 형질전환체의 선별은 백터의 항생제 내성을 이용하여 암피실린이 함유된 한천 평판상에서 실시한다. 표적 DNA로부터 항생제 유전자가 제거되었는지 여부는 적절한 항생제를 함유한 한천 평판상에서 투스픽을 통해 콜리니가 형성되는지 여부를 통해 확인한다. 항생제 마커 일부를 포함하는 deoD 유전자의 절편이 염색체 상의 야생 deoD 유전자와 재조합하여 생장을 거듭해도 계속 ushA 및 deoD 유전자의 불활성화 특성을 갖는 균주 (예어, 대장균 DKO-ud)를 분리한다. 위와 과정을 aphA, appA 및 hprt 유전자에 대하여도 순차적으로 적용함으로써 deoD, aphA, appA 및 hprt 유전자가 누적적으로 불활성화되어 있는 각 균주를 얻을 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 5'-구아닐산 합성효소 (GMP-synthetase)를 세로 내에 축적시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주를 배양 단계를 포함하는, GMP, GDP 또는 GTP를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 본 발명의 미생물의 배양은 종래 알려진 배양 조건, 예를 들면 탄소원, 질소원, 아미노산 및 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도 및 pH 등을 조절하면서 이루어질 수 있다.

탄소원으로서는 글루코오스, 과당, 살균된 전처리 당밀 (즉, 환원당으로 전환된 당밀)등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기등이 첨가될 수 있다. 배양은 호기적 조건하에서 예를 들면, 진탕배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 30∼40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양은 1∼2일 동안 수행할 수 있으며 배지 중에 XMP 아미나제의 활성이 포함된 배양물이 축적된다.

본 발명에 있어서, GMP는 XMP를 본 발명의 균주의 배양에 의하여 형성된 GMP 합성 효소를 사용하여 GMP로 전환시킴으로써 제조될 수 있다. GMP로의 전환 과정은 자이렌과 같은 세포의 XMP에 대한 막투과성을 증가시키는 물질을 배지 중에 첨가하여 XMP가 GMP 생산 균주 내에서 유입되도록 한 다음, GMP를 XMP로 전환시킴으로서 수행될 수 있다. 상기 막투과성을 증가시키는 물질은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 자일렌과 같은 소수성 물질 (예, 톨루엔, 벤젠, 에틸 아세테이트), 계면활성제 (예, 폴리옥시에틸렌스테아릴아민(예를 들면, 나이민S-215, Nihon Yushi Co.) 세틸트리메틸암모니움 브로마이드, Cation FB, Cation F2-40E 등의 양이온 성계면활성제, 나트륨 올레일아미드황산, 뉴레크스 TAB 및 라비졸 80등의 음이온성 계면활성제), 금속 이온 (예, 칼슘, 마그네슘 이온) 등이 이용될 수 있으나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기한 세포 막의 투과성을 증진시키는 물질의 사용량은 선택되는 물질에 따라 달라질 수 있으며, 당업자라면 적절하게 조절하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 첨가되는 자일렌은 배지 총 중량에 대하여 0.5 중량% 내지 1 중량%로 첨가되는 것이바람직하다. 또한, GDP 또는 GTP는 생성된 GMP에 당업계에 알려진 효소적 또는 화학적인 인산화 과정을 추가적으로 거침으로써 생산될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예1: 재조합 플라스미드 제작과 이를 이용한 deoD 유전자의 불활성화

대장균 GPU1114 (수탁번호 KCCM-10536)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 통하여 deoD 유전자의 ORF (Open Reading Frame)를 포함하는 DNA 절편, 약 720 bp를 증폭하였다. PCR은 변성 94℃에서 30 초, 어닐링 50℃에서 30초 및 연장 68℃에서 1분 30초를 35 회를 수행하였다.

얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 720 bp 크기의 밴드를 용출하여 얻었고, pUC18 클로닝 벡터 (Promega Co.)의 HindII에 16℃에서 밤새 연결시켰다 (도 1a). 형성된 재조합 플라스미드 pDEO를 대장균 DH5α에 형질전환시키고 암피실린 (50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후 미니 프렙 키트 (QIAGEN mini prep kit, QIAGEN)를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA를 제한효소 EcoRI과 Hind III로 처리한 후 deoD 유 전자의 클로닝 여부를 확인하였다. 확인된 플라스미드 pDEO를 제한효소 EcoRI과 Hind III 로 처리한 후, 0.8% 아가로즈 겔에서 약 720 bp 크기의 밴드를 용출하였다. 여기에 플라스미드 pUG6 (U. Guldenre et al, A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acid Research 24 (13),1996, pp2519-2524)를 제한효소 EcoRV와 HincII로 처리하여 얻은 loxp 부분을 포함하는 카나마이신 내성 유전자 절편 (약 1.7 kb)을 평활말단 연결시켜 재조합 플라스미드 pTdeoD::loxpKAT (약 4.5kb)를 얻었다 (도 1b).

이 재조합 플라스미드 pTdeoD::loxpKAT를 DH5α에 형질전환시키고, 암피실린과 카나마이신 (각각 50 mg/L과 50 mg/L)이 포함된 고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린과 카나마이신이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후 미니 프렙 키트(QIAGEN mini prep kit, QIAGEN 사)를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 이 플라스미드 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 통하여 deoD 유전자의 ORF와 loxpKAT 부위를 포함하는 DNA 절편, 약 2.3 kb를 증폭하였다. PCR은 변성 94℃에서 1분, 어닐링 55 ℃에서 1분 및 연장은 68℃에서 1분을 35 회 수행하였다.

이 DNA 절편 ΔdeoD::loxpKAT을 외래 guaA 유전자가 도입되어 있는 대장균 GPU1114에 전기충격요법으로 도입시켜 카나마이신이 포함된 고체배지에 도말한 후 콜로니를 선별하였다.

선별된 콜로니의 항생제 마커를 제거하기 위해 pCP20 플라스미드를 선별된 콜로니에 형질전환시키고, 암피실린 (50 mg/L)이 포함된 고체배지에 도말하여 30 ℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린과 카나마이신과 항생제 없는 고체배지에 투스픽을 한 후 43 ℃에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양한 후 항생제 없는 배지에서만 형성된 콜로니를 획득 하였으며 대장균 DKO-ud로 명명하고 2004년 11월 30일 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM-10633).

실시예2: 재조합 플라스미드 제작과 이를 이용한 aphA 유전자의 불활성화

실시예1에 얻어진 대장균 DKO-ud로부터 추출된 게놈 DNA 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 통하여 aphA 유전자의 ORF를 포함하는 DNA 절편, 약 714bp를 증폭하였다. PCR은 변성 94℃에서 30초, 어닐링 55℃에서 30초 및 연장 68 ℃에서 1분 30초를 35 회 수행하였다.

얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 714bp 크기의 밴드를 용출하여 얻었고, pGEM-T-easy 클로닝 벡터 (Promega Co.)에 16℃에서 밤새 연결시켰다 (도 2a). 얻어진 재조합 플라스미드 pAPH를 대장균 DH5α에 형질전환시키고, 암피실린 (50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후 미니 프렙 키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA를 제한효소 ClaI으로 처리한 후 aphA 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다. 확인된 플라스미드 pAPH를 제한효소 ClaI로 처리한 후, 0.8% 아가로즈 겔에서 약 3.7Kp 크기의 밴드를 용리하여 T4 폴리머라제 효소를 처리하여 평활말단으로 만들었다. 여기에 플라스미드 pUG6를 제한효소 EcoRⅤ와 HincII로 처리하여 얻은 loxp 부분을 포함하는 카나마이신 내성 유전자 절편 (약 1.7 kb)을 평활말단 연결시켜 재조합 플 라스미드 pTaphA::loxpKAT (약 5.4kb)를 얻었다 (도 2b).

이 재조합 플라스미드 pTaphA::loxpKAT를 DH5α에 형질전환시키고, 암피실린과 카나마이신 (각각 50 mg/L과 50 mg/L)이 포함된 고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린과 카나마이신이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후 미니 프렙 키트 (QIAGEN mini prep kit, QIAGEN)를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 이 플라스미드 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 통하여 aphA 유전자의 ORF와 loxpKAT 부위를 포함하는 DNA 절편, 약 2.4 kb를 증폭하였다. PCR은 변성 94℃에서 1분, 어닐링 55 ℃에서 1분 및 연장 68 ℃에서 1분을 35회 수행하였다.

이 DNA 절편 ΔaphA::loxpKAT을 실시예1에서 얻어진 대장균 DKO-ud에 전기충격요법으로 도입시키고, 카나마이신이 포함된 고체배지에 도말한 후 콜로니를 선별하였다.

선별된 콜로니의 항생제 마커를 제거하기 위해 pCP20 플라스미드를 선별된 콜로니에 형질전환시키고, 암피실린 (50 mg/L)이 포함된 고체배지에 도말하여 30 ℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린과 카나마이신과 항생제 없는 고체배지에 투스픽을 한 후 43 ℃에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양한 후 항생제 없는 배지에서만 형성된 콜로니를 획득하였으며 대장균 TKO-udh로 명명하고 2004년 11월 30일 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM-10631).

실시예3: 재조합 플라스미드 제작과 이를 이용한 appA 유전자의 불활성화

실시예1에서 얻어진 대장균 DKO-ud로부터 추출된 게놈 DNA 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 통하여 appA 유전자의 ORF를 포함하는 DNA 절편, 약 1.3Kb를 증폭하였다. PCR은 변성 94℃에서 30초, 어닐링 55℃에서 30초 및 연장 68 ℃에서 1분 30초를 35회 수행하였다.

얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 1.3Kb 크기의 밴드를 용출하여 얻었고, pGEM-T-easy 클로닝 벡터 16℃에서 밤새 연결시켰다 (도 3a). 얻어진 재조합 플라스미드 pAPP를 대장균 DH5α에 형질전환시키고 암피실린 (50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후 미니 프렙 키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA를 제한효소 ClaI으로 처리한 후 appA 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다. 확인된 플라스미드 pAPP를 제한효소 BclI로 처리한 후, 0.7% 아가로즈 겔에서 약 4.3kb 크기의 밴드를 용리하여 T4 폴리머라제 효소를 처리하여 평활말단으로 만들었다. 여기에 플라스미드 pUG6를 제한효소 EcoRV와 HincII로 처리하여 얻은 loxp 부분을 포함하는 카나마이신 내성 유전자 절편 (약 1.7 kb)을 평활말단 연결시켜 재조합 플라스미드 pTappA::loxpKAT (약 6.3kb)를 얻었다(도 3b).

이 재조합 플라스미드 pTappA::loxpKAT를 DH5α에 형질전환시키고, 암피실린과 카나마이신 (각각 50 mg/L과 50 mg/L)이 포함된 고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린과 카나마이신이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후 미니 프렙 키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 이 플라스미드 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티 드를 프라이머로 한 PCR을 통하여 appA 유전자의 ORF와 loxpKAT 부위를 포함하는 DNA 절편, 약 3.1kb를 증폭하였다. PCR은 변성 94℃에서 1분, 어닐링 55 ℃에서 1분 및 연장 68 ℃에서 1분을 35회 수행하였다.

이 DNA 절편 ΔappA::loxpKAT을 실시예2에서 제조된 대장균 TKO-udh에 전기충격요법으로 도입시켜 카나마이신이 포함된 고체배지에 도말한 후 콜로니를 선별하였다.

선별된 콜로니의 항생제 마커를 제거하기 위해 pCP20 플라스미드를 선별된 콜로니에 형질전환시키고, 암피실린 (50 mg/L)이 포함된 고체배지에 도말하여 30 ℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린과 카나마이신과 항생제 없는 고체 배지에 투스픽을 한 후 43 ℃에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양한 후 항생제 없는 배지에서만 형성된 콜로니를 획득하였으며 QKO-udhp로 명명하고 2004년 11월 30일 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM-10632).

실시예4: 재조합 플라스미드 제작과 이를 이용한 hprt 유전자의 불활성화

실시예3에서 제조된 대장균 QKO-udhp로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 통하여 hprt 유전자의 ORF를 포함하는 DNA 절편, 약 1.7Kb를 증폭하였다. PCR은 변성 94℃에서 30초, 어닐링 69℃에서 30초 및 연장 72℃에서 1분 30초를 30회 수행하였다.

얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 500bp 크기의 밴드를 용출하여 얻었고, pETBlue-1 클로닝 벡터 (Novagen Co.)로 16℃에서 밤새 연결시켰다 (도 4a). 얻어진 재조합 플라스미드 pHPRT를 대장균 DH5α에 형질전환시키 고 암피실린 (50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후 미니 프렙 키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA를 제한효소 HindII로 처리한 후 hprt 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다. 확인된 플라스미드 pHPRT를 제한효소 HindII로 처리한 후, 0.7% 아가로즈 겔에서 약 4.0kb 크기의 밴드를 용출하였다. 여기에 플라스미드 pUG6를 제한효소 EcoRV와 HincII로 처리하여 얻은 loxp 부분을 포함하는 카나마이신 내성 유전자 절편 (약 1.7 kb)을 평활말단 연결시켜 재조합 플라스미드 pThprt::loxpCAT (약 5.3kb)를 얻었다 (도 4b).

이 재조합 플라스미드 pThprt::loxpCAT를 DH5α에 형질전환시키고, 암피실린과 클로람페니콜 (각각 50 mg/L과 50 mg/L)이 포함된 고체배지에 도말하여 32℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 백금이에 묻혀 암피실린과 클로람페니콜이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후 미니 프렙 키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 이 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하고, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 통하여 hprt 유전자의 ORF와 loxpCAT 부위를 포함하는 DNA 절편, 약 2.1kb를 증폭하였다. PCR은 변성 94℃에서 1분, 어닐링 60℃에서 1분 및 연장 72℃에서 1분을 30회 수행하였다. 이 DNA 절편 Δhprt::loxpCAT을 실시예3에서 제조된 대장균 QKO-udhp에 전기충격요법으로 도입시켜 클로람페니콜이 포함된 고체배지에 도말한 후 콜로니를 선별하여, QIKO로 명명하고 2004년 11월 30일 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM-10630).

실시예5: 실시예4에서 선별된 대장균 QIKO의 5'-구아닐산 생산 역가

본 실시예에서는 항생제 클로람페니콜이 함유된 고체배지에 도말하여 선별된 대장균 QIKO에 대한 콜로니 30주씩을 선발하여 5'-구아닐산 역가배지 (표 1)를 사용하여 삼각 플라스크에서 5'-구아닐산 생산성을 비교하였다. 30℃의 배양기에서 5'-구아닐산 역가 고체배지 중에 밤새 배양한 단일 콜로니들을 50 ml의 역가배지에 1 백금이씩 접종하여 37℃에서 250 rpm으로 7 시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포 내에 존재하는 효소 및 기질과 생성물들의 자유로운 세포막 투과를 위해 배양액에 2 % 자일렌을 첨가하였다. 그 반응액을 효소 역가 반응액에 첨가하여 42℃에서 250 rpm으로 15 분간 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 5′구아닐산의 농도를 확인하였으며, 그 결과는 표 2와 같다.

표 1. 5'-구아닐산 역가배지

조성물	농도(g/L)
박토 펩톤	16
NaCl	5
효모 추출물	10
pH 7.0

표 2. 재조합 균주들의 플라스크 역가시험 결과

균주	GPU1114	DKO-ud	TKO-udh	QKO-udhp	QIKO
5'-구아닐산(U/mL)	46	46	46	47	49

상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 모균주인 GPU1114 균주는 46 U/mL인 반면 핵산 분해능 유전자가 파괴된 재조합 균주 QIKO는 49 U/mL의 수득율을 보였다. 이 결과를 바탕으로 농도가 모균주 대비 약 6% 정도 향상되었음을 알 수 있다.

실시예6: 실시예4에서 선별된 대장균 QIKO에 대한 삼각 플라스크에서 구아 닌 및 구아노신 부산물 비교

항생제 클로람페니콜이 함유된 고체배지에 도말하여 얻어지는 실시예4에서 선별된 대장균 QIKO 콜로니를 5'-구아닐산 역가 배지 (표 1)를 포함하고 있는 삼각 플라스크에서 배양한 다음, 배양물을 표3에서 나타낸 조성을 가지는 5'-구아닐산 부산물 생성 반응액에 첨가하여 반응 후 부산물 생성 정도를 관찰 하였다.

30℃의 배양기에서 역가 고체배지 중에 밤새 배양하여 얻어지는 대장균 QIKO의 단일 콜로니들을 50 ml의 역가배지에 1 백금이씩 접종하여 37℃에서 250 rpm으로 7 시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포 내에 존재하는 효소 및 기질과 생성물들의 자유로운 세포막 투과를 위해 2% 자일렌을 첨가한 후 37℃ 에서 250rpm으로 20 분 동안 반응시켰다. 이 배양액을 표 3에서 나타낸 5'-구아닐산 부산물 생성 반응액과 섞어서 42℃에서 250 rpm으로 8 시간 반응시켜 각각 시간별 생성된 2종의 구아닌, 구아노신 부산물의 생성 농도를 HPLC를 이용하여 확인하였으며, 그 부산물 생성 정도를 비교하여 표 4에 나타냈다.

표 3. 5'-구아닐산 부산물 생성 반응액

조성물	농도(g/L)
800 mM 트리스-말리에이트 (Tris-maleate)	24.20
MgSO₄	4.92
(NH₄)₂SO₄	6.60
5'-크산틸산	15.65
5'-구아닐산	11.54
pH 7.0

표 4. 재조합 균주들의 반응 부산물 시험결과

균주	GPU1114	DKO-ud	TKO-udh	QKO-udhp	QIKO
5′구아닐산 분해도 (mmol)	2.54	2.11	2.00	1.70	1.37
5′구아닐산 분해도 (%)	100	83	77	67	53

분해된 5′-구아닐산의 농도는 모균주인 GPU1114의 경우 2.54 mmol인 반면 핵산 분해 유전자가 파괴된 재조합 균주 QIKO는 1.37 mmol이었으며, 이는 분해도가 모균주 대비 약 47 % 감소되었음을 알 수 있었다.

본 발명의 균주에 의하면, XMP를 GMP로 전환시키는 효율이 높으면서도 GMP의 분해 활성은 낮다.

본 발명의 5'-구아닐산 합성효소 (GMP-synthetase)를 세포 내에 축적시키는 방법에 의하면, 5'-구아닐산 합성효소를 세포 내에 고농도로 축적시킬 수 있다.

본 발명의 GMP, GDP 또는 GTP를 생산하는 방법에 의하면, GMP, GDP 또는 GTP를 높은 효율로 생산할 수 있다.

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에스케리키아 종 (Escherichia sp.) GPU1114 (수탁번호 KCCM-10536)의 변이주로서, deoD 유전자가 불활성화된 에스케리키아 (Escherichia) 속 미생물로서, aphA 유전자 및 appA 유전자가 더 불활성화되어 있는 미생물.
제7항에 있어서, 상기 appA 유전자는 NCBI accession 번호 NP_415500인 것인 미생물.
제8항에 있어서, 에스케리키아 종 (Escherichia sp.) QKO-udhp(수탁번호 KCCM-10632)인 미생물.
제7항에 있어서, hprt 유전자가 더 불활성화된 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물.
제10항에 있어서, 상기 hprt 유전자는 NCBI accession 번호 NP_414667인 것인 미생물.
제11항에 있어서, 에스케리키아 종(Escherichia sp.) QIKO (수탁번호 KCCM-10630)인 미생물.
제7항 또는 제10항에 있어서, 상기 deoD, aphA, appA 및 hprt 유전자가 각각 상동재조합에 의한 치환에 의하여 불활성되어 있는 것인 미생물.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 5'-구아닐산 합성효소 (GMP-synthetase)를 세포 내에 축적시키는 방법.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, GMP, GDP 또는 GTP를 생산하는 방법.