JP3637572B2 - 酵素による核酸の定量方法および定量用組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、少なくとも、下記の４つの反応工程からなる核酸の定量方法で、工程１：被検体中の核酸にフォスファターゼを反応せしめて無機リンを生成させる工程、工程２：生成した無機リンを、過剰量のヌクレオシド存在下、少なくともヌクレオシドフォスフォリラーゼ存在下で反応せしめ、用いたヌクレオシドから形成される脱糖化プリン誘導体または脱糖化ピリミジン誘導体およびリン酸化基質を生成せしめるとともに、工程３：生成したリン酸化基質を同フォスファターゼにて無機リンを生成せしめて工程２の反応を生ぜしめて脱糖化プリン誘導体または脱糖化ピリミジン誘導体を生成せしめてなる工程２および工程３を行い、工程４：全行程において生成した脱糖化プリン誘導体または脱糖化ピリミジン誘導体の量を酵素的に定量する工程および核酸の定量用組成物に関する。
【０００２】
【従来技術】
被検体、例えば、アデノシン・モノリン酸（ＡＭＰ）、グアノシン・モノリン酸（ＧＭＰ）、シチジン・モノリン酸（ＣＭＰ）、チミジン・モノリン酸（ＴＭＰ）、ウリジン・モノリン酸（ＵＭＰ）、イノシン酸（ＩＭＰ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体などの生体中の核酸は、リン酸化された化合物であり、それぞれの代謝反応および遺伝情報の伝達などにおいて重要な役割を果たしている。最近、臨床検査の分野では、核酸の塩基配列の特異性を利用して、感染症の診断やガン遺伝子を対象とした病態検査等を行っており、特にポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法（Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８年、２３９巻、４８７〜４９１）に代表されるような核酸増幅技術の発達により、目的遺伝子の検出のための検体が急増している。
【０００３】
従来、核酸研究分野において核酸を測定する場合、ビオチン、酵素、ラジオアイソトープ、ハプテンなどで標識された核酸を用いて測定対象物質と結合反応をさせ、結合物と未結合物とを分離した後、その標識体から信号を検出する方法が一般的である。例えば、検出方法としては、増幅産物をポリアクリルアミド電気泳動したのち、ゲルをエチジウムブロマイド染色をしてトランスイルミネーターにて検出する方法や、放射性同位元素により標識された標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブを用い、これと標的核酸とをハイブリダイゼーション反応させ、未反応物を洗浄除去等で分離した後、反応産物中の放射活性を検出する手法等を用いる。しかしながら、電気泳動法では臨床検査で用いるような多検体の処理には不向きであるし、一方、放射性同位元素を用いる手法では特別な施設を必要とし、放射線にさらされる危険性から、操作が極めて煩雑で、特殊な研究以外、汎用性には乏しい。
【０００４】
また、上記電気泳動法や放射性同位元素による標識法の他に、非放射性標識プローブを用いた手法も行われている。例えば測定対象となる核酸と相補的な塩基配列を有する核酸の５’末端にビオチン標識したプローブを用い、予め被検体を必要に応じてアルカリ処理や熱処理などをして１本鎖とした核酸とハイブリダイゼーション反応させ、未反応物を洗浄除去等で反応産物と分離した後に、酵素と結合させておいたアビジンと反応産物中のビオチンとを結合反応させ、再度、反応産物と未反応の酵素標識されたアビジンとを洗浄などにより分離し、最終的に酵素活性を測定する方法がある。しかし、これら方法では、未反応の標識体と反応産物とを分離する操作が必要であり、測定操作が極めて煩雑であるためルーチン分析には不適である。
【０００５】
また、検体である核酸を検出する感度を向上させる手法として各種の核酸増幅法が用いられている。代表的なものとしてＰＣＲ法は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２種類の特異的プライマーを用い、温度の上下の繰り返しによって対象となる１種類以上の核酸をＤＮＡポリメラーゼ反応とアニーリングを繰り返しながら対象を特異的に増幅反応を行わせる手法である。この手法は単に核酸を増幅させるための手法であるため増幅された標的核酸を検出するために増幅とは別の検出系が必要である。
【０００６】
また、他の核酸増幅技術としてリガーゼチェーンリアクション（ＬＣＲ）法（Ｆ．Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ＵＳＡ、１９９１年、８８巻、１８９〜１９３頁）も用いられており、具体的には上記ＰＣＲ法の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの代わりに耐熱性ＤＮＡリガーゼを用い、ＰＣＲ法同様温度の上下でアニーリングとリガーゼ反応を繰り返して核酸増幅を行わせる手法である。反応産物を検出するための方法として、上記ＰＣＲ法と同様な方法を行う。
【０００７】
さらに、ＮＡＳＢＡ法（Ｔ．Ｋｉｅｖｉｔｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９１年、３５巻、２７３〜２８６頁）などに代表される核酸増幅技術においてもその反応産物の核酸検出方法は同様である。具体的には、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨと２種類のプライマーを用いて酵素のカスケード反応によって常温で対象の核酸を増幅させる方法が知られている。
【０００８】
しかし、上記ＰＣＲ法及びＬＣＲ法同様に核酸増幅の反応をもちいて検出感度を向上させても、反応産物の核酸の検出方法は煩雑な手法しか用いられておらず、検出までの操作時間は短縮されずにいるため多検体の処理は極めて困難な状況下にある。
一方、核酸を簡便に定量する方法として、核酸中のリン酸を測定する方法も考えられる。実際、前記のごとく、放射性同位元素により標識された標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブを用る場合、放射性同位元素の種類は³²Ｐを用いるのが一般的で、この量を定量することで核酸量として検出される。しかし前述のごとく操作性の煩雑さなどから汎用性が低い。
【０００９】
また、非放射性のリン酸測定の方法も考えられるが、従来のリン酸測定法としては、酸性溶液中でモリブデン酸アンモニウムとリン酸を反応させ、所定の方法で還元してモリブデンブルーに変換する方法により測定されてきた。また、酵素的なリン酸の定量法として、種々報告されている。例えば、（１）ホスホリラーゼにより、グリコーゲン＋無機リン→グルコース−１−リン酸＋グリコーゲンなる反応をさせ、生じたグルコース−１−リン酸をホスホグルコムターゼによりグルコース−６−リン酸に転換後、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとＮＡＤＰを用い、生成するＮＡＤＰＨを測定するもの（臨床検査、２２巻、１１号、１３３９頁、１９７８年）、（２）Ｄ−グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼによる、Ｄ−グリセロアルデヒド−３−リン酸＋無機リン＋ＮＡＤ→１，３−ジホスホグリセリン酸＋ＮＡＤＨなる反応系を利用するもの（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９，ｐ８８〜９４、１９７２年）、（３）（１）のホスホリラーゼの代わりにシュークロースホスホリラーゼを用い、シュークロース＋無機リン→グルコース−１−リン酸＋フルクトースなる反応系によりグルコース-１-リン酸を生成せしめ、以下（１）と同様に測定するもの（臨床化学会年会記録、第２６集、１６１頁、１９８６年）、（４）プリンヌクレオシドフォスフォリラーゼを用いて、イノシン＋無機リン→ヒポキサンチン＋リボース−１−リン酸とし、生じたヒポキサンチンをさらにキサンチンオキシダーゼを用いてヒポキサンチン＋２Ｈ₂ Ｏ＋２Ｏ₂ →尿酸＋２Ｈ₂ Ｏ₂ なる酵素反応系により生成する過酸化水素をペルオキシダーゼ反応により比色定量するもの、（５）６−ホスホフルクトキナーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼを用い、Ｄ−フルクトース−１，６−ジリン酸＋無機リン→ピロリンサン＋フルクトース−６−リン酸→グルコース−６−リン酸なる酵素反応により生じたグルコース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いて測定するもの（特開平１−１７９６９９号公報）等がある。
【００１０】
しかしながら、これらの方法のほとんどが、無機のリン酸を特異的に測定するための手法であり、しかも、いずれも高感度な測定法とはいえず、被検体中の測定対象物質が微量の場合は、定量できないという欠点があった。このため、核酸を定量するためにこれらの非放射性のリン酸測定法はほとんど用いられてこなかった。
【００１１】
また、微量の物質を測定する手法として分光分析よりも高感度である蛍光分析や発光分析などが用いられているが、特殊な機器設備を必要とし、汎用性に乏しい。
以上の理由から、核酸を定量することを目的に核酸中のリン酸量に基づいて核酸を酵素的に定量する方法は実用化されていなかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
前記の核酸のようなヌクレオシドとエステルを形成したリン酸を酵素的に特異的かつ高感度に定量することができれば、微量の核酸が測定可能であることはもちろん、測定に必要な検体量を減らすことができる。そして、酵素の特異性を利用して各反応工程間で行う、反応産物と未反応物との分離操作も少なくなり、大幅に操作性を向上させることができるようになる。また短時間に多検体を測定することができるようにもなり、ルーチン分析が可能となる。このように、検出感度を上げ、操作性を改善することは臨床検査分野において、微量成分を多検体測定する必要性から考えて、必然の要求である。
【００１３】
前述のごとく、従来の核酸定量法ではいまだ満足のいくものではなく、簡便かつ高感度の定量法の開発が望まれていた。
従って、本発明の目的は、高感度でかつ高精度で簡便な核酸の定量方法および定量用組成物を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、まず、被検体中の核酸を基質としてフォスファターゼ反応せしめて核酸から無機リンを遊離せしめ、次に、遊離した無機リンとヌクレオシドを基質として、ヌクレオシドに無機リン酸が酵素的に転移して分解した脱糖化プリン誘導体または脱糖化ピリミジン誘導体とリボース−１−リン酸またはデオキシリボース−１−リン酸を生成するヌクレオシドフォスフォリラーゼ反応を行ってリボース−１−リン酸またはデオキシリボ−１−リン酸であるリン酸化基質を生成せしめ、次いで、一度基質として使用した無機リン酸をフォスファターゼによってリボース−１−リン酸またはデオキシリボース−１−リン酸であるリン酸化基質より生成させ、この無機リンをヌクレオシドフォスフォリラーゼ反応基質の１つとして再利用してなるヌクレオシドの存在下ヌクレオシドフォスフォリラーゼ反応を行わせ、この時過剰量のヌクレオシドを用いることによる無機リンの酵素的なサイクリング反応を見いだし、核酸を高感度かつ短時間に測定しうる定量方法および定量用組成物を見いだした。
【００１５】
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、少なくとも、下記の４つの反応工程からなる核酸の定量方法で、
工程１：被検体中の核酸にフォスファターゼを反応せしめて無機リンを生成させる工程、
工程２：生成した無機リンを、過剰量のヌクレオシド存在下、少なくとも、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ存在下で反応せしめ、用いたヌクレオシドから形成される脱糖化プリン誘導体または脱糖化ピリミジン誘導体およびリン酸化基質を生成せしめるとともに、
工程３：生成したリン酸化基質を同フォスファターゼにて無機リンを生成せしめて工程２の反応を生ぜしめて脱糖化プリン誘導体または脱糖化ピリミジン誘導体を生成せしめてなる工程２および工程３の反応を行い、
工程４：全行程において生成した脱糖化プリン誘導体または脱糖化ピリミジン誘導体の量を酵素的に定量する工程、を特徴とし、少なくとも、被検液中の核酸の定量に当たって下記の反応組成物を含む核酸の定量用組成物で
（１）ヌクレオシドフォスフォリラーゼ
（２）ヌクレオシド
（３）フォスファターゼ
（４）脱糖化プリン誘導体または脱糖化ピリミジン誘導体の量を酵素的に定量する成分
を含有する核酸の定量用組成物である。
【００１６】
本発明における被検体中の核酸とは、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とし、基本単位が１つの時はペントース部がリン酸エステルを形成している化合物で、２つ以上の基本単位の時は各ヌクレオチド間で糖の３’と５’位の炭素のリン酸ジエステル結合で結ばれた化合物で、フォスファターゼによって無機リン酸またはそのイオン体を遊離しうる化合物を意味し、これらの核酸を含有するものであれば、例えば、血清、血漿、尿、唾液、涙液などの生体液や生体組織から得られる細胞抽出液、飲食物抽出液、核酸試薬液、好適にはウイルスや微生物等の感染症由来の核酸含有液などが被検体として挙げられるが特に限定されるものではない。また、被検体の使用量は核酸の濃度によって多少異なるが適宜希釈するなどして例えば１μｌ〜１ｍｌの範囲で適量を用いればよい。
【００１７】
また核酸としては例えば、モノリボヌクレオシド、モノデオキシリボヌクレオシド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド型、１本鎖または２本鎖のＤＮＡ型またはＲＮＡ型のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、またはそれらのヌクレアーゼ分解産物が挙げられる。
具体的には、例えばアデノシン・トリリン酸（ＡＴＰ）、アデノシン・ジリン酸（ＡＤＰ）、アデノシン・モノリン酸（ＡＭＰ）、グアノシン・トリリン酸（ＧＴＰ）、グアノシン・ジリン酸（ＧＤＰ）、グアノシン・モノリン酸（ＧＭＰ）、シチジン・トリリン酸（ＣＴＰ）、シチジン・ジリン酸（ＣＤＰ）、シチジン・モノリン酸（ＣＭＰ）、チミジン・トリリン酸（ＴＴＰ）、チミジン・ジリン酸（ＴＤＰ）、チミジン・モノリン酸（ＴＭＰ）、ウリジン・トリリン酸（ＵＴＰ）、ウリジン・ジリン酸（ＵＤＰ）、ウリジン・モノリン酸（ＵＭＰ）、イノシン・トリリン酸（ＩＴＰ）、イノシン・ジリン酸（ＩＤＰ）、イノシン酸（ＩＭＰ），デオキシアデノシン・トリリン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシアデノシン・ジリン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン・モノリン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン・トリリン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシグアノシン・ジリン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン・モノリン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシシチジン・トリリン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシシチジン・ジリン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン・モノリン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシチミジン・トリリン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシチミジン・ジリン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン・モノリン酸（ｄＴＭＰ）などの低分子量の核酸が例示できる。
【００１８】
また高分子量の核酸としては、例えばＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡのオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドとして２〜３０個の核酸の鎖として挙げられる）やポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドとして３０個以上の核酸の鎖として挙げられる）などが挙げられ、例えばＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体としてはポリＡ−オリゴｄＴ_12-18 、逆転写酵素反応産物などが挙げられ、１本鎖ＤＮＡとしてはオリゴｄＴ_19-24 、オリゴｄＴ_12-18 、オリゴｄＣ_12-18 、オリゴｄＧ_12-18 、オリゴｄＡ_12-18 、オリゴｄＴ₂₅、ポリｄＡ、合成プローブ、プライマーなどが挙げられ、２本鎖ＤＮＡとしては動植物または微生物のゲノムＤＮＡやプラスミド、ＤＮＡポリメラーゼ反応産物などが挙げられ、また１本鎖ＲＮＡとしてはオリゴＡ_12-18 、ポリＡ、動植物のｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡまたはｔ−ＲＮＡ、ウイルスゲノムＲＮＡ、リボムクレオチジルトランスフェラーゼ反応産物、合成プローブ、プライマーなどが挙げられ、２本鎖ＲＮＡとしては１本鎖ＲＮＡ同士のハイブリダイゼイション反応産物などが挙げられ、これらのオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドのヌクレアーゼ分解産物も挙げられ、さらにオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの例示として後述する感染症由来の核酸が挙げられる。
【００１９】
また、糖の５’位がリン酸エステルを形成していない場合は、これらの化合物をあらかじめリン酸化酵素などの核酸修飾酵素でリン酸化しておけばそれでよい。リン酸化酵素としては、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドカイネース、ヌクレオシドフォスフォトランスフェラーゼ、デオキシアデノシンカイネース、デオキシシチジンカイネースなどあり、これらの化合物の種類に合わせた基質特異性を有する酵素を選択して、本発明の対象とする核酸として用いればよい。
【００２０】
検出する目的の一つの核酸として感染症由来の核酸が挙げられ、感染症の由来が微生物の場合は、例えば好気性グラム陽性菌、好気性グラム陰性菌、嫌気性グラム陽性菌、嫌気性グラム陰性菌、抗酸菌、真菌、クラミジア、リッケチア、また、ウイルスの場合は例えばヒトエイズウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴセル白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）などのレトロウイルス、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス、バルボウイルス、パポーバウイルス、ポリオウイルス、ラブドウイルスなどが挙げられ、これら診断に有効であるような変異の少ない特異的遺伝子、また、癌遺伝子として癌抑制遺伝子や核内癌遺伝子などの定量が可能である。また、遺伝子治療を行う際の治療効果の判定や治療用遺伝子の定量等においても、本発明における核酸の定量方法は有用である。
【００２１】
使用されるヌクレオシドフォスフォリラーゼとは少なくともヌクレオシド＋無機リン＝リボース−１−リン酸（用いるヌクレオシドのペントースがリボースの場合）またはデオキシリボース−１−リン酸（用いるヌクレオシドのペントースがデオキシリボースの場合）＋脱糖化プリン誘導体（用いるヌクレオシドの塩基がプリン塩基である場合）または脱糖化ピリミジン誘導体（用いるヌクレオシドの塩基がピリミジン塩基の場合）なる反応を触媒するものであって、例えば、プリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＥＣ ２．４．２．１）、ピリミジンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＥＣ ２．４．２．２）、ウリジンフォスフォリラーゼ（ＥＣ ２．４．２．３）、チミジンフォスフォリラーゼ（ＥＣ ２．４．２．４）等が挙げられ、好ましくはプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼが挙げられる。特にプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼは生体に広く存在し、例えば動物組織、赤血球、酵母などに存在し（Ｆｒｉｅｄｋｉｎ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ（２ｎｄ ｅｄ），１９６１年，５，２３７−６４７頁）、市販もされている（東洋紡社）ため容易に入手できる。
【００２２】
また基質となるヌクレオシドは、プリンまたはピリミジンを塩基としたペントースからなる糖を結合したヌクレオシドで、ペントースとしては好適には例えばリボースまたはデオキシリボースが挙げられ、少なくともヌクレオシドフォスフォリラーゼの基質となるものであれば何でも良く、例えばグアノシン、イノシン、デオキシグアノシン、キサントシン、８−アザグアノシン、ウリジン、チミジン、デオキシウリジン、５−ブロモウリジン、５−ブロモデオキシウリジンなどが良く知られており、これらの群から選ばれた１つ以上のものならいずれも用いることができ、好ましくはイノシンが挙げられる。
【００２３】
また、本発明におけるフォスファターゼとは、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ反応によって生成したリボース−１−リン酸またはデオキシリボース−１−リン酸等のリン酸化基質を基質として少なくともリボース−１−リン酸→リボース＋無機リンまたはデオキシリボース−１−リン酸→デオキシリボース＋無機リンなる反応を触媒するものであれば用いることができ、さらにリボース−１−リン酸またはデオキシリボース−１−リン酸などのリン酸化基質を基質とする酵素と、核酸を基質として無機リンを生成せしめる触媒反応を行うような酵素群とを１種類以上組み合わせて使用することも可能である。
【００２４】
フォスファターゼとしては例えば、アルカリフォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１）、酸性フォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．２）、５’ヌクレオチダーゼ（ＥＣ ３．１．３．５）、３’ヌクレオチダーゼ（ＥＣ ３．１．３．６）、ポリヌクレオチド−５’−フォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．３３）、デオキシヌクレオチド−３’−フォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．３４）、チミジレート−５’−フォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．３５）、アシルフォスファターゼ、グルコース−１−フォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１０）、フルクトースビスフォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１１）、ビスフォスフォグリセレートフォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１３）、フォスフォリラーゼフォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１７）、グリセロール−２−フォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１９）、フォスフォグリセレートフォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．２０）、シュークロースフォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．２４）、フォスファチジルグリセロフォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．２７）、ＡＤＰフォスフォグリセレートフォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．２８）、デオキシヌクレオチド−３’−フォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．２４）、フォスファチジルイノシトールービスフォスフェートフォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．３６）、ストレプトマイシン−６−フォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．３９）、４−ニトロフェニルフォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．４１）などがよく知られており、これら酵素群から、基質特異性を考慮のうえ１種類かそれ以上選択すればよいが、特にこれに限定されるものではない。
【００２５】
こうして反応させたサイクリング反応によって蓄積されるリボースまたはデオキシリボース、脱糖化プリン誘導体または脱糖化ピリミジン誘導体を定量することによって簡単に核酸量を定量できる。具体的には、例えば脱糖化プリン誘導体がヒポキサンチンである場合、ヒポキサンチンを基質にキサンチンオキシダーゼ（市販酵素が簡便であり、例えばベーリンガーマンハイム社製が挙げられる）またはキサンチンデヒドロゲナーゼ（簡便には特開平６−１１３８３７号公報記載の細菌−Ｎｏ．１９７（１０）〔Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｎｏ．１９７（１０）〕微工研条寄第３６６４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６６４）によるキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔが挙げられる）などの酵素を、必要であれば適当な補酵素存在化にて反応せしめ、また、脱糖化ピリミジンがチミンまたはウラシルである場合、チミンまたはウラシルを基質にウラシルデヒドロゲナーゼまたはデヒドロウラシルデヒドロゲナーゼなどの酵素を、必要であれば適当な補酵素存在化にて反応せしめ、反応生成物を光学的に検出定量すればよい。
【００２６】
また必要であればキサンチンオキシダーゼ反応生成物やキサンチンデヒドロゲナーゼ反応生成物、例えば過酸化水素をさらに酵素的に定量すればなおよい。例えば、キサンチンオキシダーゼ反応によって生成した過酸化水素を基質に４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＨＡＬＰＳ）（同人化学研究所株式会社製）など市販されている酸化還元発色試薬存在化、パーオキシダーゼ反応せしめ、生成物を光学的に定量、例えば発色における特異的吸収波長に基づく吸光度を測定すればよい。また、キサンチンオキシダーゼ反応において消費される酸素の量を酸素電極や生成される過酸化水素を過酸化水素電極にて定量しても良い。
【００２７】
または、ＮＡＤやＮＡＤＰなどの補酵素存在化、キサンチンデヒドロゲナーゼ反応またはデヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ反応によって生成した還元型補酵素をその極大吸収波長、例えば還元型ＮＡＤや還元型ＮＡＤＰの場合３４０ｎｍ付近の吸光度を測定しても良く、また、還元型補酵素にテトラゾリウム化合物の存在化ジアホラーゼ反応せしめ、反応生成物のホルマザン色素を光学的に検出すればよい。
【００２８】
各酵素の量は、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ量は０．００１Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの範囲内であればそれでよく、好ましくは０．０１Ｕ／ｍｌ〜４０Ｕ／ｍｌの濃度であればよいが、特にこれに限定されるものではなく、フォスファターゼの濃度は、０．０１Ｕ／ｍｌ〜１０００００Ｕ／ｍｌの濃度であればよいが、好ましくは０．０５Ｕ／ｍｌ〜１０００Ｕ／ｍｌであればなお良いが、特にこれに限定されるものではない。
【００２９】
添加されるヌクレオシドの量は、ヌクレオシドフォスフォリラーゼが核酸より遊離したリン酸と必要かつ充分な反応ができるような過剰量であれば良く、その濃度は０．０１ｍＭ〜２００ｍＭであれば良く、好ましくは０．５ｍＭ〜１００ｍＭであればなお良いが、特にこれに限定されるものではない。反応系は、上記の酵素や構成試薬を同時に添加して用いるのが最も良いが、その添加する順序は特に限定されない。
【００３０】
キサンチンオキシダーゼまたはキサンチンデヒドロゲナーゼまたはデヒドロウラシルデヒドロゲナーゼの量は５０Ｕ／ｍｌ〜０．０００１Ｕ／ｍｌの濃度範囲であればそれでよく、好適には５Ｕ／ｍｌ〜０．００１Ｕ／ｍｌであればなおよく、補酵素の量は１００ｍＭ〜０．０００１ｍＭの範囲であれば良いが特にこれに限定されるものではない。
【００３１】
反応液中のｐＨは各酵素の至適なｐＨを考慮のうえ、最適な値をとればそれでよく、ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ５〜９であればそれでよいが、特にこれに限定されるものではない。反応液に用いる緩衝液は設定するｐＨにあわせて選択すればそれで良く、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グッド緩衝液などから１種類かそれ以上選択すればそれでよい。
【００３２】
また、反応温度は、用いる酵素が失活しない温度であれば特に限定されるものではなく、一般に酵素の作用温度条件であればよく、例えば０〜１００℃程度、好適には３７℃付近である。
反応時間は、酵素的サイクリング反応である工程２および工程３の反応が少なくとも１回以上反復する時間であればよく、酵素的サイクリングの１回に要する時間としては、使用する酵素の量によって多少異なるが、約１０〜２０秒程度であり、測定における反応時間は簡便には１分以上であればよく、好適には１０分以内であるが、よりサイクリング反応を生じせしめて高感度とするためにより長時間反応せしめてもよく、反応後に検出できる変化の量、例えば前記した酸素の消費量、過酸化水素の生成量、還元型補酵素の生成量またはこれらの量に基づく吸光値によって検量線に基づき算出することにより被検体中の核酸を定量できる。
【００３３】
そして、必要に応じて上記反応液中に、ＮａＣｌもしくはＫＣｌ等の塩を添加し、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトールやグルタチオンなどのＳＨ保護剤を添加したり、また、保存容器の種類に応じて、アルブミン、ＩｇＧ等のタンパク質、リジンやポリ−Ｌ−リジンなどのモノ、もしくはポリアミノ酸、及び界面活性剤を吸着防止剤として添加した液であれば、なんでも用いることができる。
【００３４】
上記の手法で特にオリゴヌクレオチドを定量しようとした場合に、その感度がさらに必要ならば、検体をヌクレアーゼによって分解し、その分解産物を上記手法で定量することによってさらに感度が向上する。
ヌクレアーゼは例えば、エクソデオキシヌクレアーゼＩ（ＥＣ３．１．１１．１）、エクソデオキシヌクレアーゼＩＩＩ（ＥＣ３．１．１１．２）、エクソデオキシヌクレアーゼラムダインデュース（ＥＣ３．１．１１．３）、エクソデオキシヌクレアーゼファージＳＰ３インデュース（ＥＣ３．１．１１４）、エクソデオキシヌクレアーゼＶ（ＥＣ３．１．１１．５）、エクソデオキシヌクレアーゼＶＩＩ（ＥＣ３．１．１１．６）、リボヌクレアーゼＩＩ（ＥＣ３．１．１３．１）、エクソリボヌクレアーゼＨ（ＥＣ３．１．１３．２）、オリゴヌクレオチダーゼ（ＥＣ３．１．１３．３）、イーストリボヌクレアーゼ（ＥＣ３．１．１４．１）、ヴェノムエクソヌクレアーゼ（ＥＣ３．１．１５．１）、スプリーンエクソヌクレアーゼ（ＥＣ３．１．１６．１）、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＥＣ３．１．２１．１）、エンドデオキシリボヌクレアーゼＩＶファージＴ４インデュース（ＥＣ３．１．２１．２）、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ（ＥＣ３．１．２２．１）、アスペルギルスデオキシリボヌクレアーゼＫ₁ （ＥＣ３．１．２２．２）、エンドデオキシリボヌクレアーゼＶ（ＥＣ３．１．２２．３）、リボヌクレアーゼ（ＥＣ３．１．２６．１、ＥＣ３．１．２７．２、ＥＣ３．１．２７．５、ＥＣ３．１．２７．６、）、リボヌクレアーゼα（ＥＣ３．１．２６．２）、リボヌクレアーゼＩＩＩ（ＥＣ３．１．２６．３）、エンドリボヌクレアーゼＨ（ＥＣ３．１．２６．４）、リボヌクレアーゼＰ（ＥＣ３．１．２６．５）、リボヌクレアーゼＴ₂ （ＥＣ３．１．２７．１）、リボヌクレアーゼＴ₁ （ＥＣ３．１．２７．３）、リボヌクレアーゼＵ₂ （ＥＣ３．１．２７．４）、エンドヌクレアーゼＳ₁ （ＥＣ３．１．３０．１）、エンドヌクレアーゼ（ＥＣ３．１．３０．２）、ミクロコッカルエンドヌクレアーゼ（ＥＣ３．１．３１．１）、または各種の制限酵素などが良く知られており、検体の種類と必要な感度にあわせて適当な種類を一つかまたはそれ以上組み合わせればよいが、特にこれに限定されるものではない。
【００３５】
ヌクレアーゼ濃度は、核酸を適当な反応条件下で分解できる濃度があれば良く、好ましくは０．００１Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌであればをれで良いが、特にこれに限定されるものではない。
ヌクレアーゼ反応条件は、選択されたヌクレアーゼに最適な条件下で行えば良く、例えば、ｐＨは選択された酵素における至適なｐＨに合わせられるように前記各種の緩衝液から選択すればそれでよく、必要に応じて、ＮａＣｌもしくはＫＣｌ等の塩を添加し、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトールやグルタチオンなどのＳＨ保護剤を添加したり、また、保存容器の種類に応じて、アルブミン、ＩｇＧ等のタンパク質、リジンやポリ−Ｌ−リジンなどのモノ、もしくはポリアミノ酸、及び界面活性剤を吸着防止剤として添加した液であれば、なんでも用いることができる。
【００３６】
ヌクレアーゼ反応はサイクリング反応に用いる各酵素と同時に反応させても良いが、ヌクレアーゼ反応によって生成されたヌクレオチドを前記核酸の定量方法に従って反応できれば別々に反応させても良い。
特に、目的以外の核酸の混入が疑われる場合は、目的とする核酸に対して相補的な塩基配列を有するプローブにて目的の核酸を選別すると特異性が向上する。
【００３７】
具体的には、固相担体に目的遺伝子と相補的な遺伝子配列を持つプローブを予め固相化させておき、これと目的遺伝子とをハイブリダイゼーション反応せしめ、結合した核酸の量を上記酵素反応によって定量すればよい。
さらに具体的には、透明なもしくは半透明なまたは着色した基材に目的遺伝子と実質的に相補的なプローブ遺伝子配列を固着させておき、目的遺伝子と従来一般的に用いられている反応条件にてハイブリダイゼーション反応せしめ（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．、１９８２年、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、目的以外の核酸を洗浄除去し、上記サイクリング反応せしめれば目的遺伝子量だけを特異的に定量できる。
【００３８】
プローブは、目的核酸と実質的に相補的で目的核酸とハイブリダイズできる配列であればよく標識体でも非標識体でも良く、配列によっては後述するポリメラーゼの転写反応開始部位を含むプライマーとしても利用できる。また、目的核酸とあらかじめ固相に結合できるように標識されているものも使用することができ、プローブに結合した目的核酸が上記ヌクレアーゼ反応およびサイクリング反応できるものであれば何でも用いることができる。
【００３９】
例えば、感染症の診断を行う場合に用いるプローブとして、クラミジアトラコマーチスの場合、ＤＮＡの５’末端側から、ＣＴＧＣＴＣＡＣＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＴＴＣＣＧ（位置２４４１〜２４６５）、ＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＡＴＴＡＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧＣ（位置１３０１〜１３２５）、ＧＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＣＴＣ（位置２４５８〜２４３４）、ＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＣＡＣＡＧＴＡＧＣＴＧＡＴ（位置１３１〜１０８）等、ヨーロッパ特許第１９２０３３号明細書に示されている部位を含むもの、また、ＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＴ（位置２４０２〜２３７８）、ＣＴＴＣＣＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＴＴＣＣＡＧＴ（位置１７２２〜１７４６）など、クラーケら、Ｇｅｎｅ、１９８８年、７１巻３０７〜３１４に示されている部位を含むものから１種類かそれ以上を選択すればそれでよい。
【００４０】
また、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の場合は、特公平５−８１６００号公報に示されているような配列からこのウイルスに特異的な領域を利用すればそれでよく、例えば特開平６-２３７７９９号公報に示されているようなＣＣＴＣＴＣＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧＧ、ＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＣＡＴ、ＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＣ、ＧＡＧＴＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡ等が挙げられ、実質的にこれらの配列を含むものから１種類かそれ以上選択すればそれでよい。
【００４１】
またヒト後天性免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の場合、Ｔ．ＫｉｅｖｉｔｓらによるＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９１年、３５巻、２７３〜２８６頁に示されているように、ＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＡ、ＡＴＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＴＡ、ＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＡＧＧＴＡ、ＴＧＴＣＣＴＣＧＴＣＴＡＴＧＴＣＡＴＡＡＴＣ、ＡＣＣＴＴＣＴＴＴＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＧＴＣＴＡＡＣＣＡＡＣＧ、ＣＡＴＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＡＴ、ＡＴＣＴＴＣＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＧＴＡＣＡＧＴＣＣＣＴ、ＧＧＴＴＴＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＡＴ、ＡＧＧＧＡＣＴＧＴＡＣＧＡＣＡＧＴＡＧＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴを含む塩基配列などが挙げられ、これらを実質的に含むプローブを１種類かそれ以上選択すればそれでよいが、特にこれらに限定させるものではない。
【００４２】
固相基材としてよく用いられるものはＥＩＡ用プレート、磁性ビーズ、ＥＩＡ用プラスチックボール、チューブ、イオン交換樹脂等で、その材質としては、核酸を固定化できるものであれば何でも用いることができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、テフロン、ポリエチレン、メチルベンテン樹脂（ＴＰＸ）、フッ素樹脂、アクリル樹脂、シリカ、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリカーボネート、ポリウレタン、塩化ビニル樹脂等のプラスチック、ステンレス、アルミ、チタン等の金属、ガラス及びゴム等が挙げられる。
【００４３】
基材への核酸の固相化方法は、固相担体への吸着や、核酸の５’末端から直接基材へ化学結合する手法（Ｖ．Ｌｕｎｄ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１６，２２，１０８６１−１０８８０（１９８８））、核酸の５’末端、３’末端または、核酸のプリンもしくはピリミジン環部分にビオチン、ハプテン、レセプターなどを修飾し、基材に予め固相化しておいたアビジンや抗体などのリガンドと結合させることなどによって簡単に固相化できる。
【００４４】
固相上における核酸の検出は、特にヌクレアーゼ反応を行わなくとも検出できるが、高感度が要求される場合はヌクレアーゼ反応を行えばそれでよい。
また、さらに高感度化が必要な場合は、固相担体上においてポリメラーゼ反応を行わせればなおよい。固相上にあらかじめ目的の核酸が結合できるような、ポリメラーゼの転写開始部位を含むプローブを固相化させておき、検体と接触させてハイブリダイズ反応せしめた後、ポリメラーゼ反応によって鋳型となる核酸から新たに核酸を合成せしめ、その核酸が、固相担体上に固着されて得られれば、その量を上記ヌクレアーゼ反応及びサイクリング反応によって定量できる。このようにハイブリダイズ反応した目的核酸の量をポリメラーゼで合成された核酸量に基づいて定量することにより、容易にもとの目的核酸量を増大させて高感度に定量することができる。
【００４５】
例えば、検体がＲＮＡの場合、基材に検体と相補的な１本鎖ＤＮＡプローブを固相化させておき、ハイブリダイゼーション反応後、逆転写酵素反応をさせる。このとき固相プローブとのハイブリッド体のうちプローブとハイブリダイズしていない１本鎖の領域をＤＮＡ−ＲＮＡの２本鎖ハイブリッド体を合成する。目的以外の核酸を洗浄除去し、リボヌクレアーゼＨ反応によって、ハイブリッド体のＲＮＡだけを分解し、その分解産物中のヌクレオチド量を本発明の手法に従ってサイクリング反応にて定量すればよい。
【００４６】
また、検体がＤＮＡの場合、検体を熱処理またはアルカリ処理などによって、少なくとも検体以外の１本鎖核酸とハイブリダイズすることができるように前処理を行い、基材に検体と相補的な１本鎖ＤＮＡプローブを固相化させておき、ハイブリダイゼーション反応後、ＤＮＡポリメラーゼ反応をさせる。目的以外の核酸を洗浄除去し、エクソヌクレアーゼＩＩＩによってハイブリッド体を分解し、その分解産物中のヌクレオチド量を本発明の手法に従ってサイクリング反応にて定量すればよい。
【００４７】
ポリメラーゼとは、鋳型となる塩基配列から新たに核酸を合成する酵素で例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、クレノウフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどが知られており市販もされているので簡単に入手でき、これら酵素を１種類かそれ以上用いればそれでよい。
【００４８】
ポリメラーゼ濃度は、適当な条件下で鋳型核酸から新たに核酸を合成できれば良く、好ましくは、０．００１Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌであればよいが、特にこれに限定されるものではない。またこの反応に用いるヌクレオチドとしてはＵＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ等を適宜選択し組み合わせて用いれば良く、その量は１００ｍＭ〜０．０００１ｍＭの濃度範囲で用いれば良く、またポリメラーゼ反応の鋳型となる核酸の塩基配列に合わせて反応に最適な条件となるように各ヌクレオチドの濃度を別々に設定しても良い。
【００４９】
ポリメラーゼ反応条件は、用いるポリメラーゼに合わせて反応条件を選択すればそれで良く、固相上において核酸が転写され、その転写された核酸が固着された状態で得られれば何でも用いることができ、目的核酸と固相上のプローブとのハイブリダイズ反応とポリメラーゼ反応とは同一の反応系内で行わせるのがよいが、必要に応じて別々に反応させることもできる。
【００５０】
さらには、固相担体上で核酸増幅を行えばさらに感度を向上させることができる。例えば、固相基材上にＰＣＲなどの核酸増幅技術を行わせるための２種類のプライマー（ポリメラーゼの転写開始部位を含む核酸で、例えば逆転写酵素反応やＤＮＡポリメラーゼ反応のための１本鎖ＤＮＡ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ反応のためのＴ７プロモーター２本鎖ＤＮＡ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ反応のためのＳＰ６プロモーター２本鎖ＤＮＡなどが挙げられる）のうち一方をポリメラーゼ反応の反応開始部位を含む本発明でのプローブとして用い、もう一方のプライマーを増幅する対象となる核酸の塩基配列と同一かもしくは相補的な塩基配列を持つポリメラーゼ反応の反応開始部位を含み、少なくともそのうち少なくとも１種類を固相化させておき、目的遺伝子を含む検体と核酸増幅を行わせるための反応組成物として例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼともう一方のプライマーと最適な反応に必要な組成を含む反応液を添加し、固相上でＰＣＲを行わせた後、未反応物を洗浄除去後、固相上の反応生成物を上記のヌクレアーゼ反応及びサイクリング反応を用いて定量すればさらに感度は向上する。プライマーは上記感染症に例を挙げたプローブを２種類以上選択して使用すればそれでよい。
【００５１】
核酸増幅方法としては、例えば、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。ＬＣＲ法の場合はＰＣＲ法の場合と同様に、２種類のプライマーのうち少なくとも１種類を固相化させておき、目的遺伝子を含む検体と核酸増幅を行わせるための反応組成物として例えば耐熱性ＤＮＡリガーゼともう一方のプライマーと最適な反応に必要な組成を含む反応液を添加し、固相上でＬＣＲを行わせた後、上記ＰＣＲ法の場合と同様に検出すればよい。また酵素のカスケード反応を利用したＮＡＳＢＡ法を用いる場合は２種類のプライマーのうち少なくとも１種類を固相化させておき、目的遺伝子を含む検体と核酸増幅を行わせる反応組成物として逆転写酵素、リボヌクレアーゼＨ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼともう一方のプライマー及び最適な反応に必要な組成を含む反応液を添加し、固相上で増幅反応を行わせた後、固相上に形成される２本鎖ＤＮＡを上記ＰＣＲ法の場合と同様に検出すればよい。
【００５２】
さらに具体的には、例えば、検体がＨＩＶやＨＣＶのようなＲＮＡの場合、基材に前述したＨＩＶまたはＨＣＶ用のプローブのうち１種類を固相化させておき、ハイブリダイゼーション反応後、目的以外の核酸を洗浄除去し、上記の如くもう一方のプローブとともにＮＡＳＢＡ法による核酸増幅反応せしめ、未反応物を洗浄除去した後、固相上に形成される２本鎖ＤＮＡをエクソヌクレアーゼＩＩＩにて分解し、その分解産物中のヌクレオチド量を上記サイクリング反応にて定量すれば目的のＨＩＶまたはＨＣＶウイルスが検出可能となる。
【００５３】
また検体が癌遺伝子を含む生体中の構造遺伝子のようなＤＮＡの場合は、検体を酵素処理、加熱処理またはアルカリ処理などによって、少なくとも検体以外の１本鎖核酸とハイブリダイズすることができるように前処理を行い、検体と相補的な１本鎖ＤＮＡプローブを固相化させておいた固相基材とハイブリダイゼーション反応後、目的以外の核酸を洗浄除去し、エクソヌクレアーゼＩＩＩによってハイブリッド体を分解し、その分解産物中のヌクレオチド量を本発明の酵素反応によって定量すればよい。また、さらに高感度が必要な場合は、上記のごとく核酸増幅法と組み合わせればよく、この場合上述の如くＰＣＲ法で固相上のプローブと液相のもう一方のプローブとを用いてポリメラーゼ反応させ、得られる固相上の２本鎖核酸を同様にエクソヌクレアーゼＩＩＩによって分解させその産物を検出すれば目的の癌遺伝子が検出できる。
【００５４】
検体は、固相の核酸とハイブリダイズできるように、生体成分から核酸抽出などの前処理をしたものであれば良く、必要に応じて酵素処理、加熱処理またはアルカリ処理、または樹脂やシリカなどに吸着させるなど精製を行うのが一般的に行われている手法であり（Ｔ．Ｋｉｅｖｉｔｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９１年、３５巻、２７３〜２８６頁）、このようにして得られた多種多様な核酸から目的とする核酸が検出された場合、その検査の目的の菌またはウイルスの存在、または癌遺伝子等の特定の核酸が同定定量され、診断に有効に利用しうるものとなる。
【００５５】
【実施例】
次に本発明の実施例によりさらに例示するが、本発明の範囲をこれにより制限するものではない。
【００５６】
【実施例１】
５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０Ｕ牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液１ｍｌに、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８溶液中に、０〜１ｍＭの濃度になるように調製されたＡＭＰ溶液０．０１ｍｌを添加し、３７℃での溶液の５４２ｎｍの１分後、２分後、３分後の吸光度を分光光度計にて測定した（ＡＬＰ＋）。
【００５７】
また、これとは別に上記酵素溶液中にアルカリフォスファターゼを含まない酵素溶液１ｍｌに、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８溶液中に、測定対象物となる０、０．２、０．４、０．６、０．８、１ｍＭの濃度になるように調製された６種類のＡＭＰ溶液をそれぞれ０．０１ｍｌ添加し、３７℃での溶液の５４２ｎｍの１分後、２分後、３分後の吸光度を分光光度計にて測定した（ＡＬＰ−）。その結果を表１に示した。
【００５８】
【表１】

【００５９】
アルカリフォスファターゼを含まない酵素液を用いて測定した結果はＡＭＰ量に依存した結果が得られなかったのに対して、アルカリフォスファターゼを含む酵素液を用いて測定した場合ＡＭＰ濃度が高濃度であれば吸光度が大きく、逆に低濃度のＡＭＰでは吸光度が小さい結果となった。また、本発明では反応時間とともに吸光度が増加するもので、明らかに酵素的サイクリング反応に基づくものである。
【００６０】
【実施例２】
５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液中に、５０Ｕ／ｍｌの濃度になるように、子牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ、大腸菌由来のアルカリフォスファターゼをそれぞれ添加し、酵素溶液を調製した。またこれとは別に５０ｍＭＭＥＳｐＨ６（和光純薬工業社製）、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液中に、５０Ｕ／ｍｌの濃度になるように、大腸菌由来の酸性フォスファターゼ（シグマ社製）を添加して酵素溶液を調製し、前記２種類の酵素溶液と合わせて３種類の酵素溶液を調製した。
【００６１】
この酵素溶液１ｍｌに、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８溶液中に、測定対象物となる０、０．５、１ｍＭの濃度になるように調製された６種類のＡＭＰ溶液０．０１ｍｌを添加し、３７℃での溶液の５４２ｎｍの２分後の吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表２に示した。
【００６２】
【表２】

【００６３】
どの酵素溶液を用いても、測定結果はＡＭＰ濃度に依存した吸光度の結果が得られ、ＡＭＰ濃度が高濃度であれば吸光度が大きく、逆に低濃度のＡＭＰでは吸光度が小さい結果となった。
【００６４】
【実施例３】
５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８，１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０Ｕ牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液１ｍｌに、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８溶液中に、測定対象物となる０、０．１５、０．３ｍＭの濃度になるように調製されたそれぞれのＡＭＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を添加し、３７℃での溶液の５４２ｎｍの２分後の吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表３に示した。
【００６５】
【表３】

【００６６】
どの測定対象物質も濃度依存的に吸光度が変化した。つまり高濃度であれば吸光度が大きく、逆に低濃度では吸光度が小さい結果となった。
【００６７】
【実施例４】
５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０Ｕ牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液１ｍｌに、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８溶液中に、測定対象物となるオリゴｄＴ₁₉-₂₄ （ＳＩＧＭＡ社製）、オリゴｄＧ₁₂-₁₈ 、オリゴｄＣ₁₂-₁₈ 、オリゴＡ₁₂-₁₈ （ファルマシア社製）を０、１、５μｇ／μｌの濃度になるように調製された１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）５ｍＭＥＤＴＡ溶液それぞれを１μｌ添加し、３７℃での溶液の５４２ｎｍの２分後の吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表４に示した。
【００６８】
【表４】

【００６９】
どの物質を測定しても、測定対象物質の濃度依存的に吸光度が変化し、つまり高濃度であれば吸光度は大きく、逆に低濃度では吸光度が小さい結果となった。
【００７０】
【実施例５】
１０μｇの、ラムダＤＮＡ（東洋紡社製）をそれぞれ１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール、１０Ｕの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを含む溶液１００μｌ中で３７℃３０分間消化し、１０μｌの５ＭＮａＣｌとエタノール１ｍｌ添加後、−８０℃にて３０分間冷却し、遠心沈殿を乾燥させて、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）５ｍＭＥＤＴＡ溶液にて０、１０、１００μｇ／μｌの濃度になるように調製し、検体とした。また、ポリＡおよびポリＣ（ファルマシア社製）を１０ｍＭＴｒｉｓーＨＣｌ（ｐＨ８）５ｍＭＥＤＴＡ溶液にて０、１０、１００μｇ／μｌの濃度になるように調製し、これらを検体とした。
【００７１】
５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０Ｕ牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液１ｍｌに、検体１μｌ添加し、３７℃での溶液の５４２ｎｍの２分後の吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表５に示した。
【００７２】
【表５】

【００７３】
どの物質を測定しても、測定対象物質の濃度依存的に吸光度が変化した。つまり高濃度であれば吸光度が大きく、逆に低濃度では吸光度が小さい結果となった。
【００７４】
【実施例６】
実施例５に従い、ラムダＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素にて分解し、０、０．１、０．５μｇ／μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）５ｍＭＥＤＴＡ溶液を検体をとして調製した。検体１μｌを５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８，１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、エクソヌクレアーゼＩＩＩ（宝酒造社製）１．８Ｕ／μｌの酵素溶液１００μｌ中に添加し、３７℃で２時間分解反応させた。この溶液に、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８，１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０Ｕ牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液１ｍｌを添加し、３７℃での溶液の２分後の吸光度を測定した。その結果を表６に示した。
【００７５】
【表６】

【００７６】
測定対象物質である核酸の量に依存して吸光度が変化し、高濃度であれば吸光度が大きく、逆に低濃度では吸光度が小さい結果となった。そして、実施例５におけるラムダＤＮＡ量を測定した結果よりも感度が向上していた。
【００７７】
【実施例７】
５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０Ｕ牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）にイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）を０．４９、０．９８、１．９５、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｍＭの濃度に調製された酵素溶液それぞれ１ｍｌに、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８溶液中に、測定対象物となるオリゴｄＴ₁₉-₂₄ （ＳＩＧＭＡ社製）を０、５μｇ／μｌの濃度になるように調製された１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）５ｍＭＥＤＴＡ溶液それぞれを１μｌ添加し、３７℃での溶液の５４２ｎｍの２分後の吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表７に示した。
【００７８】
【表７】

【００７９】
どのイノシン濃度においても、オリゴｄＴ_19-24 を測定することができた。
【００８０】
【実施例８】
５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）に、１２８０、６４０、３２０、１６０、８０、４０、２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１９５、０．０９７７、０．０４８８Ｕ牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）それぞれの濃度に調製された酵素溶液１ｍｌに、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８溶液中に、測定対象物となるオリゴｄＴ₁₉-₂₄ （ＳＩＧＭＡ社製）０、５μｇ／μｌの濃度になるように調製された１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）５ｍＭＥＤＴＡ溶液それぞれを１μｌ添加し、３７℃での溶液の５４２ｎｍの２分後の吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表８に示した。
【００８１】
【表８】

【００８２】
どの量のＡＬＰ濃度においてもオリゴｄＴ_19-24 を測定することができた。
【００８３】
【実施例９】
５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）中に各酵素が表９に示したような量になるように酵素溶液を調製した。
【００８４】
【表９】

【００８５】
調製された各酵素溶液１ｍｌに、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８溶液中に、測定対象物となるオリゴｄＴ₁₉-₂₄ （ＳＩＧＭＡ社製）０、５μｇ／μｌの濃度になるように調製された１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）５ｍＭＥＤＴＡ溶液それぞれを１μｌ添加し、３７℃での溶液の５４２ｎｍの２分後の吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表１０に示した。
【００８６】
【表１０】

【００８７】
どの酵素濃度の溶液を用いても、測定対象物質であるオリゴｄＴ_19-24 を測定することができた。
【００８８】
【実施例１０】
８０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、６００ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ中にオリゴｄＡ_12-18 （ファルマシア社製）それぞれを０、５０、２００μｇ／ｍｌの濃度になるように調製し、検体液とした。この検体液２００μｌに、マグネチックパーティクルコンセントレーターＭＰＣ−Ｅ（ダイナル社製）を用いて０．１５ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５；以下ＴＢＳと呼ぶ）１ｍｌにて５回洗浄したオリゴｄＴ₂₅固相化磁性ビーズ（ダイナル社製）１ｍｇを添加し、３７℃で２時間静置した。この後、上清液を捨てた後、上記洗浄法に従ってＴＢＳ１ｍｌにて５回洗浄した。洗浄されたビーズに、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、０．２５Ｕ／μｌ牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）溶液２００μｌを添加し３７℃３０分インキュベートしたのち、マグネチックパーティクルコンセントレーターＭＰＣ−Ｅにて溶液を回収した。回収した液に５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液１ｍｌを添加し、３７℃での溶液の２分後の５４２ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表１１に示した。
【００８９】
【表１１】

【００９０】
高い濃度のオリゴｄＡ_12-18 では高い吸光度が得られ、逆に低い濃度のオリゴｄＡ_12-18では低い吸光度が得られたことから、本法でオリゴｄＡの定量が可能であることが確認できた。
【００９１】
【実施例１１】
８０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、６００ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ中にポリｄＡ（ファルマシア社製）それぞれを０、２．５、５μｇ／ｍｌの濃度になるように調製し、検体液とした。この検体液２００μｌに、マグネチックパーティクルコンセントレーターＭＰＣ−Ｅ（ダイナル社製）を用いて０．１５ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５；以下ＴＢＳと呼ぶ）１ｍｌにて５回洗浄したオリゴｄＴ₂₅固相化磁性ビーズ（ダイナル社製）１ｍｇを添加し、３７℃で２時間静置した。この後、上清液を捨てた後、上記洗浄法に従ってＴＢＳ１ｍｌにて５回洗浄した。
【００９２】
洗浄されたビーズに、１００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．８、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ還元型グルタチオン、０．２％トリトンＸ−１００、２％エチレングリコール、１４０ｍＭＫＣｌ、０．０１Ｕ／μｌＤＮＡポリメラーゼＩ（東洋紡社製）、０．５ｍＭデオキシＮＴＰ（宝酒造社製）溶液２００μｌをに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。この後、上記洗浄方法でＴＢＳ１ｍｌにて５回洗浄した後、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、エクソヌクレアーゼＩＩＩ（宝酒造社製）０．９Ｕ／μｌの酵素溶液２００μｌをウエルに添加し、３７℃で３０分分解反応させた。
【００９３】
この分解反応液をマグネチックパーティクルコンセントレーターＭＰＣ−ＥにてオリゴｄＴ₂₅固相化磁性ビーズとを分離し回収した。回収した液に５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０Ｕ子牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液１ｍｌを添加し、３７℃での溶液の２分後の５４２ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表１２に示す。
【００９４】
【表１２】

【００９５】
高い濃度のポリｄＡでは高い吸光度が得られ、逆に低い濃度のポリｄＡでは低い吸光度が得られたことから、本法でポリｄＡの定量が可能であることが確認できた。
【００９６】
【実施例１２】
８０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、６００ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ中にポリＡ（ファルマシア社製）それぞれを０、５、１０μｇ／ｍｌの濃度になるように調製し、検体液とした。この検体液２００μｌに、マグネチックパーティクルコンセントレーターＭＰＣ−Ｅ（ダイナル社製）を用いて０．１５ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５；以下ＴＢＳと呼ぶ）１ｍｌにて５回洗浄したオリゴｄＴ₂₅固相化磁性ビーズ（ダイナル社製）１ｍｇを添加し、３７℃で２時間静置した。この後、上清液を捨てた後、上記洗浄法に従ってＴＢＳ１ｍｌにて５回洗浄した。
【００９７】
洗浄されたビーズに、１００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．８、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ還元型グルタチオン、０．２％トリトンＸ−１００、２％エチレングリコール、１４０ｍＭＫＣｌ、０．０１Ｕ／μｌＨＩＶ−１由来逆転写酵素（生化学工業社製）、０．５ｍＭデオキシＮＴＰ（宝酒造社製）溶液２００μｌをに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。この後、上記洗浄方法でＴＢＳ１ｍｌにて５回洗浄した後、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、リボヌクレアーゼＨ（宝酒造社製）１．８Ｕ／μｌの酵素溶液２００μｌを添加し、３７℃で３０分分解反応させた。
【００９８】
この分解反応液をマグネチックパーティクルコンセントレーターＭＰＣ−ＥにてオリゴｄＴ₂₅固相化磁性ビーズとを分離し回収した。回収した液に５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０Ｕ子牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液１ｍｌを添加し、３７℃での溶液の２分後の５４２ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表１３に示した。
【００９９】
【表１３】

【０１００】
高い濃度のポリＡでは高い吸光度が得られ、逆に低い濃度のポリＡでは低い吸光度が得られたことから、本発明によりポリＡの定量が可能であることが確認できた。
【０１０１】
【実施例１３】
ストレプトアビジン固相化磁性ビーズ（ダイナル社製）２０ｍｇに、２５０μｇ５’末端ビオチン標識合成プローブｄ（ＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴ）、５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭＥＤＴＡ、０．３％牛血清アルブミン、０．１％トリトンＸ-１００を含む溶液１ｍｌ調製し、３７℃２時間反応させて、実施例１０の磁性ビーズ洗浄方法に従ってＴＢＳにて５回洗浄し、プローブ固相化磁性ビーズとした。
【０１０２】
ヒト免疫不全ウイルス１型ＬＡＶ−１株をＭＯＬＴ−４細胞に感染させたのち、２０％牛血清、ＲＰＭＩ１６４０培地中で３週間培養し、培養上清液と１％トリトンＸ−１００溶液とを等量混合して検体液とした。対照群として何も感染させなかったＭＯＬＴ−４細胞を同様の手法で培養し、前者とともに２種類の検体液を得た。また、これとは別に何も培養していない２０％牛血清、ＲＰＭＩ１６４０培地も検体液と同様の処理操作を行った。
【０１０３】
検体液５μｌに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．００１％ゼラチン１ｍＭｄＡＴＰ、１ｍＭｄＧＴＰ、１ｍＭｄＣＴＰ、１ｍＭｄＴＴＰ、ｇａｇ領域であるｄ（ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴ）とｄ（ＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴ）の塩基配列の２種類のプライマーそれぞれ５μｇ、１４ＵのＨＩＶ−１由来逆転写酵素（生化学工業社製）、０．５ｍＭデオキシＮＴＰ（宝酒造社製）を含むように調製された１００μｌの液を３７℃３０分間反応させた。この液にさらに５Ｕ／μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）１μｌを加え、サーマルサイクラーにて３０サイクルＰＣＲ反応を行わせた。
【０１０４】
反応液を１００℃１時間加温し、氷上で急速冷却し、プローブ固相化磁性ビーズ５ｍｇを添加し、４２℃で１昼夜ハイブリダイズ反応させた。反応後、マグネチックパーティクルコンセントレーターＭＰＣ−Ｅ（ダイナル社製）を用いてＴＢＳ１ｍｌにて５回洗浄し、洗浄されたビーズに、１００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．８、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ還元型グルタチオン、０．２％トリトンＸ−１００、２％エチレングリコール、１４０ｍＭＫＣｌ、０．０１Ｕ／μｌ大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、０．５ｍＭデオキシＮＴＰ（宝酒造社製）を含む溶液２００μｌを添加し、３７℃で２時間インキュベートした。
【０１０５】
この後、上記洗浄方法でＴＢＳ１ｍｌにて５回洗浄した後、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、エクソヌクレアーゼＩＩＩ（宝酒造社製）０．９Ｕ／μｌの酵素溶液２００μｌを添加し、３７℃で３０分分解反応させた。この分解反応液をマグネチックパーティクルコンセントレーターＭＰＣ−ＥにてオリゴｄＴ₂₅固相化磁性ビーズとを分離し回収した。
【０１０６】
回収した液に５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４ーアミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０Ｕ子牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液１ｍｌを添加し、３７℃での溶液の２分後の５４２ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表１４に示した。
【０１０７】
【表１４】

【０１０８】
その結果、ＨＩＶを感染させた細胞の培養液から得られた検体において、感染させなかった細胞から得られた検体と比較して高い吸光度が得られ、感染細胞の培養上清中においてＨＩＶの存在が確認できた。
【０１０９】
【実施例１４】
ストレプトアビジン固相化磁性ビーズ（ダイナル社製）２０ｍｇに、２５０μｇ５’末端ビオチン標識合成プローブｄ（ＡＣＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＡＧＴＡＴＴＡＧ）、５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭＥＤＴＡ、０．３％牛血清アルブミン、０．１％トリトンＸ−１００を含む溶液１ｍｌ調製し、３７℃２時間反応させて、実施例１０の磁性ビーズ洗浄方法に従ってＴＢＳにて５回洗浄し、プローブ固相化磁性ビーズとした。
【０１１０】
ヒト免疫不全ウイルス１型ＧＨ−３株をＭＯＬＴ−４細胞に感染させたのち、２０％牛血清、ＲＰＭＩ１６４０培地中で３週間培養し、培養上清液と１％トリトンＸ−１００溶液とを等量混合して検体液とした。対照群として何も感染させなかったＭＯＬＴ−４細胞を同様の手法で培養し、前者とともに２種類の検体液を得た。また、これとは別に何も培養していない２０％牛血清、ＲＰＭＩ１６４０培地も検体液と同様の処理操作を行った。検体液５μｌを用いてＴ．Ｋｉｅｖｉｔｓらによる核酸増幅方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ、１９９１年、３５巻、２７３〜２８６頁）に従いＮＡＳＢＡ反応をさせた。
【０１１１】
反応に用いた２種類のプライマーはｄ（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴ）とｄ（ＡＣＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＡＧＴＡＴＴＡＧ）を用い、反応液は２５μｌで４１℃６時間反応させた。得られた反応液にプローブ固相化磁性ビーズ５ｍｇに反応液全量を添加し、４２℃で１昼夜ハイブリダイズ反応させた。
【０１１２】
反応後、マグネチックパーティクルコンセントレーターＭＰＣ−Ｅ（ダイナル社製）を用いてＴＢＳ１ｍｌにて５回洗浄し、洗浄されたビーズに、１００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．８、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ還元型グルタチオン、０．２％トリトンＸ−１００、２％エチレングリコール、１４０ｍＭＫＣｌ、０．０１Ｕ／μｌＨＩＶ−１由来逆転写酵素（生化学工業社製）、０．５ｍＭデオキシＮＴＰ（宝酒造社製）溶液２００μｌをに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。
【０１１３】
この後、上記洗浄方法でＴＢＳ１ｍｌにて５回洗浄した後、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、リボヌクレアーゼＨ（宝酒造社製）１．８Ｕ／μｌの酵素溶液２００μｌを添加し、３７℃で３０分分解反応させた。この分解反応液をマグネチックパーティクルコンセントレーターＭＰＣ−ＥにてオリゴｄＴ₂₅固相化磁性ビーズとを分離し回収した。
【０１１４】
回収した液に５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）、１ｍＭＡＤＯＳ（同人科学研究所製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０Ｕ子牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）、５０ｍＵキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）、パーオキシダーゼ４．５Ｕ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液１ｍｌを添加し、３７℃での溶液の２分後の５４２ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表１５に示した。
【０１１５】
【表１５】

【０１１６】
その結果、ＨＩＶを感染させた細胞培養から得られた検体において、感染させなかった細胞から得られた検体と比較して高い吸光度が得られ、感染細胞の培養上清中においてＨＩＶの存在が確認できた。
【０１１７】
【実施例１５】
５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、２ｍＭＮＡＤ（和光純薬工業社製）、０．５ｍｇニトロブルーテトラゾリウム（和光純薬工業社製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０Ｕ牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）、０．５Ｕキサンチンデヒドロゲナーゼ（特開平６−１１３８３７号公報に記載のＦＥＲＭ ＢＰ３６６４によって調製した）、５Ｕジアホラーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液１ｍｌに、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８溶液中に、０〜１ｍＭの濃度になるように調製されたＡＭＰ溶液０．０１ｍｌを添加し、３７℃での溶液の５５０ｎｍの１分後、２分後、３分後の吸光度を分光光度計にて測定した（ＡＬＰ＋）。
【０１１８】
また、これとは別に上記酵素溶液中にアルカリフォスファターゼを含まない酵素溶液１ｍｌに、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８溶液中に、測定対象物となる０、０．２、０．４、０．６、０．８、１ｍＭの濃度になるように調製された６種類のＡＭＰ溶液をそれぞれ０．０１ｍｌ添加し、３７℃での溶液の５５０ｎｍの１分後、２分後、３分後の吸光度を分光光度計にて測定した（ＡＬＰ−）。その結果を表１６に示した。
【０１１９】
【表１６】

【０１２０】
アルカリフォスファターゼを含まない酵素液を用いて測定した結果はＡＭＰ量に依存した結果が得られなかったのに対して、アルカリフォスファターゼを含む酵素液を用いて測定した場合ＡＭＰ濃度が高濃度であれば吸光度が大きく、逆に低濃度のＡＭＰでは吸光度が小さい結果となった。また、本発明では反応時間とともに吸光度が増加するもので、明らかに酵素的サイクリング反応に基づくものである。
【０１２１】
【実施例１６】
５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１０ｍＭイノシン（ＳＩＧＭＡ社製）、２ｍＭＮＡＤ（和光純薬工業社製）、０．５ｍｇニトロブルーテトラゾリウム（和光純薬工業社製）、０．３７５Ｕプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ（東洋紡社製）、５０Ｕ牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）、０．５Ｕキサンチンデヒドロゲナーゼ（同上）、５Ｕジアホラーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）の濃度に調製された酵素溶液１ｍｌに、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８溶液中に、測定対象物となるオリゴｄＴ₁₉-₂₄ （ＳＩＧＭＡ社製）、オリゴｄＧ₁₂-₁₈ 、オリゴｄＣ₁₂-₁₈ 、オリゴＡ₁₂-₁₈ （ファルマシア社製）を０、１、５μｇ／μｌの濃度になるように調製された１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）５ｍＭＥＤＴＡ溶液それぞれを１μｌ添加し、３７℃での溶液の５５０ｎｍの２分後の吸光度を分光光度計にて測定した。その結果を表１７に示した。
【０１２２】
【表１７】

【０１２３】
どの物質を測定しても、測定対象物質の濃度依存的に吸光度が変化し、つまり高濃度であれば吸光度は大きく、逆に低濃度では吸光度が小さい結果となった。
【０１２４】
【発明の効果】
本発明により、従来の核酸定量技術に比べて、極めて簡便に酵素的サイクリング反応を構成して高感度かつ再現良く核酸を定量し得るもので、特に臨床検査分野での感染症などの核酸のルーチン分析や機器による自動化によって検査コストを低減させられる効果を奏する。

Claims (22)

1. 少なくとも、下記の４つの反応工程からなる核酸の定量方法。
   工程１：被検体中の核酸にフォスファターゼを反応せしめて無機リンを生成させる工程、
   工程２：生成した無機リンを、過剰量のヌクレオシド存在下、少なくともヌクレオシドフォスフォリラーゼ存在下で反応せしめ、用いたヌクレオシドから形成される脱糖化プリン誘導体または脱糖化ピリミジン誘導体およびリン酸化基質を生成せしめる工程、
   工程３：生成したリン酸化基質に同フォスファターゼを作用させて無機リンを生成せしめ、該無機リンを少なくとも１回以上工程２の反応に再利用してなる工程、
   工程４：全工程において生成した脱糖化プリン誘導体または脱糖化ピリミジン誘導体の量を酵素的に定量する工程。
2. 請求項１においてヌクレオシドフォスフォリラーゼの量が０．０１Ｕ／ｍｌ〜４０Ｕ／ｍｌの濃度の範囲であり、ヌクレオシド量が０．５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度の範囲であり、フォスファターゼ量が０．０５Ｕ／ｍｌ〜１０００Ｕ／ｍｌの濃度の範囲である請求項１記載の核酸の定量方法。
3. 被検液中の核酸が、モノリボヌクレオチド、モノデオキシリボヌクレオチド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド型、１本鎖または２本鎖のＤＮＡ型またはＲＮＡ型のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、またはそれらのヌクレアーゼ分解産物のいずれかを１つまたはそれ以上含む核酸である請求項１記載の核酸の定量方法。
4. 被検体中の核酸が、被検体中の核酸に対して実質的に相補的な塩基配列を含む核酸の固相化担体と被検体とを接触させて、固相担体上にハイブリダイズ反応を行なわせたハイブリダイズした核酸であり、ハイブリダイズした核酸またはハイブリダイズした核酸のヌクレアーゼにて分解された産物を定量してなる請求項１記載の核酸の定量方法。
5. ハイブリダイズした核酸が、感染症由来の核酸である請求項４記載の核酸の定量方法。
6. 被検体中の核酸が、被検体中の核酸に対して実質的に相補的な塩基配列を含む核酸の固相化担体と接触させて固相担体上にハイブリダイズ反応を行なわせたハイブリダイズした核酸を、ポリメラーゼ反応により、その核酸に相補的または同一塩基配列を有する核酸の伸長反応により核酸を形成せしめたものである請求項１記載の核酸の定量方法。
7. 請求項１においてヌクレオシドがイノシンまたはキサントシンである場合に、脱糖化プリン誘導体がヒポキサンチンまたはキサンチンであり、ヌクレオシドがグアノシンである場合に脱糖化プリン誘導体がグアニンであり、ヌクレオシドが８−アザグアノシンである場合に脱糖化プリン誘導体が８−アザグアニンであり、ヌクレオシドがウリジンまたはデオキシウリジンの場合に脱糖化ピリミジン誘導体がウラシルであり、ヌクレオシドがチミンであり、リン酸化基質がリボース−１−リン酸またはデオキシリボース−１−リン酸である請求項１記載の核酸の定量方法。
8. ヌクレオシドがプリンヌクレオシドである場合、ヌクレオシドフォスフォリラーゼがプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼである請求項１記載の核酸の定量方法。
9. ヌクレオシドがピリミジンヌクレオシドである場合、ヌクレオシドフォスフォリラーゼがピリミジンヌクレオシドフォスフォリラーゼまたはウリジンフォスフォリラーゼまたはチミジンフォスフォリラーゼである請求項１記載の核酸の定量方法。
10. 工程４において脱糖化プリン誘導体の量を酵素的に定量する場合、キサンチンオキシダーゼまたはキサンチンデヒドロゲナーゼを用いて定量する請求項１記載の核酸の定量方法。
11. 工程４において脱糖化ピリミジン誘導体の量を酵素的に定量する場合、ウラシルデヒドロゲナーゼまたはデヒドロウラシルデヒドロゲナーゼを用いて定量する請求項１記載の核酸の定量方法。
12. 少なくとも、被検液中の核酸の定量に当たって下記の反応組成物を含む核酸の定量用組成物で
    （１）ヌクレオシドフォスフォリラーゼ
    （２）ヌクレオシド
    （３）フォスファターゼ
    （４）脱糖化プリン誘導体または脱糖化ピリミジン誘導体の量を酵素的に定量する成分
    を含有する核酸の定量用組成物。
13. ヌクレオシドフォスフォリラーゼの量が０．０１Ｕ／ｍｌ〜４０Ｕ／ｍｌの濃度の範囲であり、ヌクレオシド量が０．５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度の範囲であり、フォスファターゼ量が０．０５Ｕ／ｍｌ〜１０００Ｕ／ｍｌの濃度の範囲である請求項１２記載の核酸の定量用組成物。
14. 被検液中の核酸が、モノリボヌクレオチド、モノデオキシリボヌクレオチド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド型、１本鎖または２本鎖のＤＮＡ型またはＲＮＡ型のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、またはそれらのヌクレアーゼ分解産物のいずれかを１つまたはそれ以上含む核酸である請求項１２記載の核酸の定量用組成物。
15. 被検体中の核酸が、被検体中の核酸に対して実質的に相補的な塩基配列を含む核酸の固相化担体と被検体とを接触させて、固相担体上にハイブリダイズ反応を行なわせたハイブリダイズした核酸であり、ハイブリダイズした核酸またはハイブリダイズした核酸のヌクレアーゼにて分解された産物を定量してなる請求項１２記載の核酸の定量用組成物。
16. 請求項１５に記載したハイブリダイズした核酸が、感染症由来の核酸である請求項１５記載の核酸の定量用組成物。
17. 被検体中の核酸が、被検体中の核酸に対して実質的に相補的な塩基配列を含む核酸の固相化担体と接触させて固相担体上にハイブリダイズ反応を行なわせたハイブリダイズした核酸を、ポリメラーゼ反応により、その核酸に相補的または同一塩基配列を有する核酸の伸長反応により核酸を形成せしめたものである請求項１２記載の核酸の定量用組成物。
18. 請求項１２においてヌクレオシドがイノシンまたはキサントシンである場合に脱糖化プリン誘導体がヒポキサンチンまたはキサンチンであり、ヌクレオシドがウリジンまたはデオキシウリジンの場合に脱糖化ピリミジン誘導体がウラシルであり、ヌクレオシドがチミジンの場合に脱糖化ピリミジン誘導体がチミンであり、リン酸化基質がリボース−１−リン酸またはデオキシリボース−１−リン酸である請求項１２記載の核酸の定量用組成物。
19. ヌクレオシドがプリンヌクレオシドである場合、ヌクレオシドフォスフォリラーゼがプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼである請求項１２記載の核酸の定量用組成物。
20. ヌクレオシドがピリミジンヌクレオシドである場合、ヌクレオシドフォスフォリラーゼがピリミジンヌクレオシドフォスフォリラーゼまたはウリジンフォスフォリラーゼまたはチミジンフォスフォリラーゼである請求項１２記載の核酸の定量用組成物。
21. 脱糖化プリン誘導体の量を酵素的に定量する成分が、キサンチンオキシダーゼまたはキサンチンデヒドロゲナーゼを含む請求項１２記載の核酸の定量用組成物。
22. 脱糖化ピリミジン誘導体の量を酵素的に定量する成分が、ウラシルデヒドロゲナーゼまたはデヒドロウラシルデヒドロゲナーゼを含む請求項１２記載の核酸の定量用組成物。