CN104561239A - 一种atp的检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明一种ATP的检测系统，细胞和生物样品中的细胞材料的非常低的水平的方法，组合物和试剂盒。核酸检测系统利用加上pyrophosphorylation磷酸核糖焦磷酸合成酶催化产生无论是三磷酸脱氧核糖核苷或核糖核苷三磷酸的各种聚合酶或核酸酶消化催化焦磷酸解反应。dNTPs浓度转化为ATP的核苷二磷酸激酶的作用。这些反应产生的ATP可被检测到的荧光素酶或NADH的检测系统。如果需要更灵敏的检测，NTPs和dNTPs浓度的扩增方案中所提供的。样品中的细胞或细胞物质的检测系统，其特征在于，AMP和磷酸供体的高能量被转换为内源酶的作用，随后检测的ATP的ATP加入到样品。

Description

一种ATP的检测系统

发明领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种ATP的检测系统。

发明背景

目前的准则规定，存在于重组治疗性蛋白质的核酸量小于10 pg的每日剂量的重组蛋白的DNA。因此，用于检测核酸的量极低的方法是必要的。这种方法也将得到广泛的使用，法医样品中的DNA的定量。 已经描述的核酸检测的低水平的几种方法。第一种方法是基于经典的杂交技术。此方法利用放射性标记的核酸探针结合到感兴趣的DNA。然而，这种方法有几个缺点，包括再现性差，产生大量废试剂，引起的非特异性结合的高背景水平。此外，这种技术用于确定低量的未知序列的DNA的存在通常是不适当的 检测核酸的第二种方法利用能够插入到核酸的荧光染料。然而，如清洁剂，蛋白质和脂质的许多干扰物质影响通过该方法产生的信号的再现性， 利用生物素化的检测的DNA的水平低的第三种方法的单链DNA结合蛋白（SSB），链霉抗生物素蛋白，抗稠合到脲酶DNA抗体，以及作为试剂的生物素化的硝化纤维素。此法是市售Kung等分子器件和描述，皮克总DNA定量使用SNA-结合蛋白在硅基于传感器的系统，肛交。生物化学。187：220-27（1990）。该试剂盒的操作，允许将要形成一个复杂的的链霉抗生物素蛋白，生物素，SSB，抗DNA抗体一起孵育。然后将复合体上的生物素化的过滤器捕获，洗涤，读取捕获的脲酶的量。此方法是高度敏感的，但是有几个缺点。这些缺点包括昂贵的试剂和广泛的控制的需要。 第四种方法包括解聚或降解核酸和检测由荧光素酶的ATP。多核苷酸聚合酶的核酸在细胞中的合成负责。这些酶也能够德意志和Kornberg，脱氧核糖核酸酶催化合成，生物化学杂志中所描述的催化其它反应。化学 244（11）:3019-28（1969）。很多，但不是全部，聚合酶能够解聚磷酸盐或焦磷酸盐存在下，无论是在核酸 的美国专利。第4735897号描述了一种方法，检测的多聚腺苷酸化，信使RNA（聚（A）-mRNA的）。解聚的聚（A）-mRNA的磷酸盐的存在已被证实会导致在形成ADP，它可以被转换为ATP由丙酮酸激酶或肌酸磷酸激酶。RNA也可通过核糖核酸酶消化AMP，腺苷酸激酶转化为ADP，然后转换为ATP的丙酮酸激酶 的ATP这样生产的荧光素酶检测系统检测。在ATP和O2的存在下，荧光素酶催化荧光素的氧化作用，产生光，然后可以使用光度计定量。其他反应的副产物是AMP的磷酸盐，焦磷酸盐和氧合虫荧光素， ATP的产生在所有的生物体中的酶的存在下，也允许使用荧光素酶系统的，用于检测污染细胞的存在或量的样品中，如描述在美国专利。第5648232号。例如，可能会增加ADP怀疑含有污染细胞的样品。转换的ADP转化为ATP酶的细胞的荧光素酶测定法检测，如上所述。这种方法的缺点是相对不稳定的ADP衬底， 这是本领域需要的是可靠的，成本效益的方法，核酸，细胞，细胞物质在多种类型的样品的检测非常低的水平。本发明公开了新颖的方法，用于检测的DNA，RNA和细胞数量低。这些方法利用焦磷酸或核酸酶降解的新颖的组合，转换为ATP的dNTPs，直接向ATP，AMP的转化，扩增的ATP敏感性增加，寡核苷酸探针的解聚，和优化的反应条件。

发明内容

甲需要由重组方法产生的蛋白质的质量控制检测。目前的指引建议，重组蛋白制剂应含有小于10微微克的核酸。也有必要可以定量取证样品中核酸的非常低的水平。因此，它是本发明的一个目的是提供用于检测低量的核酸和低数量的细胞或细胞物质的方法。这也是本发明的一个目的是提供用于检测核酸和检测核酸的试剂盒组合物， 在本发明的一个实施例中，提供一种方法，用于检测和/或在一个反应体系中磷酸盐测定脱氧核糖核酸腺苷5'-二磷酸，或它们的组合。该方法包括的核酸酶裂解的终端internucleoside的磷酸二酯键和重整与焦磷酸盐分子相同，根据下列反应，以形成脱氧核糖核苷三磷酸分子在末端核苷酸：选自下组的DNA聚合酶或逆转录酶催化的解聚 T4聚合酶，Taq DNA聚合酶，AMV反转录酶，MMLV逆转录酶组成的。解聚工序中的定量测定核酸，重复基本上完成或均衡，取得至少两个从最小3个核苷酸的链的核苷三磷酸分子。检测DNA，无需重复解聚步骤，如果有足够的核酸分子，本以产生一个信号。下一步涉及酶促脱氧核糖核苷三磷酸分子5'端的磷酸基团转移形成腺苷-5'-三磷酸腺苷-5'-二磷酸分子根据下面的反应： 核苷二磷酸激酶的催化式中，P *是终端5 '磷酸转移。最后的步骤是检测的ATP，通过荧光素酶检测系统或NADH的检测系统。的解聚步骤和磷酸转移步骤可任选地在一个单一的一锅反应进行。如果需要更高的灵敏度，所产生的磷酸转移步骤或解聚步骤中生产的国家结核病ATP分子可能被放大，以形成多个ATP分子。 在本发明的另一个实施例中，提供了一种方法，用于检测多聚腺苷酸化的mRNA含有焦磷酸的反应。第一解聚在一个末端核苷酸的多聚腺苷酸化的mRNA的酶裂解终端internucleoside的磷酸二酯键和重整与焦磷酸盐分子相同，根据下列反应，形成游离的ATP分子： 聚（A）聚合酶催化。解聚工序中的RNA的定量测定，重复基本上完成或均衡，取得至少两个从最小3个核苷酸的链的核苷三磷酸分子。检测DNA，无需重复解聚步骤，如果有足够的核酸分子，本以产生一个信号。然后，如此形成的ATP分子的荧光素酶检测系统或NADH检测系统检测。反应的灵敏度可以增加在本发明的另一个实施例中，提供一种方法，用于有选择地检测和/或测定聚（A）mRNA在一个反应体系中，焦磷酸，腺苷5'-二磷酸任选放大ATP分子。 或它们的组合。在该方法中，互补的寡聚（dT）探针的poly（A）mRNA的杂交，形成RNA-DNA杂合体。然后解聚酶裂解终端internucleotide的磷酸二酯键和重整与焦磷酸分子以形成脱氧胸苷-5'-三磷酸的末端核苷酸的寡聚（dT）链的RNA-DNA杂合体。根据下面的反应： TT.sub.n + PP.sub.i.fwdarw.TT.sub.n-1 + dTTP的 利用逆转录酶催化。解聚工序中的定量测定核酸，重复基本上完成或均衡，取得至少两个从最小3个核苷酸的链的核苷三磷酸分子。检测DNA，无需重复解聚步骤，如果有足够的核酸分子，本以产生一个信号。接着，从脱氧胸苷-5'-三磷酸酶的磷酸基团转移到腺苷5'-二磷酸分子形成ATP分子，根据下面的反应： ，其中P * 5'端磷酸转移催化NDPK。最后，如此形成的ATP的荧光素酶检测系统或NADH检测系统的检测。如果所需的敏感性增加，的末端磷酸dTTP的可能被转移到ADP形成ATP上述后跟的扩增所产生的ATP， 在本发明的另一个实施例中，提供一种方法，在一个反应体系中，检测DNA磷酸核糖焦磷酸，腺苷5'-二磷酸，或它们的组合。在该方法中，免费的脱氧核糖核苷单磷酸分子的核酸通过核酸酶消化产生。然后，焦磷酸基酶从磷酸核糖焦磷酸分子转移到脱氧腺苷单磷酸分子以形成脱氧腺苷三磷酸分子根据下面的反应： 磷酸核糖焦磷酸合成酶催化的。接着，从脱氧腺苷三磷酸分子的5'端的磷酸基团转移酶，腺苷5'-二磷酸分子，根据下面的反应形成ATP分子 的dATP * + ADP.fwdarw.dADP + ATP 催化由NDPK其中P *终端5'磷酸转移。如此产生的ATP可被检测到的荧光素酶检测系统或NADH检测系统。如果需要，也可以进行焦磷酸转移步骤和磷酸转移步骤在一个单一的反应锅内。如果增加的敏感性是必要的，ATP分子可能被放大， 本发明的另一个实施例提供了一种方法，检测的RNA，在反应体系中，磷酸核糖焦磷酸。免核糖核苷单磷酸分子是由具有核酸酶消化的RNA。接着，从磷酸核糖焦磷酸分子的焦磷酸分子酶转移磷酸腺苷分子，根据下面的反应形成三磷酸腺苷分子： 磷酸核糖焦磷酸合成酶催化的。如此产生的ATP，然后检测由荧光素酶检测系统或NADH检测系统。如果增加的敏感性是必要的，这样生产的ATP可以被放大， 本发明的另一个实施例提供了一种方法，用于确定细胞和细胞物质存在于样品中的存在和/或量。在该方法中，单元格的内容被释放以形成细胞裂解物。磷酸供体分子和腺苷-5'-单磷酸分子，然后加入细胞裂解物中，根据下列反应，使腺苷5'-二磷酸分子是由来自供体的腺苷-5'-单磷酸酶的磷酸基转移： 存在于细胞裂解物中的内源酶催化的。然后，所产生的酶的磷酸盐转移从供体分子，按照下列反应：本细胞裂解物样品中的内源酶催化腺苷5'-二磷酸分子ATP 。如此产生的腺苷5'-三磷酸，然后由一个荧光素酶检测系统或NADH检测系统检测。在此实施例中的磷酸供体，可以是任一脱氧胞苷-5'-三磷酸，5'-三deoxyguanidine，或脱氧胸苷-5'-三磷酸， 本发明还提供一种组合物的制造从DNA，焦磷酸腺苷-5'-三磷酸的物质，并腺苷5'-二磷酸。此组合物包括核苷二磷酸激酶，在足够的浓度，催化产生ATP从DNA在约皮克微克量的DNA中所提供的核酸聚合酶的混合物，本发明，还提供了一种用于制备组合物的物质。 从DNA，磷酸核糖焦磷酸，5'-二磷酸腺苷三磷酸腺苷。此组合物含有足够的浓度，催化产生三磷酸腺苷，从约皮克微克量的DNA中的磷酸核糖焦磷酸合成酶和核苷二磷酸激酶的混合物，本发明提供了各种用于核酸检测的试剂盒。首先，提供了药盒，其中包含用于检测DNA的焦磷酸的试剂。该试剂盒包含一个容器中的核酸聚合酶和容器中的核苷二磷酸激酶。也可以设置在相同的容器中的核酸聚合酶和核苷二磷酸激酶。第二，提供了药盒，其中包含的核酸检测的试剂，通过核酸酶消化。该套件包含一个容器，含磷酸核糖焦磷酸合成酶和核酸酶的容器中。第三，提供了药盒，其中包含通过焦磷酸水解RNA的检测试剂。该套件包含的容器中的poly（A）聚合酶。第四，提供的试剂盒，包含用于检测DNA的核酸酶消化的试剂。此套件包含磷酸核糖焦磷酸合成酶的容器中核苷二磷酸果糖激酶的容器中。的磷酸核糖焦磷酸合成酶和二磷酸核苷激酶可任选地被设置在同一个容器中， 本发明的一个实施例还提供了一种试剂盒中含有的试剂的细胞和/或细胞样品中的材料的检测。该试剂盒包含一个容器中腺苷5'-单磷酸和一个容器中的高能量可能不被利用荧光素酶的磷酸供体， 本发明还提供了一种在一个反应体系中，腺苷-5'-单磷酸核苷三磷酸分子扩增分子，高能量的磷酸供体分子，或它们的组合。在该方法中，5'端磷酸基团从三磷酸核苷存在于样品中的分子（XTP）酶腺苷-5'-单磷酸分子加入到样品中，以形成腺苷5'-二磷酸分子和核苷二磷酸分子转移到（ XTP，无论是核糖核苷或脱氧核糖核苷三磷酸），按照下列反应： 由第一酶可以是单磷酸核苷激酶或腺苷酸激酶催化。接着，从高能磷酸供体分子可能不被利用的第一个酶，磷酸酶转移到腺苷5'-二磷酸分子，根据到以下反应：ADP + DP.fwdarw“的形成腺苷-5'-三磷酸分子 ATP + D 核苷二磷酸激酶和丙酮酸激酶催化。然后，这两个步骤重复进行，直到达到理想水平的扩增。高能量磷酸供体可以是dCTP或AMP-CPP NDPK，和PEP丙酮酸激酶， 本发明还提供了一种方法，用于检测在一个反应体系中，焦磷酸，腺苷5'-单磷酸脱氧核糖核酸或核糖核酸，和高能量磷酸供体，或它们的组合，在一个单一的反应锅内。首先，核酸酶裂解终端internucleotide的磷酸二酯键与焦磷酸分子形成游离核糖核苷或脱氧核苷三磷酸分子（XTP）（XTP）根据反应1：聚合酶催化的解聚在一个末端核苷酸 。解聚步骤重复取得的至少两个核苷三磷酸分子。核糖核苷三磷酸分子或脱氧核糖核苷三磷酸分子，然后扩增酶，腺苷-5'-单磷酸腺苷5'-二磷酸分子和核苷5反应1中形成的核苷三磷酸分子5'端的磷酸基团转移-二磷酸分子（XDP）根据第一酶：下，高能量磷酸供体分子，这是不是第一种酶的底物的磷酸基团从2催化反应 ，酶腺苷-5'-二磷酸的分子转移到中产生的反应，根据反应3第二种酶催化的两个放大的步骤被重复直到达到理想水平的扩增产生腺苷-5'-三磷酸分子 。在该方法中的酶1可能是腺苷酸激酶或核苷单磷酸激酶酶2，而可以是丙酮酸激酶或二磷酸nuceloside激酶 优选实施例的描述 本发明提供了一种方法，用于检测非常低的水平，包括各种核酸脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的生物样品中，特别是重组蛋白的样品。的极端敏感性，重现性，易于进行的反应，进行反应的速度表示当前正在使用的低电平检测核酸的方法，该检测方法的主要优点可以被划分为三个一般步骤。第一个步骤是生产以下核苷包括核糖核苷单磷酸（核基质蛋白）腺苷5'-一磷酸（AMP），鸟苷-5'-单磷酸（GMP），尿苷5'-一磷酸（UMP）的核苷单磷酸（XMPs）和胞苷5'-单磷酸（CMP），脱氧核糖核苷的单磷酸（dNMPs）包括脱氧腺苷5'-单磷酸（湿），脱氧鸟苷-5'-磷酸（dGMP的），5'-单磷酸脱氧胸苷（DTMP），脱氧胞苷5'-单磷酸（的dCMP），三磷酸核苷包括核糖核苷三磷酸（国家结核病）（XTPs）腺苷5'-三磷酸（ATP），鸟苷5'-三磷酸（GTP），尿苷5'-三磷酸（UTP）和胞苷-5'-三磷酸（CTP ）和脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），包括脱氧腺苷5'-三磷酸（的dATP），脱氧鸟苷5'-三磷酸（三磷酸），5'-脱氧胸苷三磷酸（dTTP的），胞苷5'-三磷酸（dCTP标记）。官委议员和dNMPs生产核酸酶消化和国家结核病防治规划和dNTP解聚焦磷酸。第二步骤中，使用时的初始衬底是DNA，是从dNTPs浓度为ADP形成ATP末端磷酸转移。XTP扩增可选的步骤，可以在这个阶段进行，以增加灵敏度的检测系统的，特别是当测量样品中的DNA含量低的核酸的取值范围为1-10皮克。第三步是通过适当的检测方法，检测ATP。这样的检测系统的实施例的荧光素酶检测系统和的NADH基于检测系统， 核酸聚合酶催化核酸链的伸长率。该反应是由焦磷酸裂解释放每个核苷添加。每个核苷三磷酸有三个磷酸基团与碳5或脱氧核糖。核苷的加入到一个不断增长的核酸在形成一个internucleoside磷酸二酯键的结果。此键，其特征在于，在具有核糖或脱氧核糖的5'联动核糖或脱氧核糖的5碳碳三的3'联动。每个核苷加入通过形成一个新的3'联动，使核酸链的5'到3'方向生长。的核酸的5'末端的特征在于由一个磷酸基团连接到碳5。 亦称为聚合酶催化的聚合过程中的反向。这种反向的反应被称为焦磷酸。德意志和Kornberg，脱氧核糖核酸酶催化合成，生物化学所表明的DNA聚合酶的焦磷酸水解活性。化学 244：3019-28（1969）。测试的其它核酸聚合酶能够焦磷酸包括DNA聚合酶，DNA聚合酶，T4 DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶，Klenow片段，AMV逆转录酶，MMLV逆转录酶。然而，并非所有的聚合酶是已知的具有焦磷酸活动。例如，多聚（A）聚合酶已报道不催化pyrophosphorylation。（见西佩尔，欧洲生物化学杂志37:31-40（1973）。） 已提出的一种机制焦磷酸RNA聚合酶。据认为，可能会增加的一个Mg.sup.2 +离子从对方焦磷酸，磷酸盐的磷酸二酯键的RNA internucleoside部分转移的焦磷酸钠和二酯的亲电性的亲核反应性，如在Rozovskaya等描述人。生物化学。J. 224：645-50（1984）。通过加入焦磷酸核苷的5'磷酸和焦磷酸和核苷单磷酸之间形成一个新的磷酸二酯键。酶解的internucleoside磷酸二酯键 的焦磷酸解反应可归纳如下： 其中，NA是核酸，PP 。sub.i是焦磷酸钠和XTP要么是一个脱氧核糖核苷三磷酸分子或核糖核苷三磷酸分子。然后，该反应可进行多次，以获得至少两个XTP分子。应该指出的是，该反应可在相同的核酸分子或不同的核酸分子上的多个重复 优选的反应混合物通过焦磷酸解聚，其中包括公开在实施例的合适的缓冲液用于分析每个核酸聚合酶。在这些条件下，产生足够的NTP或dNTP的精确地检测或测定极低量的核酸（5-15皮克）。 尽管优选的反应条件下的聚合和解聚焦磷酸是相似的，这些反应的速率差别很大。例如，AMV和RLV反向转录酶的催化焦磷酸在最佳条件下，在约50至百倍小于聚合，生物化学Srivastavan莫达克证明的速率。化学 255（5）：2000-04（1980）。因此，管材的高效的焦磷酸解反应是意想不到的，并出现要asscociated的对比度高得多的量的DNA进行的研究的以前的DNA焦磷酸的DNA底物具有非常低的水平， 不同的核酸聚合酶的焦磷酸水解活性也不同。T4聚合酶似乎具有最大的焦磷酸活动所产生的焦磷酸水解ATP的萤光素酶检测作为衡量。用T4聚合酶的焦磷酸导致普遍提高了在低皮克水平的检测核酸碎片或部分在大约10倍，增加光的产生相比，MMLV-RT和一个4倍，增加Taq聚合酶相比，光的产生。 消化的核酸。优选地，通过超声处理或限制性内切酶消化的核酸碎片化，形成多个较小的核酸片段。这一步可能提高因为焦磷酸反应所得的DNA检测结束后，实例证明。提供更多数量的DNA末端装置，更多的反应发生在任何一个时间。应当指出，DNA末端可能存在于一个分子中，以及结束时的线性DNA片段。例如，聚合酶可以催化焦磷酸的间隙中的DNA片段的DNA片段或一个缺口。焦磷酸和不同的底物用于酶的类型确定是否是必要的碎片。例如，实施例中所述的数据表明，碎片大大增加检测信息Tag聚合酶的质粒DNA，但不影响检测时使用T4聚合酶。但是，当染色体DNA为底物，碎片增加检测从两种酶 切割的限制性内切酶消化的类型也影响不同的核酸聚合酶的焦磷酸水解活性。例如，MMLV-RT和信息Tag聚合酶可以催化焦磷酸与5'突出端的DNA片段，但不是3'突出端。与此相反，T4 DNA聚合酶催化两个3'和5'末端伸出的钝端介导的焦磷酸。T4聚合酶因此，一个优选的焦磷酸酶。其它核酸聚合酶中使用的焦磷酸的限制性内切酶处理的DNA，必须采取匹配的聚合酶用不同的限制性核酸内切酶所创建的悬伸出特异性， 但必须注意，焦磷酸单链的序列特异性前面已经指出的，在DNA测序Tabor和Richardson，生物化学。化学 265（14）：8322-28（1990）。一些双脱氧终止的序列片段的序列特异性的焦磷酸解反应被证明是比其他片段的磷酸解更容易退化。 另外，焦磷酸解反应中使用不同的聚合酶必须匹配正确的核酸基板。一般情况下，DNA聚合酶和逆转录酶是优选的DNA解聚，和优选解聚RNA的RNA聚合酶。逆转录酶是首选解聚RNA-DNA杂交 进一步表明申请人的poly（A）聚合酶催化焦磷酸，即使没有这样的反应已有报道。事实上，已经被广泛报道的poly（A）聚合酶催化焦磷酸。见，例如，西佩尔，欧元。生物化学杂志。37:31-40（1973）和生物化学杂志佐野和FEIX的，欧元。71:577-83（1976）。令人惊讶的是，申请人表明，在适当的反应条件下的poly（A）聚合酶催化解磷。优选的是，氯化锰存在于先前报告的缓冲器被省略，氯化钠浓度的降低，和从约8.0至约7.5的pH值降低。最优选的是，多聚（A）聚合酶焦磷酸解反应缓冲液中包含的50mM Tris-氯pH为7.5，10 NMM MgCl.sub.2，50 mM氯化钠，和2mM NaPP.sub.i（焦磷酸钠）， 重要的是要注意，解聚反应是在聚合反应的反向。因此，随着越来越多的游离的三磷酸核苷的解聚反应产生的，理论上可能达到一种平衡状态，其中聚合及解聚反应平衡。或者，检测到少量的核酸，将反应可能基本上去完成，没有达到平衡，即大于90％的解聚成其组成的亚基核苷酸的核酸。以定量的测试，这是很重要的，因为释放的核苷酸的总量是proprtional的检测法中产生的信号的量。当用于核酸的定性检测，这是没有必要的，如果反应达到平衡或基本上完成提供阈值电平产生的核苷酸。核苷三磷酸的混合物的分子所产生的解聚，因此优选被转换成三磷酸腺苷（如下文所述）。对于任何一种检测或测定三磷酸腺苷分子6.times.10.sup.7，可检测的阈值电平，必须提供用于检测的光从一个典型的荧光素酶检测。

在一个优选实施例的本发明的用于检测核酸，核酸聚合酶和PP.sub.i的含有小于1的样品中加入核酸，mu.g下降到低于约10 pg的核酸。以增加灵敏度的检测DNA，该DNA可被分片处理，用限制性核酸内切酶，或通过超声处理。接着，将核酸是焦磷酸水解释放的自由国家结核控制规划或dNTPs浓度降解。有用的焦磷酸解反应的酶活性包括AMV反转录酶，MMLV逆转录酶，DNA聚合酶的α和β，Taq DNA聚合酶，T4 DNA聚合酶，Klenow片段和聚（A）聚合酶。最优选的是，利用T4聚合酶DNA焦磷酸解反应，因为它的3'和5'突出末端平末端和如上所述的高处理确认。 萤光素酶，这是优选ATP检测系统的一部分，是抑制焦磷酸（PP sub.i）。因此，必须采取的，不转让高度抑制量的PP.sub.i ATP检测反应。优选地，量PP.sub.i的延续，以的ATP检测反应结果的浓度为PP.sub.i中的荧光素酶检测反应，小于约100微米，但小于约10微米是可取的。因此，焦磷酸解反应中使用的量PP.sub.i都被认为是在荧光素酶检测系统中使用的等分试样的大小将由。等分试样的大小可能不同，但转让或结转的荧光素酶检测反应的量PP.sub.i应该对应的的PP.sub.i浓度上述参数，，的浓度PP.sub.i至少下列约100微米，优选低于约10。mu.M. 在另一个实施例中，核酸可以是第一受核酸外切酶的消化降解成NMP或dNMP环境中，根据下面的反应： 式中，NA是一种核酸，XMP可以是一磷酸脱氧核糖核苷或核糖核苷单磷酸酯，和n是核苷中的核酸的数量。 可以通过各种各样的核酸酶，包括BAL 31核酸酶S1核酸酶，绿豆核酸酶，核酸外切酶III和核糖核酸酶H。核酸酶的核酸酶消化消解条件和缓冲区可能会发现在产品文献资料可从商业来源，或披露的实施例中， 用核酸酶消化后，官委议员或dNMPs的国家结核病防治规划或dNTPs浓度分别被转换成。美国专利 第4375897号描述了检测RNA的核酸酶消化，然后转换为NTP。该方法利用一个两步方案中，腺苷酸激酶AMP转换为ADP，丙酮酸激酶然后将其转换为ATP的ADP。此方法的poly（A）mRNA表达的检测本质上是有限的，因为没有机制转换的dNTPs，优选的荧光素酶的底物三磷酸腺苷建议。核酸酶消化或磷酸解的查询结果不作为高效荧光素酶的底物的dNTP的混合物中的DNA。 在生物合成嘌呤和嘧啶mononucleosides的，磷酸核糖焦磷酸（PRPP）是强制性核糖-5'-磷酸供体。PRPP本身形成由PRPP合成酶催化的反应中，通过从ATP焦磷酸核糖-5 -磷酸转移。圆柏等人所描述的，已知该反应是可逆的，科学223：1193至1195年（1984）， 核酸酶消化产生的NMP或dNMP环境中，另外，在本发明中，优选直接转换酶PRPP的NTP或dNTP的合成在下列反应： 其中XMP是任一磷酸腺苷或脱氧腺苷一磷酸和XTP可以是一个三磷酸腺苷，脱氧腺苷三磷酸。优选地，该至少6.times.10.sup.7三磷酸腺苷分子反应产生可检测的阈值电平， 在该反应中，焦磷酸基的PRPP酶促转移到XMP分子，形成XTP分子。反应条件和缓冲区被设置为在实施例中所述。当RNA是将基片，产生的ATP可被直接检测到。 利用PRPP反应的核酸检测系统中有几个优点优于现有技术的。首先，只有一个步骤是必要的，以转换为AMP或潮湿的一个ATP或DATP，从而简化了检测系统。其次，与外源ATP，ADP或AMP的检测反应的污染的可能性较小。 dNTPs浓度所产生的焦磷酸或核酸酶消化，然后pyrophosphorylation理论上可以直接使用作为荧光素酶的底物，可检测的核酸。然而，荧光素酶的首选基板是ATP莫耶和亨德森，核苷三磷酸萤火虫荧光素酶的特异性，肛交证明。生物化学。131:187-89（1983）。当DNA的初始底物，核苷二磷酸激酶（NDPK）方便地利用以下的一般反应：其中dNTP的是脱氧核糖核苷三磷酸的混合物中，和dNTP是相应的三磷酸脱氧核糖核苷催化转换的dNTPs，对ATP的 。在该反应中，该终端的dNTP的5'-三磷酸（P *）被转移到ADP形成ATP 酶催化该反应一般被称为核苷二磷酸激酶（NDPK）。NDPKs是无处不在的，相对专一性的酶。NDPK评论，看到公园和阿加瓦尔，酶，第8卷，第博耶埃德。（1973）。NDPK对ATP的国家结核控制规划或dNTPs浓度的转换优选通过国家结核控制规划或焦磷酸，或核酸酶消化，然后将产生的预期的dNTPs的量的增加的NDPK和摩尔过量的ADP是PRPP合成酶pyrophosphorylation。另外，如果用于扩增方案，AMP的摩尔过量的可能被作为优选的基板。ADP的利用率，需要优化的ADP添加的量。太多ADP结果高背景水平。甲反应体系中，NDPK含有约0.01〜0.50微米，ADP，优选约0.05微米ADP。说明性的缓冲液和反应组分列于实施例中， 作为一个可选步骤，NTP，dNTP浓度，或ATP焦磷酸或核酸酶消化方案所产生的被放大到更大的灵敏度。扩增时，可能需要利用检测系统以外的荧光素酶，或当所需要的检测信号水平的提高较不敏感的萤光光度计。NTP的扩增是指连续反应，其中1 NTP 2国家结核病产生，它可以是循环，得到4 NTPs和等。当AMP被加入到饲料中的扩增反应，ATP将积聚而原始的NTP量保持不变。PCT公布WO二万五千六百十九分之九十四和Chittock等，肛门。生物化学，255:120-6（1998），引入本文作为参考，披露对ATP的放大系统，其特征在于由下面的偶联反应： 其中，C1是本待扩增样品中的目标化合物中，S1是扩增的底物，E1的催化酶，能够利用C1和S1产生C2，S2是一个能量捐赠基板，和E2的催化酶，能够利用C2和S2产生C1，然后再循环通过反应。根据此反应，偶联反应的每个通过量加倍，可随后检测到的C1。专利申请GB 2055200公开了一种利用腺苷酸激酶和丙酮酸激酶的放大系统， 在设计用于在核酸检测中的耦合ATP扩增反应，必须考虑两个主要的要求。首先，E1必须不能够利用E2利用高能磷酸捐助。如果E1，可以利用高能量的磷酸供体的ATP扩增反应进行NTP或dNTP的生产的情况下，作为一个结果，焦磷酸或核酸酶消化，然后pyrophosphorylation。这将导致不希望出现的假阳性结果。其次，必须提供增值的高能量磷酸供体的摩尔过量的dXTP或XTP预期反应中的量相比。第三，E1必须是能够利用的NTP，dNTP浓度，或在步骤1中通过焦磷酸水解的核酸或核酸酶消化产生的ATP。 本发明的放大系统的特征，如下所示：： XTP + AMP.fwdarw。 XDP + ADP ，其中DP是一种高能量的磷酸供体，E1和E2酶能够催化磷酸转移XTP为AMP，ADP，从DP分别。如此产生的ATP可重新进入反应（XTP），将反应反复进行，直到在基板耗尽或达到平衡，从而导致在生产每个ATP提供给或由反应产生的ATP。请注意，当目标XTP是任何三磷酸核苷，三磷酸腺苷以外的其他只产生1周期的初始穿过三磷酸腺苷，然后重新进入循环以产生两个ATP，重新进入循环，产生4 ATP等。优选地，扩增反应产生可检测的阈值电平6.times.10 sup.7三磷酸腺苷分子 反应6 XTP是一种三磷酸核糖核苷或脱氧核糖核苷三磷酸，它可优选为所提供的焦磷酸的三磷酸腺苷（反应1）或创建XTP NDPK转换的ADP ATP（反应5）或提供加上pyrophosphorylation（反应4），其次NDPK转化为ATP（反应5）核酸酶消化。然而，必须理解的是，放大步骤，当被用于的DNA底物，步骤转换的dNTP对ATP的放大系统中固有的。因此，并不需要一个单独的转换步骤。 甲核苷的单磷酸的激酶（NMPK）或腺苷酸激酶作为酶1（E1）优选利用。NMPKs，其中每个家庭是负责催化磷酸化的一个特定的NMP的发生。直到最近，人们普遍认为，ATP和唐麦首选磷酸盐捐助。然而，Shimofuruya和铃木生化的。国际机场 26（5）:853-61（1992）最近表明，至少有一些可以利用其他磷酸盐NMPKs捐助者，如CTP和UTP。酶2（E2）优选为核苷二磷酸激酶（NDPK）或丙酮酸激酶。NDPK一般的5'-三磷酸的终端的国家结核病转移催化NDPS形成国家结核病。丙酮酸激酶催化磷酸磷酸转移至ADP形成ATP。这些酶的活性是利用在转移磷酸基团从高能量的磷酸供体（DP）为ADP或NDP的扩增反应。 甲高能磷酸供体（DP）是必需的，但不是由E1 E2可用于。当E2是：NDPK dCTP或阿尔法测试版。亚甲基腺苷-5'-三磷酸（AMP-CPP）可以利用作为DP。当E2是丙酮酸激酶，磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）是首选的高能磷酸捐助。NDPK的能力，利用这些微量ATP生产效率，使基板在不知道。令人惊讶的是，这些高能磷酸捐助者利用与NMPK和腺苷酸激酶符合要求的扩增反应时，最近的文献表明，NMPK（E1）可能利用磷酸盐捐助以外ATP或唐麦。腺苷酸激酶的非特异性也是众所周知的。必须提供高能量的磷酸供体和/或AMP相比没有可观的速率再循环，从而使高能磷酸供体的ATP或预期存在于样品中的dNTP的量在摩尔过量。附加的缓冲液和反应组分的实施例都包含在核酸检测的第三步是检测的NTP，dNTP浓度或扩增ATP。两个公知的检测系统包括：发光的荧光素酶检测系统，和NADH的光的吸附检测系统（NADH的检测系统）， 这样产生的ATP的荧光素酶检测系统检测。在ATP和O2的存在下，荧光素酶催化荧光素的氧化作用，产生光，然后可以使用光度计定量。其他反应的副产物是AMP的磷酸盐，焦磷酸盐和光能，因而发光。可检测到的光光度计。 优选ATP检测缓冲液，将被称作为LAR缓冲区中，通过混合19.1毫升去离子水; 800配制的0.5M甘氨酸，pH值8.0; 70 mu.l。亩升1M MgSO.sub.4; 4 mu.l 0.5M EDTA;0.108克DTT（二硫苏糖醇）; 0.003克荧光素，调节pH值至7.8，如果需要。优选地，约5至10微克的重组荧光素酶（Promega公司的批号6414002）是在反应中使用。更大量的荧光素酶有增大的趋势非特异性背景。申请人还已经表明，删去辅酶A从LAR反应混合降低背景。 的NADH的检测系统，组合使用两种酶，磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脱氢酶，催化形成由NADH，NAD，ATP的存在。ATP作为荧光强度的损失，，因为NADH荧光，而NAD是没有。的NADH基于ATP检测的实施例公开在美国专利。第4735897号，4595655号，4446231和4743561，以及英国专利申请GB 2055200，所有通过引用并入本文。 若干上述反应中，也可以进行对单罐反应。的单罐反应是其中至少有两个具有催化活性的酶（E1和E2）存在在同一个反应混合作用于一个或多个基片）（S1和S2）。酶催化的反应可能同时发生，其中E1的行为在S1和E2行为S2成功。另外，E1和E2催化反应可能发生在一步明智的方式，S1 E1行为，产生中间S2.sub.i和E2然后作用于S2.sub.i.的 当然，这样的偶联反应也可能基本上是同时进行的。 光实现的核酸检测的非常低的水平的能力，利用本发明的单罐反应的酶的组合或混合物是令人惊讶的。即使有些酶是小于最佳条件下，这样低的水平的检测是可能的。如前所述，这是必要的，以优化的浓度的PP.sub.i中使用的焦磷酸解反应，使荧光素酶就不能抑制。因此，NMP，dNMP环境中，NTP，dNTP和ATP产生的反应的等分试样可以直接添加LAR的荧光素酶检测缓冲液，没有任何的反应产物纯化。萤光素酶反应是不是中毒或以其他方式骤冷的反应元件。这种理想的功能，用少量的时间和精力允许高通量筛选，并在整体检测方案的设计还具有很大的灵活性。 优选地，焦磷酸反应生产dNTP和国家结核病防治规划的dNTPs转换的的NDPK催化反应在一个单一的一锅反应中的核酸聚合酶缓冲液，也可以进行对ATP。NDPK活性是足够的，即使转换的dNTP ATP聚合酶缓冲液条件NDPK活性不够。聚合酶和NDPK都可能存在，首先在反应中，或NDPK可直接加入到反应潜伏期之后，足以满足生产NTP或dNTP的。的核酸聚合酶和NDPK可以设置在同一容器中，或在上述反应中使用的混合物。优选的混合物含有的核酸聚合酶和NDPK的浓度足以催化的ATP生产时，在存在的核酸的磷酸盐，焦磷酸盐和ADP。优选地，所述聚合酶的浓度为约1至100单位/ .mu.l的，最优选的是约5单位/ .mu.l。优选地，所述NDPK中的浓度为0.1〜100单位/ .mu.l的，最优选的是约5单位/ .mu.l。优选地，所述混合物是纯度大于99％， 同样，PRPP合成酶和NDPK反应可以在一个单一的一锅反应中的PRPP合成酶缓冲。同样，NDPK活性足够NDPK活性，即使条件不理想。核酸酶消化后的样品含有游离核基质和dNMPs的可能被添加到最初含有PRPP合成酶和NDPK混合反应，或添加到NDPK和荧光素酶检测反应组分的反应混合物含有一个PRPP合成酶反应。可能会发现在实施例的优选的缓冲液和反应组分。PRPP合成酶和NDPK也可以设置在同一容器中，或在上述反应中使用的混合物。该混合物优选含有PRPP合成酶和NDPK中的浓度足以催化的ATP生产时，磷酸核糖焦磷酸和ADP存在下。优选地，所述NDPK中的浓度为0.1〜100单位/ .mu.l的，最优选的是约5单位/ .mu.l。优选地，设置在PRPP合成酶的浓度为0.001〜10单位/ .mu.l的，最优选约0.01单位/ .mu.l若随意放大，PRPP合成酶反应必须是热灭活的，否则的PRPP合成酶将转换ATP AMP。优选地，该混合物是大于99％纯度的 焦磷酸解反应和扩增反应，也可能在一个单一的一锅反应进行。在这种单罐反应，聚合酶可能是AMV逆转录酶，MMLV逆转录酶，DNA聚合酶α或β，Taq DNA聚合酶，T4 DNA聚合酶，Klenow片段或聚（一）聚合酶，AMP的转化为ADP的第一酶可以是肌激酶（腺苷酸激酶）或NMPK，以及第二转换ADP对ATP的酶可能是丙酮酸激酶或NDPK。所以这样的背景下，尽可能减少由于污染ADP和ATP的反应一定要喂AMP，最好Apyrase处理AMP。可能被添加推荐的1U/.mu.l Apyrase 1.mu.l的〜19。mu.l的10mM AMP，然后在室温下孵育30分钟，三磷酸腺苷双磷酸酶的热失活的孵育温度70.degree。C. 10分钟。高能磷酸捐赠者也必须加入到该反应。当利用丙酮酸激酶，磷酸烯醇式丙酮酸被添加，而利用NDPK时dCTP标记添加。优选地，高能量的磷酸供体与聚合酶预孵育约15分钟后，加入，尽管这不是必需的。这些反应可能，其特征如下： 其中，NA是核酸，XTP是一种三磷酸核苷，无论是脱氧核苷或核糖核苷三磷酸，XDP是核苷二磷酸，无论是脱氧核苷或核糖核苷二磷酸，和DP是一种高能量的磷酸供体。应当认识到，该反应产生ATP，优选的荧光素酶的底物，从dNTPs浓度。扩增反应进行反应7中所描述的三磷酸腺苷分子6.times.10.sup.7产生可检测到的阈值电平。优选地，所述聚合酶的浓度为约1至100单位/ .mu.l的，最优选的是约5单位/ .mu.l。优选地，设置在浓度为0.1〜100单位/ .mu.l的，最优选为约1单位/ .mu.l NDPK。优选，优选地，该混合物的纯度大于99％， 在另一个实施例中，上述反应可用于选择性地检测多聚（A）根据下面的方案进行mRNA的。第一的寡聚（dT）引物杂交的多聚（A）尾的mRNA形成的DNA-RNA杂交体。接着，进行逆转录酶（RT）的焦磷酸解反应。它可用于本发明中的反转录酶包括小鼠乳腺白血病病毒（MMLV）逆转录，鸟骨髓瘤病毒（AMV）RT和劳氏肉瘤病毒（RSV）RT。该检测系统的一个优点是，这些反应时催化焦磷酸水解双链核酸双链的RNA-DNA杂交体，但不是单链核酸。因此，在细胞总RNA样品中的聚（A）+ RNA的量来确定。dTTP的焦磷酸解反应产生下列反应： 其中TT.sub.n是寡聚（dT）的PP.sub.i焦磷酸 dTTP的可转换NDPK对ATP的上述第4反应中所描述的，任选扩增，检测，如上所述。 在另一个实施例中，上述反应可被用于检测样品中存在的细胞。美国专利 第5648232号，通过引用并入本文，描述了一种方法，检测样品中的细胞。该方法利用的腺苷酸激酶活性，这是存在于所有活的生物体。简单地说，涉嫌含有微生物或其他生物细胞样本条件，导致细胞裂解。ADP，然后加入溶胞产物，这是转换腺苷酸激酶活性的内源性ATP通过下列反应： 该反应中所产生的三磷酸腺苷，然后检测由荧光素酶检测系统， 本发明还提供了一种方法，检测是否存在细胞的裂解物中的样品被怀疑含有细胞物质通过使用不同的基材。该系统利用根据下面的反应式由内源性腺苷酸激酶活性（AK）和NDPK活性催化的偶联反应： 其中DP是一种高能量的磷酸供体，加入细胞裂解物和AMP的细胞裂解物中加入磷酸腺苷样品。在该反应中，腺苷-5'-二磷酸分子是由酶促转移磷酸基团从高能量的磷酸供体分子（DP）的增值腺苷5'-一磷酸（AMP）分子。然后，腺苷-5'-三磷酸，所产生的酶的磷酸转移根据以下一般催化反应的内源性酶，存在于细胞裂解物样品共同的核苷的浓度优化，从DP分子的5'-二磷酸腺苷分子 添加是必要的，以优化的光输出，从这些反应的样品。约1mM 80mM的AMP和1mM〜100mM的dCTP标记可能会被添加到测试样品，并优选为约10mM的AMP和100mM dCTP标记可能被添加到测试样品。添加核苷样品后，样品优选在室温下保温约10〜60分钟，从样品的光输出由光度计确定。其它优选的缓冲液和反应成分在实施例中，可能会发现， 在先前所描述的细胞的检测系统，该系统具有一个重要的优点。AMP和dCTP比ADP稳定得多，因此其结果是更具有可重复性， 在本发明的另一个方面，提供用于进行焦磷酸的核酸检测方法的核酸检测的检测试剂盒。的核酸检测的检测试剂盒包括所需的核酸检测方法，本发明的必要的试剂。用于核酸检测焦磷酸，该套件包括能够如Taq DNA聚合酶，T4聚合酶，AMV反转录酶，MMLV逆转录酶，或聚（A）聚合酶催化焦磷酸酶的容器中。聚合酶的浓度为0.1〜100单位/ .mu.l的，优选为约5个单位/ .mu.l。在DNA检测中使用的试剂盒还包括一个容器，含有核苷diphosphokinase和容器中的ADP。优选的是，这些试剂的污染，三磷酸腺苷和腺苷酸激酶。NDPK设置在约0.1至100单位/ .mu.l的浓度，优选为约1.0单位/ .mu.l。可通过透析或三磷酸腺苷双磷酸酶处理的污染物。可选套件中可能包含的dNTPs扩增或NTP对ATP的试剂的船只。扩增试剂包括丙酮酸激酶，腺苷酸激酶，NMPK，NDPK，AMP放大基板，和dCTP或AMP-CPP作为高能磷酸捐助。该试剂盒可以被打包在一个单一的机箱，包括进行测定方法的说明。用的试剂的容器中所提供的强度适合于直接使用或稀释后使用。也可以提供一套标准允许定量结果。为获得最佳酶活性的测试的缓冲区可以被包括。最优选的是，的的NDPK和核酸聚合酶中所提供使单锅一贯反应可在同一反应组合。 在本发明的另一个方面，提供的核酸检测试剂盒用于进行核酸酶消化核酸检测本发明的方法。

Claims (5)

1.一种ATP的检测系统，包括：

释放单元格的内容，以形成细胞裂解物;

添加磷酸供体分子和腺苷-5'-单磷酸分子的细胞裂解物，使腺苷5'-二磷酸分子是由供体的磷酸基团从腺苷-5'-单磷酸酶转移按照下列一般反应催化由存在于细胞裂解物中的内源酶：

和

生产腺苷-5'-三磷酸酶转移的供体分子的磷酸基团从根据下列一般反应的细胞裂解物样品中存在的内源性酶，腺苷5'-二磷酸分子：

和

检测由此产生的腺苷5'-三磷酸。

2. 根据权利要求1所述的一种ATP的检测系统，其特征在于，所述磷酸盐供体是选自脱氧胞苷-5'-三磷酸，deoxyguanidine 5'三磷酸脱氧胸苷5'三磷酸组成的组中。

3. 根据权利要求1所述的一种ATP的检测系统一种组合物，用于生产腺苷-5'-三磷酸的DNA磷酸盐，焦磷酸盐，腺苷5'-二磷酸的混合物的组合物，该组合物包括：

核苷二磷酸激酶;

提供足够浓度的核酸聚合酶，核苷二磷酸激酶，核酸聚合酶催化从DNA的三磷酸腺苷的生产在大约皮克微克量的DNA。

4.根据权利要求1所述的一种ATP的检测系统、磷酸核糖焦磷酸和腺苷5'-二磷酸的混合物的组合物，该组合物包括：用于产生三磷酸腺苷

一个磷酸核糖焦磷酸合成酶;

核苷二磷酸激酶，磷酸核糖焦磷酸合成酶，在足够的浓度，催化产生的三磷酸腺苷，从约皮克微克量的DNA的核苷二磷酸激酶。

5.根据权利要求1所述的一种ATP的检测系统产生三磷酸腺苷分子的多个由核苷三磷酸分子中的反应体系中，腺苷-5'-单磷酸分子，高能量的磷酸供体分子，或它们的组合方法。