WO2020166790A1 - 제노 핵산 센서를 포함하는 스몰 rna 검출용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

제노 핵산 센서를 포함하는 스몰 rna 검출용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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small rna
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nucleic acid
xeno
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PCT/KR2019/014843
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양성욱
조석근
샤프라틱
니틴 나그다리디
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주식회사 제노헬릭스
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a composition for detecting small RNA comprising a xeno-nucleic acid sensor and a use thereof.
  • the small RNA detection may be performed using a fluorometer and high resolution melting (HRM) analysis.
  • HRM high resolution melting
  • small RNA As one of the biomarkers in various diseases, small RNA (sRNA) is in the spotlight. Small RNA can be erroneously regulated, and this can lead to various diseases or change in sensitivity to treatment, medication compliance, and tolerance. Accordingly, detection of small RNA is very important for targeted or personalized treatment, disease-specific diagnosis, and prognosis prediction.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for detecting small RNA comprising the composition for detecting small RNA.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting small RNA.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object relates to a composition for detecting small RNA, comprising a xeno nucleic acid and a fluorescent material.
  • small RNA is a short-stranded non-coding RNA consisting of about 30 nucleotides or less, for example, 15 to 30, 15 to 29, 15 to 28 in length.
  • the small RNA may be in the form of iRNA, miRNA piRNA, or snRNA, but is not limited thereto.
  • xeno nucleic acid refers to a heterologous nucleic acid capable of hybridizing with a complementary single-stranded target sequence.
  • the xeno nucleic acid may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the form of the geno nucleic acid may be changed by the nucleotide sequence specificity of the target small RNA.
  • ANA Arabino-nucleic acid
  • FANA Fluoro arabino-nucleic acid
  • FNA Forml glycerol nucleic acid
  • 2'-OMe (2'-OMethyl DNA
  • MOE Metalethyl-oligoribonucleotides
  • LNA Locked Nucleic acid
  • AmNA amido-bridged nucleic acid
  • TNA Threose Nucleic Acid
  • UNA Unlocked Nucleic Acid
  • HNA Hydrophilitol nucleic acid
  • CeNA cyclohexene nucleic acid
  • X cyclo
  • hybridization refers to a process in which two complementary strands of a nucleic acid are combined to form a double-stranded molecule, a so-called hybrid.
  • target small RNA is a small RNA that can be used to determine whether it is expressed in a subject, and specifically, may be a small RNA related to disease diagnosis and prognosis.
  • the disease may be related to humans, animals, and plants, but is not limited thereto.
  • RNA related to diagnosis and prognosis of various diseases, etc. is available at http://www.mirbase.org/, http://genome.ucsc.edu/, http://www.bioinfo.rpi.edu/zukerm
  • a database selected from the group consisting of /rna/mfold-3.html, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, etc. can be used, or can be obtained through direct analysis.
  • Nucleic acid molecules such as DNA and RNA have the property of specifically binding to each other according to the base sequence constituting the molecule, and reactions can be controlled by appropriately designing the base sequence.
  • composition for detecting small RNA of the present invention may be one further comprising a nuclease.
  • nuclease refers to an enzyme that binds to and degrades unbound ssDNA or ssRNA, single-stranded xeno nucleic acid, unbound xeno nucleic acid sensor, and the like.
  • noise was removed by decomposing unbound geno sensors, target miRNAs, etc. by adding nucleases.
  • a "fluorescence molecule” is a substance that emits fluorescence by absorbing and emitting light of a specific wavelength, and it is possible to confirm whether hybridization between the target nucleic acid and the xeno nucleic acid has been achieved by labeling the xeno nucleic acid and in vitro ( It means a substance capable of providing a small RNA detection signal in vitro ) and/or in vivo .
  • the target nucleic acid may be iRNA, miRNA piRNA, or snRNA, but is not limited thereto.
  • the fluorescent material is Cyber Green I (SYBR Green I), fluorescein (fluorescein), FAM (carboxyfluorescein), rhodamine, Texas Red (Texas Red), tetramethylrhodamine, carboxyrhodamine, carboxyrotamine 6G, Carboxyrodol, Carboxyrhodamine 110, Cascade Blue, Cascade Yellow, Komarin, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-chrome, phycoerythrin , PerCP (peridinine chlorophyll-a protein), PerCP-Cy5.5, JOE (6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), NED, ROX(5- (And -6)-carboxy-X-rhodamine), HEX, Lucifer Yellow, Marina Blue, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green Green) 514, Alexa Fluor (trade name) 350, Alexa floor
  • composition for detecting small RNA including the xeno nucleic acid and a fluorescent material may also be referred to as a'geno nucleic acid sensor'.
  • the target small RNA detected in the case of wild-type Arabidopsis thaliana showed remarkably stronger fluorescence than that of the hyl1-2 mutant Arabidopsis thaliana.
  • the sensor of the present invention efficiently expressed a specific target miRNA even in a biological sample. It was confirmed that it can be detected (FIGS. 3 and 4).
  • kits for small RNA detection comprising the composition for small RNA detection.
  • the kit may additionally include instructions describing the conditions for performing the optimal reaction, and, if necessary, may additionally include, without limitation, a composition or structure necessary for detecting small RNA.
  • Another aspect of the present invention is a) contacting the small RNA composition with a sample; And b) measuring the fluorescence of the result of step a).
  • the method may additionally include a high resolution melting (HRM) analysis step.
  • HRM high resolution melting
  • sample refers to any sample containing a target small RNA.
  • the sample may be any tissue or body fluid obtained from a subject of interest as a biological sample.
  • the sample is sputum, blood, serum, plasma, blood cells (e.g., white blood cells), tissues, biopsy samples, smear samples, washing samples, swab samples, cell-containing body fluids, fluid nucleic acids, urine, peritoneal fluid And pleural fluid, cerebral spinal fluid, feces, lacrimal fluid, or cells therefrom. It may also include tissue sections taken for histological purposes, ie frozen or fixed sections or microdissected cells or extracellular portions thereof. The sample can be obtained in a way that does not harm the subject.
  • blood cells e.g., white blood cells
  • tissues e.g., biopsy samples, smear samples, washing samples, swab samples, cell-containing body fluids, fluid nucleic acids, urine, peritoneal fluid And pleural fluid, cerebral spinal fluid, feces, lacrimal fluid, or cells therefrom. It may also include tissue sections taken for histological purposes, ie frozen or fixed sections or microdissected cells
  • the xeno sensor of the present invention can specifically bind to and detect a target small RNA, and this can be used to detect a target small RNA.
  • composition for small RNA detection including the xeno-nucleic acid sensor of the present invention enables ultra-high sensitivity detection of small RNA expressed in a small amount in cells without an amplification process, so it can be usefully used for diagnosis or prognosis of diseases. have.
  • FIG. 3 shows the results of confirming the in vivo detection ability of the Xeno-NA160 sensor in wild-type Arabidopsis thaliana and hyl1-2 mutant Arabidopsis thaliana (black: basic fluorescence of Xeno-NA160 sensor itself, blue: hyl1-2 mutant Arabidopsis Detection level of ath-miR160 in, red: detection level of ath-miR160 in wild type Arabidopsis).
  • Figure 4 shows the results of confirming the in vivo detection ability of the Xeno-NA173-3p (173D) sensor in wild-type Arabidopsis and hyl1-2 mutant Arabidopsis (black: Xeno-NA173-3p (173D) sensor itself Fluorescence, blue: detection level of ath-miR173-3p in hyl1-2 mutant Arabidopsis, red: detection level of ath-miR173-3p in wild-type Arabidopsis).
  • a geno nucleic acid consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2 in Table 1 was synthesized.
  • the first base'T' of the geno nucleic acid SEQ ID NO: 1 and 2, which is an example of the present invention, is Locked Nucleic Acid (LNA) at the corresponding position, and is indicated by an underline in Table 1 below.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • SEQ ID NOs: 2 to 8 show the target small RNA sequence to be detected in the present invention.
  • the detection ability was confirmed using a Xeno sensor (Xeno-NA160) complementary to the ath-miR160 sequence of Arabidopsis.
  • composition for detection was configured as summarized in Table 2 below, and an experiment was performed.
  • the configuration corresponding to'genosensor alone' is indicated as 160D in the following experiment, and the configuration corresponding to'miRNA alone' is indicated as 160R, 221R, 27bR, 196aR, and 21R.
  • the configuration corresponding to'Geno sensor + miRNA' is indicated as 160DR/160D+160R, 160D+221R, 160D+27bR, 160D+196aR, 160D+21R, and 160DR/160D+160R are complementary geno sensors and Compositions of miRNAs and other configurations with different numbers were used as controls by constructing a genosensor and miRNA that were not complementary to each other.
  • the Cyber Green I is a fluorescent material that is inserted into the duplex to which the Xeno-NA160 sensor-miR160 is complementarily bound, and the nuclease decomposes the unbound single-stranded miR160 and Xeno-NA160 sensors to remove noise.
  • high-resolution melting measurement was performed in increments of 0.2° C. per second while maintaining 5 seconds for each step from 200° C. to 950° C., and real-time measurement of the melting curve was performed at Ex/Em-500/520 nm.
  • the detection ability of the target miRNA was confirmed when non-specific miRNAs were present together.
  • the Xeno-NA160 sensor was used, and the specific miRNA for this was miR160, and the other 221R, 27bR, 196aR, and 21R correspond to non-specific miRNAs.
  • RNA of Arabidopsis thaliana Targeting the total RNA of Arabidopsis thaliana, the ability of the genosensor to detect miRNA was confirmed. Specifically, wild type (WT) Arabidopsis thaliana and hyl1-2 mutant Arabidopsis thaliana were used, and total RNA was extracted from each plant. The hyl1-2 mutant Arabidopsis thaliana lacks an important component of miRNA biosynthesis and thus expresses significantly less miRNA than the wild-type Arabidopsis thaliana.
  • WT wild type
  • hyl1-2 mutant Arabidopsis thaliana lacks an important component of miRNA biosynthesis and thus expresses significantly less miRNA than the wild-type Arabidopsis thaliana.
  • composition for detection was configured as summarized in Table 3 below, and an experiment was performed.
  • 'Genosensor + col miRNA' was a wild-type Arabidopsis thaliana and was used as a control with the'Genosensor alone' group.
  • the Xeno-NA160 sensor was used to detect ath-miR160 among the total RNA of Arabidopsis thaliana.
  • the hyl1-2 mutant Arabidopsis is lacking miRNA compared to wild-type Arabidopsis, which contains many miRNAs.
  • the Xeno-NA173-3p (173D) sensor was used to detect ath-miR173-3p among the total RNA of Arabidopsis thaliana.

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Abstract

본 발명은 제노 핵산 센서를 포함하는 small RNA 검출용 조성물 및 이의 용도 관한 것이다. 구체적으로, 상기 small RNA 검출은 PCR 기반으로 한 목표 miRNA의 증폭 과정 없이 고해상도 융해(High Resolution Melting, HRM) 분석을 이용하여 직접적으로 탐지할 수 있다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 19.11.2019]　제노 핵산 센서를 포함하는 스몰 RNA 검출용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 제노 핵산 센서를 포함하는 small RNA 검출용 조성물 및 이의 용도 관한 것이다. 구체적으로, 상기 small RNA 검출은 형광측정기(fluorometer) 및 고해상도 융해(High Resolution Melting, HRM) 분석을 이용할 수 있다.
다양한 질환에서의 바이오마커 중 하나로 small RNA(sRNA)가 각광받고 있다. small RNA는 잘못 조절될 수 있으며, 이로 인하여 다양한 질환이 발생하거나 치료제에 대한 민감도, 복약 순응도, 내성 등이 달라질 수 있다. 이에 따라, small RNA의 검출은 표적 맞춤형 또는 개인 맞춤형 치료, 질환 특이적인 진단 및 예후 예측 등에 매우 중요하다.
종래의 직접적인 small RNA 검출방법은 small RNA의 세포로부터 추출 및 증폭 단계를 포함하는 QRT-PCR을 수행하거나, 전기화학적 방법을 이용하였으나, 대체로 적은 양의 small RNA를 검출한다 하여도 정확도와 신뢰도가 떨어지는 한계가 있었다.
이에, small RNA 검출방법에 대한 연구 개발이 요구되고 있으며, 특히 간단하면서도, 신뢰성이 높은 고해상도 분석이 가능하도록 한 small RNA 검출에 관한 연구는 매우 필요한 실정이다.
(선행문헌-비특허문헌 1) Theranostics. 2013; 3(6): 395-408. Molecular Beacons of Xeno-Nucleic Acid for Detecting Nucleic Acid
본 발명의 목적은 제노 핵산(xeno nucleic acid) 및 형광물질을 포함하는, small RNA 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 small RNA 검출용 조성물을 포함하는 small RNA 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 small RNA 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 제노 핵산(xeno nucleic acid) 및 형광물질을 포함하는, small RNA 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, "small RNA(sRNA)"는 약 30개 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 짧은 가닥 비번역(non-coding) RNA로, 예를 들어 길이가 15 내지 30개, 15 내지 29개, 15 내지 28개, 15 내지 27개, 15 내지 26개, 15 내지 25개, 15 내지 24개, 15 내지 23개, 15 내지 22개, 15 내지 21개, 15 내지 20개, 15 내지 19개, 15 내지 18개, 15 내지 17개, 18 내지 30개, 18 내지 29개, 18 내지 28개, 18 내지 27개, 18 내지 26개, 18 내지 25개, 18 내지 24개, 18 내지 23개, 18 내지 22개, 18 내지 21개, 18 내지 20개, 19 내지 30개, 19 내지 29개, 19 내지 28개, 19 내지 27개, 19 내지 26개, 19 내지 25개, 19 내지 24개, 19 내지 23개, 19 내지 22개, 19 내지 21개, 19 내지 20개, 20 내지 30개, 20 내지 29개, 20 내지 28개, 20 내지 27개, 20 내지 26개, 20 내지 25개, 20 내지 24, 20 내지 23개, 20 내지 22개, 20 내지 21개, 21 내지 30개, 21 내지 29개, 21 내지 28개, 21 내지 27개, 21 내지 26개, 21 내지 25개, 21 내지 24개, 21 내지 23개 또는 21 내지 22개의 뉴클레오티드인 영역을 가진 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하며, 전사 단계에서 RNA 침묵(RNA silencing) 그리고 전사 후 단계에서 유전자 발현의 조절 등 다양한 생체 내 프로세스에서 중요한 역할을 한다. 특히, small RNA는 다양한 질병 및 암 조절과 연관이 있는 것으로 알려지고 있어, 질병의 진단이나 예후용 바이오마커로서 활용될 수 있다.
상기 small RNA는 iRNA, miRNA piRNA 또는 snRNA 등의 형태일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "제노 핵산(xeno nucleic acid)"은 상보적인 단일가닥 표적 서열과 혼성화할 수 있는 이종 핵산을 말한다. 구체적으로, 상기 제노 핵산은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 제노 핵산의 형태는 표적 small RNA의 염기서열 특이성에 의해서 바뀔 수 있다. 예를 들어 ANA(Arabino-nucleic acid), FANA(Fluoro arabino-nucleic acid), FNA(Formyl glycerol nucleic acid), 2'-OMe(2'- OMethyl DNA), MOE(Methoxyethyl)-oligoribonucleotides), 2'-MOE(2'-O-(2-Methoxyethyl)-oligoribonucleotides), 2S-MOP(2'-O-(2S-methoxypropyl)-RNA), LNA(Locked Nucleic acid), AmNA(amido-bridged nucleic acid), TNA(Threose Nucleic Acid), UNA(Unlocked nucleic acid), HNA(Hexitol nucleic acid), CeNA(cyclohexene nucleic acid), XyNA(xylonucleic acid), PNA(Peptide Nucleic acid), GNA(Glycerol Nucleic Acid), L-DNA(Isomer of natural DNA)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "혼성화(hybridization)"는 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자, 이른바 혼성체를 형성하는 과정을 의미한다.
상기 "표적 small RNA"는 대상체 내에서 발현 여부의 확인이 되는 small RNA 로서, 구체적으로는 질환의 진단, 예후 예측에 관련된 small RNA일 수 있다. 상기 질환은 인간, 동물, 식물에 관한 것일 수 있으며, 제한되는 것은 아니다.
다양한 질환의 진단, 예후 예측 등과 관련된 표적 small RNA의 서열은 http://www.mirbase.org/, http://genome.ucsc.edu/, http://www.bioinfo.rpi.edu/zukerm/rna/mfold-3.html, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 데이터베이스를 이용하거나, 직접 분석을 통하여 확보할 수 있다.
DNA나 RNA와 같은 핵산 분자는 해당 분자를 구성하는 염기 서열에 따라서 상호간에 특이적으로 결합하는 성질이 있으며, 그 염기 서열을 적절하게 디자인함으로써 반응을 조절할 수 있다.
또한 구체적으로, 본 발명의 small RNA 검출용 조성물은 뉴클레아제(nuclease)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서, "뉴클레아제(nuclease)"는 미결합 ssDNA 또는 ssRNA, 단일가닥 제노 핵산, 미결합 제노 핵산 센서 등에 결합하여 분해하는 효소를 말한다. 본 발명 일 실시예에서는 뉴클레아제를 추가함으로써 결합되지 않은 제노 센서, 표적 miRNA 등을 분해함으로써 노이즈가 제거되도록 하였다.
본 발명에서, "형광물질(fluorescence molecule)"은 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로써, 제노 핵산에 표지하여 표적 핵산과 제노 핵산 사이의 혼성화가 이루어졌는지 확인할 수 있고 시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo)에서 small RNA 검출 신호를 제공할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 표적 핵산은 iRNA, miRNA piRNA 또는 snRNA 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 형광물질은 사이버 그린 I(SYBR Green I), 플루오레신(fluorescein), FAM(carboxyfluorescein), 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민 6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민 110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 오레곤 그린(Oregon Green) 514, 알렉사 플로어(Alexa Fluor, 상표명) 350, 알렉사 플로어 430, 알렉사 플로어 488, 알렉사 플로어 532, 알렉사 플로어 546, 알렉사 플로어 568, 알렉사 플로어 594, 알렉사 플로어 633, 알렉사 플로어 647, 알렉사 플로어 660, 알렉사 플로어 680, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY, 상표명) FL, 보디피 FL-Br2, 보디피 530/550, 보디피 558/568, 보디피 564/570, 보디피 576/589, 보디피 581/591, 보디피 630/650, 보디피 650/665, 보디피 R6G, 보디피 TMR 및 보디피 TR로, 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 형광 신호의 검출은 형광 물질의 종류에 따라 다양한 방법이 이용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 제노 핵산과 형광물질을 포함하는 small RNA 검출용 조성물은 '제노 핵산 센서'로도 명명될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 비특이적 small RNA가 혼재되어 있는 경우에도 특이적인 표적 small RNA에 대해서만 높은 형광을 나타내는 것을 확인하였으며, 이로부터 본 발명의 센서가 매우 높은 특이도를 가지고 결합함에 따라 정확도가 높음을 확인하였다(도 2).
나아가, 야생형 애기장대의 경우 검출되는 표적 small RNA가 hyl1-2 돌연변이 애기장대에 비해 현저히 강한 형광을 나타냄을 확인하였는 바, 이로부터 본 발명의 센서가 생물 표본에서도 특정한 표적 miRNA를 상대적인 발현 정도까지 효율적으로 검출할 수 있음을 확인하였다(도 3 및 도 4).
본 발명의 다른 측면은 상기 small RNA 검출용 조성물을 포함하는 small RNA 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 설명서를 추가로 포함할 수 있으며, 필요에 따라 small RNA 검출에 필요한 조성물이나 구조체를 제한없이 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 a) 상기 small RNA 조성물을 시료와 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 a) 단계의 결과물의 형광을 측정하는 단계를 포함하는, small RNA 검출방법에 관한 것이다. 구체적으로 상기 방법은 고해상도 융해(High Resolution Melting, HRM) 분석 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서, "시료"는 표적 small RNA를 포함하는 임의의 시료를 말한다. 상기 시료는 생물학적 시료로서 관심 대상으로부터 수득한 임의의 조직 또는 체액일 수 있다.
구체적으로, 상기 시료는 대상의 가래, 혈액, 혈청, 혈장, 혈구(예를 들어, 백혈구), 조직, 생검 샘플, 도말 샘플, 세척 샘플, 면봉 샘플, 세포 함유 체액, 유동 핵산, 소변, 복막액 및 흉수, 뇌 척수액, 대변, 누액 또는 이로부터의 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 조직학적 목적 하에 취해진 조직 절편, 즉 동결 또는 고정 절편 또는 그의 미세해부 세포 또는 세포 외 부분을 포함할 수 있다. 상기 시료는 대상에게 위해를 끼치지 않는 방법으로 얻어질 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 본 발명의 제노 센서가 표적 small RNA에 대해 특이적으로 결합하여 검출이 가능함을 확인하였는 바, 이를 이용하여 표적 small RNA 검출에 활용할 수 있다.
본 발명의 제노 핵산 센서를 포함하는 small RNA 검출용 조성물은 증폭 과정 없이도 세포 내 미량으로 발현되는 small RNA 를 초고감도로 검출할 수 있게 하므로, 질환의 진단이나 예후 예측용으로도 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 Xeno-NA160 센서의 miR160에 대한 특이적 검출능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 비특이적 miRNA 혼합 존재시의 Xeno-NA160 센서의 miR160에 대한 특이적 검출능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 야생형 애기장대 및 hyl1-2 돌연변이 애기장대에서의 Xeno-NA160 센서의 in vivo 검출능을 확인한 결과를 나타낸 것이다(검정색: Xeno-NA160 센서 자체의 기본 형광, 파란색: hyl1-2 돌연변이 애기장대에서의 ath-miR160 검출수준, 빨간색: 야생형 애기장대에서의 ath-miR160 검출수준).
도 4는 야생형 애기장대 및 hyl1-2 돌연변이 애기장대에서의 Xeno-NA173-3p(173D) 센서의 in vivo 검출능을 확인한 결과를 나타낸 것이다(검정색: Xeno-NA173-3p(173D) 센서 자체의 기본 형광, 파란색: hyl1-2 돌연변이 애기장대에서의 ath-miR173-3p 검출수준, 빨간색: 야생형 애기장대에서의 ath-miR173-3p 검출수준).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 제노 핵산(xeno nucleic acid)의 준비
하기 표 1의 서열 번호 1 및 2로 이루어진 제노 핵산을 합성하였다. 본 발명의 예시인 제노 핵산 서열번호 1 및 2의 첫 번째 염기 'T'는 해당 위치에서의 Locked Nucleic Acid (LNA)이며, 하기 표 1 내에서 밑줄로 표시하였다.
서열번호 2 내지 8은 본 발명에서 검출 대상이 된 표적 small RNA 서열을 나타낸 것이다.
서열번호 올리고 종류 DNA 서열
1 160D XNA-sensor 5'- T GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3'
2 173D XNA-sensor 5'- T TTCGCTTACACAGAGAATCA-3'
3 160R microRNA-160 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA-3'
4 221R microRNA-221 5'-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3'
5 27bR microRNA-27b 5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC-3'
6 196aR microRNA-196a 5'-UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGGG-3'
7 21R microRNA-21 5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'
8 173R microRNA-173-3p 5'-UGAUUCUCUGUGUAAGCGAAA-3'
실험예 1. in-vitro small RNA (miRNA) 검출능 확인
애기장대(Arabidopsis)의 ath-miR160 서열에 상보적인 제노 센서(Xeno-NA160)을 이용하여 검출능력을 확인하였다.
검출을 위한 조성물은 하기 표 2에 정리된 바와 같이 구성하여 실험을 수행하였다.
농도 제노센서 단독 miRNA 단독 제노센서 + miRNA
제노 센서(Xeno- sensor) 100uM 5ul - 5ul
RNA (specific or non-specific) 100uM - 5ul 5ul
완충용액(Buffer) - 5ul 5ul 5ul
뉴클레아제 무존재 증류수(DEPC nuclease free water) - 10ul 10ul 5ul
55°C에서 10 분간 열을 가한 후, 상온에서 30분간 인큐베이션(incubation)
뉴클레아제(nuclease) 10,000units 1.5ul 1.5ul 1.5ul
상온에서 30분간 인큐베이션(incubation)
사이버 그린 I(SYBR Green I) 1000x 1ul 1ul 1ul
합계 - 22.5ul 22.5ul 22.5ul
상기 표 2에서, '제노센서 단독'에 해당되는 구성은 이하 실험에서 160D로 표시되었으며, 'miRNA 단독'에 해당되는 구성은 160R, 221R, 27bR, 196aR, 21R로 표시되었다. 또한, '제노센서 + miRNA'에 해당되는 구성은 160DR/160D+160R, 160D+221R, 160D+27bR, 160D+196aR, 160D+21R로 표시되었으며, 160DR/160D+160R은 서로 상보적인 제노센서와 miRNA로 구성한 것이고 그 외 숫자가 다른 구성은 서로 상보적이지 않은 제노센서와 miRNA 를 구성하여 대조군으로 활용하였다.
구체적으로, 100 μM의 제노센서 솔루션 5 ul, 100 μ의 small RNA 솔루션 5 ul, 5X 반응 버퍼 5 ul 및 뉴클레아제 무존재 증류수(DEPC nuclease free water) 5 ul를 가하여 총 20 ul 가 되도록 하고, 볼텍스(vortex) 및 스핀 다운(spin dows)을 진행하였다. 이후 55°C에서 10 분간 열을 가하여 변성시키고 잠시 스핀(spin)시켰다. 이후 25°C에서 30분간 인큐베이팅 후 뉴클레아제(nuclease) 1.5 ul을 넣고 다시 25°C에서 30분간 인큐베이팅하였다. 이후 사이버 그린 I(SYBR Green I) 1 ul을 혼합하여 총 반응액이 22.5 ul이 되도록 한 후 이 중 20 ul을 96 웰(well) 플레이트에 옮긴 후 고해상도 융해 측정(High Resolution Melting(HRM) Measurement)을 진행하였다. 상기 사이버 그린 I은 형광물질로서 Xeno-NA160 센서- miR160이 상보적으로 결합된 듀플렉스 내에 삽입되며, 뉴클레아제는 결합되지 않은 단일가닥 miR160 및 Xeno-NA160 센서를 분해하여 노이즈가 제거되도록 한다.
또한, 고해상도 융해 측정은 200 ℃에서 950 ℃까지 각 단계마다 5초씩 유지하면서 초당 0.2 ℃씩 증분 가열되도록 하였으며, 용융 곡선의 실시간 측정은 Ex/Em-500/ 520nm에서 수행하였다.
1-1. 160D, 160R 및 160DR의 대비
160D, 160R 및 160DR의 검출능력을 확인한 결과, 형광 신호는 160DR에서 매우 강하게 나타났으며, 160D, 160R에서는 형광 신호가 거의 나타나지 않음을 확인하였다(도 1).
1-2. 비특이적 miRNA 혼합 존재시의 검출능 확인
상기 1-1에서의 확인에 더하여, 비특이적 miRNA가 함께 존재할 경우의 표적 miRNA의 검출능력을 확인하였다. Xeno-NA160 센서를 사용하였으며, 이에 대해 특이적인 miRNA는 miR160이며, 그 외의 221R, 27bR, 196aR, 21R은 비특이적 miRNA에 해당한다.
검출능 확인 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 Xeno-NA160 센서, 이와 상보적으로 miR160가 결합한 160D+160R에서만 매우 높은 형광 신호가 나타났으며, 다른 비특이적 miRNA의 경우 단독 뿐만 아니라 Xeno-NA160 센서와 결합하더라도 특이적으로 상보적인 결합이 나타나지 않아 형광 신호가 나타나지 않았다. 이는 본 발명의 센서가 매우 높은 특이도를 가지고 결합함에 따라 정확도가 높음을 나타내는 것이다.
실험예 2. in-vivo small RNA 검출
애기장대의 총 RNA을 대상으로 하여 제노센서의 miRNA 검출능력을 확인하였다. 구체적으로 야생형(Wild Type,WT)의 애기장대와 hyl1-2 돌연변이 애기장대를 이용하였으며, 각각의 식물로부터 전체 RNA를 추출하였다. hyl1-2 돌연변이 애기장대는 miRNA 생합성의 중요한 구성 요소가 결핍되어 있음에 따라 야생형의 애기장대에 비해 miRNA가 현저히 적게 발현된다.
검출을 위한 조성물은 하기 표 3에 정리된 바와 같이 구성하여 실험을 수행하였다.
농도 제노센서 단독 제노센서 + col miRNA 제노센서 + hyl miRNA
제노 센서(Xeno- sensor) 100uM 5ul - 5ul
RNA (specific or non-specific) 100uM - Up to 2ug of RNA Up to 2ug of RNA
완충용액(Buffer) - 5ul 5ul 5ul
뉴클레아제 무존재 증류수(DEPC nuclease free water) - 10ul up to 20ul up to 20ul
55°C에서 10 분간 열을 가한 후, 상온에서 30분간 인큐베이션(incubation)
뉴클레아제(nuclease) 10,000units 1.5ul 1.5ul 1.5ul
상온에서 30분간 인큐베이션(incubation)
사이버 그린 I(SYBR Green I) 1000x 1ul 1ul 1ul
합계 - 22.5ul 22.5ul 22.5ul
검출방법 및 고해상도 융해 측정은은 상기 실험예 1에서 수행한 방식과 동일하다. '제노센서 + col miRNA'은 야생형 애기장대로서 '제노센서 단독'군과 함께 대조군으로 하였다.
2-1. Xeno-NA160 센서의 in vivo 검출능 확인
애기장대의 총 RNA 중 ath-miR160를 검출하기 위하여 Xeno-NA160 센서를 사용하였다. hyl1-2 돌연변이 애기장대는 miRNA가 많은 야생형 애기장대에 비해 miRNA가 부족하다.
도 3에 나타난 바와 같이 야생형 애기장대의 총 RNA 2ug은 hyl1-2 돌연변이 애기장대의 총 RNA 2ug에 비해 5 배 더 높은 형광을 보였으며, 이는 본 발명의 조성물이 생물 표본에서 특정한 표적 miRNA를 상대적인 발현 정도까지 효율적으로 검출할 수 있음을 나타내는 것이다.
2-2. Xeno-NA173-3p(173D) 센서의 in vivo 검출능 확인
애기장대의 총 RNA 중 ath-miR173-3p 를 검출하기 위하여 Xeno-NA173-3p(173D) 센서를 사용하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, ath-miR173-3p 검출의 경우에도 야생형 애기장대의 총 RNA 2ug은 hyl1-2 돌연변이 애기장대의 총 RNA 2ug에 비해 현저히 강한 형광을 나타내었으며, 본 발명의 조성물이 생물 표본에서 특정한 표적 miRNA를 상대적인 발현 정도까지 효율적으로 검출할 수 있음을 상기 2-1에 이어 반복적으로 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

  1. 제노 핵산(xeno nucleic acid) 및 형광물질을 포함하는, small RNA(sRNA) 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제노 핵산은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인, small RNA 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 검출용 조성물은 뉴클레아제(nuclease)를 추가로 포함하는 것인, small RNA 검출용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 형광물질은 사이버 그린 I(SYBR Green I), 플루오레신(fluorescein), FAM(carboxyfluorescein), 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민 6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민 110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 오레곤 그린(Oregon Green) 514, 알렉사 플로어(Alexa Fluor, 상표명) 350, 알렉사 플로어 430, 알렉사 플로어 488, 알렉사 플로어 532, 알렉사 플로어 546, 알렉사 플로어 568, 알렉사 플로어 594, 알렉사 플로어 633, 알렉사 플로어 647, 알렉사 플로어 660, 알렉사 플로어 680, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY, 상표명) FL, 보디피 FL-Br2, 보디피 530/550, 보디피 558/568, 보디피 564/570, 보디피 576/589, 보디피 581/591, 보디피 630/650, 보디피 650/665, 보디피 R6G, 보디피 TMR 및 보디피 TR로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, small RNA 검출용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, small RNA 검출용 키트.
  6. a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 시료와 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계의 결과물의 형광을 측정하는 단계를 포함하는, small RNA 검출방법.
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