JP2001292798A - 生物発光によりｒｎａを検出する方法 - Google Patents
生物発光によりｒｎａを検出する方法Info
- Publication number
- JP2001292798A JP2001292798A JP2000112790A JP2000112790A JP2001292798A JP 2001292798 A JP2001292798 A JP 2001292798A JP 2000112790 A JP2000112790 A JP 2000112790A JP 2000112790 A JP2000112790 A JP 2000112790A JP 2001292798 A JP2001292798 A JP 2001292798A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- atp
- rna
- bioluminescence
- polyphosphate
- adp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】新規物質によりＲＮＡ由来のＡＭＰをＡＴＰに
変換し、生物発光させ、生じたＡＭＰを再びＡＴＰに変
換し、それが連続的に起こることによって生物発光強度
の増加及び発光時間を安定に持続させてなるＲＮＡ検出
方法の提供。 【解決手段】試料中のＲＮＡを単離し、得られたヌクレ
オチドのうちのＡＭＰを、ポリリン酸存在下でリン酸基
転移酵素と反応させてＡＤＰに変換せしめ、次いで、前
記ＡＤＰをポリリン酸合成酵素と反応させてＡＴＰに変
換せしめる。該ＡＴＰをルシフェリン及び溶存酸素の存
在下でルシフェラーゼと反応させ、生成した発光量を測
定することにより、ＲＮＡを生物発光で定量する。ポリ
リン酸はリン酸が数百つながったものなので、連続的に
再生反応が起り、生物発光の強度増加、並びに発光時間
の持続が可能になった。
変換し、生物発光させ、生じたＡＭＰを再びＡＴＰに変
換し、それが連続的に起こることによって生物発光強度
の増加及び発光時間を安定に持続させてなるＲＮＡ検出
方法の提供。 【解決手段】試料中のＲＮＡを単離し、得られたヌクレ
オチドのうちのＡＭＰを、ポリリン酸存在下でリン酸基
転移酵素と反応させてＡＤＰに変換せしめ、次いで、前
記ＡＤＰをポリリン酸合成酵素と反応させてＡＴＰに変
換せしめる。該ＡＴＰをルシフェリン及び溶存酸素の存
在下でルシフェラーゼと反応させ、生成した発光量を測
定することにより、ＲＮＡを生物発光で定量する。ポリ
リン酸はリン酸が数百つながったものなので、連続的に
再生反応が起り、生物発光の強度増加、並びに発光時間
の持続が可能になった。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、リボ核酸（ＲＮ
Ａ）を検出するための、特に、高等生物の細胞中に存在
し、タンパク質合成に重要な関与をするメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、
転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を検出するための方法に関す
る。
Ａ）を検出するための、特に、高等生物の細胞中に存在
し、タンパク質合成に重要な関与をするメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、
転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を検出するための方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】今日、高等生物の細胞中に存在し、タン
パク質合成に関与するリボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡか
らの遺伝情報を他の細胞に伝達する仲介的役割をするこ
とが知られている（広海啓太郎著，実験で学ぶ生化学，
p205，化学同人，1987.7.10）。
パク質合成に関与するリボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡか
らの遺伝情報を他の細胞に伝達する仲介的役割をするこ
とが知られている（広海啓太郎著，実験で学ぶ生化学，
p205，化学同人，1987.7.10）。
【０００３】細胞質内で合成されるタンパク質は、核の
ＤＮＡの塩基配列順序によって決定されることが明らか
になっている。遺伝コード（暗号）は、コーディングト
リプレット（暗号三重子）として知られる３個の重なり
合わない塩基の組みがおのおのアミノ酸を規定するもの
である。そして、遺伝情報は、メッセンジャー（伝令）
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）という仲介者的分子によって核から
リボソーム上のタンパク質合成系へと伝達される。この
分子は核のＤＮＡに相補的な塩基配列をもっており、コ
ーディングトリプレットに対応するｍＲＮＡ上の３個の
塩基の組はコドンとして知られており、ＤＮＡはまず、
第１段階としては、ｍＲＮＡが合成されるための「鋳
型」として働くのである。
ＤＮＡの塩基配列順序によって決定されることが明らか
になっている。遺伝コード（暗号）は、コーディングト
リプレット（暗号三重子）として知られる３個の重なり
合わない塩基の組みがおのおのアミノ酸を規定するもの
である。そして、遺伝情報は、メッセンジャー（伝令）
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）という仲介者的分子によって核から
リボソーム上のタンパク質合成系へと伝達される。この
分子は核のＤＮＡに相補的な塩基配列をもっており、コ
ーディングトリプレットに対応するｍＲＮＡ上の３個の
塩基の組はコドンとして知られており、ＤＮＡはまず、
第１段階としては、ｍＲＮＡが合成されるための「鋳
型」として働くのである。
【０００４】上記のｍＲＮＡはリボソームに運ばれ、ｔ
ＲＮＡの助けを借りて、特定タンパク質の合成に携わ
る。
ＲＮＡの助けを借りて、特定タンパク質の合成に携わ
る。
【０００５】このようなＲＮＡに対し、その組成を知る
ことで、人間の健康に関する分野(例えば、病気の診断
や治療薬の開発)や、食品中のバクテリアの汚染を検出
する分野（清浄度検査）等において応用範囲が広がって
きており、最近の代謝・生合成系の分野で注目を浴びて
きている。
ことで、人間の健康に関する分野(例えば、病気の診断
や治療薬の開発)や、食品中のバクテリアの汚染を検出
する分野（清浄度検査）等において応用範囲が広がって
きており、最近の代謝・生合成系の分野で注目を浴びて
きている。
【０００６】ＲＮＡの組成を検出する技術は公知であ
り、例えば、酵母から遠心分離によりＲＮＡを単離し、
紫外分光光度計（クロマトグラフィー）により吸収スペ
クトルを測定する方法や、ＲＮＡを加水分解した後、電
気泳動により分離してヌクレオチドの吸収スペクトルを
測定する方法はよく知られている。
り、例えば、酵母から遠心分離によりＲＮＡを単離し、
紫外分光光度計（クロマトグラフィー）により吸収スペ
クトルを測定する方法や、ＲＮＡを加水分解した後、電
気泳動により分離してヌクレオチドの吸収スペクトルを
測定する方法はよく知られている。
【０００７】また、特公平8-2320号公報の請求項１に
は、試料中の３’−末端ポリリボアデノシンセグメント
を有するポリヌクレオチドの測定方法であって、以下の
工程；（ａ）試料中の核酸を、無機ホスフェートの存在
下、ポリヌクレオチドホスホリラーゼで消化して、３’
−末端ポリリボアデノシンセグメントを、ＡＤＰを含有
するリボヌクレオシドジホスフェートに転化し；（ｂ）
消化工程（ａ）で生じたＡＤＰをホスホリル化してＡＴ
Ｐを製造し、；そして（Ｃ）ホスホリル化工程（ｂ）で
生じたＡＴＰ又はホスホリル化工程の副生成物のどちら
かを検出する、ことよりなる、ポリヌクレオチドの測定
方法が開示してあり、また、請求項２では、３’−末端
ポリリボアデノシンセグメントを有するポリヌクレオチ
ドが、真核生物のｍＲＮＡであることを特徴とし、さら
に、請求項９では、ＡＴＰの検出する工程で、ルシフェ
ラーゼの存在化で、ルシフェリンと反応させて、生物発
光反応を生ぜしめてＡＴＰ量を検出する技術が開示され
ている。
は、試料中の３’−末端ポリリボアデノシンセグメント
を有するポリヌクレオチドの測定方法であって、以下の
工程；（ａ）試料中の核酸を、無機ホスフェートの存在
下、ポリヌクレオチドホスホリラーゼで消化して、３’
−末端ポリリボアデノシンセグメントを、ＡＤＰを含有
するリボヌクレオシドジホスフェートに転化し；（ｂ）
消化工程（ａ）で生じたＡＤＰをホスホリル化してＡＴ
Ｐを製造し、；そして（Ｃ）ホスホリル化工程（ｂ）で
生じたＡＴＰ又はホスホリル化工程の副生成物のどちら
かを検出する、ことよりなる、ポリヌクレオチドの測定
方法が開示してあり、また、請求項２では、３’−末端
ポリリボアデノシンセグメントを有するポリヌクレオチ
ドが、真核生物のｍＲＮＡであることを特徴とし、さら
に、請求項９では、ＡＴＰの検出する工程で、ルシフェ
ラーゼの存在化で、ルシフェリンと反応させて、生物発
光反応を生ぜしめてＡＴＰ量を検出する技術が開示され
ている。
【０００８】これにより、真核生物のｍＲＮＡの組成
を、ＡＴＰによる生物発光により検出することが可能と
なり、また、ｍＲＮＡのＡＭＰ又はＡＤＰへの消化、Ａ
ＤＰからＡＴＰへのホスホリル化により、各成分を定量
することが可能になるものである。
を、ＡＴＰによる生物発光により検出することが可能と
なり、また、ｍＲＮＡのＡＭＰ又はＡＤＰへの消化、Ａ
ＤＰからＡＴＰへのホスホリル化により、各成分を定量
することが可能になるものである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】以上のように、真核生
物のｍＲＮＡの組成を、ＡＴＰによる酵素反応で生物発
光により検出する技術は、特公平8-2320号公報に開示さ
れているが、この中で記載された生物発光の測定は、発
光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失するとい
う欠点を有しており、感度と精度を獲得するため、反応
時間の厳密な制御と、短時間で消失する発光を捕らえる
ための特別なルミノメータの使用を必要とする問題点が
ある。
物のｍＲＮＡの組成を、ＡＴＰによる酵素反応で生物発
光により検出する技術は、特公平8-2320号公報に開示さ
れているが、この中で記載された生物発光の測定は、発
光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失するとい
う欠点を有しており、感度と精度を獲得するため、反応
時間の厳密な制御と、短時間で消失する発光を捕らえる
ための特別なルミノメータの使用を必要とする問題点が
ある。
【００１０】特開平11-69997号公報には、汚れの指標成
分であるＡＴＰに加え、従来のルシフェリン・ルシフェ
ラーゼ発光試薬では測定が困難であったＡＤＰ、ＡＭＰ
及びＲＮＡも同時に測定して、少ない汚れでも、感度よ
く検出して、精度よく清浄度を評価できる清浄度検査試
薬及びこの試薬を用いる清浄度検査方法を提供するもの
である。
分であるＡＴＰに加え、従来のルシフェリン・ルシフェ
ラーゼ発光試薬では測定が困難であったＡＤＰ、ＡＭＰ
及びＲＮＡも同時に測定して、少ない汚れでも、感度よ
く検出して、精度よく清浄度を評価できる清浄度検査試
薬及びこの試薬を用いる清浄度検査方法を提供するもの
である。
【００１１】上記公報によるＲＮＡの測定は、ＲＮＡ分
解酵素によりＲＮＡから５’−モノクレオチド（ＡＭ
Ｐ，ＧＭＰ，ＣＭＰ，ＵＭＰ）を生成し、これによりＲ
ＮＡをＡＭＰに変換せしめ、次いで、ＡＭＰがＡＴＰに
変換され、次いで、ＡＴＰがルシフェリン／ルシフェラ
ーゼ反応により消費されて発光し、ＡＭＰが生成するこ
とが示されている。これにより、一連のＡＴＰ変換反応
系において生成する発光は減衰することなく、高水準の
まま、少なくとも１０分間にわたって安定となる。
解酵素によりＲＮＡから５’−モノクレオチド（ＡＭ
Ｐ，ＧＭＰ，ＣＭＰ，ＵＭＰ）を生成し、これによりＲ
ＮＡをＡＭＰに変換せしめ、次いで、ＡＭＰがＡＴＰに
変換され、次いで、ＡＴＰがルシフェリン／ルシフェラ
ーゼ反応により消費されて発光し、ＡＭＰが生成するこ
とが示されている。これにより、一連のＡＴＰ変換反応
系において生成する発光は減衰することなく、高水準の
まま、少なくとも１０分間にわたって安定となる。
【００１２】上記特開平11-69997号公報に開示される検
査試薬及び検査方法は、ＡＭＰをＡＴＰに変換する再生
系において、触媒となる酵素にピルベートオルトホスフ
ェートジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸及びピル
ビン酸を用いたものである。しかしながら、以下の構造
式で示されるホスホエノールピルビン酸は、１分子にリ
ン化物（ＭI ３Ｐ）が１個しか含まれておらず、ＡＭＰ
からＡＴＰへの変換が不十分となり、ＡＴＰを多量に再
生するにはホスホエノールピルビン酸を多量に補給しな
ければならなかった。このようにホスホエノールピルビ
ン酸を多量に補給するのは、不経済であった。
査試薬及び検査方法は、ＡＭＰをＡＴＰに変換する再生
系において、触媒となる酵素にピルベートオルトホスフ
ェートジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸及びピル
ビン酸を用いたものである。しかしながら、以下の構造
式で示されるホスホエノールピルビン酸は、１分子にリ
ン化物（ＭI ３Ｐ）が１個しか含まれておらず、ＡＭＰ
からＡＴＰへの変換が不十分となり、ＡＴＰを多量に再
生するにはホスホエノールピルビン酸を多量に補給しな
ければならなかった。このようにホスホエノールピルビ
ン酸を多量に補給するのは、不経済であった。
【化１】
【００１３】また、ホスホエノールピルビン酸は熱に非
常に弱く分解されやすい性質があり、炊飯工場などで炊
き上がったばかりのご飯を被検査物とする場合（例え
ば、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対し、耐
熱性の酵素を用いて測定するとよい。）、ホスホエノー
ルピルビン酸を含む試薬を被検査物に投与すると、リン
化物（ＭＩ ３Ｐ）が分解されてＡＭＰからＡＴＰへの変
換が不十分となることがある。つまり、ＡＴＰによる蛍
光発光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失する
虞（おそれ）がある。
常に弱く分解されやすい性質があり、炊飯工場などで炊
き上がったばかりのご飯を被検査物とする場合（例え
ば、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対し、耐
熱性の酵素を用いて測定するとよい。）、ホスホエノー
ルピルビン酸を含む試薬を被検査物に投与すると、リン
化物（ＭＩ ３Ｐ）が分解されてＡＭＰからＡＴＰへの変
換が不十分となることがある。つまり、ＡＴＰによる蛍
光発光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失する
虞（おそれ）がある。
【００１４】さらに、被検査物中には、複数種類の細菌
が存在する場合もあり、この細菌中にホスホエノールピ
ルビン酸を分解する酵素が存在すると、リン化物（ＭＩ
３Ｐ）が補給されず、ＡＭＰからＡＴＰへの変換が不十
分となる虞がある。
が存在する場合もあり、この細菌中にホスホエノールピ
ルビン酸を分解する酵素が存在すると、リン化物（ＭＩ
３Ｐ）が補給されず、ＡＭＰからＡＴＰへの変換が不十
分となる虞がある。
【００１５】本発明は、上記問題点にかんがみ、ホスホ
エノールピルビン酸のようなリン化物が少なく、耐熱性
に問題のある物質を使うのではなく、新規な物質を使っ
て生物発光強度の増加及び発光時間を安定に持続させる
生物発光によりＲＮＡを検出する方法を提供することを
技術的課題とする。
エノールピルビン酸のようなリン化物が少なく、耐熱性
に問題のある物質を使うのではなく、新規な物質を使っ
て生物発光強度の増加及び発光時間を安定に持続させる
生物発光によりＲＮＡを検出する方法を提供することを
技術的課題とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するた
め本発明は、以下の４つの反応によりＲＮＡを生物発光
により検出する。つまり、（１）試料中のＲＮＡをＲＮ
Ａ分解酵素により分解し、モノヌクレオチドを得て、
（２）得られたモノヌクレオチドのうちのＡＭＰを、リ
ン酸基転移酵素によりポリリン酸からリン酸基を転移さ
せ、ＡＤＰに変換せしめ、（３）次いで、ポリリン酸キ
ナーゼにより、前記ＡＤＰをポリリン酸を使ってリン酸
化し、ＡＴＰに変換せしめ、（４）該ＡＴＰをルシフェ
リン及び溶存酸素の存在下でルシフェラーゼと反応さ
せ、生成した発光量を測定し、ＲＮＡ中のＡＭＰを定量
する、という技術的手段を講じた。
め本発明は、以下の４つの反応によりＲＮＡを生物発光
により検出する。つまり、（１）試料中のＲＮＡをＲＮ
Ａ分解酵素により分解し、モノヌクレオチドを得て、
（２）得られたモノヌクレオチドのうちのＡＭＰを、リ
ン酸基転移酵素によりポリリン酸からリン酸基を転移さ
せ、ＡＤＰに変換せしめ、（３）次いで、ポリリン酸キ
ナーゼにより、前記ＡＤＰをポリリン酸を使ってリン酸
化し、ＡＴＰに変換せしめ、（４）該ＡＴＰをルシフェ
リン及び溶存酸素の存在下でルシフェラーゼと反応さ
せ、生成した発光量を測定し、ＲＮＡ中のＡＭＰを定量
する、という技術的手段を講じた。
【００１７】これにより、試料中のＲＮＡを単離し、得
られたヌクレオチドのうちのＡＭＰを、ＡＤＰに変換
し、次いで、ＡＤＰからＡＴＰに変換せしめるが、この
とき、ポリリン酸及びポリリン酸合成酵素を添加させる
ので、ＡＭＰからＡＤＰを経てＡＴＰへの変換が十分に
行われる。また生物発光で生じたＡＭＰが同反応により
再びＡＴＰまで再生される。つまり、生物発光の発光量
を減衰することなく、安定に持続させることができ、安
価でかつ構造が簡単なルミノメータによりＲＮＡ中のＡ
ＭＰを検出することが可能となる。
られたヌクレオチドのうちのＡＭＰを、ＡＤＰに変換
し、次いで、ＡＤＰからＡＴＰに変換せしめるが、この
とき、ポリリン酸及びポリリン酸合成酵素を添加させる
ので、ＡＭＰからＡＤＰを経てＡＴＰへの変換が十分に
行われる。また生物発光で生じたＡＭＰが同反応により
再びＡＴＰまで再生される。つまり、生物発光の発光量
を減衰することなく、安定に持続させることができ、安
価でかつ構造が簡単なルミノメータによりＲＮＡ中のＡ
ＭＰを検出することが可能となる。
【００１８】また、前記ポリリン酸は、化学合成により
生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも１０
〜１００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いる
とよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリ
ン化物（ＭＩ ３Ｐ）が少なくとも１０〜１００個含まれ
ているので、ＡＭＰからＡＤＰを経てＡＴＰへの変換が
十分に行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり
経済的となる。
生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも１０
〜１００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いる
とよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリ
ン化物（ＭＩ ３Ｐ）が少なくとも１０〜１００個含まれ
ているので、ＡＭＰからＡＤＰを経てＡＴＰへの変換が
十分に行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり
経済的となる。
【００１９】そして、前記ポリリン酸は、バクテリア由
来のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１０
００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いると、
耐熱性、耐菌性が向上する。
来のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１０
００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いると、
耐熱性、耐菌性が向上する。
【００２０】さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリ
ン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれ
ば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化
合物を安価に生成することが可能となる。
ン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれ
ば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化
合物を安価に生成することが可能となる。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明の実施の形態を説明する。
まず、試料中のＲＮＡを単離する方法は公知の方法で行
なうとよい。例えば、加水分解、遠心分離、電気泳動の
いずれか又は組み合わせによりＲＮＡを単離する方法を
以下に述べる。
まず、試料中のＲＮＡを単離する方法は公知の方法で行
なうとよい。例えば、加水分解、遠心分離、電気泳動の
いずれか又は組み合わせによりＲＮＡを単離する方法を
以下に述べる。
【００２２】細胞からＲＮＡを単離するには遠心分離を
用いるとよい。例えば、酵母の全ＲＮＡの抽出は細胞の
摩砕物をフェノールで処理して巨大分子の水素結合を切
り、タンパク質の変性を起こす。不透明な懸濁液を遠心
分離にかけると２相に分かれ、下側のフェノールの相は
ＤＮＡを含み、上側の水相は炭水化物とＲＮＡを含む。
変性したタンパク質はさらに遠心分離によって除き、次
に、ＲＮＡをアルコールで沈殿させ、得られた生成物は
ＤＮＡは含まないが、多糖類を夾雑しており、それ以上
の精製はアミラーゼで処理することによって行なう。
用いるとよい。例えば、酵母の全ＲＮＡの抽出は細胞の
摩砕物をフェノールで処理して巨大分子の水素結合を切
り、タンパク質の変性を起こす。不透明な懸濁液を遠心
分離にかけると２相に分かれ、下側のフェノールの相は
ＤＮＡを含み、上側の水相は炭水化物とＲＮＡを含む。
変性したタンパク質はさらに遠心分離によって除き、次
に、ＲＮＡをアルコールで沈殿させ、得られた生成物は
ＤＮＡは含まないが、多糖類を夾雑しており、それ以上
の精製はアミラーゼで処理することによって行なう。
【００２３】ＲＮＡを構成塩基に分解するには、加水分
解するとよい。すなわち、ＲＮＡのペプチド結合を分解
するためＲＮＡ分解酵素で処理し、５’-モノヌクレオ
チド（ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰ）に加水分解
される。ＲＮＡ分解酵素としては公知のものを用いると
よく、例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いる。
解するとよい。すなわち、ＲＮＡのペプチド結合を分解
するためＲＮＡ分解酵素で処理し、５’-モノヌクレオ
チド（ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰ）に加水分解
される。ＲＮＡ分解酵素としては公知のものを用いると
よく、例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いる。
【００２４】従来は、このようにして生成した塩基を、
ペーパークロマトグラフィーにより分離し、紫外線で検
出したり、ｐＨ３．５のクエン酸緩衝液中では構成塩基
が各々全く異なる電荷をもつので、電気泳動によって分
けたり、さらに、強酸性のイオン交換カラムで分離し、
その特性的な紫外吸収スペクトルを用いて同定してい
た。
ペーパークロマトグラフィーにより分離し、紫外線で検
出したり、ｐＨ３．５のクエン酸緩衝液中では構成塩基
が各々全く異なる電荷をもつので、電気泳動によって分
けたり、さらに、強酸性のイオン交換カラムで分離し、
その特性的な紫外吸収スペクトルを用いて同定してい
た。
【００２５】本発明では、ＲＮＡをＲＮＡ分解酵素によ
り加水分解して構成塩基に分解し、得られた５’ＡＭ
Ｐ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰのヌクレオチドのうち、
５’ＡＭＰについて、これをＡＤＰに変換し、次いで、
ＡＴＰに変換し、ＡＴＰをルシフェリン／ルシフェラー
ゼ反応させて取り出したＡＭＰ量を推定するのである。
り加水分解して構成塩基に分解し、得られた５’ＡＭ
Ｐ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰのヌクレオチドのうち、
５’ＡＭＰについて、これをＡＤＰに変換し、次いで、
ＡＴＰに変換し、ＡＴＰをルシフェリン／ルシフェラー
ゼ反応させて取り出したＡＭＰ量を推定するのである。
【化２】
【００２６】上記反応においてＡＭＰからＡＴＰへの変
換は、ポリリン酸化合物（polyPn）の存在下で、ＡＭＰ
をAMP-polyPホスホトランスフェラーゼ（リン酸基転移
酵素：ＡＰＰ）と反応させてＡＤＰに変換せしめる反応
（３）と、ポリリン酸化合物（polyPn-1）の存在下で、
前記ＡＤＰをポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）と反応させ
て、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyP n-2）に変換
せしめる反応（４）とからなる。また、ＡＴＰのルシフ
ェリン／ルシフェラーゼ反応は、（１）のようにＡＴ
Ｐ、ルシフェリン、溶存酸素（図示せず）及び酵素の失
活抑制を目的としたマグネシウムイオンなど金属イオン
（図示せず）に、ルシフェラーゼを作用させると、ＡＭ
Ｐ、ピロリン酸、オキシルシフェリン、炭酸ガス（図示
せず）及び光を生成する反応（２）が行われ、このルシ
フェラーゼにより発生する光を測定することで、ＡＴＰ
量を検出することができ、これにより、ＡＴＰ変換前の
ＡＭＰ量を推定することができる。
換は、ポリリン酸化合物（polyPn）の存在下で、ＡＭＰ
をAMP-polyPホスホトランスフェラーゼ（リン酸基転移
酵素：ＡＰＰ）と反応させてＡＤＰに変換せしめる反応
（３）と、ポリリン酸化合物（polyPn-1）の存在下で、
前記ＡＤＰをポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）と反応させ
て、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyP n-2）に変換
せしめる反応（４）とからなる。また、ＡＴＰのルシフ
ェリン／ルシフェラーゼ反応は、（１）のようにＡＴ
Ｐ、ルシフェリン、溶存酸素（図示せず）及び酵素の失
活抑制を目的としたマグネシウムイオンなど金属イオン
（図示せず）に、ルシフェラーゼを作用させると、ＡＭ
Ｐ、ピロリン酸、オキシルシフェリン、炭酸ガス（図示
せず）及び光を生成する反応（２）が行われ、このルシ
フェラーゼにより発生する光を測定することで、ＡＴＰ
量を検出することができ、これにより、ＡＴＰ変換前の
ＡＭＰ量を推定することができる。
【００２７】この反応の要点について以下に述べる。ま
ず、ＲＮＡから加水分解により取り出した５’ＡＭＰが
反応（３）によりＡＤＰに変換された後、反応（４）で
ＡＤＰがＡＴＰに変換される。そして、このＡＴＰが反
応（１）に供され、ＡＴＰが消費されて発光する。以
下、ＡＴＰの消費系となる反応（１）（２）と、ＡＴＰ
への変換系となる反応（３）（４）（５）とが連続的に
繰り返し行われる。この発光は、ポリリン酸化合物のリ
ン化物（ＭＩ ３Ｐ）の量に依存して生物発光の光量の増
強効果を得るとともに、発光時間を持続させることがで
き、１０分間以上にわたって安定であり、１時間以上経
過後も殆ど減衰することなく安定であることが確認され
ている。
ず、ＲＮＡから加水分解により取り出した５’ＡＭＰが
反応（３）によりＡＤＰに変換された後、反応（４）で
ＡＤＰがＡＴＰに変換される。そして、このＡＴＰが反
応（１）に供され、ＡＴＰが消費されて発光する。以
下、ＡＴＰの消費系となる反応（１）（２）と、ＡＴＰ
への変換系となる反応（３）（４）（５）とが連続的に
繰り返し行われる。この発光は、ポリリン酸化合物のリ
ン化物（ＭＩ ３Ｐ）の量に依存して生物発光の光量の増
強効果を得るとともに、発光時間を持続させることがで
き、１０分間以上にわたって安定であり、１時間以上経
過後も殆ど減衰することなく安定であることが確認され
ている。
【００２８】ところで、前記ＡＭＰからＡＤＰに変換す
る反応（３）においては、ポリリン酸化合物（polyPn）
の存在下で、前記ＡＭＰをAMP−polyPホスホトランスフ
ェラーゼ（リン酸基転移酵素：ＡＰＰ）と反応させる
と、ポリリン酸化合物からリン化物（ＭＩ ３Ｐ）が１個
消費されて、ＡＤＰ及びポリリン酸化合物（polyPn-1）
に変換される。そして、前記ＡＤＰからＡＴＰに変換す
る反応（４）においては、ポリリン酸化合物（polyP
n−１）の存在下で、前記ＡＤＰをポリリン酸キナーゼ
（ＰＰＫ）と反応させると、ポリリン酸化合物（polyP
n-1）からリン化物（ＭＩ ３Ｐ）がさらに１個消費され
て、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPn-２）に変換
される。このとき、ポリリン酸化合物としては、少なく
とも１０以上のリン化物（ＭＩ ３Ｐ）が直鎖状に重合し
たものでなければ、反応に寄与しない。
る反応（３）においては、ポリリン酸化合物（polyPn）
の存在下で、前記ＡＭＰをAMP−polyPホスホトランスフ
ェラーゼ（リン酸基転移酵素：ＡＰＰ）と反応させる
と、ポリリン酸化合物からリン化物（ＭＩ ３Ｐ）が１個
消費されて、ＡＤＰ及びポリリン酸化合物（polyPn-1）
に変換される。そして、前記ＡＤＰからＡＴＰに変換す
る反応（４）においては、ポリリン酸化合物（polyP
n−１）の存在下で、前記ＡＤＰをポリリン酸キナーゼ
（ＰＰＫ）と反応させると、ポリリン酸化合物（polyP
n-1）からリン化物（ＭＩ ３Ｐ）がさらに１個消費され
て、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPn-２）に変換
される。このとき、ポリリン酸化合物としては、少なく
とも１０以上のリン化物（ＭＩ ３Ｐ）が直鎖状に重合し
たものでなければ、反応に寄与しない。
【００２９】つまり、ポリリン酸化合物（polyPn）とし
て１０≦ｎ≦１００のものを用いると、１分子中にリン
化物（ＭＩ ３Ｐ）が少なくとも１０〜１００個含まれて
いるから、ＡＭＰからＡＤＰへの変換、及びＡＤＰから
ＡＴＰへの変換の際に、リン化物（ＭＩ ３Ｐ）が不足す
ることがなく変換がスムーズに行われる。このため、変
換系においては、リン化物（ＭＩ ３Ｐ）の供給が少量で
よく、経済的になる。
て１０≦ｎ≦１００のものを用いると、１分子中にリン
化物（ＭＩ ３Ｐ）が少なくとも１０〜１００個含まれて
いるから、ＡＭＰからＡＤＰへの変換、及びＡＤＰから
ＡＴＰへの変換の際に、リン化物（ＭＩ ３Ｐ）が不足す
ることがなく変換がスムーズに行われる。このため、変
換系においては、リン化物（ＭＩ ３Ｐ）の供給が少量で
よく、経済的になる。
【００３０】さらに、ポリリン酸化合物が熱にさらされ
た場合であっても、リン化物（ＭＩ ３Ｐ）が直鎖状に重
合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０
℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そし
て、リン化物（ＭＩ ３Ｐ）が直鎖状に重合しているた
め、細菌中に存在する酵素であっても分解されにくい。
た場合であっても、リン化物（ＭＩ ３Ｐ）が直鎖状に重
合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０
℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そし
て、リン化物（ＭＩ ３Ｐ）が直鎖状に重合しているた
め、細菌中に存在する酵素であっても分解されにくい。
【００３１】例えば、本発明で用いられるポリリン酸化
合物（polyPn）は、以下の構造式によって表される。こ
こで（polyPn）は１０≦ｎ≦１００の範囲が好ましい。
合物（polyPn）は、以下の構造式によって表される。こ
こで（polyPn）は１０≦ｎ≦１００の範囲が好ましい。
【化３】
【００３２】前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来
のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１００
０個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いると、１
０〜１０００個のリン化物（ＭＩ ３Ｐ）が重合している
ので、耐熱性、耐菌性が向上する。
のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１００
０個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いると、１
０〜１０００個のリン化物（ＭＩ ３Ｐ）が重合している
ので、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００３３】ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、Ａ
ＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上
して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能と
なる。例えば、以下の反応式に示すようにポリリン酸化
合物を、ＡＴＰから生合成する。
ＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上
して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能と
なる。例えば、以下の反応式に示すようにポリリン酸化
合物を、ＡＴＰから生合成する。
【化４】
【００３４】上記反応式によるポリリン酸化合物の生合
成は、例えば、特開平5-153993号公報などに開示された
従来のポリリン酸の製造方法を利用すればよい。本実施
形態では、ポリリン酸合成酵素を触媒として、ポリリン
酸合成酵素とＡＴＰと酵素の失活抑制を目的としたマグ
ネシウムなどの金属イオンとを反応させ、ポリリン酸化
合物を生合成する。本実施形態に使用されるポリリン酸
合成酵素はポリリン酸化合物を生合成し得るものであれ
ばよい。
成は、例えば、特開平5-153993号公報などに開示された
従来のポリリン酸の製造方法を利用すればよい。本実施
形態では、ポリリン酸合成酵素を触媒として、ポリリン
酸合成酵素とＡＴＰと酵素の失活抑制を目的としたマグ
ネシウムなどの金属イオンとを反応させ、ポリリン酸化
合物を生合成する。本実施形態に使用されるポリリン酸
合成酵素はポリリン酸化合物を生合成し得るものであれ
ばよい。
【００３５】
【実施例１】酵母からのＲＮＡの単離 試薬と器具 １．乾燥酵母 200g ２．フェノール溶液（900g/l） 1l ３．酢酸カリウム（200g/l,pH5） 200mg ４．純エタノール 3l ５．ジエチルエーテル 500mg ６．37℃の恒温槽 5台 方法 予め37℃に加温しておいた水120ml中に、30gの乾燥酵母
を懸濁させる。この温度に15分間保ち、160mlの濃フェ
ノール溶液を加える。懸濁液を室温で30分間機械的に攪
拌した後、エマルジョンを破壊するため、冷所で15分
間、3000Gで遠心分離する。上部の水層を駒込ピペット
で注意深く取り、10000Gで5分間、冷却遠心器で遠心分
離し、変性したタンパク質を沈降させる。上澄液に酢酸
カリウムを最終濃度20g/lとなるように加え、2倍量のエ
タノールを加えてＲＮＡを沈殿させる。溶液を氷中で冷
却し、１時間放置した後、冷所で2000Gで5分間遠心分離
して沈殿を集める。このＲＮＡをエタノール水溶液、エ
タノール、そして最後にエーテルで洗浄し、空気中で乾
かすと、酵母の乾燥重量の約４％のＲＮＡを単離するこ
とができた。
を懸濁させる。この温度に15分間保ち、160mlの濃フェ
ノール溶液を加える。懸濁液を室温で30分間機械的に攪
拌した後、エマルジョンを破壊するため、冷所で15分
間、3000Gで遠心分離する。上部の水層を駒込ピペット
で注意深く取り、10000Gで5分間、冷却遠心器で遠心分
離し、変性したタンパク質を沈降させる。上澄液に酢酸
カリウムを最終濃度20g/lとなるように加え、2倍量のエ
タノールを加えてＲＮＡを沈殿させる。溶液を氷中で冷
却し、１時間放置した後、冷所で2000Gで5分間遠心分離
して沈殿を集める。このＲＮＡをエタノール水溶液、エ
タノール、そして最後にエーテルで洗浄し、空気中で乾
かすと、酵母の乾燥重量の約４％のＲＮＡを単離するこ
とができた。
【００３６】
【実施例２】ＲＮＡ分解によるヌクレオチドの生成 試薬と器具 １．市販のｔＲＮＡ 2μｌ ２．付属緩衝液（buffer） 1μｌ ３．蒸留水 6.5μｌ ４．ヌクレアーゼＳ１ 0.5μｌ 方法 市販のｔＲＮＡ 2μｌを、付属緩衝液 1μｌ、蒸留水
6.5μｌ、ヌクレアーゼＳ１ 0.5μｌに溶かし、37℃で1
0分間インキュベートした。そして、生じた5’-モノヌ
クレオチドうち、ＡＭＰを以下の反応によりＡＴＰに変
換し、生物発光測定にて測定する。
6.5μｌ、ヌクレアーゼＳ１ 0.5μｌに溶かし、37℃で1
0分間インキュベートした。そして、生じた5’-モノヌ
クレオチドうち、ＡＭＰを以下の反応によりＡＴＰに変
換し、生物発光測定にて測定する。
【００３７】
【実施例３】 生物発光測定によるＡＭＰヌクレオチドの同定 試薬 １．ポリリン酸キナーゼ緩衝液（ＰＰＫbuffer） ３μｌ ２．0.1mM（濃度）アデノシン１リン酸（ＡＭＰ） ３μｌ ３．30 mM（濃度）ポリリン酸化合物（PolyP） ３μｌ ４．イオン交換水 １９μｌ ５．ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ） １μｌ ６．AMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＰ） １μｌ 方法 上記１．〜６．の試薬を、温度３０℃の条件でインキュ
ベートし、反応後５分、１５分、６０分に１０μｌずつ
サンプリングを行った。そして、１０μｌルシフェリン
及び５μｌルシフェラーゼを添加済みの測定用ウェルに
全量を添加し、生成する発光量をルミノメータ（ＡＲＶ
Ｏ社製）にて測定した。
ベートし、反応後５分、１５分、６０分に１０μｌずつ
サンプリングを行った。そして、１０μｌルシフェリン
及び５μｌルシフェラーゼを添加済みの測定用ウェルに
全量を添加し、生成する発光量をルミノメータ（ＡＲＶ
Ｏ社製）にて測定した。
【００３８】発光量からそれぞれの経過時間におけるＡ
ＴＰ容量を知ることができ、これを図１に示す。これに
より、反応後５分、１５分、６０分と時間を経るととも
にＡＴＰ容量が増加していることが分かる。この実験か
らポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）及びAMP−polyP ホス
ホトランスフェラーゼ（ＡＰＰ）の２つの酵素によりＡ
ＭＰからＡＴＰを生成することができることが示され
た。従って、これらの反応はＡＴＰ変換系として使うこ
とが可能であるとともに、ＡＭＰを生物発光により検出
し、ＲＮＡ構成ヌクレオチドのＡＭＰを同定することが
できる。
ＴＰ容量を知ることができ、これを図１に示す。これに
より、反応後５分、１５分、６０分と時間を経るととも
にＡＴＰ容量が増加していることが分かる。この実験か
らポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）及びAMP−polyP ホス
ホトランスフェラーゼ（ＡＰＰ）の２つの酵素によりＡ
ＭＰからＡＴＰを生成することができることが示され
た。従って、これらの反応はＡＴＰ変換系として使うこ
とが可能であるとともに、ＡＭＰを生物発光により検出
し、ＲＮＡ構成ヌクレオチドのＡＭＰを同定することが
できる。
【００３９】
【実施例４】 生物発光測定によるＲＮＡの検出 試薬 １．ポリリン酸キナーゼ緩衝液（ＰＰＫbuffer） ４μｌ ２．実施例２で生じるＲＮＡの分解物 ２μｌ ３．30 mM（濃度）ポリリン酸化合物（PolyP） ２μｌ ４．イオン交換水 ７μｌ ５．ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ） ２μｌ ６．AMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＰ） ３μｌ 方法 上記１．〜６．の試薬を、温度３０℃の条件でインキュ
ベートし、６０分反応後、１０μｌルシフェリン及び５
μｌルシフェラーゼを添加済みの測定用ウェルに全量を
添加し、生成する発光量をルミノメータ（ＡＲＶＯ社
製）にて測定した。
ベートし、６０分反応後、１０μｌルシフェリン及び５
μｌルシフェラーゼを添加済みの測定用ウェルに全量を
添加し、生成する発光量をルミノメータ（ＡＲＶＯ社
製）にて測定した。
【００４０】発光量を図２の最上段に示す。対照とし
て、ヌクレアーゼによる分解に供していないＲＮＡサン
プルを試薬２のかわりに添加したもの（図２、２段
目）、ならびにＲＮＡを添加せず、ヌクレアーゼだけの
試料を添加したもの（図２、３段目）を用いた。これに
より、ＲＮＡが分解されることが生物発光するために必
要であることがわかる。すなわちＲＮＡの分解によって
ＡＭＰが生じることが必要であることがわかる。また純
粋なＡＭＰを試料とした場合、ＡＴＰが生成し、生物発
光した（図２、４段目）。また実施例２で生じるＲＮＡ
の分解物を添加するが、ポリリン酸キナーゼ、AMP−pol
yP ホスホトランスフェラーゼを添加しないものを図
２、５段目に示す。この場合、ＡＭＰからＡＴＰが生成
しないので、生物発光しない。これらのことから、ＲＮ
Ａの構成ヌクレオチドであるＡＭＰをＡＴＰまで生成さ
せ、生物発光させることにより、ＲＮＡを検出すること
ができる。ＲＮＡの検出感度は生物発光によるＡＴＰの
検出感度に依存するので、その検出感度は非常に高い。
て、ヌクレアーゼによる分解に供していないＲＮＡサン
プルを試薬２のかわりに添加したもの（図２、２段
目）、ならびにＲＮＡを添加せず、ヌクレアーゼだけの
試料を添加したもの（図２、３段目）を用いた。これに
より、ＲＮＡが分解されることが生物発光するために必
要であることがわかる。すなわちＲＮＡの分解によって
ＡＭＰが生じることが必要であることがわかる。また純
粋なＡＭＰを試料とした場合、ＡＴＰが生成し、生物発
光した（図２、４段目）。また実施例２で生じるＲＮＡ
の分解物を添加するが、ポリリン酸キナーゼ、AMP−pol
yP ホスホトランスフェラーゼを添加しないものを図
２、５段目に示す。この場合、ＡＭＰからＡＴＰが生成
しないので、生物発光しない。これらのことから、ＲＮ
Ａの構成ヌクレオチドであるＡＭＰをＡＴＰまで生成さ
せ、生物発光させることにより、ＲＮＡを検出すること
ができる。ＲＮＡの検出感度は生物発光によるＡＴＰの
検出感度に依存するので、その検出感度は非常に高い。
【００４１】
【発明の効果】以上のように本発明によれば、試料中の
ＲＮＡを単離し、得られたヌクレオチドのうちのＡＭＰ
を、ポリリン酸存在下で、リン酸基転移酵素と反応させ
てＡＤＰに変換せしめ、次いで、生じたＡＤＰをポリリ
ン酸合成酵素と反応させてＡＴＰに変換せしめる。該Ａ
ＴＰをルシフェリン及び溶存酸素の存在下でルシフェラ
ーゼと反応させ、生成した発光量を測定することによ
り、ＲＮＡ中のＡＭＰを定量する。また生物発光により
生じるＡＭＰを、同反応によりＡＤＰに変換し、次い
で、ＡＤＰからＡＴＰに変換するので、生物発光の発光
量を減衰することなく安定に持続させ、安価でかつ構造
が簡単なルミノメータによりＲＮＡ中のＡＭＰを検出す
ることが可能となる。
ＲＮＡを単離し、得られたヌクレオチドのうちのＡＭＰ
を、ポリリン酸存在下で、リン酸基転移酵素と反応させ
てＡＤＰに変換せしめ、次いで、生じたＡＤＰをポリリ
ン酸合成酵素と反応させてＡＴＰに変換せしめる。該Ａ
ＴＰをルシフェリン及び溶存酸素の存在下でルシフェラ
ーゼと反応させ、生成した発光量を測定することによ
り、ＲＮＡ中のＡＭＰを定量する。また生物発光により
生じるＡＭＰを、同反応によりＡＤＰに変換し、次い
で、ＡＤＰからＡＴＰに変換するので、生物発光の発光
量を減衰することなく安定に持続させ、安価でかつ構造
が簡単なルミノメータによりＲＮＡ中のＡＭＰを検出す
ることが可能となる。
【００４２】また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成
により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくと
も１０〜１００個のリン化物が直鎖状に重合したものを
用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子
中にリン化物（ＭＩ ３Ｐ）が少なくとも１０〜１００個
含まれているので、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が容易に
行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり経済的
になる。
により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくと
も１０〜１００個のリン化物が直鎖状に重合したものを
用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子
中にリン化物（ＭＩ ３Ｐ）が少なくとも１０〜１００個
含まれているので、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が容易に
行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり経済的
になる。
【００４３】そして、前記ポリリン酸化合物は、バクテ
リア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０
〜１０００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用い
ると、耐熱性、耐菌性が向上する。
リア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０
〜１０００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用い
ると、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００４４】さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリ
ン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれ
ば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化
合物を安価に生成することが可能となる。
ン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれ
ば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化
合物を安価に生成することが可能となる。
【図１】ＡＴＰ変換の経過時間におけるＡＴＰ容量変化
を示す図である。
を示す図である。
【図２】ＲＮＡの生物発光による検出の比較図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 正太郎 広島県東広島市西条町寺家7899沖本ハイツ Ａ101 Ｆターム(参考） 2G054 AA08 AB07 CA21 CE01 EA02 4B063 QA01 QA18 QQ52 QR03 QR07 QR14 QR58 QS02 QX02
Claims (4)
- 【請求項１】 以下の４つの反応によりＲＮＡを生物発
光により検出する方法。 （１）試料中のＲＮＡをＲＮＡ分解酵素により分解し、
モノヌクレオチドを得て、（２）得られたモノヌクレオ
チドのうちのＡＭＰを、リン酸基転移酵素によりポリリ
ン酸からリン酸基を転移させ、ＡＤＰに変換せしめ、
（３）次いで、ポリリン酸キナーゼにより、前記ＡＤＰ
をポリリン酸を使ってリン酸化し、ＡＴＰに変換せし
め、（４）該ＡＴＰをルシフェリン及び溶存酸素の存在
下でルシフェラーゼと反応させ、生成した発光量を測定
し、ＲＮＡ中のＡＭＰを定量する。 - 【請求項２】 前記ポリリン酸は、化学合成により生成
されたポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１
００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いてなる
請求項１記載の生物発光によりＲＮＡを検出する方法。 - 【請求項３】 前記ポリリン酸は、バクテリア由来のポ
リリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１０００個
のリン化物が直鎖状に重合したものを用いてなる請求項
１記載の生物発光によりＲＮＡを検出する方法。 - 【請求項４】 前記ポリリン酸は、ポリリン酸合成酵素
の触媒作用により、ＡＴＰから生合成してなる請求項３
記載の生物発光によりＲＮＡを検出する方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000112790A JP3864032B2 (ja) | 2000-04-14 | 2000-04-14 | 生物発光によりｒｎａを検出する方法 |
| PCT/JP2001/000238 WO2001053513A1 (fr) | 2000-01-17 | 2001-01-17 | Systemes et procede de reaction de regeneration atp permettant d'examiner le nucleotide d'adenine, procede de detection d'arn et procede d'amplification d'atp |
| EP01901364A EP1264894A4 (en) | 2000-01-17 | 2001-01-17 | REACTION SYSTEMS FOR ATP REGENERATION AND METHOD FOR THE CONTROL OF ADENIN NUCLEOTIDES, METHOD FOR THE DETECTION OF RNA AND METHOD FOR THE AMPLIFICATION OF ATP USING THEREOF |
| CN01803798.4A CN1191370C (zh) | 2000-01-17 | 2001-01-17 | Atp再生反应系统、利用该系统的腺苷酸的检验方法、rna检测方法和atp放大方法 |
| US10/188,091 US20030064394A1 (en) | 2000-01-17 | 2002-07-03 | ATP-regeneration reaction system, and method for examining adenine nucleotide, method for detecting RNA and method for amplifying ATP, using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000112790A JP3864032B2 (ja) | 2000-04-14 | 2000-04-14 | 生物発光によりｒｎａを検出する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001292798A true JP2001292798A (ja) | 2001-10-23 |
| JP3864032B2 JP3864032B2 (ja) | 2006-12-27 |
Family
ID=18624886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000112790A Expired - Lifetime JP3864032B2 (ja) | 2000-01-17 | 2000-04-14 | 生物発光によりｒｎａを検出する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3864032B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009513105A (ja) * | 2003-06-30 | 2009-04-02 | バイオタージ アクチボラゲット | 放出されたピロリン酸を検出することによるオリゴヌクレオチド連結アッセイ |
-
2000
- 2000-04-14 JP JP2000112790A patent/JP3864032B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009513105A (ja) * | 2003-06-30 | 2009-04-02 | バイオタージ アクチボラゲット | 放出されたピロリン酸を検出することによるオリゴヌクレオチド連結アッセイ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3864032B2 (ja) | 2006-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1259555A (en) | Method and kit for detecting polyriboadenosine segments and messenger rna | |
| US6270974B1 (en) | Exogenous nucleic acid detection | |
| US6653078B2 (en) | Multiplex method for nucleic acid detection | |
| US6277578B1 (en) | Deploymerization method for nucleic acid detection of an amplified nucleic acid target | |
| US8790873B2 (en) | DNA ligation on RNA template | |
| US20050214753A1 (en) | Detection of nucleic acid hybrids | |
| US20030064394A1 (en) | ATP-regeneration reaction system, and method for examining adenine nucleotide, method for detecting RNA and method for amplifying ATP, using the same | |
| CN108699599A (zh) | 获得和校正生物序列信息的方法 | |
| JPS61254856A (ja) | ポリヌクレオチド置換、分離、酵素開裂、およびアデノシンリン酸検出を用いる診断用試薬、キットおよび方法 | |
| WO2012077819A1 (ja) | 標的核酸の検出方法及びキット | |
| CN107190056A (zh) | 微生物核酸的定性和定量检测 | |
| CN107604097A (zh) | 用于多种参数的对照核酸 | |
| JP2002525129A (ja) | ポリヌクレオチドを分析するための方法 | |
| EP1378575A1 (en) | Method of detecting inorganic phosphoric acid, pyrophosphoric acid and nucleic acid and method of typing snp sequence of dna | |
| Chaney et al. | Incorporation of water oxygens into intracellular nucleotides and RNA: II. Predominantly hydrolytic RNA turnover in Escherichia coli | |
| JP2001292798A (ja) | 生物発光によりｒｎａを検出する方法 | |
| CN107075552A (zh) | 利用弗氏志贺菌腺苷三磷酸双磷酸酶的分析和诊断方法 | |
| CN111979295B (zh) | 一种酪氨酸磷酸酶生物传感器及其检测方法与应用 | |
| AU774085B2 (en) | Multiplex method for nucleic acid detection | |
| CN114250272A (zh) | 一种基于crispr的荧光生物传感器及其在dna糖基化酶检测中的应用 | |
| JP3301876B2 (ja) | 特定のポリヌクレオチドの検出方法及び当該方法に用いる検出用キット | |
| KR102610767B1 (ko) | 자가혈당측정기를 이용한 유전자 검출 방법 | |
| WO2023125898A1 (zh) | 核酸检测方法与系统 | |
| Yuan et al. | PT-seq: A method for metagenomic analysis of phosphorothioate epigenetics in complex microbial communities | |
| CN104561239A (zh) | 一种atp的检测系统 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050620 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050818 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20060118 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060118 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060307 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060427 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060616 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060905 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20061002 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091006 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101006 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111006 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121006 Year of fee payment: 6 |