CN105713938B - 一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法 - Google Patents
一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法，属于医药中间体领域。所述方法包括：以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将所述胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。所述方法工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产，该方法与单纯的化学法相比，反应条件温和，操作简便，成本较低，污染少，且能完成在化学反应中难以进行的酶催化反应。
Description
技术领域
本发明涉及医药中间体的制备领域，特别涉及一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法。
背景技术
胍基丁胺是左旋精氨酸脱羧酶(L-ADC)催化精氨酸脱羧基的产物，是一种神经递质，在哺乳动物体内的大部分器官和组织内均有分布，其特异性地存在于某些细胞内，如肾上腺嗜铬细胞、神经胶质细胞和颈动脉体的球细胞等。研究资料表明，胍基丁胺有降血糖、降血压、利尿、抗炎、抗抑郁、抑制细胞增生等生物活性，特别是对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的拮抗作用较强而持久，具有对动物吗啡依赖性的戒断作用，是一种极具开发价值的戒毒类药物。且胍基丁胺通过刺激释放下丘脑的荷尔蒙来工作，包括促黄体激素和生长激素。通过两种途径来提高一氧化氮的含量：刺激释放一氧化氮和抑制一氧化氮酶的合成。可提高身体耐受度，加快身体恢复(一般指运动后的恢复)，提高身体性能，表现出惊人和长久的能量供输，提高全身构成。
目前市面上胍基丁胺多数以硫酸盐形式存在，硫酸胍基丁胺作为胍基丁胺的药用硫酸盐，具有多种药理学活性，硫酸胍基丁胺的市场运用前景广阔。在现有技术中，硫酸胍基丁胺的化学合成方法是用1，4-丁二胺为原料，先对它进行单胺基保护，再使用1-硝基胍基-3,5-二甲基吡唑对另一个胺基进行硝胍基化，后经还原、脱保护、成盐，最终制得硫酸胍基丁胺。该路线步骤多、收率低、成本高、不适合大规模的工业化生产。另一种以己二酸二乙酯为原料合成硫酸胍基丁胺，首先将乙二酸二乙酯与水合肼反应制得己二酸二酰肼，在与亚硝酸钠反应得重氮盐，加热脱氮，生成1,4-二异氰酸酯丁烷，水解得到关键中间体1,4-丁二胺，然后再与S-甲基异硫脲硫酸盐反应制得硫酸胍基丁胺。此路线步骤较多，生产过程大量放氮，易爆炸，并且使用S-甲基异硫脲硫酸盐作为胍基化试剂不可避免产生气味难闻的烷基硫醇，对环境造成较大污染。而用1,4-丁二胺为原料，使用S-甲基异硫脲硫酸盐作为胍基化试剂，同样也存在环境污染问题。例如中国公开专利CN1834085A和CN101121677均报道了用1，4-丁二胺和3-甲基异硫脲反应，得到硫酸胍基丁胺。但该方法的不足之处是：(1)反应收率低(仅为40％左右)；(2)反应易产生三废，特别是产生的烷基硫醇气味难闻，易对环境造成污染，不利于劳动保护，更不符合节能减排的产业政策。
因此，研发一种高效的硫酸胍基丁胺的生物转化方法显得十分必要。
发明内容
为了解决现有技术中没有高效的硫酸胍基丁胺的生物转化方法的问题，本发明实施例提供了一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法。所述技术方案如下：
本发明实施例提供了一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法，所述方法包括：以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将所述胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。
具体地，所述方法还包括：以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应。
进一步地，所述精氨酸脱羧酶与所述左旋精氨酸的质量比不超过0.05；所述磷酸吡哆醛与所述左旋精氨酸的质量比不超过0.002。
进一步地，所述精氨酸脱羧酶与所述左旋精氨酸的质量比为1︰40；所述磷酸吡哆醛与所述左旋精氨酸的质量比为1︰1000。
具体地，所述脱羧反应的反应温度为19-46℃；所述脱羧反应的反应体系的pH值为6-10。
具体地，所述精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，所述精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含所述精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将所述工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的所述精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1︰0.6-0.8︰10-13加入pH值为6-8的缓冲溶液中，在25-35℃下恒温搅拌2-3h，离心后收集固体，得到固定酶载体；其中，所述添加剂包括硫酸铁和硫酸镁中的至少一种；所述固定化载体包括藻土、石英砂、含黏合剂型硅胶、活性氧化钙、脂粉、明胶、氧化铝和高岭土中的至少一种；
3)将步骤2)中得到的所述固定酶载体用乙醇洗涤1-3次，干燥，即得到所述固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
进一步地，所述添加剂包括硫酸铁和硫酸镁，所述硫酸铁和所述硫酸镁的质量比为1︰2；所述固定化载体为由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成，藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为4︰1︰1︰3。
具体地，当脱羧反应进行到1h以后，向所述脱羧反应补加左旋精氨酸。
具体地，当脱羧反应进行到第2h时，向所述脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
具体地，所述方法还包括对所述硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，所述纯化步骤如下：
1)向所述硫酸胍基丁胺粗产物中加入活性炭，在40℃～60℃下放置1h～2h，再用孔径为0.45um的过滤膜抽滤，将抽滤后所得的溶液在旋转蒸发仪中旋转蒸发去除杂质，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
2)将步骤1)所得的所述硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体；
或者所述纯化步骤如下：
1)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为2.5～3.5︰3.5～5︰1混合均匀，得到混合溶剂；
2)将所述硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤1)中的所述混合溶剂中，其中，所述硫酸胍基丁胺粗产物与所述混合溶剂的质量比为1︰8～13，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
3)将步骤2)所得的所述硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法，工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产，该方法与单纯的化学法相比，反应条件温和，操作简便，成本较低，污染少，且能完成在化学反应中难以进行的酶催化反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例一提供的纯化后的硫酸胍基丁胺的液相图，其中，横坐标为时间，纵坐标mAU为电信号；
图2是本发明实施例一提供的精氨酸脱羧酶液重复利用10次的比活力数据图，其中，横坐标为次数，纵坐标为每毫克酶活力。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
本发明实施例提供了一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法，该方法包括：以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。
具体地，该方法还包括：以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应。
进一步地，精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比不超过0.05；磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比不超过0.002。
进一步地，精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1︰40；磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1︰1000。
具体地，脱羧反应的反应温度为19-46℃；脱羧反应的反应体系的pH值为6-10。
具体地，精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1︰0.6-0.8︰10-13加入pH值为6-8的缓冲溶液中，在25-35℃下恒温搅拌2-3h，离心后收集固体，得到固定酶载体；其中，缓冲溶液可以为磷酸盐缓冲溶液；添加剂可以包括硫酸铁和硫酸镁中的至少一种；固定化载体可以包括藻土、石英砂、含黏合剂型硅胶(硅胶G)、活性氧化钙、脂粉、明胶、氧化铝和高岭土中的至少一种；
3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤1-3次，干燥，即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
进一步地，添加剂包括硫酸铁和硫酸镁，硫酸铁和硫酸镁的质量比为1︰2；固定化载体为由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成，藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为4︰1︰1︰3。
具体地，当脱羧反应进行到1h以后，向脱羧反应补加左旋精氨酸。
具体地，当脱羧反应进行到第2h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
具体地，采用浓度为0.1mol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗产物，即硫酸胍基丁胺粗产物的pH值为4～5。
具体地，该方法还包括对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)向硫酸胍基丁胺粗产物中加入活性炭，在40℃～60℃下放置1h～2h，再用孔径为0.45um的过滤膜抽滤，将抽滤后所得的溶液在旋转蒸发仪中旋转蒸发去除杂质，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；其中，活性炭的加入量可使黄色的硫酸胍基丁胺粗产物吸附至无色即可。同时，可利用液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)和高效液相色谱法(High PerformanceLiquid Chromatography，HPLC)进行监控，直至底物完全利用；
2)将步骤1)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体；其中，乙醇将硫酸胍基丁胺粗晶体清洗干净即可，其用量可根据具体情况进行调整。
或者纯化步骤如下：
1)乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为2.5～3.5︰3.5～5︰1混合均匀，得到混合溶剂；
2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤1)中的混合溶剂中，其中，硫酸胍基丁胺粗产物与混合溶剂的质量比为1︰8～13，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。其中，乙醇将硫酸胍基丁胺粗晶体清洗干净即可，其用量可根据具体情况进行调整。
优选地，将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3︰4︰1混合均匀，得到混合溶剂。
实施例一
以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1︰40；磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1︰1000。控制反应体系的温度为35℃；控制反应体系的pH值为6.5。
精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1︰0.7︰11加入pH值为7的磷酸盐缓冲溶液中，在30℃下恒温搅拌2.5h，离心后收集固体，得到固定酶载体；其中，添加剂包括硫酸铁和硫酸镁，硫酸铁和硫酸镁的质量比为1︰2，硫酸铁和硫酸镁的质量比为1︰2更能促进精氨酸脱羧酶的活性；固定化载体由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成，藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为4︰1︰1︰3，藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为4︰1︰1︰3能够更高的提升精氨酸脱羧酶的活性，更利于精氨酸脱羧酶的多次循环利用；
3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤3次，干燥，即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
当脱羧反应进行到第2h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
具体地，采用浓度为0.1mol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗产物，即硫酸胍基丁胺粗产物的pH值为4。
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3︰4︰1混合均匀，得到混合溶剂；
2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤1)中的混合溶剂中，其中，硫酸胍基丁胺粗产物与混合溶剂的质量比为1︰10，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
将纯化的硫酸胍基丁胺晶体进行液相色谱实验，所得实验结果如图1所示，在该图中，于15.579min处有吸收峰。本实施例提供的底物左旋精氨酸的转化率为97.5％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到99.4％。
将精氨酸脱羧酶液重复利用10次并得到其比活力数据图，如图2所示，固定后，精氨酸脱羧酶重复利用10次后反应仍具有酶活，并且在第10次使用时，其酶的比活力大于30U/mg。这使得昂贵的精氨酸脱羧酶可以循环利用，极大地节省生产成本。
实施例二
以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1︰20；磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1︰800。控制反应体系的温度为30℃；控制反应体系的pH值为6。
精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1︰0.6︰13加入pH值为6的磷酸盐缓冲溶液中，在25℃下恒温搅拌2h，离心后收集固体，得到固定酶载体；其中，添加剂包括硫酸铁和硫酸镁，硫酸铁和硫酸镁的质量比为1︰1；固定化载体由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成，藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为2︰1︰2︰4；
3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤1次，干燥，即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
当脱羧反应进行到第1h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的3/4。
具体地，采用浓度为0.1mol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化，使所得硫酸胍基丁胺粗产物的pH值为4。
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)向硫酸胍基丁胺粗产物中加入活性炭，在40℃下放置2h，再用孔径为0.45um的过滤膜抽滤，将抽滤后所得的溶液在旋转蒸发仪中旋转蒸发去除杂质，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；其中，过滤膜可以为硅藻土0.45um膜。其中，活性炭的加入量可使黄色的硫酸胍基丁胺粗产物吸附至无色即可。同时可利用液相色谱-质谱联用技术和高效液相色谱法进行监控，直至底物完全利用。
2)将步骤1)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
本实施例提供的底物左旋精氨酸的转化率为96.8％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到99.1％。
实施例三
以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1︰30；磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1︰500。控制反应体系的温度为42℃；控制反应体系的pH值为7。
精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1︰0.8︰10加入pH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液中，在35℃下恒温搅拌3h，离心后收集固体，得到固定酶载体；其中，添加剂包括硫酸铁和硫酸镁，硫酸铁和硫酸镁的质量比为1︰1.5；固定化载体由藻土、氧化铝和明胶组成，藻土、氧化铝和明胶的质量比为2︰1︰1；
3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤2次，干燥，即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
当脱羧反应进行到第1.5h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的2/3。
具体地，采用浓度为0.1mol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗产物，即硫酸胍基丁胺粗产物的pH值为5。
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为2.5︰3.5︰1混合均匀，得到混合溶剂；
2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤1)中的混合溶剂中，其中，硫酸胍基丁胺粗产物与混合溶剂的质量比为1︰8，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
底物左旋精氨酸的转化率为97.1％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到99.2％。
实施例四
以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1︰50；磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1︰600。控制反应体系的温度为25℃；控制反应体系的pH值为7.5。
精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1︰0.7︰12加入pH值为7.5的磷酸盐缓冲溶液中，在28℃下恒温搅拌2.8h，离心后收集固体，得到固定酶载体；其中，添加剂为硫酸铁；固定化载体为氧化铝；
3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤3次，干燥，即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
当脱羧反应进行到第2.5h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的1/4。
具体地，采用浓度为0.1mol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗产物，即硫酸胍基丁胺粗产物的pH值为4。
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3.5︰5︰1混合均匀，得到混合溶剂；
2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤1)中的混合溶剂中，其中，硫酸胍基丁胺粗产物与混合溶剂的质量比为1︰13，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
本实施例提供的底物左旋精氨酸的转化率为95.8％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到98.7％。
实施例五
以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1︰80；磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1︰700。控制反应体系的温度为46℃；控制反应体系的pH值为8。
精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1︰0.6︰11加入pH值为8的磷酸盐缓冲溶液中，在32℃下恒温搅拌2.3h，离心后收集固体，得到固定酶载体；其中，添加剂为硫酸镁；固定化载体包括氧化铝和明胶，氧化铝和明胶的质量比为2︰5；
3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤2次，干燥，即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
当脱羧反应进行到第2h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
具体地，采用浓度为0.1mol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗产物，即硫酸胍基丁胺粗产物的pH值为4。
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)向硫酸胍基丁胺粗产物中加入活性炭，在50℃下放置1h，再用孔径为0.45um的过滤膜抽滤，将抽滤后所得的溶液在旋转蒸发仪中旋转蒸发去除杂质，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；其中，活性炭的加入量可使黄色的硫酸胍基丁胺粗产物吸附至无色即可。同时，可利用液相色谱-质谱联用技术和高效液相色谱法进行监控，直至底物完全利用。
2)将步骤1)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
底物左旋精氨酸的转化率为95.5％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到98.9％。
实施例六
以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1︰100；磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1︰850。控制反应体系的温度为19℃；控制反应体系的pH值为10。
精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1︰0.8︰12加入pH值为7的磷酸盐缓冲溶液中，在31℃下恒温搅拌2.5h，离心后收集固体，得到固定酶载体；其中，添加剂包括硫酸镁；固定化载体包括氧化铝和高岭土，氧化铝和高岭土的质量比为2:1；
3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤1次，干燥，即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
当脱羧反应进行到第1.5h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
具体地，采用浓度为0.1mol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗产物，即硫酸胍基丁胺粗产物的pH值为5。
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)向硫酸胍基丁胺粗产物中加入活性炭，在60℃下放置1.5h，再用孔径为0.45um的过滤膜抽滤，将抽滤后所得的溶液在旋转蒸发仪中旋转蒸发去除杂质，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；其中，活性炭的加入量可使黄色的硫酸胍基丁胺粗产物吸附至无色即可。同时可利用液相色谱-质谱联用技术和高效液相色谱法进行监控，直至底物完全利用。
2)将步骤1)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
底物左旋精氨酸的转化率为95.3％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到98.6％。
实施例七
以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1︰40。控制反应体系的温度为35℃；控制反应体系的pH值为6.5。
精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1︰0.7︰11加入pH值为7的磷酸盐缓冲溶液中，在30℃下恒温搅拌2.5h，离心后收集固体，得到固定酶载体；其中，添加剂包括硫酸铁和硫酸镁，硫酸铁和硫酸镁的质量比为1︰2；固定化载体由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成，藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为4︰1︰1︰3；
3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤3次，干燥，即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
当脱羧反应进行到第2h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
具体地，采用浓度为0.1mol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗产物，即硫酸胍基丁胺粗产物的pH值为5。
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3︰4︰1混合均匀，得到混合溶剂；
2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤1)中的混合溶剂中，其中，硫酸胍基丁胺粗产物与混合溶剂的质量比为1︰10，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
本实施例提供的底物左旋精氨酸的转化率为85.4％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到98.7％。
实施例八
以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1︰20。控制反应体系的温度为30℃；控制反应体系的pH值为6。
精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1︰0.6︰13加入pH值为6的磷酸盐缓冲溶液中，在25℃下恒温搅拌2h，离心后收集固体，得到固定酶载体；其中，添加剂包括硫酸铁和硫酸镁，硫酸铁和硫酸镁的质量比为1︰1；固定化载体由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成，藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为2︰1︰2︰4；
3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤1次，干燥，即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
当脱羧反应进行到第1h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的3/4。
具体地，采用浓度为0.1mol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗产物，即硫酸胍基丁胺粗产物的pH值为4。
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)向硫酸胍基丁胺粗产物中加入活性炭，在40℃下放置2h，再用孔径为0.45um的过滤膜抽滤，将抽滤后所得的溶液在旋转蒸发仪中旋转蒸发去除杂质，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；其中，过滤膜可以为硅藻土0.45um膜。其中，活性炭的加入量可使黄色的硫酸胍基丁胺粗产物吸附至无色即可。同时可利用液相色谱-质谱联用技术和高效液相色谱法进行监控，直至底物完全利用。
2)将步骤1)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
本实施例提供的底物左旋精氨酸的转化率为83.1％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到98.8％。
对比例一
以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1︰40；磷酸吡哆醛与L-精氨酸的质量比为1︰1000。控制反应体系的温度为35℃；控制反应体系的pH值为6.5。
精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的精氨酸脱羧酶液和固定化载体按质量比为1︰11加入pH值为7的磷酸盐缓冲溶液中，在30℃下恒温搅拌2.5h，离心后收集固体，得到固定酶载体；其中，固定化载体由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成，藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为4︰1︰1︰3；
3)将步骤2)中得到的固定酶载体用乙醇洗涤3次，干燥，即得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
当脱羧反应进行到第2h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
具体地，采用浓度为0.1mol/L的硫酸对胍基丁胺粗产物进行酸化，使酸化后的胍基丁胺粗产物，即硫酸胍基丁胺粗产物的pH值为4。
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3︰4︰1混合均匀，得到混合溶剂；
2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤1)中的混合溶剂中，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
底物左旋精氨酸的转化率为92.1％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到98.7％。
对比例二
以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物。精氨酸脱羧酶与左旋精氨酸的质量比为1︰40；磷酸吡哆醛与左旋精氨酸的质量比为1︰1000。控制反应体系的温度为35℃；控制反应体系的pH值为6.5。
精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的精氨酸脱羧酶液用卡拉胶固定，得到固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
当脱羧反应进行到第2h时，向脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3︰4︰1混合均匀，得到混合溶剂；
2)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤1)中的混合溶剂中，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
3)将步骤2)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
底物左旋精氨酸的转化率为91.1％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到98.2％。
对比例三
将本发明实施例一获得的硫酸胍基丁胺粗产物采用如下方法进行纯化，具体纯化方法如下：
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于乙腈中，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
2)将步骤1)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
底物左旋精氨酸的转化率为97.1％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到96.2％。
对比例四
将本发明实施例一获得的硫酸胍基丁胺粗产物采用如下方法进行纯化，具体纯化方法如下：
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于四氢呋喃中，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
2)将步骤1)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
底物左旋精氨酸的转化率为97.3％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到95.9％。
对比例五
将本发明实施例一获得的硫酸胍基丁胺粗产物采用如下方法进行纯化，具体纯化方法如下：
对硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，纯化步骤如下：
1)将硫酸胍基丁胺粗产物溶于甲醇中，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
2)将步骤1)所得的硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
底物左旋精氨酸的转化率为97.0％，所制备纯化的硫酸胍基丁胺晶体的纯度达到95.8％。
将实施例一与对比例一对比可知，在固定化处理精氨酸脱羧酶的过程中，实施例一添加了添加剂，该添加剂可以提高精氨酸脱羧酶的活性。
将实施例一与对比例二对比可知，以载体固定精氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶通过共价键或物理作用力固定在载体的表面，与底物左旋精氨酸无障碍接触，与卡拉胶固定相比，也可以显著提高底物左旋精氨酸的转化率。
实施例一与对比例三、对比例四和对比例五对比可知，在硫酸胍基丁胺粗产物纯化时，先将硫酸胍基丁胺粗产物溶于乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3︰4︰1抽滤再洗涤，所得晶体纯度更高。
本发明实施例提供了一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法，首先，该方法利用载体固定精氨酸脱羧酶，固定后，精氨酸脱羧酶重复利用10次后反应仍具有酶活，昂贵的酶可以循环利用，节省生产成本，并添加硫酸铁、硫酸镁等添加剂来提高酶活。
其二，本发明实施例以乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为3︰4︰1的混合溶剂和乙醇纯化，使得本发明实施例所得的硫酸胍基丁胺晶体纯度达到98.5％以上，可见所得产品具有高纯度，同时，通过向脱羧反应补加左旋精氨酸能够有效促进反应进行，提高产物的收率。
其三，本发明实施例提供的方法工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产。
其四，本发明实施例提供的方法与单纯的化学法相比，反应条件温和，操作简便，成本较低，污染少，且能完成在化学反应中难以进行的酶催化反应。
其五，本发明实施例在生物转化过程中利用液相色谱-质谱联用技术和高效液相色谱法进行监控，直至底物完全利用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种硫酸胍基丁胺的生物转化方法，其特征在于，所述方法包括：以左旋精氨酸作为底物，以精氨酸脱羧酶作为生物转化催化剂，以磷酸吡哆醛作为辅酶，进行脱羧反应，生成胍基丁胺粗产物，将所述胍基丁胺粗产物用稀硫酸酸化，得到硫酸胍基丁胺粗产物，
所述精氨酸脱羧酶为经过固定化处理后的精氨酸脱羧酶，所述精氨酸脱羧酶的固定化处理包括如下步骤：
1)破碎含所述精氨酸脱羧酶的工程菌细胞，将所述工程菌细胞离心后，收集精氨酸脱羧酶液；
2)将步骤1)所收集的所述精氨酸脱羧酶液、添加剂和固定化载体按质量比为1︰0.6-0.8︰10-13加入pH值为6-8的缓冲溶液中，在25-35℃下恒温搅拌2-3h，离心后收集固体，得到固定酶载体；其中，所述添加剂包括硫酸铁和硫酸镁，所述硫酸铁和所述硫酸镁的质量比为1︰2；所述固定化载体为由藻土、石英砂、氧化铝和明胶组成，藻土、石英砂、氧化铝和明胶的质量比为4︰1︰1︰3；
3)将步骤2)中得到的所述固定酶载体用乙醇洗涤1-3次，干燥，即得到所述固定化处理后的精氨酸脱羧酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶与所述左旋精氨酸的质量比不超过0.05；所述磷酸吡哆醛与所述左旋精氨酸的质量比不超过0.002。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶与所述左旋精氨酸的质量比为1︰40；所述磷酸吡哆醛与所述左旋精氨酸的质量比为1︰1000。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱羧反应的反应温度为19-46℃；所述脱羧反应的反应体系的pH值为6-10。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当脱羧反应进行到1h以后，向所述脱羧反应补加左旋精氨酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当脱羧反应进行到第2h时，向所述脱羧反应补加左旋精氨酸，补加的左旋精氨酸的质量为初始所加的左旋精氨酸的质量的一半。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述硫酸胍基丁胺粗产物进行纯化，所述纯化步骤如下：
1)向所述硫酸胍基丁胺粗产物中加入活性炭，在40℃～60℃下放置1h～2h，再用孔径为0.45um的过滤膜抽滤，将抽滤后所得的溶液蒸发去除杂质，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
2)将步骤1)所得的所述硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体；
或者所述纯化步骤如下：
1)将乙腈、四氢呋喃、甲醇按体积比为2.5～3.5︰3.5～5︰1混合均匀，得到混合溶剂；
2)将所述硫酸胍基丁胺粗产物溶于步骤1)中的所述混合溶剂中，其中，所述硫酸胍基丁胺粗产物与所述混合溶剂的质量比为1︰8～13，抽滤，得到硫酸胍基丁胺粗晶体；
3)将步骤2)所得的所述硫酸胍基丁胺粗晶体用乙醇洗涤，过滤并干燥后，得到纯化的硫酸胍基丁胺晶体。
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