JP3864032B2 - 生物発光によりｒｎａを検出する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）を検出するための、特に、高等生物の細胞中に存在し、タンパク質合成に重要な関与をするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を検出するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日、高等生物の細胞中に存在し、タンパク質合成に関与するリボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡからの遺伝情報を他の細胞に伝達する仲介的役割をすることが知られている（広海啓太郎著，実験で学ぶ生化学，p205，化学同人，1987.7.10）。
【０００３】
細胞質内で合成されるタンパク質は、核のＤＮＡの塩基配列順序によって決定されることが明らかになっている。遺伝コード（暗号）は、コーディングトリプレット（暗号三重子）として知られる３個の重なり合わない塩基の組みがおのおのアミノ酸を規定するものである。そして、遺伝情報は、メッセンジャー（伝令）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）という仲介者的分子によって核からリボソーム上のタンパク質合成系へと伝達される。この分子は核のＤＮＡに相補的な塩基配列をもっており、コーディングトリプレットに対応するｍＲＮＡ上の３個の塩基の組はコドンとして知られており、ＤＮＡはまず、第１段階としては、ｍＲＮＡが合成されるための「鋳型」として働くのである。
【０００４】
上記のｍＲＮＡはリボソームに運ばれ、ｔＲＮＡの助けを借りて、特定タンパク質の合成に携わる。
【０００５】
このようなＲＮＡに対し、その組成を知ることで、人間の健康に関する分野(例えば、病気の診断や治療薬の開発)や、食品中のバクテリアの汚染を検出する分野（清浄度検査）等において応用範囲が広がってきており、最近の代謝・生合成系の分野で注目を浴びてきている。
【０００６】
ＲＮＡの組成を検出する技術は公知であり、例えば、酵母から遠心分離によりＲＮＡを単離し、紫外分光光度計（クロマトグラフィー）により吸収スペクトルを測定する方法や、ＲＮＡを加水分解した後、電気泳動により分離してヌクレオチドの吸収スペクトルを測定する方法はよく知られている。
【０００７】
また、特公平8-2320号公報の請求項１には、試料中の３’−末端ポリリボアデノシンセグメントを有するポリヌクレオチドの測定方法であって、以下の工程；（ａ）試料中の核酸を、無機ホスフェートの存在下、ポリヌクレオチドホスホリラーゼで消化して、３’−末端ポリリボアデノシンセグメントを、ＡＤＰを含有するリボヌクレオシドジホスフェートに転化し；（ｂ）消化工程（ａ）で生じたＡＤＰをホスホリル化してＡＴＰを製造し、；そして（Ｃ）ホスホリル化工程（ｂ）で生じたＡＴＰ又はホスホリル化工程の副生成物のどちらかを検出する、ことよりなる、ポリヌクレオチドの測定方法が開示してあり、また、請求項２では、３’−末端ポリリボアデノシンセグメントを有するポリヌクレオチドが、真核生物のｍＲＮＡであることを特徴とし、さらに、請求項９では、ＡＴＰの検出する工程で、ルシフェラーゼの存在化で、ルシフェリンと反応させて、生物発光反応を生ぜしめてＡＴＰ量を検出する技術が開示されている。
【０００８】
これにより、真核生物のｍＲＮＡの組成を、ＡＴＰによる生物発光により検出することが可能となり、また、ｍＲＮＡのＡＭＰ又はＡＤＰへの消化、ＡＤＰからＡＴＰへのホスホリル化により、各成分を定量することが可能になるものである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、真核生物のｍＲＮＡの組成を、ＡＴＰによる酵素反応で生物発光により検出する技術は、特公平8-2320号公報に開示されているが、この中で記載された生物発光の測定は、発光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失するという欠点を有しており、感度と精度を獲得するため、反応時間の厳密な制御と、短時間で消失する発光を捕らえるための特別なルミノメータの使用を必要とする問題点がある。
【００１０】
特開平11-69997号公報には、汚れの指標成分であるＡＴＰに加え、従来のルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬では測定が困難であったＡＤＰ、ＡＭＰ及びＲＮＡも同時に測定して、少ない汚れでも、感度よく検出して、精度よく清浄度を評価できる清浄度検査試薬及びこの試薬を用いる清浄度検査方法を提供するものである。
【００１１】
上記公報によるＲＮＡの測定は、ＲＮＡ分解酵素によりＲＮＡから５’−モノクレオチド（ＡＭＰ，ＧＭＰ，ＣＭＰ，ＵＭＰ）を生成し、これによりＲＮＡをＡＭＰに変換せしめ、次いで、ＡＭＰがＡＴＰに変換され、次いで、ＡＴＰがルシフェリン／ルシフェラーゼ反応により消費されて発光し、ＡＭＰが生成することが示されている。これにより、一連のＡＴＰ変換反応系において生成する発光は減衰することなく、高水準のまま、少なくとも１０分間にわたって安定となる。
【００１２】
上記特開平11-69997号公報に開示される検査試薬及び検査方法は、ＡＭＰをＡＴＰに変換する再生系において、触媒となる酵素にピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸及びピルビン酸を用いたものである。しかしながら、以下の構造式で示されるホスホエノールピルビン酸は、１分子にリン酸基（ PO ３基）が１個しか含まれておらず、ＡＭＰからＡＴＰへの変換が不十分となり、ＡＴＰを多量に再生するにはホスホエノールピルビン酸を多量に補給しなければならなかった。このようにホスホエノールピルビン酸を多量に補給するのは、不経済であった。
【化１】
【００１３】
また、ホスホエノールピルビン酸は熱に非常に弱く分解されやすい性質があり、炊飯工場などで炊き上がったばかりのご飯を被検査物とする場合（例えば、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対し、耐熱性の酵素を用いて測定するとよい。）、ホスホエノールピルビン酸を含む試薬を被検査物に投与すると、リン酸基が分解されてＡＭＰからＡＴＰへの変換が不十分となることがある。つまり、ＡＴＰによる蛍光発光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失する虞（おそれ）がある。
【００１４】
さらに、被検査物中には、複数種類の細菌が存在する場合もあり、この細菌中にホスホエノールピルビン酸を分解する酵素が存在すると、リン酸基が補給されず、ＡＭＰからＡＴＰへの変換が不十分となる虞がある。
【００１５】
本発明は、上記問題点にかんがみ、ホスホエノールピルビン酸のようなリン化物が少なく、耐熱性に問題のある物質を使うのではなく、新規な物質を使って生物発光強度の増加及び発光時間を安定に持続させる生物発光によりＲＮＡを検出する方法を提供することを技術的課題とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決するため本発明は、以下の工程によりＲＮＡを生物発光により検出する。即ち、（１）試料中のＲＮＡをＲＮＡ分解酵素により分解し、モノヌクレオチドを得る第１工程、（２）該第１工程によって得られたモノヌクレオチドのうちのＡＭＰを、リン酸基転移酵素であるAPP（AMP-polyPホスホトランスフェラーゼ）の存在下で、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であってリン酸基数 n が１０〜１００個直鎖状に重合したポリリン酸（ poly Ｐ n ； n ＝１０〜１００）又はバクテリア由来のポリリン酸化合物であってリン酸基数 n が１０〜１０００個直鎖状に重合したポリリン酸（ poly Ｐ n ； n ＝１０〜１０００）と反応させてＡＤＰ（アデノシン二リン酸）を生成させる第２工程、（３）該第２工程で得られたＡＤＰを、PPK（ポリリン酸キナーゼ）の存在下で前記ポリリン酸と反応させてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を生成させる工程、（４）該第３工程によって得られたＡＴＰをルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させて発光させる第４工程、及び（５）該第４工程により生成した発光量を測定することにより前記ＲＮＡ中のＡＭＰを定量する第５工程とからなるものである。
【００１７】
これにより、第１工程で試料中のＲＮＡを単離し、得られたヌクレオチドのうちのＡＭＰを、第２工程でＡＤＰに変換し、次いで、第３工程でＡＤＰからＡＴＰに変換せしめるが、このとき、ポリリン酸及びポリリン酸合成酵素であるＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）を添加しているので、ＡＭＰからＡＤＰを経てＡＴＰへの変換が十分に行われる。また生物発光で生じたＡＭＰが同反応により再びＡＴＰまで再生される。つまり、生物発光の発光量を減衰することなく、安定に持続させることができ、安価でかつ構造が簡単なルミノメータによりＲＮＡ中のＡＭＰを検出することが可能となる。
【００１８】
また、前記ポリリン酸が、化学合成により生成されたポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリン酸基（ PO ３基）が少なくとも１０〜１００個含まれているので、ＡＭＰからＡＤＰを経てＡＴＰへの変換が十分に行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり経済的となる。
【００１９】
そして、前記ポリリン酸が、バクテリア由来のポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００２０】
さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ）の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を説明する。まず、試料中のＲＮＡを単離する方法は公知の方法で行なうとよい。例えば、加水分解、遠心分離、電気泳動のいずれか又は組み合わせによりＲＮＡを単離する方法を以下に述べる。
【００２２】
細胞からＲＮＡを単離するには遠心分離を用いるとよい。例えば、酵母の全ＲＮＡの抽出は細胞の摩砕物をフェノールで処理して巨大分子の水素結合を切り、タンパク質の変性を起こす。不透明な懸濁液を遠心分離にかけると２相に分かれ、下側のフェノールの相はＤＮＡを含み、上側の水相は炭水化物とＲＮＡを含む。変性したタンパク質はさらに遠心分離によって除き、次に、ＲＮＡをアルコールで沈殿させ、得られた生成物はＤＮＡは含まないが、多糖類を夾雑しており、それ以上の精製はアミラーゼで処理することによって行なう。
【００２３】
ＲＮＡを構成塩基に分解するには、加水分解するとよい。すなわち、ＲＮＡのペプチド結合を分解するためＲＮＡ分解酵素で処理し、５’-モノヌクレオチド（ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰ）に加水分解される。ＲＮＡ分解酵素としては公知のものを用いるとよく、例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いる。
【００２４】
従来は、このようにして生成した塩基を、ペーパークロマトグラフィーにより分離し、紫外線で検出したり、ｐＨ３．５のクエン酸緩衝液中では構成塩基が各々全く異なる電荷をもつので、電気泳動によって分けたり、さらに、強酸性のイオン交換カラムで分離し、その特性的な紫外吸収スペクトルを用いて同定していた。
【００２５】
本発明では、ＲＮＡをＲＮＡ分解酵素により加水分解して構成塩基に分解し、得られた５’ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰのヌクレオチドのうち、５’ＡＭＰについて、これをＡＤＰに変換し、次いで、ＡＴＰに変換し、ＡＴＰをルシフェラーゼ存在下でルシフェリンと反応させて取り出したＡＭＰ量を推定するのである。
【化２】
【００２６】
上記反応式は、本発明における各工程を示す反応模式図であり、同反応式においてＡＭＰからＡＴＰへの変換は、リン酸基転移酵素であるＡＰＰ（ AMP-polyP ホスホトランスフェラーゼ）の存在下でＡＭＰをポリリン酸化合物（polyPn）と反応させてＡＤＰに変換せしめる反応（３）と、このＡＤＰを、ＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）の存在下でポリリン酸化合物（ polyP n-1 ）と反応させて、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPn-2）に変換せしめる反応（４）とからなる。また、ＡＴＰのルシフェリン／ルシフェラーゼ反応は、（１）のようにルシフェラーゼ、溶存酸素（図示せず）及び酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムイオンなど金属イオン（図示せず）の存在下でＡＴＰとルシフェリンとを反応させると、ＡＭＰ、ピロリン酸、オキシルシフェリン、炭酸ガス（図示せず）及び発光を生成する反応（２）が行われ、このルシフェリン／ルシフェラーゼ反応により発生する光を測定することで、ＡＴＰ量を検出することができ、これにより、ＡＴＰ変換前のＡＭＰ量を推定することができる。
【００２７】
この反応の要点について以下に述べる。まず、ＲＮＡから加水分解により取り出した５’ＡＭＰが反応（３）によりＡＤＰに変換された後、反応（４）でＡＤＰがＡＴＰに変換される。そして、このＡＴＰが反応（１）に供され、ＡＴＰが消費されて発光する。以下、ＡＴＰの消費系となる反応（１）（２）と、ＡＴＰへの変換系となる反応（３）（４）（５）とが連続的に繰り返し行われる。この発光は、ポリリン酸化合物のリン酸基（ＰＯ３基）の量に依存して生物発光の光量の増強効果を得るとともに、発光時間を持続させることができ、１０分間以上にわたって安定であり、１時間以上経過後も殆ど減衰することなく安定であることが確認されている。
【００２８】
ところで、前記ＡＭＰからＡＤＰに変換する反応（３）においては、リン酸基転移酵素であるＡＰＰ（ AMP − polyP ホスホトランスフェラーゼ）の存在下で、前記ＡＭＰをポリリン酸化合物（ polyP n ）と反応させると、ポリリン酸化合物からリン酸基が１個消費されて、ＡＤＰ及びリン酸基が１つ減少したポリリン酸化合物（polyPn-1）に変換される。そして、前記ＡＤＰからＡＴＰに変換する反応（４）においては、ＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）の存在下で前記ＡＤＰをポリリン酸化合物（polyPn −１）と反応させると、ポリリン酸化合物（polyPn-1）からリン酸基がさらに１個消費されて、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPn- ２）に変換される。このとき、ポリリン酸化合物としては、少なくとも１０以上のリン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合したものでなければ、反応に寄与しない。
【００２９】
つまり、ポリリン酸化合物（polyPn）として１０≦ｎ≦１００のものを用いると、１分子中にリン酸基（ＰＯ３基）が少なくとも１０〜１００個含まれているから、ＡＭＰからＡＤＰへの変換、及びＡＤＰからＡＴＰへの変換の際に、リン酸基（ＰＯ３基）が不足することがなく変換がスムーズに行われる。このため、変換系においては、リン酸基（ＰＯ ３基）の供給が少量でよく、経済的になる。
【００３０】
さらに、ポリリン酸化合物が熱にさらされた場合であっても、リン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そして、リン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合しているため、細菌中に存在する酵素であっても分解されにくい。
【００３１】
例えば、本発明で用いられるポリリン酸化合物（polyPn）は、以下の構造式によって表される。ここで（polyPn）は１０≦ｎ≦１００の範囲が好ましい。
【化３】
【００３２】
前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、１０〜１０００個のリン酸基（ＰＯ３基）が重合しているので、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００３３】
ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。例えば、以下の反応式に示すようにポリリン酸化合物を、ＡＴＰから生合成する。
【化４】
【００３４】
上記反応式によるポリリン酸化合物の生合成は、例えば、特開平5-153993号公報などに開示された従来のポリリン酸の製造方法を利用すればよい。本実施形態では、ポリリン酸合成酵素を触媒として、ポリリン酸合成酵素とＡＴＰと酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムなどの金属イオンとを反応させ、ポリリン酸化合物を生合成する。本実施形態に使用されるポリリン酸合成酵素はポリリン酸化合物を生合成し得るものであればよい。
【００３５】
【実施例１】
酵母からのＲＮＡの単離
試薬と器具
１．乾燥酵母200g
２．フェノール溶液（900g/l）1l
３．酢酸カリウム（200g/l,pH5）200mg
４．純エタノール3l
５．ジエチルエーテル500mg
６．37℃の恒温槽5台
方法
予め37℃に加温しておいた水120ml中に、30gの乾燥酵母を懸濁させる。この温度に15分間保ち、160mlの濃フェノール溶液を加える。懸濁液を室温で30分間機械的に攪拌した後、エマルジョンを破壊するため、冷所で15分間、3000Gで遠心分離する。上部の水層を駒込ピペットで注意深く取り、10000Gで5分間、冷却遠心器で遠心分離し、変性したタンパク質を沈降させる。上澄液に酢酸カリウムを最終濃度20g/lとなるように加え、2倍量のエタノールを加えてＲＮＡを沈殿させる。溶液を氷中で冷却し、１時間放置した後、冷所で2000Gで5分間遠心分離して沈殿を集める。このＲＮＡをエタノール水溶液、エタノール、そして最後にエーテルで洗浄し、空気中で乾かすと、酵母の乾燥重量の約４％のＲＮＡを単離することができた。
【００３６】
【実施例２】
ＲＮＡ分解によるヌクレオチドの生成
試薬と器具
１．市販のｔＲＮＡ2μｌ
２．付属緩衝液（buffer）1μｌ
３．蒸留水6.5μｌ
４．ヌクレアーゼＳ１0.5μｌ
方法
市販のｔＲＮＡ 2μｌを、付属緩衝液 1μｌ、蒸留水 6.5μｌ、ヌクレアーゼＳ１ 0.5μｌに溶かし、37℃で10分間インキュベートした。そして、生じた5’-モノヌクレオチドうち、ＡＭＰを以下の反応によりＡＴＰに変換し、生物発光測定にて測定する。
【００３７】
【実施例３】
生物発光測定によるＡＭＰヌクレオチドの同定
試薬
１．ポリリン酸キナーゼ緩衝液（ＰＰＫbuffer）３μｌ
２．0.1mM（濃度）アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）３μｌ
３．30 mM（濃度）ポリリン酸化合物（PolyP）３μｌ
４．イオン交換水１９μｌ
５．ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）１μｌ
６．AMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＰ）１μｌ
方法
上記１．〜６．の試薬を、温度３０℃の条件でインキュベートし、反応後５分、１５分、６０分に１０μｌずつサンプリングを行った。そして、１０μｌルシフェリン及び５μｌルシフェラーゼを添加済みの測定用ウェルに全量を添加し、生成する発光量をルミノメータ（ＡＲＶＯ社製）にて測定した。
【００３８】
発光量からそれぞれの経過時間におけるＡＴＰ容量を知ることができ、これを図１に示す。これにより、反応後５分、１５分、６０分と時間を経るとともにＡＴＰ容量が増加していることが分かる。この実験からポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）及びＡＰＰ (AMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ）の２つの酵素によりＡＭＰからＡＴＰを生成することができることが示された。従って、これらの反応はＡＴＰ変換系として使うことが可能であるとともに、ＡＭＰを生物発光により検出し、ＲＮＡ構成ヌクレオチドのＡＭＰを同定することができる。
【００３９】
【実施例４】
生物発光測定によるＲＮＡの検出
試薬
１．ポリリン酸キナーゼ緩衝液（ＰＰＫbuffer）４μｌ
２．実施例２で生じるＲＮＡの分解物２μｌ
３．30 mM（濃度）ポリリン酸化合物（PolyP）２μｌ
４．イオン交換水７μｌ
５．ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）２μｌ
６．AMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＰ）３μｌ
方法
上記１．〜６．の試薬を、温度３０℃の条件でインキュベートし、６０分反応後、１０μｌルシフェリン及び５μｌルシフェラーゼを添加済みの測定用ウェルに全量を添加し、生成する発光量をルミノメータ（ＡＲＶＯ社製）にて測定した。
【００４０】
発光量を図２の最上段に示す。対照として、ヌクレアーゼによる分解に供していないＲＮＡサンプルを試薬２のかわりに添加したもの（図２、２段目）、ならびにＲＮＡを添加せず、ヌクレアーゼだけの試料を添加したもの（図２、３段目）を用いた。これにより、ＲＮＡが分解されることが生物発光するために必要であることがわかる。すなわちＲＮＡの分解によってＡＭＰが生じることが必要であることがわかる。また純粋なＡＭＰを試料とした場合、ＡＴＰが生成し、生物発光した（図２、４段目）。また実施例２で生じるＲＮＡの分解物を添加するが、ＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）、ＡＰＰ（AMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ）を添加しないものを図２、５段目に示す。この場合、ＡＭＰからＡＴＰが生成しないので、生物発光しない。これらのことから、ＲＮＡの構成ヌクレオチドであるＡＭＰをＡＴＰまで生成させ、生物発光させることにより、ＲＮＡを検出することができる。ＲＮＡの検出感度は生物発光によるＡＴＰの検出感度に依存するので、その検出感度は非常に高い。
【００４１】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、試料中のＲＮＡを単離し、得られたヌクレオチドのうちのＡＭＰを、リン酸基転移酵素であるＡＰＰ（ AMP − polyP ホスホトランスフェラーゼ）の存在下でポリリン酸と反応させてＡＤＰに変換せしめ、次いで、生じたＡＤＰをポリリン酸合成酵素であるＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）の存在下でポリリン酸と反応させてＡＴＰに変換せしめる。該ＡＴＰをルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させ、生成した発光量を測定することにより、ＲＮＡ中のＡＭＰを定量する。また生物発光反応により生じるＡＭＰを、上記反応によりＡＤＰに変換し、次いで、ＡＤＰからＡＴＰに変換するので、生物発光の発光量を減衰することなく安定に持続させ、安価でかつ構造が簡単なルミノメータによりＲＮＡ中のＡＭＰを検出することが可能となる。
【００４２】
また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリン酸基が少なくとも１０〜１００個含まれているので、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が容易に行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり経済的になる。
【００４３】
そして、前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００４４】
さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＴＰ変換の経過時間におけるＡＴＰ容量変化を示す図である。
【図２】ＲＮＡの生物発光による検出の比較図である。
【発明が属する技術分野】
本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）を検出するための、特に、高等生物の細胞中に存在し、タンパク質合成に重要な関与をするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を検出するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日、高等生物の細胞中に存在し、タンパク質合成に関与するリボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡからの遺伝情報を他の細胞に伝達する仲介的役割をすることが知られている（広海啓太郎著，実験で学ぶ生化学，p205，化学同人，1987.7.10）。
【０００３】
細胞質内で合成されるタンパク質は、核のＤＮＡの塩基配列順序によって決定されることが明らかになっている。遺伝コード（暗号）は、コーディングトリプレット（暗号三重子）として知られる３個の重なり合わない塩基の組みがおのおのアミノ酸を規定するものである。そして、遺伝情報は、メッセンジャー（伝令）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）という仲介者的分子によって核からリボソーム上のタンパク質合成系へと伝達される。この分子は核のＤＮＡに相補的な塩基配列をもっており、コーディングトリプレットに対応するｍＲＮＡ上の３個の塩基の組はコドンとして知られており、ＤＮＡはまず、第１段階としては、ｍＲＮＡが合成されるための「鋳型」として働くのである。
【０００４】
上記のｍＲＮＡはリボソームに運ばれ、ｔＲＮＡの助けを借りて、特定タンパク質の合成に携わる。
【０００５】
このようなＲＮＡに対し、その組成を知ることで、人間の健康に関する分野(例えば、病気の診断や治療薬の開発)や、食品中のバクテリアの汚染を検出する分野（清浄度検査）等において応用範囲が広がってきており、最近の代謝・生合成系の分野で注目を浴びてきている。
【０００６】
ＲＮＡの組成を検出する技術は公知であり、例えば、酵母から遠心分離によりＲＮＡを単離し、紫外分光光度計（クロマトグラフィー）により吸収スペクトルを測定する方法や、ＲＮＡを加水分解した後、電気泳動により分離してヌクレオチドの吸収スペクトルを測定する方法はよく知られている。
【０００７】
また、特公平8-2320号公報の請求項１には、試料中の３’−末端ポリリボアデノシンセグメントを有するポリヌクレオチドの測定方法であって、以下の工程；（ａ）試料中の核酸を、無機ホスフェートの存在下、ポリヌクレオチドホスホリラーゼで消化して、３’−末端ポリリボアデノシンセグメントを、ＡＤＰを含有するリボヌクレオシドジホスフェートに転化し；（ｂ）消化工程（ａ）で生じたＡＤＰをホスホリル化してＡＴＰを製造し、；そして（Ｃ）ホスホリル化工程（ｂ）で生じたＡＴＰ又はホスホリル化工程の副生成物のどちらかを検出する、ことよりなる、ポリヌクレオチドの測定方法が開示してあり、また、請求項２では、３’−末端ポリリボアデノシンセグメントを有するポリヌクレオチドが、真核生物のｍＲＮＡであることを特徴とし、さらに、請求項９では、ＡＴＰの検出する工程で、ルシフェラーゼの存在化で、ルシフェリンと反応させて、生物発光反応を生ぜしめてＡＴＰ量を検出する技術が開示されている。
【０００８】
これにより、真核生物のｍＲＮＡの組成を、ＡＴＰによる生物発光により検出することが可能となり、また、ｍＲＮＡのＡＭＰ又はＡＤＰへの消化、ＡＤＰからＡＴＰへのホスホリル化により、各成分を定量することが可能になるものである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、真核生物のｍＲＮＡの組成を、ＡＴＰによる酵素反応で生物発光により検出する技術は、特公平8-2320号公報に開示されているが、この中で記載された生物発光の測定は、発光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失するという欠点を有しており、感度と精度を獲得するため、反応時間の厳密な制御と、短時間で消失する発光を捕らえるための特別なルミノメータの使用を必要とする問題点がある。
【００１０】
特開平11-69997号公報には、汚れの指標成分であるＡＴＰに加え、従来のルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬では測定が困難であったＡＤＰ、ＡＭＰ及びＲＮＡも同時に測定して、少ない汚れでも、感度よく検出して、精度よく清浄度を評価できる清浄度検査試薬及びこの試薬を用いる清浄度検査方法を提供するものである。
【００１１】
上記公報によるＲＮＡの測定は、ＲＮＡ分解酵素によりＲＮＡから５’−モノクレオチド（ＡＭＰ，ＧＭＰ，ＣＭＰ，ＵＭＰ）を生成し、これによりＲＮＡをＡＭＰに変換せしめ、次いで、ＡＭＰがＡＴＰに変換され、次いで、ＡＴＰがルシフェリン／ルシフェラーゼ反応により消費されて発光し、ＡＭＰが生成することが示されている。これにより、一連のＡＴＰ変換反応系において生成する発光は減衰することなく、高水準のまま、少なくとも１０分間にわたって安定となる。
【００１２】
上記特開平11-69997号公報に開示される検査試薬及び検査方法は、ＡＭＰをＡＴＰに変換する再生系において、触媒となる酵素にピルベートオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸及びピルビン酸を用いたものである。しかしながら、以下の構造式で示されるホスホエノールピルビン酸は、１分子にリン酸基（ PO ３基）が１個しか含まれておらず、ＡＭＰからＡＴＰへの変換が不十分となり、ＡＴＰを多量に再生するにはホスホエノールピルビン酸を多量に補給しなければならなかった。このようにホスホエノールピルビン酸を多量に補給するのは、不経済であった。
【化１】
また、ホスホエノールピルビン酸は熱に非常に弱く分解されやすい性質があり、炊飯工場などで炊き上がったばかりのご飯を被検査物とする場合（例えば、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対し、耐熱性の酵素を用いて測定するとよい。）、ホスホエノールピルビン酸を含む試薬を被検査物に投与すると、リン酸基が分解されてＡＭＰからＡＴＰへの変換が不十分となることがある。つまり、ＡＴＰによる蛍光発光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失する虞（おそれ）がある。
【００１４】
さらに、被検査物中には、複数種類の細菌が存在する場合もあり、この細菌中にホスホエノールピルビン酸を分解する酵素が存在すると、リン酸基が補給されず、ＡＭＰからＡＴＰへの変換が不十分となる虞がある。
【００１５】
本発明は、上記問題点にかんがみ、ホスホエノールピルビン酸のようなリン化物が少なく、耐熱性に問題のある物質を使うのではなく、新規な物質を使って生物発光強度の増加及び発光時間を安定に持続させる生物発光によりＲＮＡを検出する方法を提供することを技術的課題とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決するため本発明は、以下の工程によりＲＮＡを生物発光により検出する。即ち、（１）試料中のＲＮＡをＲＮＡ分解酵素により分解し、モノヌクレオチドを得る第１工程、（２）該第１工程によって得られたモノヌクレオチドのうちのＡＭＰを、リン酸基転移酵素であるAPP（AMP-polyPホスホトランスフェラーゼ）の存在下で、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であってリン酸基数 n が１０〜１００個直鎖状に重合したポリリン酸（ poly Ｐ n ； n ＝１０〜１００）又はバクテリア由来のポリリン酸化合物であってリン酸基数 n が１０〜１０００個直鎖状に重合したポリリン酸（ poly Ｐ n ； n ＝１０〜１０００）と反応させてＡＤＰ（アデノシン二リン酸）を生成させる第２工程、（３）該第２工程で得られたＡＤＰを、PPK（ポリリン酸キナーゼ）の存在下で前記ポリリン酸と反応させてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を生成させる工程、（４）該第３工程によって得られたＡＴＰをルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させて発光させる第４工程、及び（５）該第４工程により生成した発光量を測定することにより前記ＲＮＡ中のＡＭＰを定量する第５工程とからなるものである。
【００１７】
これにより、第１工程で試料中のＲＮＡを単離し、得られたヌクレオチドのうちのＡＭＰを、第２工程でＡＤＰに変換し、次いで、第３工程でＡＤＰからＡＴＰに変換せしめるが、このとき、ポリリン酸及びポリリン酸合成酵素であるＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）を添加しているので、ＡＭＰからＡＤＰを経てＡＴＰへの変換が十分に行われる。また生物発光で生じたＡＭＰが同反応により再びＡＴＰまで再生される。つまり、生物発光の発光量を減衰することなく、安定に持続させることができ、安価でかつ構造が簡単なルミノメータによりＲＮＡ中のＡＭＰを検出することが可能となる。
【００１８】
また、前記ポリリン酸が、化学合成により生成されたポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリン酸基（ PO ３基）が少なくとも１０〜１００個含まれているので、ＡＭＰからＡＤＰを経てＡＴＰへの変換が十分に行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり経済的となる。
【００１９】
そして、前記ポリリン酸が、バクテリア由来のポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００２０】
さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ）の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を説明する。まず、試料中のＲＮＡを単離する方法は公知の方法で行なうとよい。例えば、加水分解、遠心分離、電気泳動のいずれか又は組み合わせによりＲＮＡを単離する方法を以下に述べる。
【００２２】
細胞からＲＮＡを単離するには遠心分離を用いるとよい。例えば、酵母の全ＲＮＡの抽出は細胞の摩砕物をフェノールで処理して巨大分子の水素結合を切り、タンパク質の変性を起こす。不透明な懸濁液を遠心分離にかけると２相に分かれ、下側のフェノールの相はＤＮＡを含み、上側の水相は炭水化物とＲＮＡを含む。変性したタンパク質はさらに遠心分離によって除き、次に、ＲＮＡをアルコールで沈殿させ、得られた生成物はＤＮＡは含まないが、多糖類を夾雑しており、それ以上の精製はアミラーゼで処理することによって行なう。
【００２３】
ＲＮＡを構成塩基に分解するには、加水分解するとよい。すなわち、ＲＮＡのペプチド結合を分解するためＲＮＡ分解酵素で処理し、５’-モノヌクレオチド（ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰ）に加水分解される。ＲＮＡ分解酵素としては公知のものを用いるとよく、例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いる。
【００２４】
従来は、このようにして生成した塩基を、ペーパークロマトグラフィーにより分離し、紫外線で検出したり、ｐＨ３．５のクエン酸緩衝液中では構成塩基が各々全く異なる電荷をもつので、電気泳動によって分けたり、さらに、強酸性のイオン交換カラムで分離し、その特性的な紫外吸収スペクトルを用いて同定していた。
【００２５】
本発明では、ＲＮＡをＲＮＡ分解酵素により加水分解して構成塩基に分解し、得られた５’ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰのヌクレオチドのうち、５’ＡＭＰについて、これをＡＤＰに変換し、次いで、ＡＴＰに変換し、ＡＴＰをルシフェラーゼ存在下でルシフェリンと反応させて取り出したＡＭＰ量を推定するのである。
【化２】
上記反応式は、本発明における各工程を示す反応模式図であり、同反応式においてＡＭＰからＡＴＰへの変換は、リン酸基転移酵素であるＡＰＰ（ AMP-polyP ホスホトランスフェラーゼ）の存在下でＡＭＰをポリリン酸化合物（polyPn）と反応させてＡＤＰに変換せしめる反応（３）と、このＡＤＰを、ＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）の存在下でポリリン酸化合物（ polyP n-1 ）と反応させて、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPn-2）に変換せしめる反応（４）とからなる。また、ＡＴＰのルシフェリン／ルシフェラーゼ反応は、（１）のようにルシフェラーゼ、溶存酸素（図示せず）及び酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムイオンなど金属イオン（図示せず）の存在下でＡＴＰとルシフェリンとを反応させると、ＡＭＰ、ピロリン酸、オキシルシフェリン、炭酸ガス（図示せず）及び発光を生成する反応（２）が行われ、このルシフェリン／ルシフェラーゼ反応により発生する光を測定することで、ＡＴＰ量を検出することができ、これにより、ＡＴＰ変換前のＡＭＰ量を推定することができる。
【００２７】
この反応の要点について以下に述べる。まず、ＲＮＡから加水分解により取り出した５’ＡＭＰが反応（３）によりＡＤＰに変換された後、反応（４）でＡＤＰがＡＴＰに変換される。そして、このＡＴＰが反応（１）に供され、ＡＴＰが消費されて発光する。以下、ＡＴＰの消費系となる反応（１）（２）と、ＡＴＰへの変換系となる反応（３）（４）（５）とが連続的に繰り返し行われる。この発光は、ポリリン酸化合物のリン酸基（ＰＯ３基）の量に依存して生物発光の光量の増強効果を得るとともに、発光時間を持続させることができ、１０分間以上にわたって安定であり、１時間以上経過後も殆ど減衰することなく安定であることが確認されている。
【００２８】
ところで、前記ＡＭＰからＡＤＰに変換する反応（３）においては、リン酸基転移酵素であるＡＰＰ（ AMP − polyP ホスホトランスフェラーゼ）の存在下で、前記ＡＭＰをポリリン酸化合物（ polyP n ）と反応させると、ポリリン酸化合物からリン酸基が１個消費されて、ＡＤＰ及びリン酸基が１つ減少したポリリン酸化合物（polyPn-1）に変換される。そして、前記ＡＤＰからＡＴＰに変換する反応（４）においては、ＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）の存在下で前記ＡＤＰをポリリン酸化合物（polyPn −１）と反応させると、ポリリン酸化合物（polyPn-1）からリン酸基がさらに１個消費されて、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPn- ２）に変換される。このとき、ポリリン酸化合物としては、少なくとも１０以上のリン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合したものでなければ、反応に寄与しない。
【００２９】
つまり、ポリリン酸化合物（polyPn）として１０≦ｎ≦１００のものを用いると、１分子中にリン酸基（ＰＯ３基）が少なくとも１０〜１００個含まれているから、ＡＭＰからＡＤＰへの変換、及びＡＤＰからＡＴＰへの変換の際に、リン酸基（ＰＯ３基）が不足することがなく変換がスムーズに行われる。このため、変換系においては、リン酸基（ＰＯ ３基）の供給が少量でよく、経済的になる。
【００３０】
さらに、ポリリン酸化合物が熱にさらされた場合であっても、リン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そして、リン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合しているため、細菌中に存在する酵素であっても分解されにくい。
【００３１】
例えば、本発明で用いられるポリリン酸化合物（polyPn）は、以下の構造式によって表される。ここで（polyPn）は１０≦ｎ≦１００の範囲が好ましい。
【化３】
前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、１０〜１０００個のリン酸基（ＰＯ３基）が重合しているので、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００３３】
ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。例えば、以下の反応式に示すようにポリリン酸化合物を、ＡＴＰから生合成する。
【化４】
上記反応式によるポリリン酸化合物の生合成は、例えば、特開平5-153993号公報などに開示された従来のポリリン酸の製造方法を利用すればよい。本実施形態では、ポリリン酸合成酵素を触媒として、ポリリン酸合成酵素とＡＴＰと酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムなどの金属イオンとを反応させ、ポリリン酸化合物を生合成する。本実施形態に使用されるポリリン酸合成酵素はポリリン酸化合物を生合成し得るものであればよい。
【００３５】
【実施例１】
酵母からのＲＮＡの単離
試薬と器具
１．乾燥酵母200g
２．フェノール溶液（900g/l）1l
３．酢酸カリウム（200g/l,pH5）200mg
４．純エタノール3l
５．ジエチルエーテル500mg
６．37℃の恒温槽5台
方法
予め37℃に加温しておいた水120ml中に、30gの乾燥酵母を懸濁させる。この温度に15分間保ち、160mlの濃フェノール溶液を加える。懸濁液を室温で30分間機械的に攪拌した後、エマルジョンを破壊するため、冷所で15分間、3000Gで遠心分離する。上部の水層を駒込ピペットで注意深く取り、10000Gで5分間、冷却遠心器で遠心分離し、変性したタンパク質を沈降させる。上澄液に酢酸カリウムを最終濃度20g/lとなるように加え、2倍量のエタノールを加えてＲＮＡを沈殿させる。溶液を氷中で冷却し、１時間放置した後、冷所で2000Gで5分間遠心分離して沈殿を集める。このＲＮＡをエタノール水溶液、エタノール、そして最後にエーテルで洗浄し、空気中で乾かすと、酵母の乾燥重量の約４％のＲＮＡを単離することができた。
【００３６】
【実施例２】
ＲＮＡ分解によるヌクレオチドの生成
試薬と器具
１．市販のｔＲＮＡ2μｌ
２．付属緩衝液（buffer）1μｌ
３．蒸留水6.5μｌ
４．ヌクレアーゼＳ１0.5μｌ
方法
市販のｔＲＮＡ 2μｌを、付属緩衝液 1μｌ、蒸留水 6.5μｌ、ヌクレアーゼＳ１ 0.5μｌに溶かし、37℃で10分間インキュベートした。そして、生じた5’-モノヌクレオチドうち、ＡＭＰを以下の反応によりＡＴＰに変換し、生物発光測定にて測定する。
【００３７】
【実施例３】
生物発光測定によるＡＭＰヌクレオチドの同定
試薬
１．ポリリン酸キナーゼ緩衝液（ＰＰＫbuffer）３μｌ
２．0.1mM（濃度）アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）３μｌ
３．30 mM（濃度）ポリリン酸化合物（PolyP）３μｌ
４．イオン交換水１９μｌ
５．ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）１μｌ
６．AMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＰ）１μｌ
方法
上記１．〜６．の試薬を、温度３０℃の条件でインキュベートし、反応後５分、１５分、６０分に１０μｌずつサンプリングを行った。そして、１０μｌルシフェリン及び５μｌルシフェラーゼを添加済みの測定用ウェルに全量を添加し、生成する発光量をルミノメータ（ＡＲＶＯ社製）にて測定した。
【００３８】
発光量からそれぞれの経過時間におけるＡＴＰ容量を知ることができ、これを図１に示す。これにより、反応後５分、１５分、６０分と時間を経るとともにＡＴＰ容量が増加していることが分かる。この実験からポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）及びＡＰＰ (AMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ）の２つの酵素によりＡＭＰからＡＴＰを生成することができることが示された。従って、これらの反応はＡＴＰ変換系として使うことが可能であるとともに、ＡＭＰを生物発光により検出し、ＲＮＡ構成ヌクレオチドのＡＭＰを同定することができる。
【００３９】
【実施例４】
生物発光測定によるＲＮＡの検出
試薬
１．ポリリン酸キナーゼ緩衝液（ＰＰＫbuffer）４μｌ
２．実施例２で生じるＲＮＡの分解物２μｌ
３．30 mM（濃度）ポリリン酸化合物（PolyP）２μｌ
４．イオン交換水７μｌ
５．ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）２μｌ
６．AMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＰ）３μｌ
方法
上記１．〜６．の試薬を、温度３０℃の条件でインキュベートし、６０分反応後、１０μｌルシフェリン及び５μｌルシフェラーゼを添加済みの測定用ウェルに全量を添加し、生成する発光量をルミノメータ（ＡＲＶＯ社製）にて測定した。
【００４０】
発光量を図２の最上段に示す。対照として、ヌクレアーゼによる分解に供していないＲＮＡサンプルを試薬２のかわりに添加したもの（図２、２段目）、ならびにＲＮＡを添加せず、ヌクレアーゼだけの試料を添加したもの（図２、３段目）を用いた。これにより、ＲＮＡが分解されることが生物発光するために必要であることがわかる。すなわちＲＮＡの分解によってＡＭＰが生じることが必要であることがわかる。また純粋なＡＭＰを試料とした場合、ＡＴＰが生成し、生物発光した（図２、４段目）。また実施例２で生じるＲＮＡの分解物を添加するが、ＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）、ＡＰＰ（AMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ）を添加しないものを図２、５段目に示す。この場合、ＡＭＰからＡＴＰが生成しないので、生物発光しない。これらのことから、ＲＮＡの構成ヌクレオチドであるＡＭＰをＡＴＰまで生成させ、生物発光させることにより、ＲＮＡを検出することができる。ＲＮＡの検出感度は生物発光によるＡＴＰの検出感度に依存するので、その検出感度は非常に高い。
【００４１】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、試料中のＲＮＡを単離し、得られたヌクレオチドのうちのＡＭＰを、リン酸基転移酵素であるＡＰＰ（ AMP − polyP ホスホトランスフェラーゼ）の存在下でポリリン酸と反応させてＡＤＰに変換せしめ、次いで、生じたＡＤＰをポリリン酸合成酵素であるＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）の存在下でポリリン酸と反応させてＡＴＰに変換せしめる。該ＡＴＰをルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させ、生成した発光量を測定することにより、ＲＮＡ中のＡＭＰを定量する。また生物発光反応により生じるＡＭＰを、上記反応によりＡＤＰに変換し、次いで、ＡＤＰからＡＴＰに変換するので、生物発光の発光量を減衰することなく安定に持続させ、安価でかつ構造が簡単なルミノメータによりＲＮＡ中のＡＭＰを検出することが可能となる。
【００４２】
また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリン酸基が少なくとも１０〜１００個含まれているので、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が容易に行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり経済的になる。
【００４３】
そして、前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００４４】
さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＴＰ変換の経過時間におけるＡＴＰ容量変化を示す図である。
【図２】ＲＮＡの生物発光による検出の比較図である。
Claims (1)
- 生物発光によりＲＮＡを検出する方法であって、以下の工程を有することを特徴とするＲＮＡの検出方法。
(1)試料中のＲＮＡをＲＮＡ分解酵素により分解し、モノヌクレオチドを得る第１工程
(2)該第１工程によって得られたモノヌクレオチドのうちのＡＭＰを、リン酸基転移酵素であるAPP（AMP-polyPホスホトランスフェラーゼ）の存在下で、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であってリン酸基数 n が１０〜１００個直鎖状に重合したポリリン酸（ poly Ｐ n ； n ＝１０〜１００）又はバクテリア由来のポリリン酸化合物であってリン酸基数 n が１０〜１０００個直鎖状に重合したポリリン酸（ poly Ｐ n ； n ＝１０〜１０００）と反応させてＡＤＰ（アデノシン二リン酸）を生成させる第２工程
(3)該第２工程で得られたＡＤＰを、PPK（ポリリン酸キナーゼ）の存在下で前記ポリリン酸と反応させてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を生成させる工程
(4)該第３工程によって得られたＡＴＰをルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させて発光させる第４工程
(5)該第４工程により生成した発光量を測定することにより前記ＲＮＡ中のＡＭＰを定量する第５工程
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