KR20020090161A - 아그마틴의 제조방법 및 아르기닌 데카복실라제의 제조방법 - Google Patents

아그마틴의 제조방법 및 아르기닌 데카복실라제의 제조방법 Download PDF

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기쿠치요시미
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Abstract

본 발명은 아르기닌 데카복실라제를 사용하는 효소화학적인 방법에 의해 아르기닌으로부터 아그마틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.
유전공학적 수법으로 아르기닌 데카복실라제 유전자(adi)를 증폭 발현시키는 재조합체를 제조하여 당해 재조합체 또는 재조합체로부터 수득되는 아르기닌 데카복실라제 또는 아르기닌 데카복실라제 함유물을 사용하여 아르기닌을 탈카복실화함으로써 아그마틴을 제조한다.

Description

아그마틴의 제조방법 및 아르기닌 데카복실라제의 제조방법{Methods of producing agmatine and arginine decarboxylase}
본 발명은 아미노산의 하나인 아르기닌을 출발원료로 하여 효소적으로 아그마틴을 제조하는 방법에 관한 것이며, 상세하게는 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체를 사용하여 실용화 수준으로 아그마틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근에 아그마틴은 각종 지방산이 부가된 아실아그마틴 제조의 중간체로서주목받고 있다. 아실아그마틴은 우수한 계면 활성작용을 갖는 것이 밝혀지고 있으며 특히 범용의 4급 암모늄형 카복실계 양이온 계면활성제과 비교하여 세정후의 유연성 및 보습성이 우수한 점으로부터 샴프 등의 용도로 사용되고 있다.
현재, 아실아그마틴의 공업적 제조방법으로서는 화학합성법이 일반적이지만 화학합성법이므로 합성경로가 대단히 복잡하며 수득되는 아실아그마틴이 원가가 높아진다는 문제가 있다. 따라서 보다 간편한 방법으로 보다 염가로 아그마틴을 제조하는 방법이 요구되고 있다.
한편, 미생물이 생성하는 아르기닌 데카복실라제가 하기 반응식에 기재된 바와 같이 아미노산의 하나인 아르기닌을 하나의 기질로 하여 아그마틴을 생성하는 것으로 공지되어 있다.
이러한 아르기닌 데카복실라제를 생성하는 미생물로서는 이. 콜리를 포함한 에스케리키아속이나 살모넬라속[문헌 참조: J. Bacteriol., 177, 4097- 4104(1995)] 및 식물[문헌 참조: Mol. Gen. Genet., 224, 431-436(1990), Plant Physiol., 100, 146-152(1992), Plant Physiol., 103, 829-834(1993), Plant Cell Physiol., 35, 1245-1249(1994)]이 공지되어 있다.
특히 이. 콜리에서는 유도성 효소(유전자명은 adi)와 비유도성 효소(유전자명은 speA)인 2종류가 존재하는 것으로 공지되어 있다. adi에 관해서는 미생물의 생존 환경이 극단적인 산성 상태에 놓여질 때에 즉, 산 스트레스가 발생될 때에 긴급적으로 유도 발현되며 아르기닌을 탈카복실화하여 염기성의 아그마틴을 생성하여 중화되도록 함으로써 일시적으로 생존 위기를 탈출하는 메커니즘이라고 이해되고 있다[참조: J. Bacteriol., 177, 4097-4104(1995), Appl. Environ. Microbiol., 62, 3094-3100(1996), J. Bacteriol., 181, 3525-3535(1999)]. 동일한 메커니즘이 기타 데카복실라제, 예를 들면, 오르니틴 데카복실라제[참조: Biochem. Biophys. Res. Commun., 20, 697-702(1965)] 등에도 공지되어 있으며 adi의 유도 발현 메커니즘[참조: J. Bacteriol., 175, 1182-1186(1993), J. Bacteriol., 176, 6769-6775(1994), Lett. Appl. Microbiol., 24, 319-328(1997)], 효소의 정제, 결정화를 포함해서 이의 효소적 제반 성질[참조: J. Biol. Chem., 243, 1671-1677(1968)], 유전자 클로닝 및 이의 구조적 분석[참조: J. Bacteriol., 175, 1221-1234(1993)]은 이. 콜리계를 중심으로 연구되어 있다.
그러나 공지된 아르기닌 데카복실라제 생성 미생물을 배양해도 아르기닌 데카복실라제 유전자의 발현량은 매우 제한되어 있어 아그마틴의 공업적 생산에 필요한 효소량을 확보하는 것이 곤란하다. 즉, 실용적인 관점으로부터 아르기닌 데카복실라제를 고발현시키는 미생물을 효소 촉매로서 사용하여 아르기닌으로부터 상당한 양의 아그마틴을 제조한 예는 지금까지 보고되어 있지 않다.
이것은 아그마틴이 알칼리성이며 중화하지 않고 고농도가 되면 미생물에 대해 치명적이므로 아르기닌 데카복실라제 유전자를 대량으로 증폭 발현시키는 것은 비현실적인 것으로 사료되기 때문이다.
본 발명의 목적은 상기한 문제점을 해결하기 위해 아르기닌 데카복실라제를 실용적 수준에서 이용함으로써 아르기닌으로부터 비교적 염가로 제조되는 공업적 중간체 재료로서의 유용한 아그마틴을 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체의 제조방법에 대한 도식이다.
도 2는 플라스미드 pTrcadi1, pTrcadi2, pTrcadi3 및 pUCTrcadi의 작제 방법에 대한 도식이다.
도 3은 플라스미드 pMAN△speB의 작제 방법에 대한 도식이다.
상기한 문제를 감안하여 예의 연구한 결과, 본 발명자들은 에스케리키아 콜리(E. coli)에서 아르기닌 데카복실라제 유전자(adi)를 클로닝하고 이. 콜리에 도입함으로써 재조합 에스케리키아 콜리 미생물의 제조를 시도한 바, 예상치 않게 아르기닌 데카복실라제가 대량으로 증폭 발현되는 것을 밝혀내어 본 발명에 도달했다:
즉, 본 발명은 하기와 같다:
I. 아르기닌을 탈카복실화함으로써 아그마틴을 제조하는 방법에서, 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체 또는 상기한 재조합체로부터 수득되는 아르기닌 데카복실라제 또는 아르기닌 데카복실라제 함유물을 사용함을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
II. 제I항목에 있어서, 아그마틴의 제조방법에서 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체를 사용함을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
III. 제I 또는 제II항목에 있어서, 재조합체에서 아르기닌 데카복실라제의 발현량이 균체내 단백질의 5% 초과임을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
IV. 제I 내지 제III항목 중의 어느 한 항목에 있어서, 아르기닌 데카복실라제 유전자가 에스케리키아 콜리 기원 adi 유전자임을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
V. 제I 내지 제IV항목 중의 어느 한 항목에 있어서, 재조합체가 pUC계 플라스미드, pBR322계 플라스미드 또는 이의 유도체 기원의 벡터 DNA와 아르기닌 데카복실라제 유전자를 연결시켜 수득된 재조합 DNA를 사용한 형질전환체임을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
VI. 제V항목에 있어서, 재조합 DNA가 trc 프로모터를 함유함을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
VII. 제I 내지 제VI항목 중의 어느 한 항목에 있어서, 재조합체가 에스케리키아 콜리를 숙주로 함을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
VIII. 제VII항목에 있어서, 재조합체가 FERM-P18285임을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
IX. 제VII항목에 있어서, 재조합체가 아그마틴에서 푸트레신으로의 전환을 촉매하는 아그마티나제 결핍 에스케리키아 콜리임을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
X. 제I 내지 제IX항목 중의 어느 한 항목에 있어서, 아르기닌에서 아그마틴으로의 전환반응을 위한 반응계의 pH가 pH 6 미만으로 조절됨을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
XI. 제I 내지 제X항목 중의 어느 한 항목에 있어서, 아르기닌에서 아그마틴으로의 전환반응을 위한 반응계에 피리독살포스페이트를 첨가함을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
XII. 제I 내지 제XI항목 중의 어느 한 항목에 있어서, 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체를 적어도 30℃ 미만에서 배양함으로써 균체내에 아르기닌 데카복실라제를 축적시키는 공정 및 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체 또는 재조합체로부터 수득되는 아르기닌 데카복실라제 또는 아르기닌 데카복실라제 함유물을 사용하여 아르기닌을 탈카복실화함으로써 아그마틴을 제조하는 공정을 포함함을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
XIII. 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체를 배지중에 배양하며 배지중 및/또는 세포중에 아르기닌 데카복실라제를 축적시킴을 특징으로 하는 아르기닌 데카복실라제의 제조방법.
하기에 본 발명에 관해서,
[I]아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체 및
[II]아그마틴의 제조방법의 순으로 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.
[I]아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체
아르기닌 데카복실라제는 아미노산의 하나인 아르기닌으로부터 아그마틴과 이산화탄소를 생성하는 반응을 촉매한다. 아르기닌 데카복실라제 유전자는 이. 콜리를 포함하는 에스케리키아속이나 살모넬라속[참조: J. Bacteriol., 177, 4097-4104(1995)] 및 식물[참조: Mol. Gen. Genet., 224, 431-436(1990), Plant Physiol., 100, 146-152(1992), P1ant Physiol., 103, 829-834(1993), Plant Cell Physiol., 35, 1245-1249(1994)]에 존재하는 것으로 공지되어 있다. 그러나 이들 공지된 아르기닌 데카복실라제 생성 미생물을 배양해도 거의 아르기닌 데카복실라제를 축적시키지 않음을 알 수 있다.
본 발명에서는 아르기닌의 탈카복실화 반응에 필요한 효소량을 확보하기 위해 아르기닌 데카복실라제 유전자의 발현량을 상승시킨 재조합체를 제조한다.
아르기닌 데카복실라제 유전자의 발현량을 상승시키기 위해서는 아르기닌 데카복실라제 유전자의 조절 영역을 개량하면 양호하다. 조절 영역의 개량이란 예를 들면, 신규로 강력한 프로모터를 삽입하거나 프로모터에 변이를 도입함으로써 프로모터를 강화하거나 조절 영역에 결합하는 리프레서 단백질 등의 발현량을 억제하여 다운스트림에 있는 아르기닌 데카복실라제 유전자의 전사량을 증가시키는 것을 말한다.
아르기닌 데카복실라제 유전자의 발현량을 상승시키기 위해 아르기닌 데카복실라제 유전자를 다중복제(multi copy) 벡터에 연결하여 재조합 DNA를 제조하고 동일 재조합 DNA를 미생물에 유지시키는 것이 바람직하다. 아르기닌 데카복실라제 유전자의 발현량을 상승시킨 미생물의 유도에 있어서는 예를 들면, 이. 콜리 등의아르기닌 데카복실라제 생성균의 기존에 공지된 유전자 정보에 근거하며 PCR(폴리머라제 연쇄반응)법을 사용하여 필요한 유전자 영역을 증폭 취득하며 플라스미드 등의 벡터에 탑재하여 숙주 세포를 형질 전환시킨다.
도 1은 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체의 제조공정에 대한 도식이다.
우선, 본 발명의 아르기닌 데카복실라제를 암호화하는 DNA를 작제한다(단계 S1).
다음에, 작제한 아르기닌 데카복실라제 유전자를 벡터 DNA와 연결시켜 재조합 DNA를 작제하고(단계 S2), 당해 재조합 DNA로 숙주 세포를 형질 전환시켜 형질전환체를 제조한다(단계 S3). 계속해서 당해 형질전환체를 배지중에 배양하며 배지중 및/또는 세포중에 아르기닌 데카복실라제를 생성 축적시킨다(단계 S4).
다음에, 단계 S5로 진행하며 생성된 아르기닌 데카복실라제를 회수 및 정제함으로써 아르기닌 데카복실라제를 대량생산한다.
또한, 단계 S5에서 생산한 아르기닌 데카복실라제 또는 단계 S4의 아르기닌 데카복실라제가 축적된 배지를 사용하여 아르기닌을 탈카복실화함으로써 아그마틴을 대량으로 제조한다(단계 S6).
여기서 재조합 DNA 기술에 의해 아르기닌 데카복실라제 유전자는 증폭 발현시키는 재조합체를 제조하는 방법에 관해서 하기의 순서로 상세하게 설명한다.
(1)아르기닌 데카복실라제 유전자의 작제
(2)재조합 DNA의 작제
(3)재조합체의 제조
(4)아르기닌 데카복실라제의 생성 및 축적
(5)아르기닌 데카복실라제의 회수 및 정제
(1)아르기닌 데카복실라제 유전자의 작제
아르기닌 데카복실라제 유전자는 이. 콜리를 포함한 에스케리키아속이나 살모넬라속[참조: J. Bacteriol., 177, 4097-4104(1995)] 및 식물(참조: Mol. Gen. Genet., 224, 431-436(1990), Plant Physiol., 100, 146-152(1992), Plant Physiol., 103, 829-834(1993), Plant Cell Physiol., 35, 1245-1249(1994)] 등의 아르기닌 데카복실라제를 생성하는 공지된 미생물로부터 특별한 제한없이 수득할 수 있다.
특히 이. 콜리에서는 유도성 효소(유전자명은 adi)와 비유도성 효소(유전자명은 speA)의 2종류가 존재하는 것으로 공지되어 있다. adi에 관해서는 미생물의 생존 환경이 극단적인 산성 상태에 놓여졌을 때에 즉, 산 스트레스가 발생될 때에 긴급적으로 유도 발현되며 아르기닌을 탈카복실화하여 염기성의 아그마틴을 생성하여 중화되도록 함으로써 일시적으로 생존의 위기를 탈출하는 메커니즘이라고 이해되고 있다[참조: J. Bacteriol., 177, 4097-4104(1995), Appl. Environ. Microbiol., 62, 3094-3100(1996), J. Bacteriol., 181, 3525-3535(1999)].
speA에 관해서는 speAB로서 오페론을 형성하며 아르기닌으로부터 아그마틴과 이산화탄소를 생성하는 효소를 암호화하는 speA와 아그마틴로부터 푸트레신과 요소를 생성하는 효소를 암호화하는 speB가 존재하는 것으로 공지되어 있다[참조: J.Bacteriol., 174, 758-764(1992)]. 본 효소계는 비유도성이며 오르니틴을 탈카복실화하여 푸트레신을 생성하는 오르니틴 데카복실라제와 함께 미생물에 있어서는 푸트레신이나 스페르미딘 등의 폴리아민 생합성을 위해 필요한 대사경로라고 이해되고 있다[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 5181-5184(1983), J. Bacteriol., 173, 3615-3621(1991), Int. J. Biochem, 26, 991-1001(1994), J. Bacteriol, 180, 4278-4286(1998), Microbiology, 145, 301-307(1999)]. 이러한 speA에 의해 암호화된 아르기닌 데카복실라제 및 speB에 의해 암호화된 아그마티나제의 효소화학적 제반 성질이나 유전자 구조에 관해서도 상세하게 연구되어 있다[참조: J. Biol. Chem., 248, 1687-1695(1973), Methods Enzymol., 94, 117-121(1983), Gene, 30, 129-136(1984), J. Bacteriol., 172, 4631-4640(1990)]. 특히 본 효소계와 오르니틴 데카복실라제계에 관해서는 미생물에서 폴리아민의 생리학적 기능을 분석하기 위해 오르니틴 데카복실라제 유전자 및 아그마티나제 유전자(speB) 결핍 변이주가 제조되었다[참조: J. Bacteriol., 101, 725-730(1970), J. Biol. Chem., 254, 12419-12426(1979), Biochem., J., 234, 617-622(1986), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 4423-4427(1987)]. 이러한 2개 효소의 결핍은 미생물의 증식에는 영향이 있다고는 하지만 치사에는 도달하지 않으며 아직 폴리아민의 미생물에서의 생리학적 기능은 명확하지 않다[참조: J. Bacteriol., 101, 731-737(1970), J. Bacteriol., 113, 271-277(1973), Adv. Polyamine Res., 4, 495-506(1983), J. Bacteriol., l63, 522-527(1985)]. 그러나 아그마틴 등의 아민에 관해서는 알칼리성에서는 휘발성이 있으며 피부나 점막에대하여 자극성이 있으며 피부나 점막을 통해서 체내에 흡수된다는 것이 공지되어 있다. 미생물에 대한 이의 독성은 명확하지 않지만 아민은 알칼리성이며 중화하지 않고 고농도가 되면 미생물에 대하여 치명적인 것으로 생각된다.
본 발명에서는 아르기닌 데카복실라제 유전자로서 이. 콜리 유래의 adi 유전자를 사용하는 것이 특히 바람직하다. speA도 아르기닌 데카복실라제를 암호화하는 유전자이지만 adi에 의해 암호화된 아르기닌 데카복실라제[참조: J. Biol. Chem., 243, 1671-1677(1968)]가 speA에 암호화된 아르기닌 데카복실라제[참조: J. Biol. Chem., 248, 1687-1695(1973)]와 비교하여 비활성 관점에서 유리하다.
아르기닌 데카복실라제 유전자를 수득하는 데는 예를 들면, 이. 콜리 K12의 W311O주(ATCC 27325)의 염색체 DNA로 부터 PCR법을 사용하여 아르기닌 데카복실라제를 암호화하는 유전자인 adi를 클로닝하면 양호하다. 구체적으로는 공지된 adi 유전자의 염기서열로부터 30염기쌍 정도의 DNA 분자를 합성하며 이것을 프로브로서 이용하며 이. 콜리 염색체 유전자 라이브러리에서 분리하면 양호하다. 이때에 사용하는 염색체 DNA가 이. 콜리 기원이면 어떤 균주라도 양호하다.
당해 DNA 분자를 합성하는 방법은 문헌[참조: Tetrahedron Letters, 22, 1859(1981)]에 기재되어 있다. 또한, 제조원[Applied Biosystems]의 합성기를 사용하여 당해 DNA 분자를 합성할 수 있다. 당해 DNA 분자는 이. 콜리 유래의 adi 유전자 전체 길이를 이. 콜리 염색체 유전자 라이브러리로부터 분리할 때에 프로브로서 이용할 수 있는 동시에 이. 콜리 유래의 adi 유전자를 PCR법으로 증폭할 때에 프라이머로서 이용할 수 있다.
PCR법의 조작에 관해서는 문헌[참조: White, T. J. et al., Trends Genet. 5, 185(1989)] 등에 기재되어 있다. 염색체 DNA를 작제하는 방법, 또한 DNA 분자를 프로브로서 사용하여 유전자 라이브러리에서 목적하는 DNA 분자를 분리하는 방법에 관해서는 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Co1d Spring Harbor press(1989)] 등에 기재되어 있다.
본 발명에 사용하는 adi 유전자에는 유전적 다형성 등에 따른 변이체도 포함된다. 또한, 유전적 다형성이란 유전자 상의 천연 돌연변이에 의해 단백질의 아미노산 서열이 일부 변화되는 현상을 말한다.
또한, 아르기닌 데카복실라제의 활성을 상승시키기 위해 아르기닌 데카복실라제의 구조 유전자 자체에 변이를 도입하여 효소 그 자체의 활성을 상승시킬 수 있다.
유전자를 돌연변이시키기 위하여 부위 특이적 변이법[참조: Kramer, W. and Frits, H. J., Methods Enzymol., 154, 350(1987)], 재조합 PCR법[참조: PCR Technology, Stockton Press(1989)], 특정 부분의 DNA를 화학적으로 합성하는 방법 또는 당해 유전자를 하이드록실아민으로 처리하는 방법이나 당해 유전자를 보유하는 균주를 자외선 조사처리 또는 니트로소구아니딘이나 아질산 등의 화학 약제처리를 하는 방법이 있다.
(2)재조합 DNA의 작제
본 발명에서 재조합 DNA란 상기한 아르기닌 데카복실라제 유전자(adi 등)가 전달체로서 플라스미드나 파아지 DNA와 같은 벡터에 연결된 것을 언급한다.
여기서 벡터란 소위 다중복제형인 것이 바람직하며 Col E1 유래의 복제 오리진을 갖는 플라스미드, 예를 들면, pUC 계열의 플라스미드나 pBR322 계열의 플라스미드 또는 이의 유도체를 들 수 있다. 여기서 「유도체」란 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위 등에 의해 플라스미드를 변형시킴을 의미한다. 또한, 여기서 말하는 변형이란 돌연변이 유발제나 UV 조사 등에 의한 돌연변이 또는 천연 돌연변이 등에 의한 변형을 포함한다. 이들 이외에도 트랜스포존[참조: Berg, D. E. and Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417(1983)] 및 Mu 파아지[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-109985호]를 사용할 수 있다. 유전자를 상동성 재조합용 플라스미드 등을 사용하는 방법으로 염색체에 통합시켜 복제수를 증가시킬 수 있다.
이때에 당해 유용한 유전자를 효율적으로 발현시키기 위해 lac 프로모터, trp 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터, PL 프로모터, 기타 미생물에서 작용하는 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 생산량을 증대시키기 위해서는 단백질을 암호화하는 유전자의 다운스트림에 위치한 전사 종결서열인 터미네이터를 연결하는 것이 바람직하다. 이러한 터미네이터로서는 T7 터미네이터, fd 파아지 터미네이터, T4 터미네이터, 테트라사이클린 내성 유전자의 터미네이터, 이. 콜리 trpA 유전자의 터미네이터 등을 들 수 있다. 또는 인핸서를 새롭게 도입함으로써 유전자의 전사량을 증가시킬 수 있다.
또한, 형질전환체를 선별하기 위해 당해 벡터는 암피실린 내성 유전자 등의 마커를 갖는 것이 바람직하며 이러한 플라스미드로서 예를 들면, pUC 계열[다카라슈조(주)제], pPROK계열(클론텍제), pKK233-2계열(클론텍제) 등과 같이 강력한 프로모터를 가지는 발현 벡터가 시판되고 있다.
(3)재조합체의 작제
아르기닌 데카복실라제 유전자의 발현량을 상승시키는 재조합체의 유도에 있어서는 아르기닌 데카복실라제 유전자(adi 등)를 플라스미드나 파아지 DNA의 벡터에 연결시킨 재조합 DNA를 숙주 세포에 도입하여 형질전환시킨다.
형질전환되는 숙주 세포로서는 아르기닌 데카복실라제를 암호화하는 유전자가 발현되는 미생물, 예를 들면, 세균세포, 방선(放線)균 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포, 식물 세포, 동물 세포 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 엔테로박테라(Enterobactera), 보다 바람직하게는 에스케리키아 콜리, 특히 바람직하게는 이. 콜리 JM109 등의 컴피턴트 세포가 사용된다.
상기한 재조합 DNA를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시킨다. 형질전환을 실시하는 방법 및 형질전환체를 선별하는 방법은 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989) 등]에 기재되어 있는 방법을 적용할 수 있다.
(4)아르기닌 데카복실라제의 생성 및 축적
상기한 방법으로 수득된 아르기닌 데카복실라제 유전자(adi 등)을 함유하는 재조합 DNA로 형질 전환된 재조합체를 배양하여 목적하는 효소를 생성하고 축적시킨다. 아르기닌 데카복실라제 유전자의 고발현능을 획득한 재조합체를 배양하는 방법을 하기에 설명한다.
사용하는 배지는 흔히 LB 배지(박토-트립톤 1%, 효모 추출물 0.5%, NaCl 1%,글루코스 0.1%, pH7.0)가 사용되지만 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 필요에 따라 기타 유기성분을 함유하는 통상적인 배지일 수 있다.
탄소원으로서는 글루코스, 락토스, 갈락토스, 프룩토스, 아라비노스, 말토스, 크실로스, 트레할로스, 리보스나 전분의 가수분해물 등의 당류, 글리세롤, 만니톨이나 소르비톨 등의 알콜류, 글루콘산, 푸마르산, 시트르산이나 석신산 등의 유기산류를 사용할 수 있다.
질소원으로서는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등의 무기 암모늄염, 대두 가수분해물 등의 유기질소, 암모니아 가스, 암모니아수 등을 사용할 수 있다. 유기 미량 영양소로서는 각종 아미노산, 비타민 B6 등의 비타민류, RNA 등의 핵산류 등의 요구물질 또는 효모 추출물 등을 적량 함유시키는 것이 바람직하다.
이들 이외에 필요에 따라 인산칼슘, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온 등이 소량 첨가된다.
배양은 호기적 조건하에 12 내지 72시간 정도 실시하는 것이 양호하며 배양온도는 20℃ 내지 45℃, 배양 pH는 5 내지 8로 제어하는 것이 바람직하다. 또한, pH 조정에는 무기 또는 유기의 산성 또는 알칼리성 물질, 또한 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다.
재조합체에서 아르기닌 데카복실라제의 발현량이 미생물 단백질의 10%를 초과하는 경우에는 아르기닌 데카복실라제가 과립(inclusion body)을 형성하여 오히려 아르기닌 데카복실라제 활성이 저하되는 경우가 있지만 재조합체를 3O℃ 이하에서 배양함으로써 과립의 형성을 억제할 수 있다.
배양액으로부터 미생물의 분리회수 및 효소액의 조제는 통상적으로 원심분리, 초음파 파쇄, 이온교환 수지법, 침전법, 기타 공지된 방법을 조합하여 실시할 수 있다.
[II]아그마틴의 제조방법
본 발명의 아그마틴의 제조방법에서는 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체에 의해 생성 축적된 아르기닌 데카복실라제를 사용하여 효소화학적으로 L-아르기닌(L-Arginine)을 탈카복실화한다.
L-아르기닌에 아르기닌 데카복실라제를 작용시키는 방법은 특별히 한정되지 않으며 예를 들면, 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체를 배양하면서 배양액 중에 직접 L-아르기닌을 첨가할 수 있으며 배양액에서 분리된 미생물, 세척된 미생물 등을 사용할 수 있다. 또한, 세포를 파쇄 또는 용균시킨 세포 추출물을 그대로 사용할 수 있으며 당해 세포 추출물로부터 아르기닌 데카복실라제를 회수하여 조효소액으로서 사용할 수 있으며 또한, 아르기닌 데카복실라제를 정제하여 사용할 수 있다. 즉, 아르기닌 데카복실라제 활성를 갖는 분획이면 효소와 당해 효소 함유물 모두를 사용할 수 있다. 여기서 「효소 함유물」이란 당해 효소를 함유하는 것이면 양호하며 구체적으로는 배양물, 배양 미생물, 세정 미생물, 세포를 파쇄 또는 용균시킨 세포 추출물, 조효소액, 정제 효소 등을 포함한다. 공정을 간소화하여 아그마틴의 제조원가 절감을 도모하는 관점에서는 배양액 중에 직접 기질을 첨가하여 반응시키는 방법이 가장 바람직하다.
아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체를 배양하면서 배양액 중에 직접 L-아르기닌을 첨가하여 아그마틴 생성반응을 진행시키는 경우, 반응은 정치(靜 置) 내지는 완만하게 교반하여 실시한다. 반응온도는 10℃ 내지 60℃, 바람직하게는 25℃ 내지 45℃, pH는 3 내지 8, 바람직하게는 pH 4.5 내지 6으로 제어하는 것이 좋다. 또한 반응에는 보효소인 피리독살 포스페이트를 첨가하는 것이 바람직하다. 기질인 L-아르기닌(L-Arginine)은 반응이 계속되는 한은 첨가해도 양호하며 필요에 따라 필요한 양과 시간만큼 반응시킬 수 있다.
조효소액을 사용하여 아그마틴 생성반응을 실시하는 경우, 배양 미생물을 원심 분리조작 등에 의해 회수한 다음, 세포를 파쇄 또는 용균시켜 아르기닌 데카복실라제를 함유하는 조효소액을 조제한다. 세포 파쇄에는 초음파 파쇄, 프렌치 프레스 파쇄, 유리 비드 파쇄 등의 방법을 사용할 수 있으며 또한 용균시키는 경우에는 알부민 라이소자임이나 펩티다제 처리 또는 이들을 적절하게 조합한 방법이 사용된다. 정제 효소액을 사용하여 아그마틴 생성반응을 실시하는 경우, 또한, 통상적인 침전, 여과, 칼럼 크로마토그래피 등의 수법에 의해 아르기닌 데카복실라제의 조효소액을 정제한다. 이 경우, 아르기닌 데카복실라제에 대한 항체를 이용하는 정제법도 이용할 수 있다.
아르기닌 데카복실라제의 조효소액 또는 정제 효소를 사용하여 아그마틴 생성반응을 진행시키는 경우에는 기질의 L-아르기닌(L-Arginine)과 조효소액 또는 정제 효소를 함유하는 반응액을 10℃ 내지 60℃, 바람직하게는 25℃ 내지 45℃, pH는 3 내지 8, 바람직하게는 pH 4.5 내지 6으로 제어하면서 반응을 진행시킨다. 반응에는 보효소인 피리독살 포스페이트를 첨가하는 것이 바람직하다. 기질인 L-아르기닌(L-Arginine)은 반응이 계속되는 한은 첨가할 수 있으며 필요에 따라 필요한 양과 시간만큼 반응시킬 수 있다.
실시예 1
(아르기닌 데카복실라제 유전자(adi)의 클로닝 및 발현)
유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)에서「adi」를 키워드로 하여 검색되는 정보에 근거하여 작제된 GACCATGGCTAAAGTATTAATTGTTGAAAG(서열 1)와 CCGGATCCACGCCTTCAGCGGAATAGTG(서열 2)의 30mer와 28mer의 양쪽 말단 프라이머 및 CCCTGCAGATCAGTATCAGCCAAAAAAA(서열 3)와 CCGGATCCACGCCTTCAGCGGAATAGTG(서열 2)의 28mer와 28mer의 양쪽 말단 프라이머와 Pyrobest DNA 폴리머라제[다카라슈조사제)에 의한 PCR법(94℃, 30초, 55℃, 1분, 72℃, 2분, 30사이클, Gene Amp PCR System Mode 19600(파킨엘머사 제)]을 실시하며 ATG 및 SD-ATG와 해독 종료 코돈 영역을 포함하는 adi 구조 유전자 영역 약 2.3kb 단편을 증폭시키며 전자의 단편에 관해서는 NcoI와 BamHI로 분해시킨 후, pTrc 99A(파마시아사 제)의 NcoI 부위와 BamHI 부위 사이에 삽입한다. 본 발현 플라스미드를 pTrcadi1이라고 명명한다(도 2). 후자의 단편에 관해서는 PstI와 BamHI로 분해시킨 후, pUC19(다카라슈조사 제)의 PstI 부위와 BamHI 부위 사이에 삽입한다. 본 발현 플라스미드를 pUCadi라고 명명한다(도 1).
PCR용 프라이머에서 서열 1에는 NcoI 부위, 서열 2에는 BamHI 부위, 서열 3에는 PstI 부위가 각각 디자인되어 있다. 또한 클론화된 adi는 pTrc 99A 벡터에서는 trc 프로모터 통제하에, pUC19 벡터에서는 lac 프로모터의 통제하에 발현되며아르기닌 데카복실라제가 해독된다.
또한, 이들 플라스미드 pTrcadi 1 및 pUCadi에서 E. coli JM1O9를 형질 전환한 재조합체를 50mg/L의 암피실린 및 10mg/L의 피리독신을 함유하는 LB 액체 배지(박토-트림톤 1%, 효모 추출물 O.5%, NaCl 1%, 글루코스 0.1%, pH 7.0)에서 배양하며 1mM IPTG(이소프로필-1-티오-β-D-갈락토사이드) 첨가에 의한 발현 유도를 실시하고 약 16시간 동안 배양한 후에 배양액 4ml분의 세포를 수거한다. 이들 세포를 1% L-아르기닌·HCl과 0.02% 피리독살 포스페이트를 함유하는 0.2M 나트륨 아세테이트 완충액 0.4ml에 현탁하며 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 이러한 반응액을 원심분리하여 세포를 제거한 다음, 상등액을 HPLC에서 분석한 결과, pTrcadi 1/JM109에서는 거의 100%의 전환율로 아그마틴이 생성된다. pUCadi/JM109에서는 전환율이 약 20%이다. 또한, IPTG 비유도 재조합 세포를 사용하는 경우에는 양쪽 모두 약 10 내지 20%의 전환율이다. 대조구로서 숙주 세포 균주 JM1O9 또는 야생형 균주 W3110에서는 거의 전환되지 않는다.
또한 pTrcadi1/JM109 및 pUCadi/JM1O9의 1mm IPTG 유도 세포를 1% SDS 용액으로 용균시키고 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)-크마시브릴리언트 블루(CBB) 염색 분석을 실시한 바, pTrcadi1/JM1O9 세포에서는 아르기닌 데카복실라제의 서브 유니트의 분자량에 상응하는 약 85kDa의 현저한 밴드가 발견된다. 이것은 대략 재조합체내 단백질의 10% 이상을 차지하고 있다. pUCadi/JM1O9 세포 및 IPTG 비유도성 세포에 관해서는 대조구와 비교하여 85kDa에 해당하는 유의적인 밴드를 찾아낼 수 없다.
pTrcadi1/JM109인 E. coli AJ13839 균주는 FERM-P 18285로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁 센터[International Patent Organism Depository(IPOD)]에 기탁되었다.
또한, 이때의 HPLC의 분석조건은 다음과 같다:
컬럼: SUMIPAX PG-0DS 07-4625, 250×4.6mm
이동상: 아세트니트릴/인산 완충액(0.03M NaH2P04, pH 3.0)= 30/70
온도:40℃
유속: 1.0ml/분
검출기: 210nm(UV)이다.
실시예 2
(아르기닌 데카복실라제 유전자(adi)의 발현 시스템의 개선)
아르기닌 데카복실라제 유전자(adi)를 탑재한 발현 플라스미드 pTrc 99A에는 당해 trc 프로모터 통제하의 발현을 통상시에는 억제하기 위해 lacIq라고 하는 리프레서를 암호화하는 유전자가 동일한 플라스미드 위에 탑재되어 있다. 그리고 발현시키고 싶을 때에는 1 내지 2mM의 IPTG를 배양 도중에 첨가한다.
따라서 IPTG 부재하에서도 아르기닌 데카복실라제 유전자(adi)가 발현할 수 있도록 pTrcadi1의 lacIq유전자의 일부를 가공하여 리프레서를 불활성화시켰다. 이러한 방법으로서 lacIq상의 제한효소 부위인 ApaI 부위를 결실시키는 방법 및Van91I와 EcoRV 부위 사이를 결실시키는 방법과 같은 두가지 방법을 사용한다. 즉, 전자에 관해서는 pTrcadi1을 ApaI로 분해시키며 T4 DNA 폴리머라제로 ApaI의 접착 말단을 평활 말단화한 다음, T4 DNA 리가제로 자가 연결한다. ApaI로 절단할 수 없게 된 플라스미드를 pTrcadi2라고 명명한다(도 2). 후자에 관해서는 pTrcadi1를 Van 91I와 EcoRV로 분해하며 T4 DNA 폴리머라제로 Van 91I의 접착 말단을 평활 말단화한 다음, Van 91I와 EcoRV로 절단된, 소형 단편을 제외한 약 6kb의 DNA 단편을 T4 DNA 리가제로 자가 연결한다. 수득된 플라스미드를 pTrcadi3이라고 명명한다(도 2).
pTrcadi2 및 pTrcadi3으로 이. 콜리 JM109를 형질 전환한 pTrcadi 2/JM1O9 및 pTrcadi 3/JM1O9균을 사용하여 50mg/L의 암피실린 및 10mg/L의 피리독신을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하며 IPTG를 첨가하지 않고 약 16시간 동안 배양한 후에 배양액 4ml분의 균체를 수거한다. 실시예 1과 동일한 반응계에서 아르기닌으로부터 아그마틴로의 전환율을 분석한 결과, 둘다 거의 100%의 전환율로 아그마틴을 생성한다.
또한 pTrcadi2/JM109 및 pTrcadi 3/JM109의 IPTG 비유도 균체를 1% SDS 용액으로 용균시켜 SDS-PAGE-크마시브릴리언트블루(CBB) 염색분석을 실시한 바, pTrcadi2/JM109와 pTrcadi3/JM1O9 균체 모두 아르기닌 데카복실라제의 서브 유니트의 분자량에 상응하는 약 85kDa의 유의적인 밴드가 발견된다. 이것은 대략 균체내 단백질의 5% 정도를 차지하고 있다.
실시예 3
1)아르기닌 데카복실라제 유전자(adi)의 고발현 시스템의 구축
IPTG 부재하에서 아르기닌 데카복실라제 유전자(adi)가 또한 고발현할 수 있도록 pTrcadi3의 trc 프로모터와 adi 유전자 영역을 pUC19 플라스미드 위에 탑재한다. pUC19 플라스미드는 pTrc 99A(복제기능이 pBR322로부터 유래됨)보다 복제수가 거의 10배가 된다. 이러한 방법으로서 pTrcadi3을 제한효소 ApaLI로 분해(4개의 단편이 생긴다)하고 T4 DNA 폴리메라제로 ApaLI의 접착 말단을 평활 말단화한 다음, 약 3.2kb의 ApaLI 단편을 분리하고 제조한다. 다음에 pUC 19를 PvuII로 분해(2개의 단편이 생긴다)하고 수득한 약 2.4kb의 단편을 분리하고 제조한다. 이러한 3.2kb와 2.4kb의 단편을 T4 DNA 리가제로 연결시킨다. 수득된 약 5.6kb의 플라스미드를 pUCTrcadi라고 명명한다(도 2).
pUCTrcadi로 E. coli JM1O9를 형질 전환한 pUCTrcadi/JM109균을 사용하여 50mg/L의 암피실린 및 10mg/L의 피리독신을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하고 IPTG 부재하에서 약 16시간 동안 배양한 후에 배양액 0.4ml분의 균체를 수거한다. 실시예 1과 동일한 반응계에서 아르기닌으로부터 아그마틴으로의 전환율을 분석한 결과, 둘다 거의 100%의 전환율로 아그마틴을 생성한다. 이 결과는 실시예 1에서 pTrcadi 1/JM109균에서의 IPTG 유도 균체법과 거의 동등한 활성을 나타낸다.
또한 pUCTrcadi/JM109의 IPTG 비유도 균체를 1% SDS 용액으로 용균시키고 SDS-PAGE-크마시브릴리언트 블루(CBB) 염색분석을 실시한 바, pUCTrcadi/JM109 균체에서는 아르기닌 데카복실라제의 서브 유니트의 분자량에 상응하는 약 85kDa의 현저한 밴드가 발견된다. 이것은 약 균체내 단백질의 20% 이상을 차지하고 있으며일부의 균체에서는 과립(inclusion body)의 형성이 나타난다. 본 과립 형성은 pUCTrcadi/JM109 균체의 배양온도를 3O℃ 이하에서 실시함으로써 억제할 수 있으며 본 균체의 아르기닌 데카복실라제가 또한 균체내 단백질의 20% 정도를 차지하고 있다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 4
1)아그마티나제 유전자(speB)의 클로닝 및 이의 파괴된 유전자를 함유하는 균주의 작제
유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)에서 「speAB」를 키워드로 하여 검색되는 정보에 근거하여 작제된 CCGAATTCACGTCCATCCCAACAATGTT(서열 4)와 CCGCATGCGGCGATGCGTGTGAAGAAAA(서열 5)의 28mer와 28mer의 양쪽 말단 프라이머와 Pyrobest DNA Polymerase(다카라슈조사 제)에 의한 PCR법[94℃, 30초, 55℃, 1분, 72℃, 2분, 30사이클, Gene Amp PCR System Model 9600(파킨엘머사 제)]를 실시하고 speAB의 부분 유전자 영역 약 1.9kb 단편을 증폭하며 EcoRI와 SphI로 분해시킨 후, pUC19(다카라슈조사 제)의 EcoRI 부위와 SphI 부위 사이에 삽입한다. 본 발현 플라스미드를 pUCspeAB라고 명명한다. PCR용 프라이머에서 서열 4에는 EcoRI 부위, 서열 5에는 SphI 부위가 각각 존재한다.
다음에 speAB 유전자의 일부를 가공하여 speB의 기능을 불활성화시킨다. 이러한 방법으로서 speAB 상에 있는 제한효소 부위의 Eco81I와 HpaI 부위 사이의 영역을 결실시킨다. 즉, pUCspeAB를 Eco81I와 HpaI로 분해하며 T4 DNA 폴리머라제로 Eco81I의 접착 말단을 평활 말단화한 다음, Eco81I와 HpaI으로 절단된, 소단편(약260bp)을 제외한 약 4.3kb의 DNA 단편을 T4 DNA 리가제로 자가 연결한다. 수득된 플라스미드를 pUC△speB라고 명명한다(도 3). 다음에 pUC△speB를 EcoRI와 SphI로 절단하며 speAB를 함유하는 약 1.7kb의 단편을 수득하고 이러한 단편을 온도 민감성 복제 오리진(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터인 pMAN997(W0 99/03988)의 EcoRI 부위와 SphI 부위 사이에 삽입하여 목적하는 플라스미드를 수득한다. 이러한 플라스미드를 pMAN△speB라고 명명한다(도 3).
pMAN 997는, pMAN O31[참조: S. Matsuyama, et al., J. Bacteriol., 162, 1196-1202(1985)]의 온도 민감성 복제 오리진을 함유하지 않는 HindIII-VspI 단편과 pUC19의 오리진을 함유하지 않는 HindIII-VspI 단편을 교환함으로써 구축된다.
따라서 pMAN△speB를 E. coli W3110(야생 균주)에 형질도입하며 수득된 형질전환체를 50mg/L의 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하고 30℃에서 밤새 배양한다.
다음에 이들 배양 균체를 50mg/L의 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에 각각 단일 콜로니가 생성되도록 도말하고 42℃에서 증식하는 콜로니를 수득한다. 다시 한번, 42℃에서 증식하는 단일 콜로니를 얻는 조작을 반복하여 상동성 재조합에 의해 플라스미드 전체가 염색체에 재조합된 클론을 선별한다. 본 클론은 세포질중에 플라스미드를 갖고 있지 않음을 확인한다. 다음에 이러한 몇몇 클론을 LB 한천 배지에 도말하고 30℃에서 밤새 배양한 다음, LB 액체 배지 3ml/시험관에 접종하고 42℃에서 3 내지 4시간 동안 진탕 배양한다. 이러한 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적당하게 희석(10-5내지 10-6)하고 LB 한천 배지에 도말하며 42℃에서 밤새 배양하여 콜로니를 수득한다. 출현한 콜로니 중에서 무작위로 100개의 콜로니를 골라내어 각각을 LB 한천 배지와 50mg/L의 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에 증식시켜 LB 한천 배지에만 증식하는 암피실린 민감성 클론을 선별한다. 이러한 민감성 클론중 몇몇 클론을 사용하여 염색체 DNA를 작제하고 서열 4와 서열 5를 프라이머로 하는 PCR(상기 조건과 동일)을 실시하며 speAB의 약 1.7kb 또는 약 2kb의 단편을 증폭시킨다. 약 1.7kb의 단편이 Eco81I 또는 HpaI로 절단될 수 없음을 확인한다. 이러한 약 1.7kb의 단편이 검출된 △speB 유전자를 염색체에 갖고 있는 균주를 아그마티나제를 발현할 수 없는 speB 결핍 균주(speB-)로서 수득한다.
2)speB 결핍 균주를 사용하는 아그마틴 생산 평가
speB 결핍 균주에 실시예 2에서 작제된 아르기닌 데카복실라제 유전자(adi) 발현 플라스미드 pTrcadi 2를 도입하여 pTrcadi 2/speB-균주를 제조한다. 본 형질전환체를 사용하여 50mg/L의 암피실린 및 10mg/L의 피리독신을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하고 IPTG 부재하에서 약 16시간 동안 배양한 후에 배양액 4ml분의 균체를 수거한다. 실시예 1과 동일한 반응계에서 아르기닌로부터 아그마틴으로의 전환율을 분석한 결과, 거의 100%의 전환율로 아그마틴을 생성한다. 또한 지금까지 speB+균주(JM1O9)에서 박층 크로마토 분석(조건: 클로로포름/메탄올/암모니아수= 2/4/3으로 분리한 다음, 닌하이드린 발색으로 검출)으로 소량 검출된 푸트레신의 생성이 본 speB-주에서는 상실된다. 이러한 점은 speB에 암호화되는 아그마티나제에 의해 촉매되는 아그마틴에서 푸트레신의 생성이 speB 결실에 의해 상실된 것으로 사료된다. 이러한 아그마틴 분해 시스템을 차단함으로써 아그마틴의 수율 저하를 억제할 수 있으며 아그마틴의 동일한 아민인 푸트레신의 오염을 방지하는 이점이 생긴다.
또한 pTrcadi 2/speB-균주의 IPTG 비유도성 균체를 1% SDS 용액으로 용균시키고 SDS-PAGE-크마시브릴리언트 블루(CBB) 염색분석을 실시한 바, 아르기닌 데카복실라제의 서브 유니트의 분자량에 상응하는 약 85kDa의 유의적인 밴드가 발견된다. 이것은 대략 균체내 단백질의 5% 정도를 차지하고 있지만 배양에서 플라스미드의 보존성이 불안정한 측면도 발견된다.
본 발명에 따라 아르기닌 데카복실라제 유전자를 이. 콜리와 같은 숙주에서 안정적으로 대량으로 발현시킬 수 있다. 이 결과, 이러한 형질전환체를 사용하여 비교적 염가로 제조된 아르기닌으로부터 공업적 중간체 재료로서 유용한 아그마틴을 효율적으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에 따라 수득된 아그마틴을 아실아그마틴 제조의 중간체로서 사용함으로써 아실아그마틴 합성에 요구되는 복잡한 화학 합성공정의 일부를 간략화할 수 있으므로 계면활성제로서 유용한 아실아그마틴의 제조 원가를절감시킬 수 있다.

Claims (13)

  1. 아르기닌을 탈카복실화함으로써 아그마틴을 제조하는 방법에서, 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체 또는 상기한 재조합체로부터 수득되는 아르기닌 데카복실라제 또는 아르기닌 데카복실라제 함유물을 사용함을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 아그마틴의 제조방법에서 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체를 사용함을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 재조합체에서 아르기닌 데카복실라제의 발현량이 균체내 단백질의 5% 초과임을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 아르기닌 데카복실라제 유전자가 에스케리키아 콜리 기원 adi 유전자임을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 재조합체가 pUC계 플라스미드, pBR322계 플라스미드 또는 이의 유도체 기원의 벡터 DNA와 아르기닌 데카복실라제 유전자를 연결시켜 수득된 재조합 DNA를 사용한 형질전환체임을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 재조합 DNA가 trc 프로모터를 함유함을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 재조합체가 에스케리키아 콜리를 숙주로 함을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 재조합체가 FERM-P18285임을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 재조합체가 아그마틴에서 푸트레신으로의 전환을 촉매하는 아그마티나제 결핍 에스케리키아 콜리임을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 아르기닌에서 아그마틴으로의 전환반응을 위한 반응계의 pH가 pH 6 미만으로 조절됨을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 아르기닌에서 아그마틴으로의 전환반응을 위한 반응계에 피리독살 포스페이트를 첨가함을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체를 적어도 30℃미만에서 배양함으로써 균체내에 아르기닌 데카복실라제를 축적시키는 공정 및
    아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체 또는 재조합체로부터 수득되는 아르기닌 데카복실라제 또는 아르기닌 데카복실라제 함유물을 사용하여 아르기닌을 탈카복실화함으로써 아그마틴을 제조하는 공정을 포함함을 특징으로 하는 아그마틴의 제조방법.
  13. 아르기닌 데카복실라제 유전자를 증폭 발현시키는 재조합체를 배지중에 배양하고 배지중 및/또는 세포중에 아르기닌 데카복실라제를 축적시킴을 특징으로 하는 아르기닌 데카복실라제의 제조방법.
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