JP2002345496A - アグマチンの製造方法およびアルギニン脱炭酸酵素の製造方法 - Google Patents
アグマチンの製造方法およびアルギニン脱炭酸酵素の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アルギニン脱炭酸酵素を用いた酵素化学的な
方法によりアルギニンよりアグマチンを製造する。 【解決手段】 遺伝子工学的手法でアルギニン脱炭酸酵
素遺伝子(ａｄｉ)を増幅発現させた組換え体を作製し、
前記組換え体、または、前記組換え体から得られるアル
ギニン脱炭酸酵素もしくはアルギニン脱炭酸酵素含有物
を用いてアルギニンを脱炭酸することによりアグマチン
を製造する。
方法によりアルギニンよりアグマチンを製造する。 【解決手段】 遺伝子工学的手法でアルギニン脱炭酸酵
素遺伝子(ａｄｉ)を増幅発現させた組換え体を作製し、
前記組換え体、または、前記組換え体から得られるアル
ギニン脱炭酸酵素もしくはアルギニン脱炭酸酵素含有物
を用いてアルギニンを脱炭酸することによりアグマチン
を製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はアミノ酸の一つであ
るアルギニンを出発原料として、酵素化学的にアグマチ
ンを製造する方法に関し、詳しくは、アルギニン脱炭酸
酵素遺伝子が増幅発現された組換え体を用いて実用化レ
ベルでアグマチンを製造する方法に関する。
るアルギニンを出発原料として、酵素化学的にアグマチ
ンを製造する方法に関し、詳しくは、アルギニン脱炭酸
酵素遺伝子が増幅発現された組換え体を用いて実用化レ
ベルでアグマチンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、アグマチンは、各種脂肪酸の付加
したアシルアグマチン製造の中間体として注目されてい
る。アシルアグマチンは優れた界面活性作用を有するこ
とが見出されており、特に汎用の４級アンモニウム型カ
チオン界面活性剤と比較して洗浄後の柔軟性、保湿性に
優れていることからシャンプー等の用途に用いられてい
る。
したアシルアグマチン製造の中間体として注目されてい
る。アシルアグマチンは優れた界面活性作用を有するこ
とが見出されており、特に汎用の４級アンモニウム型カ
チオン界面活性剤と比較して洗浄後の柔軟性、保湿性に
優れていることからシャンプー等の用途に用いられてい
る。
【０００３】現在、アシルアグマチンの工業的製造方法
としては、化学合成法が一般的であるが、化学合成法だ
と合成経路が非常に複雑であり、得られるアシルアグマ
チンがコスト高となるといった問題がある。したがっ
て、より簡便な方法で、より安価にアグマチンを製造す
る方法が求められている。
としては、化学合成法が一般的であるが、化学合成法だ
と合成経路が非常に複雑であり、得られるアシルアグマ
チンがコスト高となるといった問題がある。したがっ
て、より簡便な方法で、より安価にアグマチンを製造す
る方法が求められている。
【０００４】一方、微生物の産生するアルギニン脱炭酸
酵素（Arginine decarboxylase）が、下記反応式に示す
ように、アミノ酸の一つであるアルギニンを基質の一つ
として、アグマチンを産生することが知られている。
酵素（Arginine decarboxylase）が、下記反応式に示す
ように、アミノ酸の一つであるアルギニンを基質の一つ
として、アグマチンを産生することが知られている。
【０００５】
【化１】
【０００６】このようなアルギニン脱炭酸酵素（Argini
ne decarboxylase）を産生する微生物としては、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ をはじめとするエシェリヒア属やサルモネラ属
(J.Bacteriol., 177, 4097-4104(1995))、植物(Mol.Ge
n.Genet., 224, 431-436(1990)、Plant Physiol., 100,
146-152(1992)、Plant Physiol., 103, 829-834(199
3)、Plant Cell Physiol., 35, 1245-1249(1994))が知
られている。
ne decarboxylase）を産生する微生物としては、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ をはじめとするエシェリヒア属やサルモネラ属
(J.Bacteriol., 177, 4097-4104(1995))、植物(Mol.Ge
n.Genet., 224, 431-436(1990)、Plant Physiol., 100,
146-152(1992)、Plant Physiol., 103, 829-834(199
3)、Plant Cell Physiol., 35, 1245-1249(1994))が知
られている。
【０００７】特にＥ．ｃｏｌｉにおいては誘導型の酵素
（遺伝子名はａｄｉ）と非誘導型の酵素（遺伝子名はｓ
ｐｅＡ）の２種の存在が知られている。ａｄｉについて
は微生物の生存環境が極端な酸性状態におかれた時に、
すなわち酸ストレスが生じた時に、緊急的に誘導発現さ
れ、アルギニンを脱炭酸して、塩基性のアグマチンを生
成して、中和化を計り、一時的に生存の危機を脱する機
構であると理解されている(J.Bacteriol., 177, 4097-4
104(1995)、Appl. Environ. Microbiol., 62,3094-3100
(1996)、J.Bacteriol., 181, 3525-3535(1999))。同じ
機構が他の脱炭酸酵素、例えばオルニチン脱炭酸酵素(B
iochem.Biophys.Res.Commun., 20, 697-702(1965))等で
も知られており、Ｅ．ｃｏｌｉ系を中心にａｄｉの誘導
発現機構(J.Bacteriol., 175, 1182-1186(1993)、J.Bac
teriol., 176, 6769-6775(1994)、 Lett.Appl.Microbio
l., 24, 319-328(1997))や酵素の精製、結晶化を含めて
その酵素化学的諸性質(J.Biol.Chem., 243, 1671-1677
(1968))、遺伝子クローニングとその構造解析(J.Bacter
iol., 175, 1221-1234(1993))等について研究されてい
る。
（遺伝子名はａｄｉ）と非誘導型の酵素（遺伝子名はｓ
ｐｅＡ）の２種の存在が知られている。ａｄｉについて
は微生物の生存環境が極端な酸性状態におかれた時に、
すなわち酸ストレスが生じた時に、緊急的に誘導発現さ
れ、アルギニンを脱炭酸して、塩基性のアグマチンを生
成して、中和化を計り、一時的に生存の危機を脱する機
構であると理解されている(J.Bacteriol., 177, 4097-4
104(1995)、Appl. Environ. Microbiol., 62,3094-3100
(1996)、J.Bacteriol., 181, 3525-3535(1999))。同じ
機構が他の脱炭酸酵素、例えばオルニチン脱炭酸酵素(B
iochem.Biophys.Res.Commun., 20, 697-702(1965))等で
も知られており、Ｅ．ｃｏｌｉ系を中心にａｄｉの誘導
発現機構(J.Bacteriol., 175, 1182-1186(1993)、J.Bac
teriol., 176, 6769-6775(1994)、 Lett.Appl.Microbio
l., 24, 319-328(1997))や酵素の精製、結晶化を含めて
その酵素化学的諸性質(J.Biol.Chem., 243, 1671-1677
(1968))、遺伝子クローニングとその構造解析(J.Bacter
iol., 175, 1221-1234(1993))等について研究されてい
る。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、公知の
アルギニン脱炭酸酵素産生菌を培養しても、アルギニン
脱炭酸酵素遺伝子の発現量はごく僅かであり、アグマチ
ンの工業的生産に必要な酵素量を確保することが困難で
ある。すなわち、実用的な視点から、アルギニン脱炭酸
酵素を高発現させた菌体を酵素触媒として用いて、アル
ギニンから著量のアグマチンを製造した例は、これまで
報告されていない。
アルギニン脱炭酸酵素産生菌を培養しても、アルギニン
脱炭酸酵素遺伝子の発現量はごく僅かであり、アグマチ
ンの工業的生産に必要な酵素量を確保することが困難で
ある。すなわち、実用的な視点から、アルギニン脱炭酸
酵素を高発現させた菌体を酵素触媒として用いて、アル
ギニンから著量のアグマチンを製造した例は、これまで
報告されていない。
【０００９】これは、アグマチンがアルカリ性であり、
中和することなく高濃度になれば微生物に対して致死性
になるので、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を大量に増幅
発現させることは現実的でないと考えられていたからで
ある。
中和することなく高濃度になれば微生物に対して致死性
になるので、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を大量に増幅
発現させることは現実的でないと考えられていたからで
ある。
【００１０】本発明は上述の問題点を解決するために成
されたものであり、アルギニン脱炭酸酵素(Arginine de
carboxylase)を実用的レベルで利用することにより、比
較的安価に製造されているアルギニンから、工業的中間
体材料として有用であるアグマチンを効率的に製造する
方法を確立することを目的とする。
されたものであり、アルギニン脱炭酸酵素(Arginine de
carboxylase)を実用的レベルで利用することにより、比
較的安価に製造されているアルギニンから、工業的中間
体材料として有用であるアグマチンを効率的に製造する
方法を確立することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】上記問題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者らは、エシェリヒア・コリ(Ｅ．ｃｏ
ｌｉ)よりアルギニン脱炭酸酵素遺伝子(ａｄｉ)をクロ
ーン化し、Ｅ．ｃｏｌｉに導入した組換えエシェリヒア
・コリ菌体の作製を試みたところ、予想に反してアルギ
ニン脱炭酸酵素が大量に増幅発現されることを見出し、
本発明に想到した。
の結果、本発明者らは、エシェリヒア・コリ(Ｅ．ｃｏ
ｌｉ)よりアルギニン脱炭酸酵素遺伝子(ａｄｉ)をクロ
ーン化し、Ｅ．ｃｏｌｉに導入した組換えエシェリヒア
・コリ菌体の作製を試みたところ、予想に反してアルギ
ニン脱炭酸酵素が大量に増幅発現されることを見出し、
本発明に想到した。
【００１２】即ち、本発明は、以下のとおりである。
【００１３】（請求項１） アルギニンを脱炭酸するこ
とによりアグマチンを製造するアグマチンの製造方法に
おいて、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された
組換え体、または、前記組換え体から得られるアルギニ
ン脱炭酸酵素もしくはアルギニン脱炭酸酵素含有物を用
いることを特徴とするアグマチンの製造方法。
とによりアグマチンを製造するアグマチンの製造方法に
おいて、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された
組換え体、または、前記組換え体から得られるアルギニ
ン脱炭酸酵素もしくはアルギニン脱炭酸酵素含有物を用
いることを特徴とするアグマチンの製造方法。
【００１４】（請求項２） 前記アグマチンの製造方法
において、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現され
た組換え体を用いることを特徴とする請求項１に記載の
アグマチンの製造方法。
において、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現され
た組換え体を用いることを特徴とする請求項１に記載の
アグマチンの製造方法。
【００１５】（請求項３） 前記組換え体におけるアル
ギニン脱炭酸酵素の発現量は、菌体内タンパク質の５％
超であることを特徴とする請求項１または２に記載のア
グマチンの製造方法。
ギニン脱炭酸酵素の発現量は、菌体内タンパク質の５％
超であることを特徴とする請求項１または２に記載のア
グマチンの製造方法。
【００１６】（請求項４） 前記アルギニン脱炭酸酵素
遺伝子は、エシェリヒア・コリ由来ａｄｉ遺伝子である
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の
アグマチンの製造方法。
遺伝子は、エシェリヒア・コリ由来ａｄｉ遺伝子である
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の
アグマチンの製造方法。
【００１７】（請求項５） 前記組換え体は、ｐＵＣ系
プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導
体に由来するベクターＤＮＡと、前記アルギニン脱炭酸
酵素遺伝子とを接続して得られる組み換えＤＮＡを用い
て形質転換された菌体であることを特徴とする請求項１
〜４のいずれか一つに記載のアグマチンの製造方法。
プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導
体に由来するベクターＤＮＡと、前記アルギニン脱炭酸
酵素遺伝子とを接続して得られる組み換えＤＮＡを用い
て形質転換された菌体であることを特徴とする請求項１
〜４のいずれか一つに記載のアグマチンの製造方法。
【００１８】（請求項６） 前記組み換えＤＮＡは、ｔ
ｒｃプロモーターを含むことを特徴とする請求項５に記
載のアグマチンの製造方法。
ｒｃプロモーターを含むことを特徴とする請求項５に記
載のアグマチンの製造方法。
【００１９】（請求項７） 前記組換え体は、エシェリ
ヒア・コリを宿主とすることを特徴とする請求項１〜６
のいずれか一つに記載のアグマチンの製造方法。
ヒア・コリを宿主とすることを特徴とする請求項１〜６
のいずれか一つに記載のアグマチンの製造方法。
【００２０】（請求項８） 前記組換え体は、ＦＥＲＭ
-Ｐ１８２８５であることを特徴とする請求項７に記載
のアグマチンの製造方法。
-Ｐ１８２８５であることを特徴とする請求項７に記載
のアグマチンの製造方法。
【００２１】（請求項９） 前記組換え体は、アグマチ
ンよりプトレッシンへの転換を触媒するアグマチナーゼ
を欠失したエシェリヒア・コリであることを特徴とする
請求項７に記載のアグマチンの製造方法。
ンよりプトレッシンへの転換を触媒するアグマチナーゼ
を欠失したエシェリヒア・コリであることを特徴とする
請求項７に記載のアグマチンの製造方法。
【００２２】（請求項１０） アルギニンからアグマチ
ンへの転換反応において、反応系のｐＨをｐＨ６未満に
制御することを特徴とする請求項１〜９のいずれか一つ
に記載のアグマチンの製造方法。
ンへの転換反応において、反応系のｐＨをｐＨ６未満に
制御することを特徴とする請求項１〜９のいずれか一つ
に記載のアグマチンの製造方法。
【００２３】（請求項１１） アルギニンからアグマチ
ンへの転換反応において、反応系にピリドキサールリン
酸を添加することを特徴とする請求項１〜１０のいずれ
か一つに記載のアグマチンの製造方法。
ンへの転換反応において、反応系にピリドキサールリン
酸を添加することを特徴とする請求項１〜１０のいずれ
か一つに記載のアグマチンの製造方法。
【００２４】（請求項１２） 少なくとも、前記アルギ
ニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された組換え体を、３
０℃未満で培養することにより、菌体内にアルギニン脱
炭酸酵素を蓄積させる工程と、前記アルギニン脱炭酸酵
素遺伝子が増幅発現された組換え体、または、前記組換
え体から得られるアルギニン脱炭酸酵素もしくはアルギ
ニン脱炭酸酵素含有物を用いてアルギニンを脱炭酸する
ことによりアグマチンを製造する工程と、を含むことを
特徴とする請求項１〜１１のいずれか一つに記載のアグ
マチンの製造方法。
ニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された組換え体を、３
０℃未満で培養することにより、菌体内にアルギニン脱
炭酸酵素を蓄積させる工程と、前記アルギニン脱炭酸酵
素遺伝子が増幅発現された組換え体、または、前記組換
え体から得られるアルギニン脱炭酸酵素もしくはアルギ
ニン脱炭酸酵素含有物を用いてアルギニンを脱炭酸する
ことによりアグマチンを製造する工程と、を含むことを
特徴とする請求項１〜１１のいずれか一つに記載のアグ
マチンの製造方法。
【００２５】（請求項１３） アルギニン脱炭酸酵素遺
伝子が増幅発現された組換え体を培地中で培養し、培地
中および／または細胞中にアルギニン脱炭酸酵素を蓄積
させることを特徴とするアルギニン脱炭酸酵素の製造方
法。
伝子が増幅発現された組換え体を培地中で培養し、培地
中および／または細胞中にアルギニン脱炭酸酵素を蓄積
させることを特徴とするアルギニン脱炭酸酵素の製造方
法。
【００２６】
【発明の実施の形態】以下、本発明について、 [I] アルギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された組換
え体 [II] アグマチンの製造方法 の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。
え体 [II] アグマチンの製造方法 の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。
【００２７】[I] アルギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発
現された組換え体 アルギニン脱炭酸酵素（Arginine decarboxylase）は、
アミノ酸の一つであるアルギニンからアグマチンと炭酸
ガスを生成する反応を触媒する。アルギニン脱炭酸酵素
遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ をはじめとするエシェリヒア
属やサルモネラ属(J.Bacteriol., 177, 4097-4104(199
5))、植物(Mol.Gen.Genet., 224, 431-436(1990)、Plan
t Physiol., 100, 146-152(1992)、Plant Physiol., 10
3, 829-834(1993)、Plant Cell Physiol., 35, 1245-12
49(1994))にその存在が知られている。しかし、これら
公知のアルギニン脱炭酸酵素産生菌を培養しても、ほと
んどアルギニン脱炭酸酵素を蓄積しないことが分かって
いる。
現された組換え体 アルギニン脱炭酸酵素（Arginine decarboxylase）は、
アミノ酸の一つであるアルギニンからアグマチンと炭酸
ガスを生成する反応を触媒する。アルギニン脱炭酸酵素
遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ をはじめとするエシェリヒア
属やサルモネラ属(J.Bacteriol., 177, 4097-4104(199
5))、植物(Mol.Gen.Genet., 224, 431-436(1990)、Plan
t Physiol., 100, 146-152(1992)、Plant Physiol., 10
3, 829-834(1993)、Plant Cell Physiol., 35, 1245-12
49(1994))にその存在が知られている。しかし、これら
公知のアルギニン脱炭酸酵素産生菌を培養しても、ほと
んどアルギニン脱炭酸酵素を蓄積しないことが分かって
いる。
【００２８】本発明においては、アルギニンの脱炭酸反
応に必要な酵素量を確保するために、アルギニン脱炭酸
酵素遺伝子の発現量を上昇させた組換え体を作製する。
応に必要な酵素量を確保するために、アルギニン脱炭酸
酵素遺伝子の発現量を上昇させた組換え体を作製する。
【００２９】アルギニン脱炭酸酵素遺伝子の発現量を上
昇させるには、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子の調節領域
を改良すればよい。調節領域の改良とは、たとえば、新
たに強力なプロモーターを挿入したり、プロモーターに
変異を導入することによってプロモーターを強化した
り、調節領域に結合するリプレッサータンパク質等の発
現量を制御するなどして、下流にあるアルギニン脱炭酸
酵素遺伝子の転写量を増加させることをいう。
昇させるには、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子の調節領域
を改良すればよい。調節領域の改良とは、たとえば、新
たに強力なプロモーターを挿入したり、プロモーターに
変異を導入することによってプロモーターを強化した
り、調節領域に結合するリプレッサータンパク質等の発
現量を制御するなどして、下流にあるアルギニン脱炭酸
酵素遺伝子の転写量を増加させることをいう。
【００３０】アルギニン脱炭酸酵素遺伝子の発現量を上
昇させるため、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を多コピー
型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、同組換
えＤＮＡを微生物に保持させることが好ましい。アルギ
ニン脱炭酸酵素遺伝子の発現量を上昇させた微生物の誘
導にあたっては、例えばＥ．ｃｏｌｉ等のアルギニン脱
炭酸酵素産生菌の既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ(p
olymerase chain reaction)法を用いて必要な遺伝子領
域を増幅取得し、プラスミド等のベクターに搭載して、
宿主細胞を形質転換する。
昇させるため、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を多コピー
型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、同組換
えＤＮＡを微生物に保持させることが好ましい。アルギ
ニン脱炭酸酵素遺伝子の発現量を上昇させた微生物の誘
導にあたっては、例えばＥ．ｃｏｌｉ等のアルギニン脱
炭酸酵素産生菌の既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ(p
olymerase chain reaction)法を用いて必要な遺伝子領
域を増幅取得し、プラスミド等のベクターに搭載して、
宿主細胞を形質転換する。
【００３１】図１は、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子が増
幅発現された組換え体の製造工程のフローチャートであ
る。先ず、本発明のアルギニン脱炭酸酵素をコードする
ＤＮＡを調製する(ステップＳ１)。次に、調製したアル
ギニン脱炭酸酵素遺伝子をベクターＤＮＡと接続して組
み換えＤＮＡを作製し(ステップＳ２)、該組み換えＤＮ
Ａによって宿主細胞を形質転換して形質転換体を作製す
る(ステップＳ３)。続いて、該形質転換体を培地中で培
養し、培地中および／または細胞中にアルギニン脱炭酸
酵素を生成蓄積させる(ステップＳ４)。その後、ステッ
プＳ５に進み、生成したアルギニン脱炭酸酵素を回収・
精製することによってアルギニン脱炭酸酵素を大量生産
する。また、ステップＳ５で生産したアルギニン脱炭酸
酵素またはステップＳ４のアルギニン脱炭酸酵素が蓄積
された培地を用いて、アルギニンを脱炭酸することによ
り、アグマチンを大量に製造する(ステップＳ６)。
幅発現された組換え体の製造工程のフローチャートであ
る。先ず、本発明のアルギニン脱炭酸酵素をコードする
ＤＮＡを調製する(ステップＳ１)。次に、調製したアル
ギニン脱炭酸酵素遺伝子をベクターＤＮＡと接続して組
み換えＤＮＡを作製し(ステップＳ２)、該組み換えＤＮ
Ａによって宿主細胞を形質転換して形質転換体を作製す
る(ステップＳ３)。続いて、該形質転換体を培地中で培
養し、培地中および／または細胞中にアルギニン脱炭酸
酵素を生成蓄積させる(ステップＳ４)。その後、ステッ
プＳ５に進み、生成したアルギニン脱炭酸酵素を回収・
精製することによってアルギニン脱炭酸酵素を大量生産
する。また、ステップＳ５で生産したアルギニン脱炭酸
酵素またはステップＳ４のアルギニン脱炭酸酵素が蓄積
された培地を用いて、アルギニンを脱炭酸することによ
り、アグマチンを大量に製造する(ステップＳ６)。
【００３２】ここで、組み換えＤＮＡ技術によってアル
ギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された組換え体を製
造する方法について、下記の順に詳細に説明する。 (1)アルギニン脱炭酸酵素遺伝子の調製 (2)組み換えＤＮＡの作製 (3)組換え体の作製 (4)アルギニン脱炭酸酵素の生成蓄積 (5)アルギニン脱炭酸酵素の回収・精製
ギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された組換え体を製
造する方法について、下記の順に詳細に説明する。 (1)アルギニン脱炭酸酵素遺伝子の調製 (2)組み換えＤＮＡの作製 (3)組換え体の作製 (4)アルギニン脱炭酸酵素の生成蓄積 (5)アルギニン脱炭酸酵素の回収・精製
【００３３】(1)アルギニン脱炭酸酵素遺伝子の調製 アルギニン脱炭酸酵素遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ をはじ
めとするエシェリヒア属やサルモネラ属(J.Bacteriol.,
177, 4097-4104(1995))、植物(Mol.Gen.Genet., 224,
431-436(1990)、Plant Physiol., 100, 146-152(199
2)、Plant Physiol., 103, 829-834(1993)、Plant Cell
Physiol., 35, 1245-1249(1994))などのアルギニン脱
炭酸酵素を産生する公知の微生物から特に限定なく取得
できる。
めとするエシェリヒア属やサルモネラ属(J.Bacteriol.,
177, 4097-4104(1995))、植物(Mol.Gen.Genet., 224,
431-436(1990)、Plant Physiol., 100, 146-152(199
2)、Plant Physiol., 103, 829-834(1993)、Plant Cell
Physiol., 35, 1245-1249(1994))などのアルギニン脱
炭酸酵素を産生する公知の微生物から特に限定なく取得
できる。
【００３４】特にＥ．ｃｏｌｉにおいては、誘導型の酵
素（遺伝子名はａｄｉ）と非誘導型の酵素（遺伝子名は
ｓｐｅＡ）の２種の存在が知られている。ａｄｉについ
ては微生物の生存環境が極端な酸性状態におかれた時
に、すなわち酸ストレスが生じた時に、緊急的に誘導発
現され、アルギニンを脱炭酸して、塩基性のアグマチン
を生成して、中和化を計り、一時的に生存の危機を脱す
る機構であると理解されている(J.Bacteriol., 177, 40
97-4104(1995), Appl.Environ.Microbiol., 62,3094-31
00(1996)、J.Bacteriol., 181, 3525-3535(1999))。
素（遺伝子名はａｄｉ）と非誘導型の酵素（遺伝子名は
ｓｐｅＡ）の２種の存在が知られている。ａｄｉについ
ては微生物の生存環境が極端な酸性状態におかれた時
に、すなわち酸ストレスが生じた時に、緊急的に誘導発
現され、アルギニンを脱炭酸して、塩基性のアグマチン
を生成して、中和化を計り、一時的に生存の危機を脱す
る機構であると理解されている(J.Bacteriol., 177, 40
97-4104(1995), Appl.Environ.Microbiol., 62,3094-31
00(1996)、J.Bacteriol., 181, 3525-3535(1999))。
【００３５】ｓｐｅＡについてはｓｐｅＡＢとしてオペ
ロンを形成し、アルギニンからアグマチンと炭酸ガスを
生成する酵素をコードするｓｐｅＡとアグマチンからプ
トレッシンと尿素を生成する酵素をコードするｓｐｅＢ
が存在することが知られている(J.Bacteriol., 174, 75
8-764(1992))。本酵素系は非誘導型で、オルニチンから
脱炭酸してプトレッシンが生じるオルニチン脱炭酸酵素
とともに、微生物にとってはプトレッシンやスペルミジ
ン等のポリアミン生合成のために必要な代謝経路と理解
されている(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 80, 5181-518
4(1983)、J.Bacteriol., 173, 3615-3621(1991)、Int.
J.Biochem., 26, 991-1001(1994)、J.Bacteriol., 180,
4278-4286(1998)、Microbiology, 145, 301-307(199
9))。このｓｐｅＡのコードするアルギニン脱炭酸酵素
およびｓｐｅＢのコードするアグマチナーゼの酵素化学
的諸性質や遺伝子構造についても詳しく研究されている
(J.Biol.Chem., 248、 1687-1695(1973)、Methods Enzy
mol., 94、 117-121(1983)、Gene、 30、 129-136(198
4)、J.Bacteriol., 172、 4631-4640(1990))。特に本酵
素系とオルニチン脱炭酸酵素系については微生物におけ
るポリアミンの生理機能を解析するために、オルニチン
脱炭酸酵素遺伝子の欠失とアグマチナーゼ遺伝子(ｓｐ
ｅＢ)の欠失をした変異株が作製されている(J.Bacterio
l., 101, 725-730(1970)、J.Biol.Chem., 254, 12419-
12426(1979)、Biochem.J., 234, 617-622(1986)、Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A., 84, 4423-4427(1987))。この両
酵素の欠失は微生物の生育には影響があるようではある
が、致死には至らず、まだポリアミンの微生物における
生理機能は明確にはされていない(J.Bacteriol., 101,
731-737(1970)、J.Bacteriol., 113, 271-277(1973)、A
dv.Polyamine Res., 4, 495-506(1983)、J.Bacteriol.,
163, 522-527(1985))。しかし、アグマチン等のアミン
については、アルカリ側では揮発性があり、皮膚や粘膜
に対して刺激性があり、皮膚や粘膜を通して体内に吸収
されることが知られている。微生物に対するその毒性は
明確ではないが、アミンはアルカリ性であり、中和する
ことなく、高濃度になれば微生物に対して致死性になる
ことが考えられる。
ロンを形成し、アルギニンからアグマチンと炭酸ガスを
生成する酵素をコードするｓｐｅＡとアグマチンからプ
トレッシンと尿素を生成する酵素をコードするｓｐｅＢ
が存在することが知られている(J.Bacteriol., 174, 75
8-764(1992))。本酵素系は非誘導型で、オルニチンから
脱炭酸してプトレッシンが生じるオルニチン脱炭酸酵素
とともに、微生物にとってはプトレッシンやスペルミジ
ン等のポリアミン生合成のために必要な代謝経路と理解
されている(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 80, 5181-518
4(1983)、J.Bacteriol., 173, 3615-3621(1991)、Int.
J.Biochem., 26, 991-1001(1994)、J.Bacteriol., 180,
4278-4286(1998)、Microbiology, 145, 301-307(199
9))。このｓｐｅＡのコードするアルギニン脱炭酸酵素
およびｓｐｅＢのコードするアグマチナーゼの酵素化学
的諸性質や遺伝子構造についても詳しく研究されている
(J.Biol.Chem., 248、 1687-1695(1973)、Methods Enzy
mol., 94、 117-121(1983)、Gene、 30、 129-136(198
4)、J.Bacteriol., 172、 4631-4640(1990))。特に本酵
素系とオルニチン脱炭酸酵素系については微生物におけ
るポリアミンの生理機能を解析するために、オルニチン
脱炭酸酵素遺伝子の欠失とアグマチナーゼ遺伝子(ｓｐ
ｅＢ)の欠失をした変異株が作製されている(J.Bacterio
l., 101, 725-730(1970)、J.Biol.Chem., 254, 12419-
12426(1979)、Biochem.J., 234, 617-622(1986)、Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A., 84, 4423-4427(1987))。この両
酵素の欠失は微生物の生育には影響があるようではある
が、致死には至らず、まだポリアミンの微生物における
生理機能は明確にはされていない(J.Bacteriol., 101,
731-737(1970)、J.Bacteriol., 113, 271-277(1973)、A
dv.Polyamine Res., 4, 495-506(1983)、J.Bacteriol.,
163, 522-527(1985))。しかし、アグマチン等のアミン
については、アルカリ側では揮発性があり、皮膚や粘膜
に対して刺激性があり、皮膚や粘膜を通して体内に吸収
されることが知られている。微生物に対するその毒性は
明確ではないが、アミンはアルカリ性であり、中和する
ことなく、高濃度になれば微生物に対して致死性になる
ことが考えられる。
【００３６】本発明においては、アルギニン脱炭酸酵素
遺伝子としてＥ．ｃｏｌｉ由来のａｄｉ遺伝子を用いる
ことが特に好ましい。ｓｐｅＡもアルギニン脱炭酸酵素
をコードする遺伝子であるが、ａｄｉにコードされるア
ルギニン脱炭酸酵素(J.Biol.Chem., 243、 1671-1677(1
968))の方がｓｐｅＡにコードされるアルギニン脱炭酸
酵素(J.Biol.Chem., 248、 1687-1695(1973))に比べ、
比活性が高い等の有利性がある。
遺伝子としてＥ．ｃｏｌｉ由来のａｄｉ遺伝子を用いる
ことが特に好ましい。ｓｐｅＡもアルギニン脱炭酸酵素
をコードする遺伝子であるが、ａｄｉにコードされるア
ルギニン脱炭酸酵素(J.Biol.Chem., 243、 1671-1677(1
968))の方がｓｐｅＡにコードされるアルギニン脱炭酸
酵素(J.Biol.Chem., 248、 1687-1695(1973))に比べ、
比活性が高い等の有利性がある。
【００３７】アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を取得するに
は、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２のＷ３１１０株
（ＡＴＣＣ２７３２５）の染色体ＤＮＡよりＰＣＲ法を
用いてアルギニン脱炭酸酵素をコードする遺伝子である
ａｄｉをクローニングすればよい。具体的には、公知の
ａｄｉ遺伝子の塩基配列から３０塩基対程度のＤＮＡ分
子を合成し、これをプローブとして利用し、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ染色体遺伝子ライブラリーから単離すればよい。この
際使用する染色体ＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉ由来であればど
の菌株でもよい。
は、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２のＷ３１１０株
（ＡＴＣＣ２７３２５）の染色体ＤＮＡよりＰＣＲ法を
用いてアルギニン脱炭酸酵素をコードする遺伝子である
ａｄｉをクローニングすればよい。具体的には、公知の
ａｄｉ遺伝子の塩基配列から３０塩基対程度のＤＮＡ分
子を合成し、これをプローブとして利用し、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ染色体遺伝子ライブラリーから単離すればよい。この
際使用する染色体ＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉ由来であればど
の菌株でもよい。
【００３８】該ＤＮＡ分子を合成する方法はTetrahedro
n Letters, 22, 1859 (1981)に開示されている。また、
Applied Biosystems社製のシンセサイザーを用いて該Ｄ
ＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子は、Ｅ．ｃｏｌｉ
由来のａｄｉ遺伝子全長を、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体遺伝子
ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用で
きるとともに、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｄｉ遺伝子をＰＣ
Ｒ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。
n Letters, 22, 1859 (1981)に開示されている。また、
Applied Biosystems社製のシンセサイザーを用いて該Ｄ
ＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子は、Ｅ．ｃｏｌｉ
由来のａｄｉ遺伝子全長を、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体遺伝子
ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用で
きるとともに、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｄｉ遺伝子をＰＣ
Ｒ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。
【００３９】ＰＣＲ法の操作については、White, T.J.
et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)等に記載されて
いる。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子
をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的
とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecula
r Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1
989)等に記載されている。
et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)等に記載されて
いる。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子
をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的
とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecula
r Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1
989)等に記載されている。
【００４０】本発明に用いるａｄｉ遺伝子には、遺伝的
多型性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多型性と
は、遺伝子上の自然突然変異によりタンパク質のアミノ
酸配列が一部変化している現象をいう。
多型性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多型性と
は、遺伝子上の自然突然変異によりタンパク質のアミノ
酸配列が一部変化している現象をいう。
【００４１】また、アルギニン脱炭酸酵素の活性を上昇
させるため、アルギニン脱炭酸酵素の構造遺伝子自体に
変異を導入して、酵素そのものの活性を上昇させても良
い。
させるため、アルギニン脱炭酸酵素の構造遺伝子自体に
変異を導入して、酵素そのものの活性を上昇させても良
い。
【００４２】遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異
的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J., Methods Enzymo
l., 154, 350(1987)）、リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣ
Ｒ Technology, Stockton Press(1989)）、特定の部分
のＤＮＡを化学合成する方法あるいは当該遺伝子をヒド
ロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株
を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝
酸などの化学薬剤処理をする方法がある。
的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J., Methods Enzymo
l., 154, 350(1987)）、リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣ
Ｒ Technology, Stockton Press(1989)）、特定の部分
のＤＮＡを化学合成する方法あるいは当該遺伝子をヒド
ロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株
を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝
酸などの化学薬剤処理をする方法がある。
【００４３】(2)組み換えＤＮＡの作製 本発明における組換えＤＮＡとは、上述のアルギニン脱
炭酸酵素遺伝子（ａｄｉ等）をパッセンジャーとして、
プラスミドやファージＤＮＡのベクターに接続したもの
をいう。
炭酸酵素遺伝子（ａｄｉ等）をパッセンジャーとして、
プラスミドやファージＤＮＡのベクターに接続したもの
をいう。
【００４４】ここでベクターとは、いわゆるマルチコピ
ー型のものが好ましく、Ｃｏｌ Ｅ１由来の複製開始点
を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐ
ＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げ
られる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、
挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を
施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変
異剤やＵＶ照射などによる変異処理あるいは自然変異な
どによる改変をも含む。これら以外にも、トランスポゾ
ン(Berg、D.E. and Berg、C.M., Bio/Technol., 1、 41
7(1983))やＭｕファージ（特開平２−１０９９８５号公
報）を用いることもできる。遺伝子を相同組換え用プラ
スミド等を用いた方法で染色体に組込んでコピー数を上
昇させることも可能である。
ー型のものが好ましく、Ｃｏｌ Ｅ１由来の複製開始点
を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐ
ＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げ
られる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、
挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を
施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変
異剤やＵＶ照射などによる変異処理あるいは自然変異な
どによる改変をも含む。これら以外にも、トランスポゾ
ン(Berg、D.E. and Berg、C.M., Bio/Technol., 1、 41
7(1983))やＭｕファージ（特開平２−１０９９８５号公
報）を用いることもできる。遺伝子を相同組換え用プラ
スミド等を用いた方法で染色体に組込んでコピー数を上
昇させることも可能である。
【００４５】その際、該有用遺伝子を効率的に発現させ
るために、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、
ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ＰＬプロモ
ーター、その他の微生物内で機能するプロモーターを用
いることが好ましい。
るために、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、
ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ＰＬプロモ
ーター、その他の微生物内で機能するプロモーターを用
いることが好ましい。
【００４６】また、生産量を増大させるためには、タン
パク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータ
ーを連結することが好ましい。このターミネーターとし
ては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネータ
ー、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子
のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネー
ター等が挙げられる。またはエンハンサーを新たに導入
することによって遺伝子の転写量を増加させてもよい。
パク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータ
ーを連結することが好ましい。このターミネーターとし
ては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネータ
ー、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子
のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネー
ター等が挙げられる。またはエンハンサーを新たに導入
することによって遺伝子の転写量を増加させてもよい。
【００４７】また、形質転換体を選別するために、該ベ
クターはアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有する
ことが好ましく、このようなプラスミドとして、例え
ば、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クロ
ーンテック製）、ｐＫＫ２３３-２（クローンテック
製）などのように強力なプロモーターを持つ発現ベクタ
ーが市販されている。
クターはアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有する
ことが好ましく、このようなプラスミドとして、例え
ば、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クロ
ーンテック製）、ｐＫＫ２３３-２（クローンテック
製）などのように強力なプロモーターを持つ発現ベクタ
ーが市販されている。
【００４８】(3)組換え体の作製 アルギニン脱炭酸酵素遺伝子の発現量を上昇させた組換
え体の誘導にあたっては、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子
（ａｄｉ等）をプラスミドやファージＤＮＡのベクター
に接続した組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換
する。
え体の誘導にあたっては、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子
（ａｄｉ等）をプラスミドやファージＤＮＡのベクター
に接続した組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換
する。
【００４９】形質転換される宿主細胞としては、アルギ
ニン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が発現する微生物、
例えば、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、
植物細胞、動物細胞等を用いることができる。好ましく
は大腸菌、より好ましくはエシェリヒア・コリ、特に好
ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９等のcompetent cell
が用いられる。
ニン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が発現する微生物、
例えば、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、
植物細胞、動物細胞等を用いることができる。好ましく
は大腸菌、より好ましくはエシェリヒア・コリ、特に好
ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９等のcompetent cell
が用いられる。
【００５０】上述の組み換えＤＮＡを用いて宿主細胞を
形質転換する。形質転換を行う方法および形質転換体を
選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold
Spring Harbor press (1989)等に記載されている方法
を適用することができる。
形質転換する。形質転換を行う方法および形質転換体を
選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold
Spring Harbor press (1989)等に記載されている方法
を適用することができる。
【００５１】(4)アルギニン脱炭酸酵素の生成蓄積 上述の方法で取得されるアルギニン脱炭酸酵素遺伝子
(ａｄｉ等)を含む組換えＤＮＡで形質転換された組換え
体を培養し、目的の酵素を生成蓄積せしめる。アルギニ
ン脱炭酸酵素遺伝子の高発現能を獲得した組換え体を培
養する方法を以下に説明する。
(ａｄｉ等)を含む組換えＤＮＡで形質転換された組換え
体を培養し、目的の酵素を生成蓄積せしめる。アルギニ
ン脱炭酸酵素遺伝子の高発現能を獲得した組換え体を培
養する方法を以下に説明する。
【００５２】使用する培地は、しばしばＬＢ培地（Bact
o-tryptone 1%、 Yeast extract 0.5%、 NaCl 1%、 Glu
cose 0.1%、 pH7.0）が用いられるが、炭素源、窒素
源、無機イオンおよび必要に応じその他の有機成分を含
有する通常の培地でよい。
o-tryptone 1%、 Yeast extract 0.5%、 NaCl 1%、 Glu
cose 0.1%、 pH7.0）が用いられるが、炭素源、窒素
源、無機イオンおよび必要に応じその他の有機成分を含
有する通常の培地でよい。
【００５３】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マル
トース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の
加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールや
ソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマー
ル酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることが
できる。
ス、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マル
トース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の
加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールや
ソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマー
ル酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることが
できる。
【００５４】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄
養素としては、各種アミノ酸、ビタミンＢ６等のビタミ
ン類、ＲＮＡ等の核酸類などの要求物質または酵母エキ
ス等を適量含有させることが望ましい。
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄
養素としては、各種アミノ酸、ビタミンＢ６等のビタミ
ン類、ＲＮＡ等の核酸類などの要求物質または酵母エキ
ス等を適量含有させることが望ましい。
【００５５】これらの他に、必要に応じて、リン酸カル
シウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン
等が少量添加される。
シウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン
等が少量添加される。
【００５６】培養は好気的条件下で１２〜７２時間程度
実施するのがよく、培養温度は２０℃〜４５℃に、培養
ｐＨは５〜８に制御するのが好ましい。なお、ｐＨ調整
には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、
さらにアンモニアガス等を使用することができる。
実施するのがよく、培養温度は２０℃〜４５℃に、培養
ｐＨは５〜８に制御するのが好ましい。なお、ｐＨ調整
には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、
さらにアンモニアガス等を使用することができる。
【００５７】組換え体において、アルギニン脱炭酸酵素
の発現量が菌体内タンパク質の１０％を超える場合は、
アルギニン脱炭酸酵素が顆粒(inclusion body)を形成し
てしまい却ってアルギニン脱炭酸酵素活性が低下する場
合があるが、組換え体を３０℃以下で培養することによ
り顆粒の形成を抑制することができる。
の発現量が菌体内タンパク質の１０％を超える場合は、
アルギニン脱炭酸酵素が顆粒(inclusion body)を形成し
てしまい却ってアルギニン脱炭酸酵素活性が低下する場
合があるが、組換え体を３０℃以下で培養することによ
り顆粒の形成を抑制することができる。
【００５８】培養液からの菌体の分離回収、および酵素
液の調製は通常、遠心分離、超音波破砕、イオン交換樹
脂法、沈殿法その他の公知の方法を組合せることにより
実施できる。
液の調製は通常、遠心分離、超音波破砕、イオン交換樹
脂法、沈殿法その他の公知の方法を組合せることにより
実施できる。
【００５９】[II] アグマチンの製造方法 本発明のアグマチンの製造方法においては、アルギニン
脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された組換え体によって生
成蓄積されたアルギニン脱炭酸酵素を用いて、酵素化学
的にＬ−アルギニン(L-Arginine)を脱炭酸する。
脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された組換え体によって生
成蓄積されたアルギニン脱炭酸酵素を用いて、酵素化学
的にＬ−アルギニン(L-Arginine)を脱炭酸する。
【００６０】Ｌ−アルギニンにアルギニン脱炭酸酵素を
作用させる方法は特に限定されず、例えば、アルギニン
脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された組換え体を培養しな
がら、培養液中に直接Ｌ−アルギニンを添加してもよい
し、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などを用いて
もよい。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理
物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からアル
ギニン脱炭酸酵素を回収し、粗酵素液として使用しても
よいし、さらに、アルギニン脱炭酸酵素を精製して用い
てもよい。すなわち、アルギニン脱炭酸酵素活性を有す
る画分であれば、酵素と当該酵素含有物全てを使用する
ことが可能である。ここで「酵素含有物」とは、当該酵
素を含むものであればよく、具体的には培養物、培養菌
体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理
物、粗酵素液、精製酵素などを含む。工程を簡素化して
アグマチンの製造コストダウンを図る観点からは、培養
液中に直接基質を添加して反応させる方法が最も好まし
い。
作用させる方法は特に限定されず、例えば、アルギニン
脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された組換え体を培養しな
がら、培養液中に直接Ｌ−アルギニンを添加してもよい
し、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などを用いて
もよい。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理
物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からアル
ギニン脱炭酸酵素を回収し、粗酵素液として使用しても
よいし、さらに、アルギニン脱炭酸酵素を精製して用い
てもよい。すなわち、アルギニン脱炭酸酵素活性を有す
る画分であれば、酵素と当該酵素含有物全てを使用する
ことが可能である。ここで「酵素含有物」とは、当該酵
素を含むものであればよく、具体的には培養物、培養菌
体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理
物、粗酵素液、精製酵素などを含む。工程を簡素化して
アグマチンの製造コストダウンを図る観点からは、培養
液中に直接基質を添加して反応させる方法が最も好まし
い。
【００６１】アルギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現さ
れた組換え体を培養しながら、培養液中に直接Ｌ−アル
ギニンを添加して、アグマチン生成反応を進行させる場
合、反応は静置ないしはゆるやかに撹拌して行う。反応
温度は１０℃〜６０℃、好ましくは２５℃〜４５℃に、
ｐＨは３〜８、好ましくはｐＨ４．５〜６に制御するの
が良い。また反応には補酵素であるピリドキサールリン
酸を添加しておくのが好ましい。基質のＬ−アルギニン
(L-Arginine) は反応が続く限りは添加しても良く、必
要に応じ、必要な量と時間だけ反応させることができ
る。
れた組換え体を培養しながら、培養液中に直接Ｌ−アル
ギニンを添加して、アグマチン生成反応を進行させる場
合、反応は静置ないしはゆるやかに撹拌して行う。反応
温度は１０℃〜６０℃、好ましくは２５℃〜４５℃に、
ｐＨは３〜８、好ましくはｐＨ４．５〜６に制御するの
が良い。また反応には補酵素であるピリドキサールリン
酸を添加しておくのが好ましい。基質のＬ−アルギニン
(L-Arginine) は反応が続く限りは添加しても良く、必
要に応じ、必要な量と時間だけ反応させることができ
る。
【００６２】粗酵素液を用いてアグマチン生成反応を行
う場合、培養菌体を遠心分離操作などにより回収した
後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、アルギニン脱炭酸酵
素を含む粗酵素液を調整する。菌体破砕には超音波破
砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を
用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リゾチ
ームや、ペプチターゼ処理またはこれらを適宜組み合わ
せた方法が用いられる。精製酵素液を用いてアグマチン
生成反応を行う場合、さらに、通常の沈澱、濾過、カラ
ムクロマトグラフィー等の手法により、アルギニン脱炭
酸の粗酵素液を精製する。この場合、アルギニン脱炭酸
酵素の抗体を利用した精製法も利用できる。
う場合、培養菌体を遠心分離操作などにより回収した
後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、アルギニン脱炭酸酵
素を含む粗酵素液を調整する。菌体破砕には超音波破
砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を
用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リゾチ
ームや、ペプチターゼ処理またはこれらを適宜組み合わ
せた方法が用いられる。精製酵素液を用いてアグマチン
生成反応を行う場合、さらに、通常の沈澱、濾過、カラ
ムクロマトグラフィー等の手法により、アルギニン脱炭
酸の粗酵素液を精製する。この場合、アルギニン脱炭酸
酵素の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００６３】アルギニン脱炭酸酵素の粗酵素液または精
製酵素を用いてアグマチン生成反応を進行させる場合に
は、基質のＬ−アルギニン(L-Arginine)と粗酵素液また
は精製酵素を含む反応液を、１０℃〜６０℃、好ましく
は２５℃〜４５℃に、ｐＨは３〜８、好ましくはｐＨ
４．５〜６に制御しながら反応を進行させる。反応には
補酵素であるピリドキサールリン酸を添加しておくのが
好ましい。基質のＬ−アルギニン(L-Arginine) は反応
が続く限りは添加しても良く、必要に応じ、必要な量と
時間だけ反応させることができる。
製酵素を用いてアグマチン生成反応を進行させる場合に
は、基質のＬ−アルギニン(L-Arginine)と粗酵素液また
は精製酵素を含む反応液を、１０℃〜６０℃、好ましく
は２５℃〜４５℃に、ｐＨは３〜８、好ましくはｐＨ
４．５〜６に制御しながら反応を進行させる。反応には
補酵素であるピリドキサールリン酸を添加しておくのが
好ましい。基質のＬ−アルギニン(L-Arginine) は反応
が続く限りは添加しても良く、必要に応じ、必要な量と
時間だけ反応させることができる。
【００６４】
【実施例】実施例１ （アルギニン脱炭酸酵素遺伝子(ａｄｉ)の取得と発現）
遺伝子データバンク（E.coli Gene Bank）において「ａ
ｄｉ」をキーワードにして検索される情報に基づいて作
製された、ＧＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＴＡＴＴＡＡ
ＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧ（配列番号１）とＣＣＧＧＡＴＣ
ＣＡＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＧＧＡＡＴＡＧＴＧ（配列番
号２）の３０merと２８merの両端プライマー、および、
ＣＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＴＡＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡ
ＡＡＡ（配列番号３）とＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＣＴ
ＴＣＡＧＣＧＧＡＡＴＡＧＴＧ（配列番号２）の２８me
rと２８merの両端プライマーとPyrobest DNA Polymeras
e（宝酒造社製）によるＰＣＲ法（９４℃、３０sec、５
５℃、１min、７２℃、２min、３０サイクル、Gene Amp
PCR System Model9600(パーキンエルマー社製)）を行
い、ＡＴＧおよびＳＤ−ＡＴＧと翻訳終止コドンをカバ
ーするａｄｉ構造遺伝子領域約２．３ｋｂ断片を増幅
し、前者の断片についてはＮｃｏＩとＢａｍＨＩ消化
後、ｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）のＮｃｏＩサ
イトとＢａｍＨＩサイトに挿入した。本発現プラスミド
をｐＴｒｃａｄｉ１と命名する。後者の断片については
ＰｓｔＩとＢａｍＨＩ消化後、ｐＵＣ１９（宝酒造社
製）のＰｓｔＩサイトとＢａｍＨＩサイトに挿入した。
本発現プラスミドをｐＵＣａｄｉと命名する（図１）。
遺伝子データバンク（E.coli Gene Bank）において「ａ
ｄｉ」をキーワードにして検索される情報に基づいて作
製された、ＧＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＴＡＴＴＡＡ
ＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧ（配列番号１）とＣＣＧＧＡＴＣ
ＣＡＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＧＧＡＡＴＡＧＴＧ（配列番
号２）の３０merと２８merの両端プライマー、および、
ＣＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＴＡＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡ
ＡＡＡ（配列番号３）とＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＣＴ
ＴＣＡＧＣＧＧＡＡＴＡＧＴＧ（配列番号２）の２８me
rと２８merの両端プライマーとPyrobest DNA Polymeras
e（宝酒造社製）によるＰＣＲ法（９４℃、３０sec、５
５℃、１min、７２℃、２min、３０サイクル、Gene Amp
PCR System Model9600(パーキンエルマー社製)）を行
い、ＡＴＧおよびＳＤ−ＡＴＧと翻訳終止コドンをカバ
ーするａｄｉ構造遺伝子領域約２．３ｋｂ断片を増幅
し、前者の断片についてはＮｃｏＩとＢａｍＨＩ消化
後、ｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）のＮｃｏＩサ
イトとＢａｍＨＩサイトに挿入した。本発現プラスミド
をｐＴｒｃａｄｉ１と命名する。後者の断片については
ＰｓｔＩとＢａｍＨＩ消化後、ｐＵＣ１９（宝酒造社
製）のＰｓｔＩサイトとＢａｍＨＩサイトに挿入した。
本発現プラスミドをｐＵＣａｄｉと命名する（図１）。
【００６５】ＰＣＲ用プライマーには配列番号１にはＮ
ｃｏＩサイト、配列番号２にはＢａｍＨＩサイト、配列
番号３にはＰｓｔＩサイトがそれぞれデザインされてい
る。またクローン化されたａｄｉはｐＴｒｃ９９Ａベク
ターではｔｒｃプロモーター支配下に、ｐＵＣ１９ベク
ターではｐＵＣ１９が持つｌａｃプロモーターの支配下
に発現され、アルギニン脱炭酸酵素に翻訳される。
ｃｏＩサイト、配列番号２にはＢａｍＨＩサイト、配列
番号３にはＰｓｔＩサイトがそれぞれデザインされてい
る。またクローン化されたａｄｉはｐＴｒｃ９９Ａベク
ターではｔｒｃプロモーター支配下に、ｐＵＣ１９ベク
ターではｐＵＣ１９が持つｌａｃプロモーターの支配下
に発現され、アルギニン脱炭酸酵素に翻訳される。
【００６６】また、これらのプラスミドｐＴｒｃａｄｉ
１およびｐＵＣａｄｉでＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形
質転換した組換え体を５０mg/Lのアンピシリンおよび１
０mg/Lのpyridoxineを含むＬＢ液体培地（Bacto-trypto
ne １％、 Yeast extract ０．５％、 ＮａＣｌ １％、
Glucose ０．１％、ｐＨ７．０）で培養し、1ｍＭ ＩＰ
ＴＧ(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside)添加による
発現誘導を行い、約１６時間培養した後にブロス４ｍｌ
分の菌体を集めた。これらの菌体を１％ L-Arginine・
ＨＣｌと０．０２％ピリドキサールリン酸を含む０．２
Ｍ酢酸ナトリウムBufferの０．４ｍｌに縣濁し、３７℃
で１時間インキュベートした。その反応液を遠心操作で
除菌後、上清液をＨＰＬＣにて分析した結果、ｐＴｒｃ
ａｄｉ１／ＪＭ１０９菌体法ではほぼ１００％の転換率
でアグマチンが生成した。ｐＵＣａｄｉ／ＪＭ１０９菌
体法では転換率は約２０％であった。また、ＩＰＴＧ非
誘導菌体を使用した場合には両者ともに約１０〜２０％
の転換率であった。コントロールとした宿主菌ＪＭ１０
９のみ、および野生株のＷ３１１０ではほとんど転換し
なかった。
１およびｐＵＣａｄｉでＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形
質転換した組換え体を５０mg/Lのアンピシリンおよび１
０mg/Lのpyridoxineを含むＬＢ液体培地（Bacto-trypto
ne １％、 Yeast extract ０．５％、 ＮａＣｌ １％、
Glucose ０．１％、ｐＨ７．０）で培養し、1ｍＭ ＩＰ
ＴＧ(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside)添加による
発現誘導を行い、約１６時間培養した後にブロス４ｍｌ
分の菌体を集めた。これらの菌体を１％ L-Arginine・
ＨＣｌと０．０２％ピリドキサールリン酸を含む０．２
Ｍ酢酸ナトリウムBufferの０．４ｍｌに縣濁し、３７℃
で１時間インキュベートした。その反応液を遠心操作で
除菌後、上清液をＨＰＬＣにて分析した結果、ｐＴｒｃ
ａｄｉ１／ＪＭ１０９菌体法ではほぼ１００％の転換率
でアグマチンが生成した。ｐＵＣａｄｉ／ＪＭ１０９菌
体法では転換率は約２０％であった。また、ＩＰＴＧ非
誘導菌体を使用した場合には両者ともに約１０〜２０％
の転換率であった。コントロールとした宿主菌ＪＭ１０
９のみ、および野生株のＷ３１１０ではほとんど転換し
なかった。
【００６７】またｐＴｒｃａｄｉ１／ＪＭ１０９および
ｐＵＣａｄｉ／ＪＭ１０９の１ｍＭＩＰＴＧ誘導菌体を
１％ ＳＤＳ溶液で可溶化し、ＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)-クマッシーブリリアン
トブルー(ＣＢＢ)染色解析を行ったところ、ｐＴｒｃａ
ｄｉ１／ＪＭ１０９菌体ではアルギニン脱炭酸酵素のサ
ブユニットの分子量に相当する約８５ｋＤａの顕著なバ
ンドが見出された。これはおよそ菌体内タンパク質の１
０％以上を占めていた。ｐＵＣａｄｉ／ＪＭ１０９菌体
およびＩＰＴＧ非誘導菌体については８５ｋＤａのとこ
ろに対照区に比べ有意なバンドを見出せなかった。
ｐＵＣａｄｉ／ＪＭ１０９の１ｍＭＩＰＴＧ誘導菌体を
１％ ＳＤＳ溶液で可溶化し、ＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)-クマッシーブリリアン
トブルー(ＣＢＢ)染色解析を行ったところ、ｐＴｒｃａ
ｄｉ１／ＪＭ１０９菌体ではアルギニン脱炭酸酵素のサ
ブユニットの分子量に相当する約８５ｋＤａの顕著なバ
ンドが見出された。これはおよそ菌体内タンパク質の１
０％以上を占めていた。ｐＵＣａｄｉ／ＪＭ１０９菌体
およびＩＰＴＧ非誘導菌体については８５ｋＤａのとこ
ろに対照区に比べ有意なバンドを見出せなかった。
【００６８】ｐＴｒｃａｄｉ１／ＪＭ１０９であるＥ.
ｃｏｌｉ ＡＪ１３８３９はＦＥＲＭ-Ｐ１８２８５とし
て独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ
ーに寄託してある。
ｃｏｌｉ ＡＪ１３８３９はＦＥＲＭ-Ｐ１８２８５とし
て独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ
ーに寄託してある。
【００６９】なお、この際のＨＰＬＣの分析条件は Column: SUMIPAX PG-ODS 07-4625、 250×4.6mm Mobile phase: アセトニトリル／リン酸buffer(0.03M N
aH2PO4、pH3.0)=30/70 Temperature: 40℃ Flow rate: 1.0 ml/min Detector: 210 nm(UV) である。
aH2PO4、pH3.0)=30/70 Temperature: 40℃ Flow rate: 1.0 ml/min Detector: 210 nm(UV) である。
【００７０】実施例２ （アルギニン脱炭酸酵素遺伝子(ａｄｉ)の発現系の改
良）アルギニン脱炭酸酵素遺伝子(ａｄｉ)を搭載した発
現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａにはそのｔｒｃプロモータ
ー支配下の発現を通常時には抑制するためにｌａｃＩq
というリプレッサーをコードする遺伝子が同じプラスミ
ド上に載っている。そして発現させたい時には１〜２mM
のＩＰＴＧを培養途中で添加することが行われている。
良）アルギニン脱炭酸酵素遺伝子(ａｄｉ)を搭載した発
現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａにはそのｔｒｃプロモータ
ー支配下の発現を通常時には抑制するためにｌａｃＩq
というリプレッサーをコードする遺伝子が同じプラスミ
ド上に載っている。そして発現させたい時には１〜２mM
のＩＰＴＧを培養途中で添加することが行われている。
【００７１】それ故、ＩＰＴＧ無添加でもアルギニン脱
炭酸酵素遺伝子(ａｄｉ)が発現できるように、ｐＴｒｃ
ａｄｉ１のｌａｃＩq遺伝子の一部を加工して、リプレ
ッサーを不活化することを試みた。その方法として、ｌ
ａｃＩq上にある制限酵素サイトのＡｐａＩサイトを消
去する方法およびＶａｎ９１ＩとＥｃｏＲＶサイトをde
leteさせる方法の二つの方法を採用した。すなわち、前
者についてはｐＴｒｃａｄｉ１をＡｐａＩで消化し、Ｔ
４ ＤＮＡ ポリメラーゼでＡｐａＩの接着末端を平滑末
端化した後、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼでセルフライゲーシ
ョンした。ＡｐａＩで切断できなくなったプラスミドを
ｐＴｒｃａｄｉ２と命名した（図２）。後者については
ｐＴｒｃａｄｉ１をＶａｎ９１ＩとＥｃｏＲＶで消化
し、Ｔ４ＤＮＡ ポリメラーゼでＶａｎ９１Ｉの接着末
端を平滑末端化した後、Ｖａｎ９１ＩとＥｃｏＲＶ切断
による小断片を除いた約６kbのＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼでセルフライゲーションした。得られたプラ
スミドをｐＴｒｃａｄｉ３と命名した（図２）。
炭酸酵素遺伝子(ａｄｉ)が発現できるように、ｐＴｒｃ
ａｄｉ１のｌａｃＩq遺伝子の一部を加工して、リプレ
ッサーを不活化することを試みた。その方法として、ｌ
ａｃＩq上にある制限酵素サイトのＡｐａＩサイトを消
去する方法およびＶａｎ９１ＩとＥｃｏＲＶサイトをde
leteさせる方法の二つの方法を採用した。すなわち、前
者についてはｐＴｒｃａｄｉ１をＡｐａＩで消化し、Ｔ
４ ＤＮＡ ポリメラーゼでＡｐａＩの接着末端を平滑末
端化した後、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼでセルフライゲーシ
ョンした。ＡｐａＩで切断できなくなったプラスミドを
ｐＴｒｃａｄｉ２と命名した（図２）。後者については
ｐＴｒｃａｄｉ１をＶａｎ９１ＩとＥｃｏＲＶで消化
し、Ｔ４ＤＮＡ ポリメラーゼでＶａｎ９１Ｉの接着末
端を平滑末端化した後、Ｖａｎ９１ＩとＥｃｏＲＶ切断
による小断片を除いた約６kbのＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼでセルフライゲーションした。得られたプラ
スミドをｐＴｒｃａｄｉ３と命名した（図２）。
【００７２】ｐＴｒｃａｄｉ２およびｐＴｒｃａｄｉ３
でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換したｐＴｒｃａ
ｄｉ２／ＪＭ１０９および ｐＴｒｃａｄｉ３／ＪＭ１
０９菌を用いて、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび１
０ｍｇ／Ｌのpyridoxineを含むＬＢ液体培地で培養し、
ＩＰＴＧ無添加で約１６時間培養した後にブロス４ｍｌ
分の菌体を集めた。実施例１と同様の反応系でアルギニ
ンからアグマチンへの転換率を解析した結果、どちらも
ほぼ１００％の転換率でアグマチンを生成した。
でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換したｐＴｒｃａ
ｄｉ２／ＪＭ１０９および ｐＴｒｃａｄｉ３／ＪＭ１
０９菌を用いて、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび１
０ｍｇ／Ｌのpyridoxineを含むＬＢ液体培地で培養し、
ＩＰＴＧ無添加で約１６時間培養した後にブロス４ｍｌ
分の菌体を集めた。実施例１と同様の反応系でアルギニ
ンからアグマチンへの転換率を解析した結果、どちらも
ほぼ１００％の転換率でアグマチンを生成した。
【００７３】またｐＴｒｃａｄｉ２／ＪＭ１０９および
ｐＴｒｃａｄｉ３／ＪＭ１０９のＩＰＴＧ非誘導菌体を
１％ ＳＤＳ溶液で可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−クマ
ッシーブリリアントブルー(ＣＢＢ)染色解析を行ったと
ころ、ｐＴｒｃａｄｉ２／ＪＭ１０９とｐＴｒｃａｄｉ
３／ＪＭ１０９菌体ともに、アルギニン脱炭酸酵素のサ
ブユニットの分子量に相当する約８５ｋＤａの有意なバ
ンドが見出された。これはおよそ菌体内タンパク質の５
％程度を占めていた。
ｐＴｒｃａｄｉ３／ＪＭ１０９のＩＰＴＧ非誘導菌体を
１％ ＳＤＳ溶液で可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−クマ
ッシーブリリアントブルー(ＣＢＢ)染色解析を行ったと
ころ、ｐＴｒｃａｄｉ２／ＪＭ１０９とｐＴｒｃａｄｉ
３／ＪＭ１０９菌体ともに、アルギニン脱炭酸酵素のサ
ブユニットの分子量に相当する約８５ｋＤａの有意なバ
ンドが見出された。これはおよそ菌体内タンパク質の５
％程度を占めていた。
【００７４】実施例３ 1) アルギニン脱炭酸酵素遺伝子(ａｄｉ)の高発現系の
構築 ＩＰＴＧ無添加でもアルギニン脱炭酸酵素遺伝子(ａｄ
ｉ)がさらに高発現できるように、ｐＴｒｃａｄｉ３の
ｔｒｃ プロモーターとａｄｉ遺伝子領域をｐＵＣ１９
プラスミド上に搭載することを試みた。ｐＵＣ１９プラ
スミドはｐＴｒｃ９９Ａ（複製機能がｐＢＲ３２２由
来）よりもコピー数が１０倍近くになると云われてい
る。その方法として、ｐＴｒｃａｄｉ３を制限酵素Ａｐ
ａＬＩで消化（４断片が生じる）し、Ｔ４ ＤＮＡ ポリ
メラーゼでＡｐａＬＩの接着末端を平滑末端化した後、
約３．２ｋｂのＡｐａＬＩ断片を分離、調製した。次
に、ｐＵＣ１９をＰｖｕＩＩ消化（２断片が生じる）
し、生じた約２．４ｋｂの断片を分離、調製した。この
３．２ｋｂと２．４ｋｂの断片をＴ４ ＤＮＡ リガーゼ
でライゲーションした。得られた約５．６ｋｂのプラス
ミドをｐＵＣＴｒｃａｄｉと命名した（図２）。
構築 ＩＰＴＧ無添加でもアルギニン脱炭酸酵素遺伝子(ａｄ
ｉ)がさらに高発現できるように、ｐＴｒｃａｄｉ３の
ｔｒｃ プロモーターとａｄｉ遺伝子領域をｐＵＣ１９
プラスミド上に搭載することを試みた。ｐＵＣ１９プラ
スミドはｐＴｒｃ９９Ａ（複製機能がｐＢＲ３２２由
来）よりもコピー数が１０倍近くになると云われてい
る。その方法として、ｐＴｒｃａｄｉ３を制限酵素Ａｐ
ａＬＩで消化（４断片が生じる）し、Ｔ４ ＤＮＡ ポリ
メラーゼでＡｐａＬＩの接着末端を平滑末端化した後、
約３．２ｋｂのＡｐａＬＩ断片を分離、調製した。次
に、ｐＵＣ１９をＰｖｕＩＩ消化（２断片が生じる）
し、生じた約２．４ｋｂの断片を分離、調製した。この
３．２ｋｂと２．４ｋｂの断片をＴ４ ＤＮＡ リガーゼ
でライゲーションした。得られた約５．６ｋｂのプラス
ミドをｐＵＣＴｒｃａｄｉと命名した（図２）。
【００７５】ｐＵＣＴｒｃａｄｉでＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ
１０９を形質転換したｐＵＣＴｒｃａｄｉ／ＪＭ１０９
菌を用いて、５０mg/Lのアンピシリンおよび１０mg／L
のpyridoxineを含むLB液体培地で培養し、ＩＰＴＧ無添
加で約１６時間培養した後にブロス０．４ml分の菌体を
集めた。実施例１と同様の反応系でアルギニンからアグ
マチンへの転換率を解析した結果、どちらもほぼ１００
％の転換率でアグマチンを生成した。この結果は実施例
１におけるｐＴｒｃａｄｉ1/ＪＭ１０９菌でのＩＰＴＧ
誘導菌体法とほぼ同等の活性を示した。
１０９を形質転換したｐＵＣＴｒｃａｄｉ／ＪＭ１０９
菌を用いて、５０mg/Lのアンピシリンおよび１０mg／L
のpyridoxineを含むLB液体培地で培養し、ＩＰＴＧ無添
加で約１６時間培養した後にブロス０．４ml分の菌体を
集めた。実施例１と同様の反応系でアルギニンからアグ
マチンへの転換率を解析した結果、どちらもほぼ１００
％の転換率でアグマチンを生成した。この結果は実施例
１におけるｐＴｒｃａｄｉ1/ＪＭ１０９菌でのＩＰＴＧ
誘導菌体法とほぼ同等の活性を示した。
【００７６】またｐＵＣＴｒｃａｄｉ／ＪＭ１０９のＩ
ＰＴＧ非誘導菌体を１％ ＳＤＳ溶液で可溶化し、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ−クマッシーブリリアントブルー(ＣＢＢ)
染色解析を行ったところ、ｐＵＣＴｒｃａｄｉ／ＪＭ１
０９菌体ではアルギニン脱炭酸酵素のサブユニットの分
子量に相当する約８５ｋＤａの顕著なバンドが見出され
た。これはおよそ菌体内タンパク質の２０％以上を占め
ており、一部の菌体では顆粒(inclusion body)の形成が
見られた。本顆粒形成はｐＵＣＴｒｃａｄｉ／ＪＭ１０
９菌体の培養温度を３０℃以下で行うことにより抑制す
ることができ、本菌体もまた菌体内タンパク質の２０％
程度を占めていることが確認できた。
ＰＴＧ非誘導菌体を１％ ＳＤＳ溶液で可溶化し、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ−クマッシーブリリアントブルー(ＣＢＢ)
染色解析を行ったところ、ｐＵＣＴｒｃａｄｉ／ＪＭ１
０９菌体ではアルギニン脱炭酸酵素のサブユニットの分
子量に相当する約８５ｋＤａの顕著なバンドが見出され
た。これはおよそ菌体内タンパク質の２０％以上を占め
ており、一部の菌体では顆粒(inclusion body)の形成が
見られた。本顆粒形成はｐＵＣＴｒｃａｄｉ／ＪＭ１０
９菌体の培養温度を３０℃以下で行うことにより抑制す
ることができ、本菌体もまた菌体内タンパク質の２０％
程度を占めていることが確認できた。
【００７７】実施例４ 1) アグマチナーゼ(Agmatinase)遺伝子(ｓｐｅＢ)の取
得とその破壊菌株の作製 遺伝子データバンク（E.coli Gene Bank）において「ｓ
ｐｅＡＢ」をキーワードにして検索される情報に基づい
て作製された、ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＣ
ＣＡＡＣＡＡＴＧＴＴ（配列番号４）とＣＣＧＣＡＴＧ
ＣＧＧＣＧＡＴＧＣＧＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡ（配列番
号５）の２８ｍｅｒと２８ｍｅｒの両端プライマーとPy
robest DNA Polymerase（宝酒造社製）によるＰＣＲ法
（９４℃、３０sec、５５℃、１min、７２℃、２min、
３０サイクル、Gene Amp PCR System Model9600(パーキ
ンエルマー社製)）を行い、ｓｐｅＡＢの部分遺伝子領
域約１．９ｋｂ断片を増幅し、ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩ消
化後、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩサイトと
ＳｐｈＩサイトに挿入した。本発現プラスミドをｐＵＣ
ｓｐｅＡＢと命名した。ＰＣＲ用プライマーには配列番
号４にはＥｃｏＲＩサイト、配列番号５にはＳｐｈＩサ
イトがそれぞれデザインされている。
得とその破壊菌株の作製 遺伝子データバンク（E.coli Gene Bank）において「ｓ
ｐｅＡＢ」をキーワードにして検索される情報に基づい
て作製された、ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＣ
ＣＡＡＣＡＡＴＧＴＴ（配列番号４）とＣＣＧＣＡＴＧ
ＣＧＧＣＧＡＴＧＣＧＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡ（配列番
号５）の２８ｍｅｒと２８ｍｅｒの両端プライマーとPy
robest DNA Polymerase（宝酒造社製）によるＰＣＲ法
（９４℃、３０sec、５５℃、１min、７２℃、２min、
３０サイクル、Gene Amp PCR System Model9600(パーキ
ンエルマー社製)）を行い、ｓｐｅＡＢの部分遺伝子領
域約１．９ｋｂ断片を増幅し、ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩ消
化後、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩサイトと
ＳｐｈＩサイトに挿入した。本発現プラスミドをｐＵＣ
ｓｐｅＡＢと命名した。ＰＣＲ用プライマーには配列番
号４にはＥｃｏＲＩサイト、配列番号５にはＳｐｈＩサ
イトがそれぞれデザインされている。
【００７８】次にｓｐｅＡＢ遺伝子の一部を加工して、
ｓｐｅＢの機能を不活化することを試みた。その方法と
して、ｓｐｅＡＢ上にある制限酵素サイトのＥｃｏ８１
ＩとＨｐａＩサイトをdeleteさせた。すなわち、ｐＵＣ
ｓｐｅＡＢをＥｃｏ８１ＩとＨｐａＩで消化し、Ｔ４
ＤＮＡ ポリメラーゼでＥｃｏ８１Ｉの接着末端を平滑
末端化した後、Ｅｃｏ８１ＩとＨｐａＩ切断による小断
片（約２６０ｂｐ）を除いた約４．３ｋｂのＤＮＡ断片
をＴ４ ＤＮＡ リガーゼでセルフライゲーションした。
得られたプラスミドをｐＵＣΔｓｐｅＢと命名した（図
３）。次にｐＵＣΔｓｐｅＢをＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで
切断し、ｓｐｅＡＢを含む約１．７ｋｂの断片を得、こ
の断片を温度感受性複製起点(ｔｓｏｒｉ)を有する相同
組み換え用ベクターであるｐＭＡＮ９９７（WO 99/0398
8）のＥｃｏＲＩサイトとＳｐｈＩサイトに挿入した目
的のプラスミドを得た。このプラスミドをｐＭＡＮΔｓ
ｐｅＢと命名した（図３）。
ｓｐｅＢの機能を不活化することを試みた。その方法と
して、ｓｐｅＡＢ上にある制限酵素サイトのＥｃｏ８１
ＩとＨｐａＩサイトをdeleteさせた。すなわち、ｐＵＣ
ｓｐｅＡＢをＥｃｏ８１ＩとＨｐａＩで消化し、Ｔ４
ＤＮＡ ポリメラーゼでＥｃｏ８１Ｉの接着末端を平滑
末端化した後、Ｅｃｏ８１ＩとＨｐａＩ切断による小断
片（約２６０ｂｐ）を除いた約４．３ｋｂのＤＮＡ断片
をＴ４ ＤＮＡ リガーゼでセルフライゲーションした。
得られたプラスミドをｐＵＣΔｓｐｅＢと命名した（図
３）。次にｐＵＣΔｓｐｅＢをＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで
切断し、ｓｐｅＡＢを含む約１．７ｋｂの断片を得、こ
の断片を温度感受性複製起点(ｔｓｏｒｉ)を有する相同
組み換え用ベクターであるｐＭＡＮ９９７（WO 99/0398
8）のＥｃｏＲＩサイトとＳｐｈＩサイトに挿入した目
的のプラスミドを得た。このプラスミドをｐＭＡＮΔｓ
ｐｅＢと命名した（図３）。
【００７９】ｐＭＡＮ９９７はｐＭＡＮ０３１(S.Matsu
yama,et al., J.Bacteriol., 162,1196-1202(1985))の
ｔｓｏｒｉ側を含まないＨｉｎｄＩＩＩ−ＶｓｐＩ断片
とｐＵＣ１９のｏｒｉ側を含まないＨｉｎｄＩＩＩ−Ｖ
ｓｐＩ断片とを取り替えることによって構築された。
yama,et al., J.Bacteriol., 162,1196-1202(1985))の
ｔｓｏｒｉ側を含まないＨｉｎｄＩＩＩ−ＶｓｐＩ断片
とｐＵＣ１９のｏｒｉ側を含まないＨｉｎｄＩＩＩ−Ｖ
ｓｐＩ断片とを取り替えることによって構築された。
【００８０】そこでｐＭＡＮΔｓｐｅＢをＥ．ｃｏｌｉ
Ｗ３１１０(野生株)に形質導入し、得られた形質転換
体を50mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布し、
３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体を５０mg
／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にシングルコロ
ニー化するように塗布し、４２℃で生育するコロニーを
得た。さらにもう一度、４２℃で生育するシングルコロ
ニーを得る操作を繰り返し、相同組み換えによってプラ
スミド全体が染色体に組み込まれたクローンを選択し
た。本クローンがプラスミドを細胞液中に持たないこと
を確認した。次にこのクローンの複数個をＬＢ寒天培地
に塗布し、３０℃で一晩培養後、ＬＢ液体培地３ｍｌ／
試験管に接種し、４２℃で３〜４時間、振とう培養し
た。この培養液をシングルコロニーが得られるように適
当に希釈(１０-5〜１０-6)し、ＬＢ寒天培地に塗布し、
４２℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニ
ーの中から無作為に１００コロニーをピックアップし
て、それぞれをＬＢ寒天培地と５０ｍｇ／Ｌのアンピシ
リンを含むＬＢ寒天培地に生育させ、ＬＢ寒天培地にの
み生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。こ
の感受性のクローンの数株につき、染色体ＤＮＡを調製
し、配列番号４と５をプライマーとしたＰＣＲ（先の条
件と同じ）を行い、ｓｐｅＡＢの約１．７ｋｂあるいは
約２ｋｂの断片を増幅させた。約１．７ｋｂの断片につ
き、Ｅｃｏ８１ＩあるいはＨｐａＩで切断できないこと
を確認した。このような約１．７ｋｂの断片が検出され
たΔｓｐｅＢ遺伝子を染色体に持つ菌株をアグマチナー
ゼの発現できないｓｐｅＢ欠失株(ｓｐｅＢ-)とした。
Ｗ３１１０(野生株)に形質導入し、得られた形質転換
体を50mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布し、
３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体を５０mg
／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にシングルコロ
ニー化するように塗布し、４２℃で生育するコロニーを
得た。さらにもう一度、４２℃で生育するシングルコロ
ニーを得る操作を繰り返し、相同組み換えによってプラ
スミド全体が染色体に組み込まれたクローンを選択し
た。本クローンがプラスミドを細胞液中に持たないこと
を確認した。次にこのクローンの複数個をＬＢ寒天培地
に塗布し、３０℃で一晩培養後、ＬＢ液体培地３ｍｌ／
試験管に接種し、４２℃で３〜４時間、振とう培養し
た。この培養液をシングルコロニーが得られるように適
当に希釈(１０-5〜１０-6)し、ＬＢ寒天培地に塗布し、
４２℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニ
ーの中から無作為に１００コロニーをピックアップし
て、それぞれをＬＢ寒天培地と５０ｍｇ／Ｌのアンピシ
リンを含むＬＢ寒天培地に生育させ、ＬＢ寒天培地にの
み生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。こ
の感受性のクローンの数株につき、染色体ＤＮＡを調製
し、配列番号４と５をプライマーとしたＰＣＲ（先の条
件と同じ）を行い、ｓｐｅＡＢの約１．７ｋｂあるいは
約２ｋｂの断片を増幅させた。約１．７ｋｂの断片につ
き、Ｅｃｏ８１ＩあるいはＨｐａＩで切断できないこと
を確認した。このような約１．７ｋｂの断片が検出され
たΔｓｐｅＢ遺伝子を染色体に持つ菌株をアグマチナー
ゼの発現できないｓｐｅＢ欠失株(ｓｐｅＢ-)とした。
【００８１】２) ｓｐｅＢ欠失株を用いるアグマチン生
産評価 ｓｐｅＢ欠失株に実施例２で構築したアルギニン脱炭酸
酵素遺伝子(ａｄｉ)発現プラスミドｐＴｒｃａｄｉ２を
導入し、ｐＴｒｃａｄｉ２／ｓｐｅＢ-株とした。本菌
を用いて、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび１０ｍｇ
／Ｌのpyridoxineを含むＬＢ液体培地で培養し、ＩＰＴ
Ｇ無添加で約16時間培養した後にブロス４ｍｌ分の菌体
を集めた。実施例１と同様の反応系でアルギニンからア
グマチンへの転換率を解析した結果、ほぼ１００％の転
換率でアグマチンを生成した。またこれまでｓｐｅＢ+
株(ＪＭ１０９)において、薄層クロマト分析（条件：ク
ロロホルム／メタノール／アンモニア水=２／４／３で
分離後、ニンヒドリン発色で検出）で少量検出されてい
たプトレッシンの生成が本ｓｐｅＢ-株では消失した。
このことはｓｐｅＢにコードされるアグマチナーゼによ
って触媒されていたアグマチンよりプトレッシンの生成
がｓｐｅＢ欠失によって消去されたものと考えられる。
このアグマチン分解系を遮断することにより、アグマチ
ンの収率低下を抑制できること、およびアグマチン中に
同じアミンであるプトレッシンのコンタミを防ぐ利点が
生じる。
産評価 ｓｐｅＢ欠失株に実施例２で構築したアルギニン脱炭酸
酵素遺伝子(ａｄｉ)発現プラスミドｐＴｒｃａｄｉ２を
導入し、ｐＴｒｃａｄｉ２／ｓｐｅＢ-株とした。本菌
を用いて、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび１０ｍｇ
／Ｌのpyridoxineを含むＬＢ液体培地で培養し、ＩＰＴ
Ｇ無添加で約16時間培養した後にブロス４ｍｌ分の菌体
を集めた。実施例１と同様の反応系でアルギニンからア
グマチンへの転換率を解析した結果、ほぼ１００％の転
換率でアグマチンを生成した。またこれまでｓｐｅＢ+
株(ＪＭ１０９)において、薄層クロマト分析（条件：ク
ロロホルム／メタノール／アンモニア水=２／４／３で
分離後、ニンヒドリン発色で検出）で少量検出されてい
たプトレッシンの生成が本ｓｐｅＢ-株では消失した。
このことはｓｐｅＢにコードされるアグマチナーゼによ
って触媒されていたアグマチンよりプトレッシンの生成
がｓｐｅＢ欠失によって消去されたものと考えられる。
このアグマチン分解系を遮断することにより、アグマチ
ンの収率低下を抑制できること、およびアグマチン中に
同じアミンであるプトレッシンのコンタミを防ぐ利点が
生じる。
【００８２】またｐＴｒｃａｄｉ２／ｓｐｅＢ-株のＩ
ＰＴＧ非誘導菌体を１％ ＳＤＳ溶液で可溶化し、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ−クマッシーブリリアントブルー(ＣＢＢ)
染色解析を行ったところ、アルギニン脱炭酸酵素のサブ
ユニットの分子量に相当する約８５ｋＤａの有意なバン
ドが見出された。これはおよそ菌体内タンパク質の５％
程度を占めていたが、培養においてプラスミドの保持性
が不安定な側面も見出された。
ＰＴＧ非誘導菌体を１％ ＳＤＳ溶液で可溶化し、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ−クマッシーブリリアントブルー(ＣＢＢ)
染色解析を行ったところ、アルギニン脱炭酸酵素のサブ
ユニットの分子量に相当する約８５ｋＤａの有意なバン
ドが見出された。これはおよそ菌体内タンパク質の５％
程度を占めていたが、培養においてプラスミドの保持性
が不安定な側面も見出された。
【００８３】
【発明の効果】本発明によって、アルギニン脱炭酸酵素
遺伝子を大腸菌などの宿主において安定に大量に発現さ
せることが可能となった。この結果、このような形質転
換体を用いて、比較的安価に製造されるアルギニンか
ら、工業的中間体材料として有用であるアグマチンを効
率的に製造することができるようになった。
遺伝子を大腸菌などの宿主において安定に大量に発現さ
せることが可能となった。この結果、このような形質転
換体を用いて、比較的安価に製造されるアルギニンか
ら、工業的中間体材料として有用であるアグマチンを効
率的に製造することができるようになった。
【００８４】また、本発明の製造方法により得られたア
グマチンをアシルアグマチン製造の中間体として用いる
ことにより、アシルアグマチン合成に要する複雑な化学
合成工程の一部を簡略化できるため、界面活性剤として
有用なアシルアグマチンのコストダウンが可能となる。
グマチンをアシルアグマチン製造の中間体として用いる
ことにより、アシルアグマチン合成に要する複雑な化学
合成工程の一部を簡略化できるため、界面活性剤として
有用なアシルアグマチンのコストダウンが可能となる。
【００８５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> AJINOMOTO Co., LTD <120> PRODUCTION OF AGMATIN <130> PAMA-13070 <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer1 <400> 1 gaccatggct aaagtattaa ttgttgaaag 30 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer2 <400> 2 ccggatccac gccttcagcg gaatagtg 28 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 3 <400> 3 ccctgcagat cagtatcagc caaaaaaa 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 4 <400> 4 ccgaattcac gtccatccca acaatgtt 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 5 <400> 5 ccgcatgcgg cgatgcgtgt gaagaaaa 28
【図１】アルギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された
組換え体の製造工程を示すフローチャートである。
組換え体の製造工程を示すフローチャートである。
【図２】プラスミドｐＴｒｃａｄｉ１、ｐＴｒｃａｄ
２、ｐＴｒｃａｄｉ３およびｐＵＣＴｒｃａｄｉの構築
過程を示すフローチャートである。
２、ｐＴｒｃａｄｉ３およびｐＵＣＴｒｃａｄｉの構築
過程を示すフローチャートである。
【図３】プラスミドｐＭＡＮΔｓｐｅＢの構築過程を示
すフローチャートである。
すフローチャートである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 菊池 慶実 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 大西 幾正 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B050 CC03 DD02 LL05 4B064 AE01 CA21 CC07 CC24
Claims (13)
- 【請求項１】 アルギニンを脱炭酸することによりアグ
マチンを製造するアグマチンの製造方法において、アル
ギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された組換え体、ま
たは、前記組換え体から得られるアルギニン脱炭酸酵素
もしくはアルギニン脱炭酸酵素含有物を用いることを特
徴とするアグマチンの製造方法。 - 【請求項２】 前記アグマチンの製造方法において、ア
ルギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された組換え体を
用いることを特徴とする請求項１に記載のアグマチンの
製造方法。 - 【請求項３】 前記組換え体におけるアルギニン脱炭酸
酵素の発現量は、菌体内タンパク質の５％超であること
を特徴とする請求項１または２に記載のアグマチンの製
造方法。 - 【請求項４】 前記アルギニン脱炭酸酵素遺伝子は、エ
シェリヒア・コリ由来ａｄｉ遺伝子であることを特徴と
する請求項１〜３のいずれか一つに記載のアグマチンの
製造方法。 - 【請求項５】 前記組換え体は、ｐＵＣ系プラスミド、
ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に由来する
ベクターＤＮＡと、前記アルギニン脱炭酸酵素遺伝子と
を接続して得られる組み換えＤＮＡを用いて形質転換さ
れた菌体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれ
か一つに記載のアグマチンの製造方法。 - 【請求項６】 前記組み換えＤＮＡは、ｔｒｃプロモー
ターを含むことを特徴とする請求項５に記載のアグマチ
ンの製造方法。 - 【請求項７】 前記組換え体は、エシェリヒア・コリを
宿主とすることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一
つに記載のアグマチンの製造方法。 - 【請求項８】 前記組換え体は、ＦＥＲＭ-Ｐ１８２８
５であることを特徴とする請求項７に記載のアグマチン
の製造方法。 - 【請求項９】 前記組換え体は、アグマチンよりプトレ
ッシンへの転換を触媒するアグマチナーゼを欠失したエ
シェリヒア・コリであることを特徴とする請求項７に記
載のアグマチンの製造方法。 - 【請求項１０】 アルギニンからアグマチンへの転換反
応において、反応系のｐＨをｐＨ６未満に制御すること
を特徴とする請求項１〜９のいずれか一つに記載のアグ
マチンの製造方法。 - 【請求項１１】 アルギニンからアグマチンへの転換反
応において、反応系にピリドキサールリン酸を添加する
ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一つに記載
のアグマチンの製造方法。 - 【請求項１２】 少なくとも、前記アルギニン脱炭酸酵
素遺伝子が増幅発現された組換え体を、３０℃未満で培
養することにより、菌体内にアルギニン脱炭酸酵素を蓄
積させる工程と、 前記アルギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発現された組換
え体、または、前記組換え体から得られるアルギニン脱
炭酸酵素もしくはアルギニン脱炭酸酵素含有物を用いて
アルギニンを脱炭酸することによりアグマチンを製造す
る工程と、を含むことを特徴とする請求項１〜１１のい
ずれか一つに記載のアグマチンの製造方法。 - 【請求項１３】 アルギニン脱炭酸酵素遺伝子が増幅発
現された組換え体を培地中で培養し、培地中および／ま
たは細胞中にアルギニン脱炭酸酵素を蓄積させることを
特徴とするアルギニン脱炭酸酵素の製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001157833A JP2002345496A (ja) | 2001-05-25 | 2001-05-25 | アグマチンの製造方法およびアルギニン脱炭酸酵素の製造方法 |
| EP02009802A EP1260588A3 (en) | 2001-05-25 | 2002-04-30 | Methods of producing agmatine and arginine decarboxylase |
| US10/137,282 US20040086985A1 (en) | 2001-05-25 | 2002-05-03 | Methods of producing agmatine and arginine decarboxylace |
| KR1020020028981A KR20020090161A (ko) | 2001-05-25 | 2002-05-24 | 아그마틴의 제조방법 및 아르기닌 데카복실라제의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001157833A JP2002345496A (ja) | 2001-05-25 | 2001-05-25 | アグマチンの製造方法およびアルギニン脱炭酸酵素の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002345496A true JP2002345496A (ja) | 2002-12-03 |
Family
ID=19001634
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001157833A Pending JP2002345496A (ja) | 2001-05-25 | 2001-05-25 | アグマチンの製造方法およびアルギニン脱炭酸酵素の製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040086985A1 (ja) |
| EP (1) | EP1260588A3 (ja) |
| JP (1) | JP2002345496A (ja) |
| KR (1) | KR20020090161A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016013570A1 (ja) * | 2014-07-22 | 2016-01-28 | 協同乳業株式会社 | バクテリア混合培養によるプトレッシン製造方法 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100697552B1 (ko) | 1997-07-18 | 2007-03-21 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법 |
| NZ552631A (en) | 2004-07-15 | 2009-09-25 | Dsm Ip Assets Bv | Biochemical synthesis of 1,4-butanediamine |
| EP2100962A1 (en) | 2008-03-12 | 2009-09-16 | Biogemma | Plants having improved resistance to pathogens |
| KR101101835B1 (ko) * | 2009-05-27 | 2012-01-05 | 연세대학교 산학협력단 | 줄기세포 생존능 및 증식능 개선용 조성물 |
| BR112012001617B1 (pt) | 2009-07-24 | 2019-06-18 | Dsm Ip Assets B.V. | Preparação de 1,4-diaminobutano |
| CN104152478A (zh) * | 2014-07-31 | 2014-11-19 | 洛阳华荣生物技术有限公司 | 一种生物转化联产d-精氨酸和胍基丁胺的方法 |
| CN105713938B (zh) * | 2015-03-30 | 2019-06-21 | 江汉大学 | 一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法 |
| CN104911223A (zh) * | 2015-06-15 | 2015-09-16 | 长兴制药有限公司 | 一种胍基丁胺硫酸盐的生物制备方法 |
| CN105861529A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-08-17 | 江南大学 | 一种精氨酸脱羧酶及其应用 |
| CN106278954B (zh) * | 2016-08-18 | 2018-06-01 | 精晶药业股份有限公司 | 一种提取胍丁胺的方法 |
| CN113913417A (zh) * | 2021-09-30 | 2022-01-11 | 新泰市佳禾生物科技有限公司 | 一种从发酵液中分离纯化精氨酸脱羧酶的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57206388A (en) * | 1981-06-11 | 1982-12-17 | Amano Pharmaceut Co Ltd | Preparation of agmatine oxidase by microorganism |
-
2001
- 2001-05-25 JP JP2001157833A patent/JP2002345496A/ja active Pending
-
2002
- 2002-04-30 EP EP02009802A patent/EP1260588A3/en not_active Withdrawn
- 2002-05-03 US US10/137,282 patent/US20040086985A1/en not_active Abandoned
- 2002-05-24 KR KR1020020028981A patent/KR20020090161A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016013570A1 (ja) * | 2014-07-22 | 2016-01-28 | 協同乳業株式会社 | バクテリア混合培養によるプトレッシン製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040086985A1 (en) | 2004-05-06 |
| EP1260588A3 (en) | 2003-04-23 |
| KR20020090161A (ko) | 2002-11-30 |
| EP1260588A2 (en) | 2002-11-27 |
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